Ecole Nationale Supérieure Agronomique –ENSA-

Département : Productions Végétales

Cours de BIOLOGIE MOLECULAIRE

Destiné aux étudiants de 4 eme année Zoologie Agricole

 1. Introduction
1.1. Définition

Un marqueur génétique est un gène ou une séquence d'ADN avec un emplacement connu
(locus) sur un chromosome et associé à un gène ou à un trait particulier.

Un marqueur génétique est un caractère mesurable qui peut détecter une variation entre les
individus (dans la séquence).

 Les marqueurs génétiques montrent des caractéristiques du phénotype et/ou du

génotype d’un individu ;
 Leur transmission héréditaire peut être suivie au cours des générations

1.2. Applications des marqueurs génétiques

 Décrire et déterminer le polymorphisme et la variabilité génétique entre les espèces et
les individus
 Distinguer les variétés pour la sélection et l’amélioration
 Description des modèles géographiques de variation génétique
 Déduire les relations taxonomiques et phylogénétiques entre les espèces
 Construire des cartes génétiques
 Mettre en évidence et suivre les gènes impliqués dans l'expression de caractères d'intérêt
agronomique (Amélioration assistée par marqueurs) :
*** Résistance aux agents pathogènes
*** Tolérance au stress
1.3. Polymorphisme de l’ADN
Divers événements ont pu produire des variants, plus ou moins complexes, dans la séquence
de l’ADN Ces variants sont généralement décrits comme des polymorphismes.

 Le polymorphisme se traduit par des différences dans le génotype et parfois dans le

phénotype.

 Plusieurs événements peuvent produire des polymorphismes :

 Phénomène de spéciation
 Des mutations ponctuelles
 Des insertions ou délétions
 Des réarrangements
Dans une espèce donnée, tous les individus ne se ressemblent pas ; il existe des populations
différentes d’individus.
 Chez les espèces cultivées ou domestiquées, il s’agit
Des variétés de plantes,
Des races animales,
Des souches de microorganismes.

Figure 1. Quelque variété de pomme de terre

Figure 2. Polymorphisme chez Papilio dardanus

1.4. Les marqueurs génétiques
A/ Types de marqueurs
 Marqueurs morphologiques (phénotypique)
 Marqueurs biochimiques (protéiques)
 Marqueurs moléculaires (ADN)
 ADN ARN Protéine Phénotype (Caractère)
(Génotype)

B/ Propriétés recherchées dans un marqueur génétique

 Polymorphe
 Codominants
 Discriminant
 Non sujet aux influences environnementales
 Economique, facile, rapide et peu coûteuse

Chapitre 01 : Marqueurs Génétiques Classiques

1. Marqueurs morphologiques
Les marqueurs morphologiques sont généralement des indicateurs visuels de caractères
phénotypiquement différents, tels que :
 La couleur (de la fleur, des graines ou des feuilles).
 La forme (de la fleur, des graines ou des feuilles).
 La taille (de la fleur, des graines ou des feuilles).
 Type de développement des plantes,
 Système racinaire…

Figure 3 : La couleur est un marqueur morphologique qui permet de distinguer les vaches
Avantage
 Disponibles immédiatement
 Nécessitent seulement un équipement simple
 Constituent la mesure la plus directe du phénotype
Inconvénients
 Nécessitent une expertise (par ex: pour la determination des espèces)
 Soumis à l’influence de l’environnement

2. Marqueurs protéiques (biochimiques)

Pour de nombreuses espèces (cas), les marqueurs morphologiques seuls sont
insuffisants pour détecter les différences entre les variétés (les individus)
Sont insuffisantes pour détecter le polymorphisme
La première technique moléculaire utilisée pour identifier et différencier les propriétés
génétiques était les marqueurs biochimiques basés sur les protéines et les enzymes (Les
isoenzymes)
1. Les isoenzymes
Les isoenzymes (variantes alléliques de la même enzyme) sont des formes alternatives ou des
variantes structurelles d'une enzyme qui ont :

 Des poids moléculaires et

 Une mobilité électrophorétique différente,
Mais ont la même activité ou la même fonction catalytique.
Les isoenzymes reflètent les produits de différents allèles plutôt que de différents gènes car la
différence de mobilité électrophorétique est provoquée par une mutation ponctuelle résultant
de la substitution d'un acide aminé.

 L’électrophorèse : la technique utilisée pour étudier les marqueurs protéique

Une méthode sépare les protéines en se basant principalement sur leur poids moléculaire dans
un champ électrique

L'électrophorèse est une technique biochimique polyvalente pour détecter la variation génétique

Principes de l'électrophorèse des protéines

 Les molécules de protéines migrent (se séparent) dans un champ électrique parce
qu'elles sont chargées
 Lorsqu'un gradient électrique est appliqué, les molécules migrent vers l'électrode avec
la charge opposée à la leur charge
 Résultats de l'électrophorèse des protéines

Gel d’électrophorèse
Interprétation des gels et des zymogrammes obtenus après électrophorèse

Photographie d'un gel montrant le motif Zymogramme de l'estérase montrant le

de bandes de l'estérase motif de bandes

Interprétation des gels et des zymogrammes obtenus après électrophorèse

 Nombre de locus (loci)
 Structure de l’enzyme (n+1) sachant que n: nombre de sous unités de l’enzyme
 Nombre d’allèle
 Résultats
** Nombre de locus (loci) : 5 zones donc 5 loci
** Structure de l’enzyme: nombre de bande, le max est 3, La loi n+1 = 3 donc n =2
Enzyme : dimères
** Nombre d’allèles : 3

Avantage des marqueurs Biochimiques

Nécessitent un équipement relativement simple
Complément robuste de l’évaluation morphologique de la variation
Inconvénients des marqueurs Biochimiques
Soumis à l’influence de l’environnement

Chapitre 02 : Marqueurs moléculaires

Les systèmes de marqueurs moléculaires peuvent révéler une variation génétique (ou
polymorphisme) dans les séquences d'ADN.

Il existe de nombreux types de marqueurs moléculaires avec des propriétés différentes, Ces
types peuvent être regroupés en deux grandes catégories :

 Les marqueurs de type RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

 Les marqueurs basés sur la méthode de PCR (Polymerase Chain Reaction) : tel que
RAPD, AFLP, SSR, ISSR, SNP…

1. Approche méthodologique pour la mise en évidence du polymorphisme

1.1. Restriction par les endonucléases
Parmi les enzymes, les Endonucléases à clivage spécifique (Enzymes de restriction : ER) est
une classe très importante car :

1. Elles sont capables de reconnaître une petite séquence spécifique (site de

reconnaissance)
2. Elles sont capables de cisailler l’ADN par hydrolyse des liens phosphodiester (site de
restriction)

A/ Origine et rôle biologique des Endonucléases

Les ER sont produits par les bactéries et constituent un mécanisme de défense contre les
infections par les phages.

B/ Mode d’action
** Coupure franche

** Coupure décalée

1.2. Amplification de l’ADN (PCR

Notions de base sur la PCR

La PCR : Est un moyen rapide, peu coûteux et simple pour copier des fragments d’ADN
spécifiques à partir de quantités minimes d’un matériel ADN source

Elle implique de préparer l’échantillon d’ADN et un mélange réactionnel avec des amorces,
puis la détection des produits de la réaction
Les procédures de la PCR

Dénaturation: Les fragments d’ADN sont chauffés à haute température, ce qui réduit la double
hélice d’ADN en de simples brins.

Appariement des amorces: Le mélange réactionnel est refroidi. Les amorces s’apparient à
leurs régions complémentaires dans les brins d’ADN source, et des doubles brins sont reformés
entre les amorces et les séquences complémentaires

Extension: L’ADN polymérase synthétise un brin complémentaire.

Le processus dans son ensemble est répété un grand nombre de fois

2. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction: (RFLP)

La détection de RFLP repose sur la possibilité de comparer des profils de bandes, générées
après digestion d’un ADN cible par des enzymes de restriction.

Les étapes expérimentales sont les suivantes:

 Extraction de l’ADN
 Digestion par enzyme de restriction et électrophorèse sur gel
 Transfert d’ADN selon la méthode de Southern
 Hybridation d’ADN et la visualisation

2.1. Extraction de l’ADN

** L’ADN génomique total est extrait des cellules végétales
** Alternativement, l’ADN des chloroplastes ou mitochondries peut être utilisé
** L’ADN doit être propre et de haut poids moléculaire

2.2.Digestion par enzyme de restriction et électrophorèse sur gel

L’ADN extrait est digéré avec des enzymes de restriction spécifiques, soigneusement choisies.
Chaque enzyme de restriction va reconnaître et couper l’ADN de façon prédictible, produisant
ainsi un ensemble de fragments d’ADN (les fragments de restriction) de différentes longueurs.
Les millions de fragments de restriction produits sont généralement séparés par électrophorèse
sur gel d’agarose (la coloration seule ne permet pas de détecter des polymorphismes).

2.3.Transfert d’ADN selon la méthode de Southern

Dans cette méthode, le gel est dénaturé dans une solution basique et placé dans un bac. Une
membrane poreuse de nylon ou de nitrocellulose est étalée sur le gel, et un poids posé sur
l’ensemble. Tous les fragments de restriction présents dans le gel se transfèrent sur la membrane
sous forme simple brin par capillarité.

2.4.Hybridation d’ADN et la visualisation

La membrane avec l’ADN cible est incubée avec la sonde ADN. Les conditions d’hybridation
sont telles que si des brins sur la membrane sont complémentaires de ceux de la sonde,
l’hybridation se produira et des duplex marqués se formeront. Les fragments désirés peuvent
être détectés après exposition simultanée de la membrane hybridée et d’un film
autoradiographique.

Exemple marqueurs RFLP

 3. Les marqueurs basés sur la méthode de PCR
On trouve :
A/ Profils d’amplifications arbitraires multiples MAAP (ADN amplifié au Hasard)
** ADN polymorphe amplifié au hasard (RAPD)
B/ Les séquences ciblées
** Microsatellites (SSR)
** Inter Microsatellites (SSR)
3.1. La technique RAPD (polymorphe amplifié au hasard)
La technique RAPD (ADN polymorphe amplifié au hasard) : est une méthode basée sur la PCR
qui utilise une petite amorce (généralement 10 bases) pour amplifier des fragments anonymes
d’ADN. Avec cette technique, il n’y a pas d’ADN cible spécifique, alors chaque amorce
particulière va adhérer à l’ADN matrice au hasard.

De ce fait, on ne connait pas la nature des produits obtenus. Les fragments d’ADN générés sont
alors séparés et détectés par électrophorèse sur gel.

Les étapes du RAPD sont :

 L’extraction d’ADN
 La réaction PCR avec une/des amorce (s)
 La séparation des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel
 La visualisation des fragments d’ADN, par le bromure d’Ethidium.

1. Extraction d’ADN (même que dans RFLP)

2. Réaction PCR avec une/des amorce (s)

 Composantes d’une PCR

 Les amorces (longues de 10 bases)

3. Séparation des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel

Les RAPD peuvent être détectés en faisant migrer les produits PCR par électrophorèse sur gel
d’agarose ou d’acrylamide. Dans les deux cas, le gel est coloré au bromure d’éthidium.

4. Visualisation des fragments d’ADN, par le bromure d’Ethidium.

Exemple marqueurs RAPD

Interprétation des profils RAPD

Du fait de la nature des marqueurs RAPD, on peut seulement caractériser la présence ou
l’absence d’une bande particulière.
Les critères de sélection des bandes interprétables sont les suivants:
 Largeur des bandes
 Taille
 3.2. Polymorphisme de longueur des fragments amplifiés (AFLP)

Principales caractéristiques :
 Une combinaison des technologies RFLP et PCR
 Basée sur l’amplification sélective par PCR de fragments de restriction d’un ADN
digéré
 Peut être réalisée avec de l’ADN génomique total ou des ADNc
Les étapes :

 L’ADN est digéré par deux enzymes de restriction différentes;

 Différentes combinaisons enzymes/amorces peuvent être utilisées.
 Des adaptateurs oligonucléotidiques sont liés aux extrémités des fragments d’ADN
 Des sous-ensembles spécifiques des produits de digestion de l’ADN sont amplifiés, en
utilisant des combinaisons d’amorces sélectives;
 Les fragments sont ensuite amplifiés par PCR.
 On utilise comme amorce un oligonucléotide complémentaire de la séquence de
l’adaptateur, prolongé de quelques nucléotides arbitraires (de 1 à 3) appelés bases
débordantes.
 Seuls sont amplifiés les fragments possédant les bases complémentaires de ces bases
arbitraires.
 Il s’agit donc d’amorces sélectives permettant de réduire le nombre de fragments
amplifiés à une centaine : sans ces séquences débordantes, il y aurait amplification
de milliers de fragments.
 La détection du polymorphisme se fait avec des radioisotopes, des sondes fluorescentes
ou une coloration à l’argent.

C’est la combinaison enzyme de restriction/amorce qui permet de révéler le polymorphisme

entre les individus. Celle-ci constitue le marqueur AFLP

Exemple marqueurs AFLP

Interprétation des bandes AFLP
La technique AFLP détecte des polymorphismes qui résultent de changements (présence ou
taille) dans les sites de restriction ou adjacents à ces sites
 Plus on ajoute de bases sélectives, moins on détectera de polymorphisme
 Les bandes sont généralement codées comme présentes ou absentes

3.3. Les Microsatellites (SSR : Simple Sequence Repeats) (séquences ciblées)

Les microsatellites sont de courtes répétitions (1-10 pb) en tandem

Les plus courants sont (A)n’ (TC)n’ (TAT)n’ et (GATA)n’, les valeurs de n pouvant
aller de quelques unités à plusieurs dizaines.
Pour être utilisés comme marqueurs, leur localisation dans le génome d’intérêt doit être
préalablement identifiée.
Les polymorphismes dans la région répétée peuvent être détectés en réalisant une PCR
avec des amorces déterminées dans la région flanquante
Les étapes :

 Extraction d’ADN
 PCR avec des amorces spécifiques des régions flanquantes
 Une paire d’amorces spécifiques des bordures droite et gauche d’un microsatellite est
utilisée pour amplifier le même microsatellite chez différents individus.
 En effet, chaque microsatellite est bordé par des séquences uniques qui lui sont propres.
Les fragments d’amplification sont ensuite révélés par électrophorèse.
 Séparation des fragments
 Visualisation Par électrophorèse sur gel d’agarose et coloration au bromure d’éthidium
et lumière UV,

Exemple marqueurs SRR

 3.4. Les Intermicrosatellites (ISSR) (séquences ciblées)
 Ce sont les régions présentes entre les répétitions microsatellites
 La technique est basée sur l’amplification par PCR des séquences intermicrosatellite
 Du fait de l’abondance connue des séquences répétées réparties sur tout le génome, elle
cible de multiples locus

On réalise une PCR type, dans laquelle les amorces ont été définies à partir des séquences
répétées des microsatellites, augmentées d’une ou plusieurs bases dans la séquence flanquante
comme point d’ancrage.

4. Les marqueurs les plus récents

1/ Séquençage d’ADN
2/ Etiquettes de séquences exprimées (Expressed sequence tags: ESTs)
3/ Technologie des puces à ADN
4/ Les polymorphismes de simple base (Single nucleotide polymorphisms: SNP)

4.1. Les polymorphismes de simple base (Single nucleotide polymorphisms : (SNP)

Substitutions d’une simple base entre des séquences homologues
Les SNP sont beaucoup plus fréquents que les autres types de polymorphismes
Ils peuvent être identifiés en utilisant :
** Des puce à ADN ou
** Un équipement de DHPLC ou
** Par séquençage
4.2. Le séquençage des acides nucléiques
Définition :
Le séquençage de l'ADN, consiste à déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides d’un
fragment d’ADN donné.

Méthodes de séquençage de la 1ere génération :

1. Méthode de Maxam et Gilbert

2. Méthode de Sanger
3. Le Pyroséquençage
4. Le séquençage automatique (méthode de Sanger)
A/ Méthode de Sanger (Méthode enzymatique)

 Elle repose sur l’allongement par l’ADN polymérase d’un brin à partir d’une amorce,
en utilisant un autre brin d’ADN comme matrice.
 Le principe consiste à utiliser des nucléotides légèrement différents : les
didésoxyribonucléotides (ddNTP) au lieu des désoxyribonucléotides triphosphates
(dNTP) lors de la polymérisation.
 Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH en position 3’.
 Ainsi, si on ajoute du ddATP, aux dNTP, la polymérisation s’arrêtera lorsque la
polymérase ajoutera un ddATP, mais continuera lorsqu'elle ajoutera un dATP.
 On aura donc une série de molécules s’arrêtant toutes à un A, ces molécules seront plus
ou moins longues
 Parallèlement, dans trois autres tubes on ajoutera aux dNTP du ddCTP, du ddTTP ou
du ddGTP. On obtiendra ainsi des molécules s’arrêtant soit aux C soit aux T soit aux G
en fonction du ddNTP utilisé.
 Parallèlement, dans trois autres tubes on ajoutera aux dNTP du ddCTP, du ddTTP ou
du ddGTP. On obtiendra ainsi des molécules s’arrêtant soit aux C soit aux T soit aux G
en fonction du ddNTP utilisé.
 Dans les quatre tubes on a donc des molécules dont la taille dépend de la séquence.
 Pour les séparer on peut faire un gel d'électrophorèse en condition dénaturante de façon
à ne voir que les molécules néo-synthétisées.

Migration électrophorétique
B/ Automatisation de la Méthode de Sanger

 Les séquenceurs automatiques modernes utilisent un système de détection in situ

pendant l’électrophorèse.

 Le faisceau d’un laser émettant dans la bande d’absorption du fluorophore traverse le

gel

 Les échantillons déposés dans les puits en haut sont séparés par une électrophorèse dans
un gel de polyacrylamide. La séquence 5’ se lit de bas en haut.

 Pendant la migration, lorsqu’une bande d’ADN passe devant le faisceau, un signal de

fluorescence est émis. Celui-ci est capté par une photodiode située en regard du gel. Le
signal est amplifié puis transmis à l’ordinateur de contrôle et analysé par un logiciel
spécialisé.

Dans des conditions favorables, cette technique permet de lire jusqu’à 1000 nucléotides par
fragment séquencé. En routine, la moyenne est de l’ordre 500 à 800 nucléotides par expérience

C/ Le pyroséquençage
Cette méthode est basée sur la détection du pyrophosphosphate lors de l’incorporation d’un
nucléotide par une polymérase (Ronaghi et al. 1998).
Le fragment d’ADN d’intérêt (amorce hybridée à une matrice simple brin) est incubé avec une
DNA polymérase, une ATP sulfurylase, une luciférase et une enzyme de dégradation des
nucléotides telle que l’apyrase.
Des nucléotides sont ensuite ajoutés par cycle, tout d’abord du dATP, puis du dTTP, du dGTP
et du dCTP.
 5. Les marqueurs moléculaires et la phylogénie

Pour mieux étudier la diversité, l’Homme a commencé par la classifier en essayant d’établir un
ordre logique

Pour y arriver, des classifications de tout type ont été proposées en utilisant des critères variés
et variables d’une époque à l’autre

Actuellement : ces critères et classifications continuent à être mis à jour conformément à la

compréhension progressive de cette diversité

Historique :

 Aristote: Regroupant les êtres vivants : Animés et Inanimés

 Linné : a proposé un système plus ou moins définitif (qui est toujours en place, au moins
du point de vue des catégories et de la nomenclature)
** Nomenclature binominale : Genre & sp
** Consister en une série de catégories : Règne, Embrochement, Classe, Genre, Espèce
 Darwin : à parler sur l’Evolution comme le processus dynamique et permanent qui
permet aux organismes de répondre aux défis de l’environnement
Définition
** La phylogénie est l'histoire de la descendance d'un groupe de taxons de leurs ancêtres
communs, y compris l'ordre de ramification et parfois les moments de divergence)

** Est l'étude des liens de parenté entre les êtres vivants et ceux qui ont disparu

Le terme « phylogénie » est dérivé d'une combinaison de termes grecs.

 Phylon signifie « tribu » ou « clan » ou « race » et
 Genèse signifie « origine » ou « source ».
En phylogénie moléculaire, les relations entre organismes ou gènes sont étudiées en comparant
des homologues de séquences d'ADN ou de protéines

Les dissemblances entre les séquences indiquent une divergence génétique résultant de
l'évolution moléculaire

L'approche phylogénétique classique repose sur les caractéristiques morphologiques d'un

organisme, les approches moléculaires dépendent des séquences nucléotidiques d'ARN et
d'ADN et des séquences d'acides aminés

En comparant des molécules homologues de différents organismes, il est possible d'établir leur
degré de similitude, établissant ou révélant ainsi une hiérarchie de relation un arbre
phylogénétique

Figure : Étapes générales de l'étude de la phylogénie moléculaire

Propriétés des gènes marqueurs idéaux
1) Un gène à copie unique peut être plus utile qu'un gène à copie multiple
2) Comme les séquences de gènes marqueurs sont alignées avant l'analyse phylogénétique,
leur alignement devrait être facile.
3) Le taux de substitution doit être optimal afin de fournir suffisamment de sites
informatifs.
4) Des amorces doivent être disponibles pour amplifier sélectivement le gène marqueur.

Exemple : Gènes ribosomiques nucléaires

L'ARN ribosomal est considéré comme la meilleure cible pour étudier la relation
phylogénétique car il est universel et composé de domaines hautement conservés et variables.
 ARNr 18S: Les eucaryotes
 ARNr 16S: Les bactéries
 ARNr 5S: Les champignons, animaux supérieurs et les protistes
 ARNr 28S: les métazoaires

Méthodes de construction d'arbres phylogénétiques (Voir l’exemple traité dans le cours)

Le résultat d'une analyse phylogénétique moléculaire peut être représenté dans un schéma
sous la forme d'un arbre phylogénétique

Arbre Phylogénétique
 Chapitre 03 : Lutte Génétique contre les ravageurs (génie génétique)
Définition 1
Le génie génétique, qui est l’une des biotechnologies modernes les plus connues, permet, en
modifiant leur patrimoine génétique, de conférer à des plantes, à des animaux et à des micro-
organismes des caractères qui ne pourraient pas être obtenus à l’aide des techniques classiques
de reproduction et de sélection.

Définition 2
Ensemble de techniques permettant de :
 Modifier le patrimoine héréditaire d'une cellule par la manipulation de gêne in vitro
 Manipuler de l'ADN et à l'insérer dans un organisme qui l'exprimera

1. Outils du génie génétique

1.1. Les enzymes

A/ Enzymes de coupure : Nucléases

** Les endonucléases

** Les Exonucléases

Ces enzymes éliminent des nucléotides un à un à partir d'une extrémité de l'acide nucléique
(ADN).
Il existe aussi des exonucléases actives sur l’ARN

B/ Enzymes de synthèse : Polymérases

Les polymérases sont des enzymes qui synthétisent un nouveau brin d'ADN complémentaire à
une matrice d'ADN ou d’ARN

Trois (03) polymérases sont couramment utilisées en génie génétique :

C/ Enzymes de liaison : Ligases
Les (ADN /ARN) ligases catalysent la formation d’une liaison phosphodiester entre deux
segments d’acides nucléiques.
Elles jouent un rôle capital en génie génétique puisqu’elles permettent la construction de
molécules recombinées

1.2. Restriction par les endonucléases (chapitre 1)

Parmi les enzymes, les Endonucléases à clivage spécifique (Enzymes de restriction : ER) est
une classe très importante car :

1. Elles sont capables de reconnaître une petite séquence spécifique (site de

reconnaissance)
2. Elles sont capables de cisailler l’ADN par hydrolyse des liens phosphodiester (site de
restriction)

Des outils importants du génie génétique.

A/ Origine et rôle biologique des Endonucléases

Les ER sont produits par les bactéries et constituent un mécanisme de défense contre les
infections par les phages.

B/ Différents types d’ER

Les ER sont actuellement classés en trois types suivant la complexité de leur structure, leurs
différents cofacteurs et leur mécanisme d’action :
Type 1

Type 2 : Ce sont les ER les plus nombreuses et les plus utilisées aux laboratoires de génie
génétique.

Type 3 : Ces enzymes sont beaucoup plus rares, elles forment un complexe bifonctionnel
capable d’agir comme endonucléase et comme méthylase

C/ Nomenclature
La nomenclature dépend de règles spécifiques qui tiennent compte de la bactérie dont a été
isolée l’ER :

 La première lettre est en majuscule cela correspond à la première lettre du genre

bactérien.

 La seconde et troisième lettre sont en minuscule et correspondent aux deux premières

lettres de l'espèce bactérienne.

 La quatrième position (lettre ou chiffre arabe) correspond à la souche bactérienne, elle

n'est pas toujours présente.

 Enfin, un chiffre romain donne le numéro d'ordre de caractérisation de l'enzyme.

 1.3. Vecteurs de clonage
Le clonage moléculaire consiste à l’insertion d’une séquence d’ADN dénommé insert dans un
vecteur approprié puis son introduction dans une cellule-hôte afin d’en obtenir plusieurs copies

Le fragment d’ADN est au préalable introduit dans une construction que l’on appelle vecteur.
Le vecteur recombiné est ensuite introduit dans une cellule hôte.
 Un vecteur de clonage est un petit élément génétique à réplication autonome, utilisé
pour produire de multitude de copie du gène d’intérêt
 Ces vecteurs de clonage sont spécialement conçus pour permettre l’intégration de la
portion d’ADN exogène dans un site spécifique sans que cela affecte sa propre
réplication

Il existe plusieurs types de vecteurs :

** Vecteur de clonage : renferme une origine de réplication et permet de cloner un segment
d’ADN ou un gène qui y est intégré.

** Vecteur d’expression : Renferme un promoteur et permet de faire exprimer un gène

A/ Vecteurs de clonage
 C’est un système permettant le transfert, l’expression et la réplication d’un ADN
étranger dans les cellules hôtes en vue d’un clonage moléculaire

 Couramment utilisés en vue de production de protéine recombinante, et pour le

séquençage d’un gène…

Propriétés des vecteurs de clonage

1/ Réplication autonome et indépendante de l’ADN de la cellule hôte

2/ Petite taille : pour permettre l’insertion de grand fragment d’ADN étranger
3/ Présence de sites de restriction localisés dans les gènes de sélection : permet de sélectionner
les cellules hôtes qui ont intégré un vecteur recombinant
4/ Stabilité: maintient sans modification dans la cellule hôte

Exemples de vecteur de clonage

Plasmides (Bactérie)
Phage lambda (Bactérie)
Cosmide (Bactérie)
BAC (bacterial artificial chromosome) (Bactérie)
YAC (yeast artificial chromosome) (Levure)

Les plasmides
 Molécule d’ADN d’origine bactérienne
 Molécule d’ADN double brin circulaire de taille réduite : 2 à 5 kb
 Capable de réplication autonome
 Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques pour permettre la sélection
 Les premiers utilisés en génie génétique: ColE1, RSF2124 et pSC101
 Les plasmides artificiels
 La série la plus importante de ces plasmides est la série pBR312 à pBR322
 Il possède 20 sites de restriction

Les phages
 Les phages sont des virus qui infectent les bactéries.
 Deux phages sont très utilisés comme vecteurs : le phage lambda et le phage M13

B/ Hôtes de clonage

En biotechnologie, le génie génétique est utilisé à des fins commerciales comme pour la
production de nouveaux vaccins, ou l’introduction de gènes spécifiques dans un organisme
animal ou végétale.

Dans chaque cas, le choix de l’hôte est essentiel puisqu’il nous orientera vers un type de vecteur
adapté.

L'hôte idéal
Pour obtenir de grande quantité d’ADN cloné l’hôte idéal doit
 Se développer rapidement dans un milieu de culture peu onéreux.
 Être non pathogène.
 Être capable d’incorporer l’ADN.
 Être stable en culture
 Possède des enzymes appropriées pour la réplication du vecteur
 Les hôtes répondant à ces critères sont des microorganismes eucaryotes ou procaryotes dont
les génomes sont bien connus car entièrement séquencés, génétiquement manipulables

a/ Escherichia coli
Avantages
1. Génétiquement très bien connue.
2. Nombreuses souches disponibles
3. Procaryote le plus connu
Inconvénients
1. Potentiellement pathogènes
b/ Bacillus subtilus
Avantages
1. Facilement transformable
2. Non pathogène
3. Formation d’endospores facilitant les cultures

Inconvénients
1. Génétiquement instable
2. Génétique moins connue

c/ Saccharomyces cerivisae
Avantages
1. Génétiquement très bien connue
2. Non pathogènes
3. Assure la maturation des ARNm et des protéines
4. Facile à cultiver.

Inconvénients
1. Plasmides instables
2. Pas de réplication pour la plupart des plasmides procaryotes

1.4. Méthodes d'introduction de l'ADN à cloner dans la cellule hôte

Il y’a plusieurs méthodes sont largement utilisées pour introduire l’ADN dans les cellules hôtes.
Chez les bactéries on peut transférer l'ADN à cloner par trois méthodes:
 La transformation,
  La transduction et
 La conjugaison
Chez les eucaryotes: La Transfection
A/ Transformation bactérienne
 Consiste à faire entrer le plasmide recombinant porteur du gène d’intérêt dans une
cellule hôte où il pourra se répliquer en grande quantité

 Rendre les bactéries compétentes : fragiliser la paroi bactérienne pour faciliter l’entrée
du plasmide

 Utilisation des méthodes physico-chimiques :

 Choc thermique (de 0 à 42°C) ou
 Choc électrique (électroporation)
B/ Électroporation
Cette technique implique l’exposition de l’hôte à des décharges électriques afin d’ouvrir les
pores (temporairement) dans la membrane par lesquels, l’ADN cloné, ajouté dans le milieu,
peut pénétrer sans lyse des cellules

C/ Microinjection
Dans les cellules animales, l’ADN peut être injecté dans le noyau par microinjection.
2. La transgénèse
 3. Technique de l'insecte stérile (SIT)
La technique des insectes stériles (SIT) est une technique dans laquelle un grand nombre
d'insectes stérilisés est libéré pour réduire l'accouplement entre homologues sauvages fertiles.

Elle a donnée des résultats intéressants avec plusieurs espèces :

 La mouche tsé-tsé
 La mouche du melon
 Chapitre 04 : Exemples d’espèces génétiquement modifiées
Exemple 01 : Maïs résistant à la pyrale
La pyrale du maïs (Ostrinia nubilalis), est un papillon redouté des agriculteurs
Ses larves se développent dans les plants de maïs, faisant chuter les rendements quand
l’infestation est massive.
Pour contrer ce ravageur, un maïs Bt résistant aux attaques de la pyrale a été mis sur le marché
en 1996.

Une bactérie produit une substance toxique pour les larves de pyrale
La bactérie parasite des insectes Bacillus thuringiensis a été le premier microorganisms
commercialisé comme biopesticide, au début des années 1960
Les plants ont montré une très bonne résistance des maïs "Bt" à la pyrale, ce qui, dans les
cultures, évite le recours à la lutte chimique
 Figure : Introduction d’un nouveau gene dans une plante

Exemple 02 : Pomme de terre résistante aux nématodes

 Les nématodes à galles (Meloidogyne spp.) sont un problème important dans la
production de pommes de terre (Solanum tuberosum)
 Il n'y a pas de cultivar de pomme de terre résistant à Meloidogyne
 des gènes de résistance ont été identifiés dans des espèces de pommes de terre sauvages
et ont été introgressés dans des lignées de sélection
 La résistance médiée par le gène R chez la pomme de terre a été déployée contre le
nématode à kyste de la pomme de terre
 Cette résistance a été introduire dans la pomme de terre cultivée du groupe tétraploïde
S. tuberosum Andigenum

Autres Exemples : Aubergine Bt & Cotton Bt