TRAVAUX ET DOCUMENTS DE L'O.R.S.T.0.M.

N" 127

O.R.S.T.O.M. - PARIS -. 1981

FERMENTATION EN MILIEU SOLIDE

CROISSANCE DE CHAMPIGNONS FILAMENTEUX

SUR SUBSTRAT AMY LAC$

Maurice R A IMBA UL T
Cette étude a fait l’objet d’une thèse de Doctorat d’&at es-Sciences Naturelles,
présentée à l’Université Paul Sabatierde Toulouse le 10 juillet 7980. Elle a bénéficié
de l’aide de la D.G.R.S.T., Comité P.O.U.

t( La loi du Il mars 1957 n’autorisant, aux termes des alinéas 2 et 3 de l’article 41, d’une part,
que les «copies ou reproductions strictement réservées à l’usage privé du copiste et non destinées
à une utilisation collective» et, d’autre part, que les analyses et les courtes citations dans un but
d’exemple et d’illustration, «toute représentation ou reproduction intégrale, ou partielle, faite
sans le consentement de l’auteur ou de ses ayants droit ou ayants cause, est illicite» (alinéa Ier
de l’article 40).
((Cette représentation ou reproduction, par quelque procédé que ce soit, constituerait donc
une contrèfaçon sanctionnée par les articles 425 et suivants du Code Pénal.»

@ O.R.S.T.O.M. 1981
ISBN : 2-7099-0589-2
ARSTRACT

SOLID STATE.FEDMENTATION:GRm OF '$'I-S FUWX ON

SrllARCHy SuBsTRAm
The grow'ch of filzxntous fungi on solid substrates plays an im-
portant part in nurterous fields such as environnent, fond and industri-
a1 microbiolcqy. Iheir importance grows bigger with the intensification
of the reeearch about bicconversions and valorisation of agricul-
tura1 prcducts.
This study was undertaken with a view to knowing the control
possibilities of solid fermentation as to valorise the agricüitural
starchy prcducts by the production of'protein enriched feed.
An original technique has been perfected for the growth of fungi
on solid substratum and the control of its aerobic developnent in the
stage of vegetative multiplication. This very simple method of culti-
vation allows ~CImaintain favourable conditions during the incubation
and brings about,an invading process of the whole mass of the substra
tum by the fungi mycelium.
According to the pursued aim and for practical reasons, one
strain of fungi belonging to the group of Asperg<Zhs niger bas ben
selected because of its performance of growth, of its heat tolerance
ard nutritionalgualities. However ithasbeen shownthat this culture
methcdcanbeusedwitha greatrnrnberof strains of filamsntius fungi.
The microscopic and microbiolqical studies allowed to show the
selective process of the fungi growth even in no strictly aseptic con-
ditions adopted.
The id%mICe Of the _teTQEratUre, ImistUre, aeration,pH md ino-
culation on the evolution of the growth has been determined SO as to
establish the best conditions of incubation.
The bicchemical study of the growth, and the definition of reac-
tions for starchhydrolysis, substrate assimilation and respiration
allowed to calculate the fermentation parameters and to define the
global stoichicmatrical equation of the growth.
The detailed study of the respiratory metabolism related to the
growth allowed to progress rapidly in the knoweldge of the mschanisms
andto obtain valuable data concerning the biosynthesis of mycelium,
the tmnsfer of calories and water rretabolism in solid state fermsnta-
tien e
 These diqferent results indicated that the onlli pattem of Expo-
nential growth cannot be sufficiént to explaîn the growth kinetics
on solid substratum and that the free residual water and the surface
contact between the mycelium and the substrate play an essential part
in the limitationof the growth in this type of medium.
According to these considerations sud on the basis of the expe-
rin-ental data a kinetic pattem which is specific of solid fermenta-
tion was established-This theorical mode1 used only physiolcgical para-
meters which could be determir?ed expsrimentally. This rtcdel was close
to the expxential pattern in the first stages of the growth and dif-
ferentiates frcm it slowly according to the progression of the reac-
tion, to tend towards a limited value determined by the structure of
the substratum and the quantity of the initial %ater.
It bas been demonstrated that this theoretical pattern allows
to translate in a satisfactory way the exparirxntal results concerning
the starch hydrolysis, the mycelium growth and the evolution of the
different constituents of the reactional medium ( sugars, oxygen, 02,
CO2 and HiO 1.
The developnent of such a kinetical pattern should allow to
realize quick progresses in the control and optimization of solid
medium fermentations so as to use in the best way the high biosynthe-
tical potential of filamantous fur@.
Data and howledge obtained durit-q this study allowed to Fxxform
a new prccess of solid medium fermentation to produce protein enriched
feed. Pilote scale experime~t led to the sqme conclusions than labora-
tory scale studies.
mording to this prcxess agricultural substrata such as cassa-
va, potato, banana or their wastes containing frcm 2 to 5 per cent
of proteins and frcm 80 to 95% of sugars were transformed in enriched
prcducts containing from 18 to 20% of proteins and frcnn 30 to 35% of
assimilable sugars, this after only 24 to 30 heurs of fermentati.on.
Other possibilities of application of the knowledge obtained
during this xork are presentl\r under investigation conceming gluco-
amylase production and the growth of fungi on cellulosic substratum.
INTRQL?UCTfON

La croissance démographique mondiale implique une augmentation de

plus en plus importante de la consommation de viande et, par voie de
conséquence, une intensification de l'élevage et des besoins en pro-
teines alimentaires. On s'accorde à penser que l'accroissement des
productions de proteines d'origine vegetale ne suffira pas à couvrir
ces besoins et qu'il est nécessaire d'envisager les possibilitds of-
fertes par les protéines des microorganismes tels que les bactéries,
les levures et les champignons (1, 2,'3,).

Parmi les nombreux substrats pouvant être utilisés par les microor-
ganismes, les substrats glucidiques agricoles présentent l'avantage
d'être à la fois abondants et théoriquement inépuisables puisqu'i'is
sont régénérés en permanence grâce à la photosynthèse. L'utilisation
des résidus agricoles disponibles en quantités importantes et parfois
gênantes, pourrait conduire à leur valorisation tout en supprimant
des sources de pollution.

La cellulose et l'amidon sont les substrats glucidiques les plus a-

bondants et offrent des perspectives d'avenir intéressantes. La cellu-
lose dont les disponibilités potentielles sont élevées présente l'in-
convénient de nécessiter l'hydrolyse des liaisons glucidiques e-1-4
qui est un processus lent et difficile à réaliser aussi bien chimique-
ment que biologiquement. L'amidon est par contre facilement et rapide-
ment hydrolysé par de nombreux microorganismes. Il semble donc préfé-
rable, dans un premier temps, de choisir les matières amylacés pour la
production de protkines.

Les différents travaux concernant l'utilisation de l'amidon pour la

production de protéines ont porté essentiellement sur la culture de
différentes souches de microorganismes en milieu liquide dilué. La
récolte et le conditionnement du matériel cellulaire synthétisé per-
met d'obtenir un produit sec à haute teneur en protéines. Les diffé-
rentes possibilites qui ont été étudiees ont conduit à l'élaboration
de divers procédés (4, 5, 6, 7,).
 2

La r6al4sation de ces diff5rents proc&l& de LransformatJon quantita-

tive de l'amidon en corps microbiens fait appel ri une techno‘logie re-
1atJvement complexe necessitant des investissements éleves. L'optîmi-
sation de ces prcductions conduit à la mise en place d'installations
de taille importante. Etant donné le prix assez élevé de la matière
première agricole et de son transport, et les difficultés d'approvi-
sionnement dûes â la nature fluctuante des récoltes, la rentabilité
de telles installations reste problématique et les protéines fabri-
quées risquent d'avoir un prix de revient trop élevé.

Dans ces conditions la mise en oeuvre des techniques classiques de

fermentation en milieu liquide se révèle rapidement peu rentable.
Elles nécessitent en effet, pour etre exploitables, une taille mini-
mum souvent sans commune mesure avec le volume des substrats disponi-
bles. D'autant plus que la collecte, le transport ou le stockage de
ces produits représente dans la plupart des cas une clause prohibitive.

A partir de ces considérations, on est amené â envisager une approche

totalement différente qui consiste à produire non pas des cellules
microbiennes, mais des aliments glucidiques enrichis en protéines par
fermentation et destinés â être utilisés tels quels pour l'alimenta-
tion animale.

Dans cette optique, différents laboratoires ont tenté de mettre au

point une technique de fermentation en milieu solide ne nécessitant
pas d'équipements importants et basée sur un enrichissement direct en
orotéines de produits agricoles, ou de sous-produits agro-industriels
solides, de façon à éviter l'utilisation de volumes d'eau importants
et â suoprimer l'étape de récupération de la biomasse puisque dans
ce cas la totalité du milieu est récolté.

Les recherches dans ce domaine (8, 9,) n'ont pas toujours conduit â
des résultats concluants, dans la mesure 00 les conditions d'aération,
de pH et de température, nécessaires â l'obtention d'une bonne crois-
sance aérobie, n'étaient pas maintenues suffisamment longtemps pour
obtenir un enrichissement en protéines satisfaisant.
 3

De tels procédés de fermentation basés sur le développement de champi-

gnons filamenteux sur substrat solide existent depuis très longtemps
et sont â la base de nombreuses fermentations alimentaires tradition-
nelles (10, 11, 12, 13, 14). Toutefois l'objectif de telles pratiques
artisanales n'est pas d'augmenter la teneur en protéines des aliments,
mais de leur fournir des qualités organoleptiques particulieres
(attieki?, miso), d'améliorer la digestibilité des protéines vegétales
(tempeh, ontjom) ou encore de fabriquer un produit â haute activité
enzymatique (Koji).

Les premières applications industrielles pour la production d'enzymes

fongiques étaient basées sur la croissance sur substrats solides en
utilisant des fermenteurs rotatifs (15, 16). Les récents progrès en
génétique, physiologie et biochimie des champignons, alliés aux pro-
grès technologiques réalisés après 1940 ont conduit à des anplica-
tions industrielles spectaculaires spécialement dans le domaine des *
antibiotiques. L'avènement des fermenteurs en culture liquide agitée
a conduit â l'abandon quasi total des techniques de culture en milieu
solide, qui connaissent aujourd'hui un retard considérable (17).

Dans les cultures en milieu liquide les substrats présents sont faci-
lement utilisés par le champignon et un environnement relativement
homogène peut être maintenu par une agitation convenable. Toutefois,
tous les substrats ne sont pas immédiatement solubles, et des limita-
tions peuvent apparaftre. L'oxygène en particulier est faiblement so-
luble dans l'eau et de fortes agitations sont nécessaires pour mainte-
nir un approvisionnement suffisant.

D'autre part la culture de mycélium en mi'lieu liquide se trouve plus

rapidement limitée que pour les bactéries et les levures. En effet si
la croissance du champignon est "filamenteuse" elle provoque des vis-
cosités élevées, ce qui pose des problèmes d'agitation, d'homogénéisa-
tion et d'aération. Si la croissance se fait en "pelotes" la croissance
oeut être limitée par manque de diffusion de l'oxygëne et du substrat.
Enfin comme il ne s'agit pas d'organismes unicellulaires l'application
des théories de croissances spécifiques des bactéries n'est pas tou-
jours possible pour le calcul des taux de croissance,ce qui pose des
problèmes pour la conduite des fermentations continues et pour le
 4

genie mlcrobiologique en general.

On est ainsi amer& a se demander si dans certains cas l'emploi de fer-

mentations en milieu solide ne permettrait pas une exploitation plus
rationnelle de l'immense potentiel biosynthetique des champignons pour
de futures applications dans les domaines de pollution, bioconverçion
ou de production de biomasse.

Sur la base de ces considérations, nous nous sommes attachés à étudier

la croissance des champignons sur substrat amylacé dans l'espoir de
pouvoir mettre au noint un procédé de culture capable de surmonter les
difficultés rencontrées dans la conduite et le contrôle des fermenta-
tions en milieu solide.

L'objectif clairement défini dès le début de ces travaux était de met-

tre au point un procédé de culture aérobie de champignons sur des mi-
lieux aussi concentrés que possible et ne nécessitant qu'un appareil-
lage simple et rustique, pouvant éventuellement être mis en oeuvre
dans des zones rurales, et permettant de transformer des substrats
agricoles pauvres en protéines en aliments fermentés contenant suffi- .
samment de protéines pour servir de base â une alimentation animale.
Pour être utilisable au niveau rural, un tel procêdé de fermentation
ne doit pas nécessiter de conditions aseptiques strictes et doit se
dérouler en une seule opération. De plus le produit obtenu doit être
utilisable tel quel, sans opération supplémentaire de concentration ou
de centrifugation.

Nous avons choisi le manioc comme matériel d'étude en raison de sa

haute teneur en amidon, de sa pauvreté en protéines et de ses rende-
ments potentiels élevés (60 tonnes/ha) dans des zones géographiques où
les carences protéiniques sont graves. Signalons cependant que d'au-
tres substrats amylacés tels que la pomme de terre, les écarts de
triage de bananes ou les résidus de fêculeries ont également été utili-
sés.
 5

Etant donne la nature du substrat a enrichir, nous nous sommes inte-

ressës surtout aux moisissures amylolytiques qui ont des capacités
hydrolytiques imnortantes et qui peuvent tolërer des acidités permet-
tant d'éviter les contaminations bactériennes.

Au cours de cette étude nous avons donc dans un premier temps isolé,
testé et classé des souches de champignons amylolytiques de façon 8
en sélectionner un parmi les mieux adaptés à la croissance sur ami-
don de manioc.

Nous décrivons ensuite la méthode de culture que nous avons mise au

point pour l'étude de la croissance des champignons sur des substrats
amylacës solides. Sur la base de cette technique de culture simple
et originale, nous avons alors étudie l'influence des facteurs de
l'environnement de façon à déterminer les meilleures conditions d'in-
cubation. ,

L'étude microbiologique a été réalisée pour connaftre le mode de co-

lonisation du substrat amylacé par le mycélium, et pour suivre l'évo-
lution des contaminants bactériens aux cours de la fermentation.

L'étude biochimique et cinétique des paramètres de la croissance en

milieu solide a été rëalisëe et les résultats comparés à ceux obtenus
en milieu liquide. Sur la base des résultats expérimentaux obtenus
nous avons tenté de trouver un modèle cinétique capable de traduire
de façon satisfaisante la croissance sur substrat solide amylacë.

Nous décrivons enfin l'application des résultats de notre travail à

la mise au point et à l'optimisation d'un nouveau procédé d'enrichis-
sement en protéines par fermentation en milieu solide. Les autres
applications possibles sont également discutées.
 CHAPITRE 1

GENl?RALITBS
1. RAPPELSSUR LACROISSANCEDES CHAMPIGNONSFILAMENTEUX

1. - BIOLOGIE ET PtiYSIULOGiE DES CHAhlPZGNNO&

Dans la taxonomie,les champignons appartiennent au monde des vége-

taux hétérotrophes, cryptogames, eucaryotes, thallophytes non
chlorophylliens.

Ces microorganismes provoquent le moisissement de tr&s nombreux

milieux organiques (déchets végétaux, écorces, paille, aliments...)
et minéraux (sols, roches).

On a dénombré plus de 100.000 espèces de champignons qui se carac-

térisent par une très grande diversité de formes allant de la cel-
lule individualisée (levures) jusqu'à l'organisation complexe en
carpophores (pleurotes, cèpes, etc...).

Les spores sont les éléments reproducteurs qui peuvent.!&tre le ré-

sultat d'un mode sexué (asques) ou asexué (conidies). Les champi-
gnons imparfaits (FKflgL kmPek@cti), qui jouent un r61e important
dans l'industrie ne disposent que du mode de reproduction asexuée.

La multiplication végétative des champignons est réalisée , après

la germination des spores,mises dans des conditions adéquates, par
des filaments microscopiques appel& hyphes. Ces filaments s'allon-
gent par croissance apicale et se ramifient.
La masse des hyphes constituant le thalle du champignon est appel&
mycélium.

Les champignons filamenteux représentent un groupe de microorganis-

mes aérobies physiologiquement divers qui sont caractérisés par un
mode de nutrition saprophyte ou oarasite. Ils neuvent
 10

se &velopeer sur des milleux liquldës ou ss94des gt dans iêur envi=

rannement naturel on les trouve frequemment à la surface des liquides
ou des solides de telle sorte qu'une grande partie de leurs hyphes
sont aeriens. Puisque ces filaments aeriens doivent obtenir leur ali-
ments carbones à partir des filaments qui sont en contact avec le
substrat, les mécanismes de transport, jouent un grand rôle dans le
contrôle de leur développement (18).

Les champignons possèdent des ëquipements enzymatiques très impor-

tants, ce qui leur confère des facultés d'adaptation extrêmement vas-
tes. Ils colonisent des milieux très variés et jouent un grand rôle
dans les cycles et les équilibres biologiques.

Etant donnée l'importance sociale et économique des champignons en

tant que sources d'aliments, d'enzymes ou de métabolites biologique-
ment actifs, de nombreuses études ont été réalisées sur la physiolo-
gie de ces microorganismes.

Des revues générales et des traités de mycologie (19, 20, 21, 22,
23, 24) relatent en détail ces études physiologiques concernant la
germination des spores, la croissance végétative, les métabolismes
primaires et secondaires du mycélium et la sporulation. Ces diffé-
rentes études ont étë pratiquées pour l'essentiel grâce â la techni-
que de culture en milieu liquide ou en surface sur milieux gélosés
synthétiques. Par contre les études portant sur la croissance des
champignons se développant sur des substrats solides naturels sont
beaucoup moins nombreuses (25, 26, 27).

2- TffEORTES DE LA CTOZSSANCE0E.S CHAE~?TG!JONS

--^ .-

Les différentes théories de croissance des champignons que nous dé-

crirons sont basées essentiellement sur les cultures en milieu liqui-
de agité, et accessoirement sur la culture de surface sur milieu
gélosé synthétique. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle
de croissance des champignons en milieu solide.
 11

Des principes similaires aux cinétiques de croissance des bactéries

(28, 29) ont été appliqués au mycélium avec des modifications appro-
priées pour rendre compte des différences morphologiques. La princi-
pale différence résidant dans la nature multicellulaire ou coenocyti-
que du mycllium.

Comme pour la plupart des mlcroorganismes, la croissance des champi-

gnons est autocatalytique et fournit une allure exponentielle dans '
un système non limité.

Le taux de croissance spkifique, qui est la quantité d'organisme

produit par unit& de temps et par unité d'organisme, est une cons-
tante caractéristique de la souche et du milieu. Autrement dit la
vitesse de croissance est proportionnelle a la concentration d'or-
ganisme.

On peut ainsi écrire :

dX ,A. si
- =p.x ou t11
dt X dt

X q concentration cellulaire en g/l

t = temps en heure

I.I q taux de croissance spécifique homogène à h -1

Le taux de croissance spécifique est inversement proportionnel au

temps de doublement de la biomasse (td) selon la formule :
0,693
P +j.L- = t
 12

L'équation (1) peut s'intégrer et la quantité de masse cellulaire

en fonction du temps s'écrit :

Xt = x0. eut

ou pour une représentation graphique plus aisée

In Xt = ut + In X0 131

Sur des coordonnées semi-logarithmiques, une droite est obtenue,

pour une croissance exponentielle, dont la pente est Ogale au taux
de croissance spkifique. De nombreux auteurs (31, 32, 33) ont obser-
ve une crofssance exponentielle du my&lium des champignons. Celle-ci
est g&nGralement prGc0dée d'une phase de latente et suivie d'une pha-
se de ralentissement et d'une phase stationnaire.

En consultant la littérature on constate qu'il existe assez peu de

références concernant les taux de croissances des champignons. Le ta-
bleau 1 nous indique les taux de croissance des espèces les plus étu-
diées. Des taux de croissance de 0,36 à 0,17 h-l (temps de doublement
de 2 â 4 heures) sont assez fréquents.

Contrairement aux bactéries et aux levures, la phase de croissance

exponentielle n'est pas toujours observée pour les champignons fila-
menteux. Cette phase est souvent relativement courte et se maintient
habituellement pendant 3 â 6 doublement de la biomasse. Elle est
suivie d'une phase de ralentissement. pendant laquelle la cinétique
de croissance est linéraire (30). L'explication de cette limitation
de la phase exponentielle n'a pas encore été fournie.
! !
Organisme 1 I.I max (h-l) 1 td (h)
! !
! ! ! !
AapengXw tigm 0,200 3,46
! 1 ! i
1 Gnaph.& bp. 1 0,187 1 3,70 I
! Adp@h@%~ tidutanb I 0,148 1 4,68 1
! I I I ’
Petic~wn Chnyb cg enum 0,123 5,63
! ! ! !
, Mucah kicm& ! 0,099 ! 7,00 !
! Geuticlzutn canckdum ! 0,610 l 1,14 l
l I ! I
Neuhodpoka bLtaphita 0,400 1,73
1 1 1 1

Tabhau I - Taux de cmbbance de qu3quea champLgnana &i.&menkeux,

Valowu ~~~jqm.tées pu& SULUMUNS (34)

E. 1.2. A.U!an~emwt apicat ek kmidlctiond

---mm -------_---------------------

Contrairement aux organismes unicellulaires pour lesquelles les cel-

lules augmentent de diamètre ou de longueur puis se divisent, la
croissance du mycélium des champignons se fait par allongement des fi-
laments. L'allongement apical des filaments a ate tres étudiee (31,
129, 130, 131, 132). Il a eté établi que la croissance active se
trouve limitée 8 l'extrémité des filaments : croissance apicale,
et que cette zone est tres faible comparée 8 la masse du mycélium.
Les autres portions du mycélium auraient pour fonction d'absorber
les nutriments et de les véhiculer vers les extrémités.

TRINCI (33) a montr& que le tube d'A&cUan6 s'allonge de façon expo-

nentielle jusqu'a 120 nm, puis l'allongement devient lineaire et une
ramification se produit, ce qui fournit une extrimite suppl6mentalre.
 14

Donc, même lorsque l'allongement aoical se produit à une vitesse

constante, la longueur totale du mycélium peut augmenter de façon
exponentielle pourvu que le nombre de ramifications soit proportion-
nel â la longueur totale de mycélium (30). Ceci peut s'exprimer ma-
thématiquement de la façon suivante :

= kl. n
rL

n -kL 2

rL = (ki. k2). L = II. L. 141

avec :

n = nombre d'extrêmités

kl = vitesse d'allongement apical

k2 = fréquence des ramifications

L = longueur totale du mycélium

KATZ & Coll. (35) ont montré que chez A. niclu~anr,

- les filaments courts s'allongent de façon exponentielle

- chaque point de croissance s'allonge à une vitesse caractéristique

de l'organisme mais indépendante du taux spécifique de croissance
et du milieu

- LUE twification se produit quand la capacité de l'hyphe à s'allonger

dépasse les possibilités du nombre de points de croissance
19 on ressort que la frlquenoe de branchement oeralt prepotilonnelle
au taux spOc=lflque de croissance et varierait en fenct!on du'mllleu
de culture. Plus le mIlieu serait favorable plus la TrQuence de bran-
chement serait elevée ce qui a &té confirme par ces auteurs (35) et
par RIGHELATO & Coll. (39).

Dans un milieu,defavorable 00 la frequence de branchement serait

proche de zéro, le nombre d'extrêmités serait constant et la croissan-
ce deviendrait linéaire.

2. 2. .l. -------.--------
SubbaYmt .lZihLt& ..------------------
- j4odëLe de HONOP

La cause la plus commune du ralentissement de la croissance est la ,'

diminution de la concentration d'un des substrats à une concentration
limitante. L'équation de MONOD(28) reliant la vitesse de croissance
à la concentration de substrat limitant s'écrit :

= PMax. s X
rX 151
k,tS *

où :

- nMax est le taux de croissance maximum caractéristique de l'organis-

me, du milieu et des conditions de culture

- k, est la constante de I saturation du substrat limitant pour

2
laquelle n = nMax
2

- S concentratton du substratlimitant
 16

Dans les cultures en batch k, est habituellement très petit par rap-
port à la concentration initiale du substrat et ainsi la croissance
se produit à PMax jusqu'à ce que S s'approche de k,, ce qui provo-
que une chute rapide de u vers zero tandis que le substrat est éli-
miné.

Pour les champignons,la limitation de la croissance se produit beau-

coup plus tôt que nour ?es levures ou les bactéries et les auteurs
ont été amenés à chercher d'autres explications.

2.2.2. C&Abance U&ne

-_---_-_“------------- et “p&dA”
cubigue--..-“-- -----I-

Différents auteurs ont trouvé que la croissance des champignons dans

des cultures homogènes était mieux adaptée â une loi racine cubique
(36, 37) q1.1'3 une loi exponentielle :

PIRT (38) a donné une interprétation de ce phénomène en notant que

cette loi racine cubique était habituellement associée à la crois-
sance sous forme de "pellets". Dans ce cas la masse d'un pellet
augmente avec le cube de son rayon, alors que la surface â partir
de laquelle le substrat peut diffuser, n'augmente qu'avec le carré
du rayon. Dans ces conditions seulement une zone périphérique du
oellet peut maintenir une croissance exponentielle :

Xp représentant la biomasse de la zone périphérique d'une épaisseur

constante LL>.

En exprimant la biomasse d'un pellet en fonction de sa densité et

de son rayon, qui augmente à une vitesse proportionnelle à II et â
w on trouve que :
 *v-xo

La racine cubique de la biomasse varierait donc bien linéairement

en fonction du temps.

La formation de "pellet" ou pelotes qui est dGe a des ramifications

tres rapproch@es, est influencee par le taux de croissance. RIGHELATO
et coll. (39) ont observé chez P. ck.+~genum que la formation de
pellets permet d'eviter des viscosités trEs fortes comme dans le cas
de la croissance filamenteuse. Par contre cela introduit une impor-
tante h8terogenGité dans la biomasse avec une zone anaerobie au cen-
tre (40). Ceci entraine la production de metabolites, des rendements
de croissance et des taux de proteines peu elevees. Ce type de crois-
sance convient mal à la production de prot&ines.

2.2.3. ViWsement
_"""""_"""___"""""" du myc&Qutn
""""_"

Dans le mycélium en développement les extrêmités des filaments sont

toujours jeunes, mais les parties les plus distales du filament sont
de plus en plus âgées et se vacuolisent. Il est bien connu qu'il y
a des différences biochimiques et structurales importantes entre les
extrêmités apicales et distales des hyphes mêmes avec des mycelium
aseptés (41, 42).

Les changements de vitesse de croissance sont accompagnés par la dimi-

nution du pourcentage d'extrêmités plutôt que par une diminution de
leur vitesse d'allongement (33).

Le développement des cultures en batch peut être carrelé avec de tel-

les modifications. La distribution d'âge du mycélium peut être définie
statistiquement et cela fournit un parametre qui est fonction à la
 18

fois du temps écoulé et du spectre des différents taux de croissance

dans une fermentation (43, 44). Un tel paramètre peut être utilisé
pour établir des corrélations significatives pendant le déroulement
de fermentations.

La phase de ralentissement du taux de croissance et la phase sta-

tionnaire sont souvent bien representées par une loi de croissance
appelée "croissance logistique" dont l'expression générale est la
suivante :

Cette relation est basée sur le concept d'une population limite

telle que lorsque la masse cellulaire tend vers cette limite le taux
de croissance tend vers zéro.

Elle peut également être interprétée comme la différence entre le

terme des "naissances" du permier ordre et un terme de "décès" du
deuxième ordre. En outre cette équation peut être déduite, avec
certaines suppositions des mécanismes d'inhibition ou de disparition
de substrats. De nombreux auteurs ont observé la bonne corrélation
de la croissance des champignons suivant une loi logistique (45, 46),
en particulier pour la croissance dans les fermentations destinées
â la production de pénicilline.

EDWARDS& WILKE (47) ont généralisé l'équation logistique initiale

pour fournir une représentation mathématique des résultats de cultu-
res en batch en général et pour les champignons en particulier.
 19

L'équation initiale

K
x= Ca1
1 t e fao - ait)

dans laquelle :

K = concentration cellulaire dans la phase stationnaire

a 1 = taux de croissance spécifique maximum

= rapport de la concentration initiale â la concentration finale

aO

De façon â rendre cette équation plus souple ces auteurs l'ont géné-
ralisee en utilisant une fonction générale du temps comme exposant .
du terme exponetkiel :

K Dl
x=

1 t e lFt)

Parmi les différentes fonctions possibles,c'est un polynôme simple

de la forme suivant qui a été choisi :

F(t) = a, + a1 t t a2 t2 t....... an t”
EDWARDS& WILKE ont montré qu'une telle équation logistique génerali-
sée permettait d'obtenir une très bonne représentation de differentes
cultures.en batch. Un programme d'ordinateur est utilisé pour resou-
dre l'équation et déterminer les différents coefficients a,, al,
a2, etc...

Toutefois seules les constantes K, a0 et a1 peuvent avoir une signi-

fication biologique, et c'est le principal défaut de ce modele que de
ne pas donner d'explication physiologique au ralentissement du taux
de croissance.

Lorsque la source d'énergie et de carbone disparaft du milieu de cul-

ture, la lyse du mycélium se produit et la concentration cellulaire
diminue (48). La lyse peut être évitée en rajoutant la source de car-
bone â faible vitesse, dénommé; "vitesse de maintenance" (39). Il
existerait donc une consommation de la source de carbone pour mainte-
nir la croissance nulle. Les cultures en croissance possèderaient
également une consommation dite de maintenance en plus de la consom-
mation de croissance (49) (50), ce qui se traduit par l'équation :

i-S= A.2 tm. X L-1

Y dt

avec :

S : concentration de substrat

Y : coefficient de rendement cellulaire

m : coefficient de maintenance

Il apparaît d'après l'équation 10, largement vérifiée par l'expérien-

ce, que l'importance de la consommation de maintenance augmente lors-
que le taux de croissance diminue.

L'interprétation de la consommation de maintenance est très controver-

sée. Pour PIRT (51) il s'agit de l'énergie nécessaire au turnover des
protéines, au travail contre les forces osmotiques ou pour effectuer
les transports actifs. Pour SENEZ (52) cette consommation s'explique
par le découplage énergétique et la différence entre la vitesse du
catabolisme et celle de l'anabolisme.
 21

Pour les bactéries le coefficient de maintenance est généralement

faible.ou négligeable pendant la phase de croissance rapide (28).
Par (antre les champignons se développant beaucoup plus lentement,
une partie non négligeable,de l'énergie est utilisée pour la mainte-
nance. R'GHELAT,O & Coll. (39). ont montré que pour PWcU.Gun
&w.+,ogenum; 1C 40 du substrat carboné est utilisé pour la maintenan-
ce lorsque la croissance est maximum. Lorsque la croissance est limi-
tée cela peut représenter jusqu'à 70 % du glucose utilisé.

3 - CUNCLUSIONS

On s'aperçoit qu'en consultant la littérature on est amené a faire

un certain nombre de remarques :

On dispose d'un nombre important de resultats concernant la biochi-

mie et la physi,ologie des champignons filamenteux.

Ces resultats ont et6 acquis presque exclusivement grke a des

techniques de culture en milieu liquide mises au point pour l'btude
des microorganismes unicellulaires,mais pas toujours bien adaptees
aux organismes filamenteux.

En ce qui concerne les concepts cinétiques de la croissance des

champignons filamenteux plusieurs théories ont été proposées mais
aucune ne donne entièrement satisfaction :

- La théorie de croissance "exponentielle" tirée de la théorie de

multiplication des organismes unicellula4res ne tient pas compte
du vieillissement du mycélium et ne rend compte que d'une faible
partie de la croissance.

- La théorie de croissance "cubique" est spécifique d'une forme

particulière de croissance du mycélium dite en "pellets" qui tra-
duit une hétérogénéité du matériel cellulaire.
 22

- La theorie de croissance "IogistJque" rend compte d'un grand

nombre d'observations sur les croissances fongiques majs n'est pas
basée sur une hypothese physiologique ou biologique, et nécessite
l'utilisation d'un programme de calcul par ordinateur pour la déter-
mination des constantes et l'ajustement des résultats expërimentaux
à une courbe théorique.

- Enfin on ne dispose d'aucun modèle cinétique de croi'ssance des

champignons en milieu solide, et l'on ne sait pas si les modèles pro-
posés pour les cultures liquides sont utilisables.
 23

II. LES FERMENTATIONS EN MILIEU SOLIDE

Le terme "fermentation en milieu solide" est la traduction de

"Solid state fermentation" ou de "Solid substrate fermentation',
expressions employées par HESSELTINE (53) pour désigner "toute fer-
mentation dans laquelle le substrat n'est pas liquide". Nous dirons
plus précisément : les fermentations dans lesquelles le substrat
n'est ni solubilisé ni en suspension dans un grand volume d'eau.

Toutefois, en fonction de la dilution du substrat, on peut se deman-

der parfois oil commence le milieu solide et où finit le milieu liqui-
de ? Pour tenter de préciser ce concept, nous établirons un paralle-
le avec les milieux naturels, Les milieux liquides sont comparables
aux rivières, lacs ou océans. Les milieux solides sont comparables
aux terres meubles plus ou moins aérées qui possèdent une texture,
une structure, une granulomètrie et une porosité bien définies. Entre
ces deux types de milieux nous pouvons trouver des milieux "pâteux"
qui sont comparables â des boues de décantation, des sols de riziè-
res ou des sols hydromorphes gorgés d'eau, qui ne possèdent pas de
structure bien organisée.

Nous définirons ainsi les milieux solides, par opposition aux milieux
liquides, et pâteux, comme ceux pour lesquels le substrat n'est pas
liquide et possède une granulomètrie et une structure organisée.

Ces milieux peuvent donc être soit des sols aérés, des graines; de
ceréales, ou des produits végétaux, organiques ou minéraux granulés
ou fragmentés dans lesquels l'eau se trouve sous forme d'eau de
constitution, d'eau libre et d'eau liée par des forces de différentes
natures(covalentes, ioniques, hygroscopiques ou capillaires). En
aucun cas l'eau ne doit occuper la totalité des espaces libres et ne
doit s'écouler librement,
 24

Il s'agit en fait du type de milieux qui se rapproche le plus de

l'environnement habituel des champignons. Ils se prêtent bien à leur
mode de croissance par allongement apical et ramification, conduisant
à une exploration rapide de l'environnement de l'organisme sur de
grandes distances.

L'utilisation des fermentations sur substrat solide n'est pas récen-

te et de nombreuses fermentati'ons alimentaires basées sur ce princi-
pe ont été pratiquées traditionnellement depuis três longtemps. De
même les applications industrielles des fermentations solides ont
largement contribué au développement de la microbiologie industriel-
le.

2 - LES FEREENTATïONS AllME,VTAIRES 7RAVlf70NNELLES

La production de Roquefort à partir du lait de brebis date d'environ

1.000 ans. Ce n'est pourtant que vers 1930 que le rôle des champi-
gnons a été reconnu et que THOM (-54) a montré que tous les champi-
gnons qui se développent dans les fromages du type "bleus" étaient
des souches d!un même organisme PeniWm ha+edotr;ti, un des
rares champignons à pouvoir se développer sous des conditions de li-
mitation d'oxygène dans les espaces libres a l'intérieur du lait
caillé. Dans les autres types de fromages : camembert, Brie, les
champignons concernés P. ccuwmbeti et P. ca6eicokm se développent
essentiellement à la surface du lait caillé.
 25

2.2. Champignoti eom~a%bles

Les premières tentatives pour cultiver des champignons comestibles

ont eu lieu en France sous le règne de Louis XIV. Les caves de Paris
fournissaient un environnement favorable et sont encore largement
utilisées actuellement. Dans les 10 ou 20 dernières années la cultu-
re artisanale des champignons a donné lieu à une technologie sophis-
tiquée qui,comme pour d'autres activités agro-industrielles, a révo-
lutionné les habitudes sociales. Alors que ces champignons étaient '
considérés comme des denrées de luxe, ils sont maintenant régulière-
ment consommés aussi bien dans les foyers que dans les restaurants.
Le développement de cette technique s'est produit non seulement dans
les pays qui,produisaient traditionnellement des champignons comme
la France, les U.S.A. et l'Angleterre mais également dans de nouveaux
pays comme l'Australie, Taïwan et la Nouvelle Zélande. La culture
des champignons se développe aussi actuellement en Chine, en Amérique
du Sud ou en Corée. La production mondiale dépasse actuellement
400.000 tonnes par an et augmente régulièrement.

2.2.1. CmnQnon. de couche A. b&potrw

" """""""_""""""""""""" """"

L'exploitation industrielle concerne presqu'exclusivement les especes

d'Ag&cw bhpokti de la famille des Agaricaceae dans la classe des
Basidiomycetes.

Les techniques de production d'Ag&cud b&poeud ainsi que les pro-

blemes posés ont&? largement décrits par HAYES et NAIR (55). La pro-
duction d'un inoculum de culture pure est essentiel pour la réussite
de la culture commerciale.

La production d'inoculum d'A. bhpohti selon la technique de SINDEN

(56).est maintenant universellement utilisée comme moyen de multipli-
cation vegetative du mycélium de champignon. Cette méthode utilise
des graines de céréales (seigle, blé, mil) comme substrat. Les grai-
nes auxquelles on ajoute de l'eau et de la craie constituent un
 26

substrat selfde et les techniques de cultures sont semblables d

celles des autres types de fermentations en milieu solide,

La production de "graines d'inoculation" est maintenant un proc6dé

généralise et mécanisé. L'application des techniques modernes d'asep-
tie éliminent les contaminations qui se produisaient généralement
lorsque le fumier était utilisé comme substrat.

Ces graines d'inoculation constituent un moyen très pratique car

elles peuvent être distribuées facilement et améliorent nettement
les possibilités d'inoculation des composts.

Les champignons sont produits par culture sur des composts pasteuri-
~6s et inoculés qui sont genéralement prépargs a partir de paille
de blé et de fumier de cheval. La preparation de ces composts est
probablement l'etape la plus difficile d réaliser.

Dans detbonnes conditions les cultures d'A. btipohti restent sous

forme vëgétative pendant au moins 28 jours avant de fructifier.
Cette fructification se fait par vagues à des intervalles d'une se-
maine environ. La production s'arrête après 5 à 6 semaJnes.

2.2.2. Chcut@gnon
“““” ” “““_““”de paille
“““““““““““”de. JLLZ : “““-““““-“““““”
Uo.&ake&!a VOL-

vacea
“““_”

Une étude complète concernant ce genre a été décrite par SINGER (57).
Quoique ce champignon ait été cultivé traditionnellement en Chine
depui.s des siecles, la culture sur une large ëchelle ne devient pos-
sible que maintenant.

Le substrat habituel est la paille de rit, mais les résidus de la

fabrication du tapioca sont également utilisés. La technique de pré-
paration du substrat est simple : la paille de riz est imbibée d'eau
par immersion, puis est mise en tas sur le sol. Le tas est mis en
couches qui sont toutes inoculées avec une culture pure de
 27

V. waRvaeea cultivée sur paille stérilisée.

Apres 12 jours la fructification se produit et fournit 6 à 7 kg de

champignon pour 100 kg de substrat. La technique a été amélioree
et HO (58) décrit une technique qui permet de doubler la production
soit 10 - 15 kg/100 kg de paille, ce qui prouve la potentialité de
ces espèces tropicales.

D'autres champignons comestibles sont cultivés à des fins commercia-

les (truffes, pleurotes) et sont susceptibles de se développer de
façon importantes (59). Les succès de telles industrialisations dé-
pendront de nombreux facteurs parmi lesquels la nature et la crois-
sance du champignon cultivé jouent un rôle important. Ainsi la
connaissance de la physiologie et de la croissance sera capitale et
permettra d'envisager éventuellement l'exploitation d'autres champi-
gnons comme les bolets ou les morilles (57).

Il existe un très grand nombre de fermentations traditionnelles qui

sont pratiquées en Chine, en Corée, au Japon et dans le Sud Est
Asiatique. Differents auteurs (10, 11, 13, 60) ont passe en revue
ces différentes préparations dont la liste, vraisemblablement non
exhaustive, s'eleve a plus de 80.

Parmi ces differents auteurs il est nêcessaire de souligner les

importants travaux de HESSELTINE et de ses collaborateurs qui a con-
tribue plus que tout autre à informer les scientifiques des pays
occidentaux au sujet de ces fermentations pratiquées en Asie et a
demontrer leur adaptation a des fabrications et utilisations en
Occident (10, 53, 61, 62, 63).

Il existe également un nombre important de fermentations alimentaires

en Afrique et en Amérique Latine. Cependant la littérature à ce su-
jet est bien moins abondante. Nous citerons cependant des fermenta-
tiens importantes I basa de manioc, comme l'attiokti, et le gwi qui
sent des sorteâ de cowcouç fermentl~.

Rappelons que le but de toutes ces fermentations n'est pas d'augmen-

ter la quantite de proteines dans les aliments, mais d'ameliorer
les possibilités de conservation, de changer leurs propriétes physi-
ques, leur couleur, leur odeur ou leurs saveurs. De nombreux produits
tels que les graines de soja ont été fermentés essentiellement pour
obtenir une meilleur odeur ou pour eliminer une odeur désagreable.
D'autre part, ces fermentations permettant d'6liminer des facteurs
antinutritionnels augmentent considerablement la digestibilite de
certains produits végétaux tels que les graines de soja.

Un trait commun a la plupart de ces fermentations traditionnelles

réside dans le fait qu'elles comportent géneralement au moins une é-
tape de fermentation sur substrat solide, et que les champignons
filamenteux y jouent un rôle essentiel sinon exclusif.

Sur le tableau II, nous avons décrit sommairement quelques unes de

ces fermentations asiatiques avec le nom du produit, le substrat
initial et le ou les organismes impliqués.

Ces fermentations traditionnelles présentent de nombreux avantages

du point de vue nutritionnel :
 29

p.“.“.“- --m

! !
{ Nom du produit j Substrat Mfcroorganisme
! !
! ! AnpettcjUw ohyzae, levure et i
; Shoyu blé et soja
! ! Lac&ba&ti
! ! ! !
, Miso ! riz et soja l AbpengiUun otLyzae et
!
Sacckahomycen nouti I
! !
! Natto I soja F3acaw n Ub.titib !
! ! !
Tempeh' soja Rltizopw o~i~oci~x~U~5
1 I I !
! Sufu soja ! Atinomuca& e&gati
! !
! Hamanatto ! soja ! Abpwg&Yun ckyzae I
! ! !
i Koji blé et riz AbpengU!w ohyzne
! I !
! Ontjom -arachide ! Newtobpotra btiapkXa
! !
! Katsuobushi ! poisson ! Ahpe,tgi..k&U4 &kUUh I

! ! !
non déterminé
!
Bagoong poisson
! I ! !
! Nuoc-mam poisson ! bactérie halophile
! !
I ! 1 I

I !

Tab&au II - LU ptinc&a~x pkodti ,$ehmetién a4iatique.h

(be-eon HESSELTINE & WANG (11)
- product;fofl d'enzymeo digestIfs (amy'lEises, eollulase, prot&ses,
pfxtlnases ( 1 loast%)

- destruction de qoGts et d'odeurs indésirables

- introduction de goilts et d'odeurs agréables

- conservation

- production de vitamines

- augmentation de la digestibilité

Parmi les innombrables préparations, nous insisterons plus particu-

lièrement sur 3 d'entre elles qui présentent un intérêt particulier :

- le koji parce que c'est une fermentation fongique sur substrat

amylacé d'une importance capitale pour de nombreuses autres fermenta-
tions et à cause des aoplications industrielles qui en ont été tirées.

- le tempeh qui a été plus particulièrement étudié et pour lequel

des procédés de fabrication ont été mis au point.

- l'ontjom qui est une fermentation à base de tourteaux d'arachide

obtenus après extraction de l'huile.

2.3.1. le K0j.i-
---_-

Le Koji est une étape commune à la plupart des fermentations alimen-

taires asiatiques. C'est une préparation qui consiste à faire pousser
un champignon sur céréales étuvées (riz, blé, ou graines de soja). La
fonction initiale du koji est d'être une source d'enzymes pour trans-
former les constituants végétaux en composés plus simples. C'est habi-
tuellement la première étape d'un procédé impliquant une seconde
fermentation. Le koji a donc le même rôle vis-à-vis des fermentations
orientales que le malt dans la fermentation alcoolique des graines en
brasserie. Le champignon habituellement utilisé est Abpetrg,GYun o&!zac
ou A. bcyo.e quoioue d'autres champignons comme des espèces produi-
sant des spores noires du genre Adpckg2& ou Rfiz0pu.s puissent être
utilisées.

D'une façon générale la fabrication du koji comporte les étapes

suivantes :

- La souche de champignon (A. ohyzae) est conservée sur gélose

inclinée à base d'amidon de riz, sous forme sporulée.

- La fabrication du koji "starter" - Les spores sont mises en sus-

pension dans l'eau stérile et la suspension de spores est utilisée
pour inoculer du riz cuit à la vapeur.

- Quand la croissance est suffisante le koji - starter est ajoute

au substrat solide a fermenter (riz, son de b'l8, graines de soja,
seuls' ou en melange) 8 raison de 1 8 10 L.

- Le mélange contenant 30 à 50 % d'eau est placé dans des sacs ou des

plateaux sur 4 à 10 cm d'épaisseur et placé dans des chambres d'in-
cubation à 25 - 35" C. Dans ces conditions, la croissance est rapi-
de et une quantité de chaleur importante est produite. Des tempéra-
tures supérieures à 40' C ne doivent pas être dépassées, ce qui
'nécessite le refroidissement du koji par un brassage du produit
et la régulation de la température et de l'humidité de l'atmosphère.

Pendant cette période le champignon se développe en utilisant les

produits à bas poids moléculaire présents dans le substrat, et secrète
différentes enzymes extracellulaires {amylases, protéases, invertases,
lipases et cellulases). La durée d'incubation est un facteur impor-
tant. Si elle est trop courte la croissance est insuffisante et la
production d'enzymes extracellulaires n'est pas bonne. Une incubation
troo longue entraîne la sporulation, et une dénaturation du produit.
A partir de graines de soja, une incubation trop longue entraîne un
dégagement important d'ammoniac _ Dans la pratique, 3 jours est une
durée optimale pour 7e développement du koj-i.
 32

Le tra4temont ulterleur de la masse,couverte de champignon,ddpend du

type de fermentation. En g&Gral cette seconde Etape vise a stopper
le développement du champignon, tandis que les enzymes extracellu-
laires peuvent continuer à agir pour hydrolyser les protéines et les
polysaccharides. Cette seconde étape est souvent anaérobie.

2.3.2. -Le_ ._&myc?k

- - - _- .

Tandis que les produits des fermentations à base de koji (sauce de

soja, miso) sont utilisés comme condiments pour donner du goût aux
aliments, le tempeh et l'ontjom, qui sont des fermentations indoné-
siennes, semblent contribuer de façon quantitative aux rations alimen-
taires humaines.

Le tempeh est fabriqué à partir de graines de soja avec une souche

de Rltizopun otigoclpo&ti (61).

Le principe de cette fermentation consiste à faire gonfler les grai-

nes de soja dans l'eau à '25' C pendant deux heures et à les cuire
pendant 30 mn. L'eau est ensuite eliminée et les graines cuites sont
refroidies. Le produit est alors inoculé avec des spores de
R. o.Cigoapow et légèrement entassé sur des plateaux ou autres con-
tainers. L'incubation se poursuit pendant 20 - 24 h à 31" C. A la
fin de l'incubation les morceaux de soja sont pris en masse et enva-
his par le mycélium sous la forme d'un gâteau solide qui peut être
coupé en tranches comme du pain. Les procédés de cuisson recommandés
consistent à rôtir les tranches ou a Tes faire frire dans T'huiTe
végétale.

R. ofigo?potrun n'utilise pas le saccharose (69) et doit se dévelop-

per d'abord aux dépens des lipides et protides présents dans les
graines ; pour cela il secrète des lipases et des protéinases très
actives.
 33

2. 3. 3. L'oLzfjott?
,..---- ..__

Il semble que le procédé soit assez similaire pour la production

du Ontjom, mais en partant de gâteaux d'arachickaprës extraction
de l'huile et en utilisant une souche de Newro&poka dMopkiEd (70).
Dans ce type de fermentation,la sporulation se produit normalement
et provoque la couleur rose du-produit final. HESSELTINE note que
c'est le seul cas qu'il connaisse où une souche de Neukocrpatra est
utilisée pour la fabrication d'aliment.

Un autre point intéressant de cette dernière fabrication, est qu'elle

est basée sur le développement d'un champignon sur un tourteau d'ara-
chide. Maintenant que l'on connait les problèmes posés par la produc-
tion d'aflatoxines lors de la contamination des tourteaux par
Aspeag.i&?ti @avu&, on peut s'étonner que de telles fermentations
traditionnelles, pratiquées sans aucune précaution d'aseptie, aient
été utilisées en alimentation humaine depuis si longtempssans inconvé-
nients sanitaires.

Toutes ces fermentations sont encore assez mal connues et posent

encore de nombreuses énigmes au biochimiste, au microbiologiste et
au nutritioniste.
En dehors de la fabrication d'aliments fermentés,nui dans certains
cas sont produits industriellement (koji, miso, sauce de soja,
tempeh) et essentiellement au Japon, les fermentations en milieu so-
lide ont donné lieu à différentes applications industrielles pour la
production d'enzymes ou de métabolites. La plupart de ces applications
industrielles découlent assez directement des procédés traditionnels
et ont pour l'essentiel été mis au point et développés au Japon. Les
principales applications concernent la production d'enzymes (amyla-
ses, cellulases) à partir du procédé Koji, la production d'acide
gallique et d'acide citrique par Ahpehg.X& nigti et nlus récemment
la production de mycotoxines.

3. 7. Ptioduction~ d’ enzyne6

3.7.1. AmyPbrieb
_- -----

L'introduction du "procédé Koji" dans nos pays occidentaux est dûe

essentiellement aux travaux de Takamine qui a développé un procédé
de fabrication sur grande échelle (71).

Ce procédé est basé sur la croissance d'A. ohyzae non plus uniquement
sur du riz comme dans le cas du koji "starter" mais avec du son de
blé. Un mélange de son de blé et d'amidon (blé, riz ou maïs) est hu-
midifié avec son poids d'une solution contenant des éléments miné-
raux et de l'acide chlorhydrique. La masse humide est disposée en
couche mince sur des plateaux métalliques dont le fond est souvent
constitué par une grille permettant une meilleure aération.

Après stérilisation et cuisson à la vapeur,les plateaux sont ensemen-

cés avec une suspension de spores d'A. okgzae et placés dans une
étuve à 30" C et à humidité contrôlée pendant plusieurs jours. On
atteint un développement abondant du mycëlium ainsi qu'une sporula-
tion intense. La masse totale du produit est alors simplement séchee
et broyée. La poudre obtenue est mélangée avec un matériau pulvéru-
lent inerte pour diluer l'activité de façon normalisée. Ce mélange
convient à des emplois industriels mais pour certaines applications
nécessitant des enzymes plus pures, la masse mycélienne est extraite
à l'eau et filtrée ; les enzymes sont alors récupérées par précipita-
tion. La figure 1 résume la technologie de ce procédé connu également
sous le terme "Mouldy bran process" (72, 73).

son humidifié

Figuhe 1 - Phodution d’cung.tane pan cu&~e UJL 6ubsW boJZ.Lde

bwLp.tateaux - A : conwogeuh; 8 : ctiewr;
C : E;tuve à ptateaux‘ ; V : ven~ateuh a ain chaud
et hum.idi@i ; E : &nneC de hèchage ; F : bhogeuh
ek tnétatzg euh.
û’apkès STMON f MElfNlER (76)
 36

Une variante de ce Drocedë conçu oar TAKALIINE (15) a &të prooosëe par
différents auteurs (74,75), de façon à supprimer le remplissage
et la récole des plateaux. Elle consiste à placer le Droduit dans un
cylindre métallique tournant lentement (1 tour/mn) autour de son axe
horizontal de façon à exposer successivement tout le substrat à l'air
et à homogénéiser le produit.

3.7.2. Ceuukanes
_-__------

Les cellulases sont utilisées comme supplément dans des rations ali-
mentaires du b&tail, comme aide digestive, pour l'isolement de pro-
Sines vG@tales et la préparation de produits alimentaires (97,
78). Maigri? ces diverses utilisations potentielles, la saccharifica-
tion de la cellulose par les cellulases reste un procbdê de labora-
toire. En effet les preparations obtenues 6 partir de cultures de
fxichodetunn cer~&elet d’A. @eh ne sont aaç suffisamment actives, et
les cellulases produites sont d'un prix de revient trop éleve.

Récemment TOYAMA (79) a décrit un procëdë de culture de T. Le.a&

(anciennement T. utide) pour 'la préparation de
produit à haute activitë cellulasique. La technique consiste â
cultiver T.&cenci sur un milieu solide composé essentiellement de
paille de riz et de $erme de b'l6 (ou de riz) dans un rapport de 8/2.
L'incubation à 25 - 30" C dure quatre jours. Une activit6 de 1.500
unites FtlP/mg (vitesse de dkomposition du papier filtre) est ainsi
obtenue. La masse du produit fermenté peut être extraite dans 3 vo-
lumes d'eau ce qui fournit une solution ayant une forte activité
cellulasique. L'auteur prëcise qu'il ne copnaît pas la raison exacte
qui fait que les procëdés de culture en milieu solide sont ainsi
appropriés à la production de cellulase.

De tels procédés de culture sur substrats solides, basés sur la tech-

nique de production de koji, ont été développés au Japon et seraient
utilisés industriellement pour la production d'amylases, mais égale-
ment pour la production de cellulases (figures 2 et 3).D'autres types

de fermenteurs tubulaires agités ont également e-té proposes (121).

 37

-
air ’ conditionné I
convoyeur

Figuke 3 - Appcu&t a.u.tomu,t-Quea chambhe wta.Cve pawr u.uXw~e en

m.Xleu hoUde : podution de Koji et p&Gpcuration de
ce.&&ue de 7. u&de. (D’apkb RWAMA (79)
 48

De nombreuses autres enzymes sont produites industriellement parmi

lesquelles on trouve les proteases, les pectinases, les lipases.
Le tableau III indique les enzymes produites, les organismes pro-
ducteurs et le type de culture utilise. Dans ce tableau la technique
de surface est synonyme de fermentation sur substrat solide et la
technique de profondeur est synonyme de fermentation en milieu liqui-
de agité. En consultant ce tableau, on doit constater avec SIMON et
MEUNIER (76j que ies inciustrfes prcd::isunt 1%plupart des enzymes
citées semblent avoir conservé leurs anciennes techniques de fabrica-
tion en milieu solide, malgré les utilisations industrielles accrues
et ies tonnayés importants qui sont prokits.
! I
! Types d'enzymes ! Microorganismes utilisés ! Techniiwer employées Utilisation
I ! ! I !
! !
! Amylases A~piq4iL"~ CZICAL' ! Surface et @rofonde"r ! Saccharification de l'amidon
I I !
A. sjtncrr,, rc,pç‘l,$.~zti, IligL'l ! Surface ! Boulanrerie, conserve de fruits ;
! I I !
! textiles ; papeterie
I I ! I I
. R/&yxJ Surface . Industries alimentaires
I I !
. Eac‘ccw ,ubtieiJ ! Surface ! Idem
I ! I 1 !
I ! ! !
. :nvertases S. caiCb.z’igcmw ! Surface Confiserie
I I I
I
! Prot&N?s ! 4. czyruc, FLmu,, hxl ! Surface I Hydrolyse de protéines et de la
! I ! I !
. C. acetr'bu.iyCicurn Surface ' gélatine
! 1
! 6. $ubtX*d ! Surface ! Clarification de la bière
I t ! I
. PJ. put<da ! Surface Tannerie
I ! ! I
C&sthidum w. ! Surface 6lancheri;se
!-.A-- ! ! ! !
I I !
! Cellulases ’ T’&lu~dcma t@u,lgi ! Surface et wofondeur ' Dégradation des aliments cellulosiques
1 ! 1 !
bly‘Luth~ciun ve'i%xmillN ! Textiles
I I ! I !
I !
! Pcctinases (mW.hylI I\bp~tg~ü~~ ip. ! Surface ' Clarification jus de fruits et des
I ! , !
' estërases ; poly- Pcaic*CLim 6~. ! Surface vins ; industiie textile ; acc1210ra-
! I !
! galacturonase) Bettyti5 qA ! s"rface ' tion des filtrations
I ! I I I

! Lactases ! Ccudida )mud&o~icd~ ! Surface

] ! crè!!Es glacëes
!
! I I I !
! Lipases ! Cmtdcda CipuCytica ; Surface et nrofondeur ; Fromagerie ; laiterie !
I 1 I I !
! Dextransucrase ; L. m2d~lticzoides ! Profondeur ! Production dextrane et fructose
!
I I a r ! I

! 1 I !
! Glucoxydase P. liO&ltatUm . Profondeur . Emballages orives d'oxygène
! ! ! ! I
Industries alimentaires
I ! ! !
I ! !
! Penicillinase 8. abtili’, 6. a~&wci~ ' Fi-ofondeur Destruction de le pënicilline
I 1 l ! !
-
1 I
! Srreptokynase ! A. caridi&&, 8. CPII~(IX '! Profondeur . Usages médicaux
1 ! ! ! !
I I I !
Streptodornase ’ St. hcwQkc*L) ' Profondeur Usages médicaux !
, r I ! !
! I !
Catdlase AciXobzctc>i p’~.w/dana . Profondeur Fabrication de matériaux poreux !
I L ! 1
-. . --- -- -.-- ---.. -.----- _._.__ _________-
L'acide gallique, qui est utilise pour le tannage des peaux et en
imprimerie, est trouvé naturellement sous forme d'esters et de glu-
cosides dans des plantes dites à tannin. Il est préparé soit par
hydrolyse chimique soit par hydrolyse enzymatique.

Dans une ancienne technique de production, les noix de galle sont

mises en 'tas et humidifiées avec de l'eau. Le développement fongi-
que se produit et après un mois environ l'acide gallique est extrait
par lessivage.

C'-est Van TIEGHEM (80) en 1867 qui a montré le premier l'importance

industrlelle d'Aaptig.kYb nigen lorsqu"i1 a identifié CA champignon
responsable de la fermentation de l'acide gallique et qu'il lui a
donné son nom.

La production microbienne d'acide gallique à partir de tannins est

encore utilisée et récemment IKEDA & coll. (81) ont montré qu' A.
tiges. est toujours le microorganisme le plus efficient.

3.2.2. Acide
-------_-_-tique --

En terme de tonnage l'acide citrique est le p'lus important produit

commercial fabriqué à partir des champignons. La production mondiale
dépasse en effet 90.000 tonnes par an. En pratique c'est A. ncge&
ou un de ses mutants qui est utilisé.

Trois procédés commerciaux sont utilisés pour la production d'acide

citrique :le procédé de fermentation "koji", la culture de surface
sur milieu liquide et la fermentation.en milieu liquide agité. Ces
procédés ont été tenus dans le secret et peu de descriptions dé-
taillées ont été'publiées, à part les brevets qui ne fournissent que
 40

peu d'~ndieettons. Nous insisterons plus perticu94&anent sur la

technJque de fermentation SUP substrat solide qui a &tl dlvelopple
eçsez rkemment au Japon (82).

Ce procédé relativement simple consiste à cultiver une souche

d'A, nigen sur des résidus amylacés fibreux (résidus de pomme de :
terre, son de blé). Puisque ces. résidus contiennent ..: . . ,Y'
du fer, du manganèse, du cobalt ou du nickel qui inhibent la for-
mation ou l'accumulation d'acide citrique (83, 84, 85), des sou-
ches d'A. niget très peu sensibles aux traces de ces ions métalli-
ques ont.été sélectionnées. Pendant l'incubation l'amidon est
hydrolysé par l'amylase d'A. nXgerr et une grande partie du sucre
est convertieen acide citrique.

La température dans la masse ne doit pas dépasser 28°C. Le pH chute

à 1,8 - 2,0 lors de l'accumulation d'acide citrique. Apr<es 5 a 8
jours la masse fermentée est extraite à l'eau dans des percolateurs
et l'acide citrique est purifié selon Ies procédés cIassiques. Envi-
ron 2.500 tonnes d'acide citrique Se+nt fabriquées annuellement au
Japon par cette méthode.

3.3.3. Mwotutines
_s__--_____

Récemment aux Etats-Unis HESSELTINE et autres chercheurs ont utili-

sé la technique de fermentation sur substrat solide pour la produc-
tion d'aflatoxine et d'ochratoxine (53, 86). Ces auteurs ont pu
produire jusqu'à 1 g de mycotoxine/kg de substrat lorsque le
champignon est cultivé sur riz à de faibles humidités, alors que la
production ne dépasse pas 1 mg/litré en culture liquide agité.

Cette production de mycotoxine par culture en milieu solide ,est

conditionnée par une faible teneur en eau du substrat (30 - 25 %
d'eau), une carence en sels minéraux pour la croissance (pas d'ad-
dition de phosphate, ni d'azote) et à une agitation permanente du
substrat (graines de riz ou de blé). Il est en .effet essentiel
 41

que les graines restent individualiseas et qu'il n'y ait pas de pri-
se en mass@.

Pendant les deux premiers jours on observe un leger developpement

de mycélium a la surface des grains, le troisième jour une colora-
tion jaune se développe et après 5 â 6 jours la production de myco-
toxine est maximum.

A notre connaissance cette technique est pratiquee uniquement à

l'echelle du laboratoire sur des quanti% de quelques centaines
de grammes de substrat seulement. D'autre part, et comme pour la
majorite des techniques de fermentations sur substrats solides, si
les conditions particulieres de production sont assez bien décrites,
les exp'lications physiologiques et les mécanismes impliqués dans
ces régulations sont encore incompris.

4 - P??.CDUCTZON
D'ALIMENTS FERMENTESENR'ICHIS EN PROTEIW
(A.F.E.P.1

Dans le cadre des recherches portant d'une part sur l'exploration

des nouvelles sources de prot&ines alimentaires et d'autre part sur
les bioconversions des residus agro-alimentaires permettant a la
fois de valoriser ces dbchets et de reduire les sources de pollution,
des études sont entreprises dans différents pays pour utiliser dans
cette optique la croissance des champignons sur des substrats soli-
des.

En effet, les techniques de culture en milieu liquide agité néces-

sitent des investissements importants, des coQts de fonctionnement
eleves et des échelles de productions industrielles souvent mal
adaptées a ce type de substrat dispersg. D'autre part, la faible
valeur ajoutée des produits (protéines, rêduction de la pollution)
et le Co(lt, non négligeable des substrats agricoles mêmes résiduels
impliquent la recherche de procédes de transformation peu coateux,
simples et rustiques.
 42

La fermentation sur substrat solide pourrait être une solution à ce

problème, â condition qu'elle soit praticable, et que des recherches
soient entreprises pour resoudre les problèmes poses et comprendre
les mécatiismes impliqués.

Les residus agricoles cellulosiques (pailles de céréales, bagasse

de canne à sucre, cosses d'arachides, etc...) représentent chaque
année des.tonnages tres importants estimes à plus de 200 millions
de tonnes. Les pailles contiennent des composés tels que la cellulo-
se ou des hÉwicelluloses qui pourraient Otre utilises en tant qu'a-
liments pour le betail ruminant. Malheureusement, leur faible valeur
digestive dDe a la P&ence de lignine et leur faible teneur en
protéines en font des aliments peu efficaces. Differentes mêthodes
de traitement physico-chimiques ont été proposées telles que le
traitement à la soude ou l'addition d'urée. De plus des essais de
production de protéines par fermentation en milieu liquide ont été
étud.iés. Ces différentes méthodes sont trop coûteuses et n'améliorent
pas toujours la valeur alimentaire ou la digestibilité de façon suf-
fisante.

HAN et ANDERSON (87) ont étudié la possibilite de cultiver une sou-

che de T. wXcle sur paille en milieu solide et ont trouvé une aug-
mentation sensible de la teneur en protéines qui passe de 3 40 dans
le substrat initial à 13 ou 14 % dans le substrat final, Ce sont es-
sentiellement les hémicelluloses qui sont utilisées et la perte pondé-
rale entraîne une augmentation de lateneur en lignine (de 6 â 9,8 %)
La valeur digestive après fermentation passe de 33 % â 44 %.

Les principaux obstacles viennent de la difficulté à hydrolyser la

cellulose en glucides assimilables, du manque de microorganismes ca-
pables de se multiplier rapidement à partir de substrats cellulosi-
ques, et du manque de traitement efficace permettant de rendre la
cellulose amorphe et facilement accessible. Toutefois les recherches
sont poursuivies activement.en vue de produire des protéines a partir
de substrats cellulosiques solides (122, 123).
 43

4.2, Sub&-a& am&wé4

Les substrats amylaces sont plus facilement utilises par de nombreux

microorganismes amylolytiques, parmi lesquels on trouve des champi-
gnons filamenteux qui possedent des vitesses de croissance relative-
ment elevées.

Les substrats amylaces sont également tres abondants et les rende-

ments des cultures.sont Blévés. On en trouve aussi bien dans les
pays tempe& (pomme de terre, mals) que dans les pays tropicaux
(manioc, bananes) deficients en prot@nes alimentaires.

Differents laboratoires ont tente d'enrichir des substrats amylacês

en protéines par fermentation en milieu solide. BROOK et coll. (8)'
ont tente d'adapter la technique de fabrication du tempeh pour enri-
chir du manioc, mais ont obtenu une très faible augmentation de la
teneur en proteines (3 à 4 %), VEZINHET et coll. (9) ont cultive une
souche de RUzopti a~ltlûzud sur du blé en milieu pâteux ; ils n'ont
également obtenu qu'une très faible augmentation de la quantité de
protéines.

Ces résultats pèu-concluants résultent de ce que les conditions

d'aération, de pH et de température nécessaires à une bonne croissan-
ce aérobie,ne sont pas maintenues euffisatmnent longtemps, et tradui-
sent le manque de connaissances dans la conduite et le contrale des
fermentations en milieu solide.

Depuis 1974 l'O.R.S.T.O.M. et l'I.R.CH.A., avec l'aide financiere de

la D.G.R.S.T., ont poursuivl en commun des recherches visant à amélio-
rer les connaissances dans le domaine des fermentations solides et a
mettre au point un procédé efficace d'enrichissement de substrats
amylacés en protéines pour l'alimentation animale. C'est particulie-
rement dans cette optique que nous avons réalisé ce travail, et nous
verrons plus loin les solutions que nous'avons pu apporter.
 Afin de mettre au point une technique de culture spécifique
permettant d'étudier et de contrôler la croissance et le métabolisme
d'un champignon dans sa phase de développement végétatif, nous avons
dû tenir compte des caractéristiques et des dïfficultés inhérentes
à la croissance sur substrats solides. Nous allons tout d'abord com-
parer les avantages et les inconvénients des cultures de champignons
filamenteux sur milieux liquide et solide, puis analyser les problè-
mes essentiels des fermentations sur substrats solides, qui résident.
dans la nature et le conditionnement du substrat, l'élimination des
calories, le maintien des conditions optimales et la disponibilité
de l'eau.

La culture des champignons filamenteux en milieu liquide agité est

désormais d'une pratique courante et a donné lieu â des applications
industrielles importantes pour la production de pénicilline, d'enzy-
mes et de métabolites biologiqtement actifs d'intérëts pharmaceuti-
ques. L'importance de tels procédés ne fera sans doute que s'accroî-
tre dans l'avenir surtout pour la fabrication de produits biologi-
ques à haute valeur ajoutée.

Les connaissances aussi bien ph&i:ologiques que technologiques dans

ce domaine sont importantes comme en témoignent les très nombreuses
réfërences bibliographiques. Toutefois la culture des champignons
en milieu liquide n'est pas sans poser de problèmes, comme nous
l'avons remarqué lors du passage en revue des différentes théories
de la croissance qui ne donnent pas entièrement satisfaction.
D'autre Part le mode de croissance et la nature de ces microorganis-
mes tendent à augmenter la viscosité des milieux qui rend plus
difficiles le transfert d'oxygene, l'agitation et l'homogénéisation
de tels milieux. Cela tend ains à diminuer l'efficacité des appa-
reillages classiques, mis au pû nt initialement pour les microorga-
 45

et la disponibilité de l'eau.

-. -_
!
! Culture ! Culture
!
1 liquide 1 solide
! ! !
! ! ! .!
Connaissances physiologiques nombreuses faibles
! ! ! !
Connaissances technologiques bonnes faibles
! ! ! !
! Maintien des conditions optimales l possibles ! difficile !
! ! !
Contrôle des paramètres bon difficile !
! i ! !
I Enzymes excrétées l diluées L concentrées L

! Volume des appareils ! élevé ! faible !

! ! ! !
Effluents à traiter oui non
! ! ! I
! Dépense d'énergie 1 imoortante 1 faible ..I
! Investissements ! ëlevës ! réduits !
I ! I !

'TabLe.au 7V - Avan&ged compahe6 du ~ehnentatioti e32 &eux Liquide

Qat lJoLi.de

5.2. Natwre ti aqxc;t du &.L~&JLLL~

Puisque les champignons sont des microorganismes aérobies, le premier

problème qui se pose est celui de l'aération. Le transfert d'oxygëne
dans un produit concentré semble au premier abord difficile et les
risques de fermentation anaérobie sont importants. Pour éviter cela,
le substrat solide ne devra pas être pâteux, mais se présenter sous
une forme telle qu'il permette la libre circulation de l'air et
donc être suffisamment poreux. Le développement du mycélium dépendra
de l'homogénéité de la répartion de l'inoculum et des sels minéraux
ajoutés dans la masse du substrat solide.
 46

nismes unicellulaires, et qui nécessitent des investissements élevés.

L' intérêt que l'on doit continuer â porter aux techniques

de culture liquide ne doit pas faire oublier les possibilités
offertes par les techniques de culture en milieu solide que l'on a
trop longtemps délaissées. Nous avons vu les nombreuses possibilités
d'application qu'elles offrent et dans certains cas elles peuvent
présenter de réels avantages dans la mesure où les appareils à met-
tre en oeuvre peuvent être moins sophistiqués et les investissements
beaucoup plus faibles.

Les fermentations en milieu solide ne nécessitent pas de conditions

aseptiques strictes et les substrats restant tri% concentrés, les
volumes des appareillages sont beaucoup plus rgduits. Les volumes
d'eau à traiter sont faibles et posent moins de probl8mes d'effluents
et de récupération des produits.

Dans un milieu solide, les enzymes excrétées par le champignon

restent concentrés dans une zone proche de l'organisme et ne sont pas
immédiatement diluées comme dans le cas des cultures liquides. Ces
vitesses de diffusion réduites rendent plus efficaces les enzymes,
mais peuvent conduire à une limitation en substrats dans la zone
considérée. Cependant les champignons filamenteux, contrairement aux
organismes unicellulaires, peuvent explorer rapidement leur environ-
nement grâce à leur mode de croissance et faire appel aux mécanismes
de transports cytoplasmiques pour véhiculer les substrats.

Sur le tableau IV nous avons résumé les avantages et les inconvé-

nients des deux types de culture. Les avantages des fermentations
solides reposent essentiellement sur des critères économiques. En
revanche les connaissances physiologiques et technologiques sont
bien moins avancées car les études fondamentales dans ce domaine sont
rares et'relativement récentes.

Les problèmes essentiels des fermentations sur substrats solides

résident principalement dans la nature du substrat, l'élimination
des calories, le maintien des conditions optimales de développement
 47

La rêhumectation d'une farine sèche avec une solution minérale conte-

nant des spores en suspension semble être une bonne solution car elle
permet une distribution dans la masse par les forces de succion (for-
ce capillaire et tension superficielle). La capacité d'absorption
et de rétention d'eau par le substrat sera donc un facteur important.

Le développement du mycélium dépendra également du degré de digesti-

bilité de l'amidon par le germe ou par son amylase. Un traitement
thermique doit donc être prévu pour Qélatiniser l'amidon. Toutefois
une cuisson trop poussée peut conduire à l'effondrement de la
structure de l'amidon avec formation de dextrines, et obtention
d'une pdte imperméable.

Ces paramètres dépendent des traitements physiques et du mode de

conditionnement du substrat solide avant la phase de croissance
(cuisson, séchage, granulation, extrusion, lyophilisation).
 48

Pour éviter les risques de contamination par les autres microorganis-

mes, il faut maintenir la souche utilisée dans des conditions favori-
sant son developpement au détriment des autres. Ceci peut être obtenu
grâce à une teneur en eau du produit et une humidité relative assez
faible pour empêcher le développement des bactéries ou des levures.
La tolerance des champignons aux pH acides et a des températures re-
lativement élevées peuvent également contribuer au développement
sélectif du mycélium.

Pour éviter les problèmes de compétition avec d'autres champignons,

une inoculation massive avec les spores de la souche étudiée doit
permettre à celle-ci de s'imposer d'emblée pour la compétition du
substrat.

Pour obtenir un développement végétatif homogène du mycélium il faut

non seulement maintenir les conditions optimales de croissance (tem-
pérature, aération, humidité, acidité) mais également contrôler la
différenciation du mycélium et empêcher la sporulation. Pour le main-
tien des conditions physico-chimiques le problème de l'évacuation des
calories et du contrôle du pH semblent particulièrement difficiles à
résoudre En effet la quantité de calories dégagées lors de la crois-
sance rapide d'un microorganisme aérqbie dans un milieu concentré peut
atteindre des niveaux tels que la température s'élève rapidement au-
dessus de la température limite de croissance de l'organisme. D'autre
part la possibilité de refroidissement par circulation d'eau dans le
milieu est difficile à pratiquer.
 49

Les problèmes de transferts de chaleur dans le substrat solide de-

vront être tout particulièrement étudiés et en particulier la capaci-
té calorifique du substrat, la conductivité thermique, les échanges
par conduction, convection, par changement d'état de l'eau et le
transfert de calories dans le flux gazeux.

Lorsque le substrat solide n'est ni agité ni homogéneisé pendant la

croissance, il semble difficile de contrôler le pH du milieu au cours
du développement.

Dans ces conditions le milieu devra être suffisamment tamponné pour

éviter les variations de pH trop importantes. Ceci peut Gtre obtenu
en ajoutant initialement un mélange de sel d'anonium et d'urée comme
source d'azote (88).

Le maintien des conditions optimales dépend essentiellement des

conditions de l'gnvironnement, du type d'appareillage et des réacteurs
utilisés ainsi que des prises de données possibles pour le controle
des paramètres. C'est dans ce domaine que les difficultés sont les
plus importantes car on dispose en définitive d'assez peu de rensei-
gnements concernant le contrôle des fermentations en milieu solide.

5.4. Vhpon.ib.ULtë de t’w

Contrairement aux fermentations en milieux liquides où l'eau est en

très ,large excès, la disponibilité et l'état de l'eau dans les
substrats soli'des est un facteur capital pour le développement des
microorganismes,

De nombreuses études ont été faites, dans le domaine de la conserva-

tion des aliments et'de leur biodégradabilité, concernant l'influence
de l'activité de l'eau sur les réactions enzymatiques et la croissan-
ce des microorganismes dans des substrats solides à faible teneur en
eau. Une étude particulièrement détaillée a été réalisée récemment
par BIZOT ti Coll. (89).
 50

L'eau possède plusieurs fonctions dans les produits biologiques :

- élément chimique participant aux réactions,

- milieu de diffusion (rôle solvant),
- constituant du matériel biologique.

Dans les produits à haute teneur en eau (70 à 99 %) on distingue

ainsi l'eau de constitution et l'eau intersticielle dont le comporte-
ment relève de la chimie des solutions et de la biologie cellulaire.

Dans les produits biologiques contenant moins de 50 % d'eau, celle-ci

n'apparaît pas sous forme de phase liquide mais constitue une phase
condensée particulière. Elle s'interprête en terme de thermodynamique
par des échanges et équilibres entre la vapeur d'eau de l'atmosphère
et l'eau physiquement liée (adsorbëe) aux macromolécules constituant
le produit. L'eau ainsi adsorbée presente un intérêt considérable
dans le cas des fermentations sur substrats solides.

Dans le cas de l'amidon la pen6tration et l'adsorption d'eau dans les

zones critallines est ainsi très limitée, et la plus grande partie de
l'eau se trouve dans les zones amorphes, adsorbée sur les sites po-
laires. MULTON (90) a calculé que dans le cas de l'amidon ayant une
teneur en eau de 40 %, il y a 5 à 6 molécules d'eau adsorbée par rési-
du glucose dans la zone amorphe.

Unaautre propriété intéressante du comportement de l'amidon, vis-à-

vis de l'eau est la "gélatinisation". L'amidon dispersé dans l'eau
(lait d'amidon) et chauffé voit sa structure cristalline détruite et
forme une solution plus ou moins visqueuse (empois d'amidon). Pendant
le refroidissement de la solution les.structures cristallines tendent
à se reformer et il y a apparition d'un gel (gélatinisation) plus ou
moins rapide : c'est le phénomène de "rétrogradation" de l'amidon.

Dans uteatmosphère déterminée il se produit un transfert entre l'eau

contenue dans le produit et celle contenue dans l'atmosphère. Le pro-
duit peut fixer de l'eau (adsorption) ou en perdre au profit de la
phase gazeuse (désorption ou.sèchage). L'état d'équilibre qui en ré-
 51

sulte peut être représenté sur un graphique dit courbe de sorption

(figure 4) qui comporteen ordonnée la teneur en eau du produit et en
abscisse l'humidité relative (H.R.) de la phase gazeuse au-dessus
du produit, ou l'activité de l'eau dans le produit (au).

eau
disponible

0 0,25 0,50 075 1 activité de l’eau

F.Lgwre4 - Combe de aohp.Con typique, seLon BT.?OT eA: co.W (891.

A : point cowupondant à la quana%? d’eau ~OJL&JW&
fpëe
8 : poht d’appaaL.Con de 1’ eau “‘~ohmmte”
C : poti comnwp0ndan.Z à La quana%é d’eau .to.tate
non “~0Lvante”
Ces deux grandeur (H.R, et au) n'ont pas 9a mtMe slgnif9eation
physique. L'H.R. se ref&e a la phase gazeuse et l'au 1 la phase
condensée. Toutefois GAL a montre (91) que l'au et 1'H.R. s'identi-
fient l'une 8 l'autre avec une erreur négligeable inferieure a 0,2 %.

Les courbes de sorption offrent une forme typiquement sigmolde pour

lesquelles on distingue 3 zones :

- pour des a" comprises entre 0 et O,l, les molecules d'eau sont très
fortement liées sur les sites polaires libres,

- pour des aw entre 0,l et 0,65 (partie sensiblement linéaire de

la courbe), des molécules d'eau se fixent sur les precedentes
ou sur de nouveaux sites polaires rendus accessibles par le gonfle-
ment du substrat,

- enfin pour les aw superieures à 0,65 la courbe montre une pente

croissante qu'il est difficile d'expliquer ; aux très fortes aw
interviennent des effets capillaires et des effets osmotiques
lorsqu'il y a des parois semi perméables. Les molécules d'eau n'ont
plus d'orientation très spécifiques et sont donc très mobiles.

L'affinité de l'eau vis-à-vis du produit diminue au fur et à mesure

qu'augmente la te~mpërature qui accroît ainsi l'activité de l'eau pour
une même teneur en eau du produit. Pour un produit donné on peut
ainsi tracer un réseau d'isothermes de sorption. Si l'on soumet un
produit à un gradient de température, il y a dans la zone échauffée
une forte augmentation de la pression de vapeur, qui crée une migra-
tion de l'eau de la zone la plus chaude vers celle qui est plus froi-
de.

La notion de disponibilité de l'eau ou d'eau solvante est capitale

car elle .détermine le métabolisme des microorganismes dans les pro-
duits solides. GUILBOT et LINDENBERG (92).ont montré que la fraction
de l'eau adsorbée qui possède une grande mobilité et qui est réaction-
nellement disponible est représentée par la partie hachurée de la
courbe de sorption (figure 4). C'est cette eau qui peut participer à
 53

des reactions biochimiques. Par contre l'eau située sous la partie

lineaire extrapolee represente l'eau fortement fixée n'ayant aucun
pouvoir solvant et donc non disponible. Il en résulte que les réac-
tions biochimiques ou enzymatiques nécessitent une ao minimale et
voient leur vitesse augmenter en fonction de la quantité correspondan-
te d'eau solvante disponible (93). Ce point est tr& important pour
la compréhension des mécanismes de fermentation en milieu solide.

6 - CONCLUSIONS~

Les champignons filamenteux participent de façon essentielle à

notre environnement, ils jouent un role capital dans le recyclage
des composés organiques et font également partie de nos habitudes
alimentaires. Leur formidable potentiel biochimique a déjà donné lieu
à des exploitations en milieu Ilqui& pour la production de biomasses,
d'enzymes, d'antibiotiques et autres produits actifs. Toutefois la
culture des champignons en milieu liquide oose des problemes du
fait du mode de croissance particulier de ces microorganismes qui
conduit à limiter l'efficacité des appareillages classiques.

D'un autre cote la culture des champignons sur substrats solides est
plus proche des conditions habituelles de leur développement, et
pourrait dans certains cas présenter de réels avantages. D'ailleurs
devant les nombreux exemples d'applications des fermentations solides,
on est frappé par l'énorme potentiel que représentent les cultures de
champignons sur substrats solides. On peut alors se demander pourquoi
de telles possibilités n'ont pas @té exploitees a plus grande échelle
et sont le plus souvent restées au stade artisanal ? C'est qu'en
réalité les processus impliqu6s dans ces fermentations ne sont na's é-
lucides et l'on est contraint de compenser par le savoir faire et
l'expérience le manque de connaissances fondamentales.

En effet, si dans ce domaine on trouve de tres nombreuses descrip-

tions détaillées des techniques artisanales, de leur adaptation plus
ou moins heureuse a des applications commerciales, ce n'est que tr6s
 54

récemment que l'on a décrit les organismes impliqués. Les études

fondamentales concernant la physiologie de la croissance et les méca-
nismes de régulations dans les cultures sur substrats soli-
des sont peu nombreuses, et les connaissances dans ce domaine sont
donc encore peu avancées.

Une des raisons essentielles à cela vient du manque de méthode spdci-

fique pour la culture des champignons sur substrat solide dans une
phase déterminée de leur développement. La seule technique consistant
à inoculer en surface un substrat solide conduit peu après le début
de la croissance à un mélange de mycélium jeune, de mycélium en dégé-
nérescence, de conidiophores et de conidies. Il est difficile dans
ces conditions d'étudier la physiologie, le métabolisme et les méca-
nismes de régulation, et donc de concevoir des appareillages adaptés
pour le contrôle et l'optimisation des fermentations solides.

Notre travail a donc consisté dans un prem~o~;~mps à mettre au point

une méthode de culture spécifique qui tienne des caractéristiques des
fermentations solides et qui permette de maintenir le champignon dans
sa phase de développement végétatif. Sur la base de cette méthode nous
avons alors étudié l'influence des facteurs de l'environnement, les
activités enzymatiques et métaboliques ainsi que la cinétique de
croissance du champignon sur substrat amylacé. Les résultats obtenus
ont été appliqués au contrôle et à l'optimisation d'une technique
d'enrichissement direct en protéines de substrats amylacés solides en
vue de l'alimentation animale.
 CHAPITRE 2

MATERIEL ET METHODES
I. TECHN'IQURDECULTURESURSUBSTRAT AMYLACllSOL1DE

A partir des consld@ations g&Wales que nous avons examIn9es au

chap'ltre prkedent, nous avons eherch8 à mettre au point une teeh-
nique de culture de myc6lium de champignon sur substrat amylace
solide repondant aux critères suivants :

- maintien d'une aération efficace et des conditions opti-

males,
- homogenéite du développement mycllien dans tout le pro-
duit,
- stéri,lisation du milieu et conditions aseptiques non ne-
cessaires,
- simplicité des appareillages à mettre en oeuvre,
- possibilité d'étude des mécanismes et des paramètres de
croissance.

Nous avons effectué une première série d'expériences ayant pour but
le choix de la technique de culture la plus appropriée. Pour cela
nous avons testé plusieurs possibilités : milieu pàteux en couche
de faible épaisseur, milieu pâteux malaxé en permanence, manioc
cru coupé en petits morceaux et farines réhumidifiées. Les meil-
leurs résultats ont été obtenus à partir de la farine de manioc
cuit, réhumidifiée avec une solution contenant des sels minéraux
et des spores de champignons (tableau V). En effet, la consommation
de sucres est nettement supérieure, la croissance du mycélium est
meilleure, la tendance à la sporulation est beaucoup plus faible,
ainsi que les risques de contaminations bactériennes. Nous avons
donc poursuivi les expériences dans cette direction.
 - _ -..
!
Conditionnement Remarques j
1
! I substrat P.S. ,g/lOO g 1 !
'substrat
! ! ! P.§. ! !
! - MILIEU PATEUX ! ! ! !
! . couche de 4 mm ! 934 ! 53,2 ! sporulation !
! ! ! ! intense !
! . couche de 8 mm I 735 ! 67,2 ! " !
! !
. malaxeur 632 nd . levures
t ! !
! ! !
- MANIOC FRAIS
! ! !
! * couche de 8 mm 622 62 ! sporulation
!
! ! ! intense
! !
! . colonne aérée ! 438 ! 72 ! ” !
! ! ! ! !
! - FARINES en COLONNE ! ! ! !
! ! ! !
. farine crue 539 ! 42,7 sporulation
! ! !
farine cuite 10,; ! 4633 1 bon développe-,
! * !
ment mycélien '
! ! ! !
sporulation
! I ! retardée !

Tab&.au V - Rénu- cancennant &Q c&$éhev~& typa de canck-

tiowwwn.2 du tnaniac

Les différents essais que nous avons faits nous ont conduit à l'éla-
boration d'une nouvelle méthode de culture dont nous rappellerons les
caractérijtiques et que nous avons utilisée pour effectuer l'essentiel
de ce travail.
 1 - f'RtNCfPE DE 1A METHODE
DE CULTURE(941

Cette technique simple est bas&e sur 'la distribution homog8ne d'un
inocu'lum de spores et des sels mineraux nfkessaires 8 la crofssance
du mycelfum dans la masse du substrat amylacl m4s sous une forme ad&
quate permettant le maintien des condJt!ons a6robIes. La préparation
d'un substrat granulaire poreux avec un pH et une teneur en eau d&
terminés est essentiklepour obtenir une croissance rapide et homogene
dans toute la masse du substrat.

Cette structure granulaire permet à un flux d'air humidifié de traver-

ser aisément la masse du produit pendant toute la durée de l'incuba-
tion, ce qui permet d'apporter l'oxyqène nécessaire à la
croissance du mycélium to,ut en évitant la dsiccation du produit.
Etant donnée la structure finement divisée du produit, la surface
de contact avec#le flux d'air est très importante pour un volume
utile rbduit. Par ailleurs, le dispositif et les condi-
tions d'incubation permettent de retarder la sporulation, mr3me avec
des champignons du genre Abpe.kgLQU qui ont une tr&s forte tendance
à sporuler sur ce type de mi.l.ieu.

Au cours de l'incubation, le produit amylacé est peu à peu envahi par

le mycélium. Celui-ci se développe aussi bien à l'intérieur qu'à la
surface des grains qui se trouvent ainsi reliés entre eux. Ceci pro-
voque une prise en masse du produit enrichi qui acquiert une consis-
tance solide spongieuse et aérée.
 60

2 - PREPARATTONVU SUBSTRAT AMYLACE

Pour les besoins des études de laboratoire nous avons mis au point
une méthode simple permettant de préparer un substrat amylacé sous
une forme adaptée à la fermentation en milieu solide. Dans cette
étude nous avons utilisé du manioc comme matériel initial, mais d'au-
tres essais ont montré que l'on pouvait utiliser de la même façon des
tubercules de pommes de terre,.des bananes vertes entières ou des
céréales (maïs, blé) préalablement gonflées par trempage.

Les racines de manioc fraichement récoltées sont lavées et débaras-

sées de leur extrêmité ligneuse. Elles sont cuites à la vapeur dans
un autoclave porté 8, 110' C pendant 20 minutes de façon â rompre
les parois cellulaires et .3 gglatiniser les grains d'amidon pour les
rendre plus accessibles aux enzymes. Les tubercules refroidis sont
alors mis au cong&lateur pendant 12 heures au mofns. Cette @tape, est
nécessaire pour l'obtention ultérieured'une farine non collante. Le
refroidissement brutal permet en effet une rétrogradation de l'amidon
soluble pendant la phase de cristallisation de l'eau.

Les tubercules peuvent ensuite être lyophilisés ou dëcongelés et

séchés dans une étuve ventilée à 50 - 55" C. Le produit fpiable obte-
nu est alors broyé en farine grossière à l'aide d'un broyeur à mar-
teaux.

La farine de manioc cuit ainsi obtenue a la composition suivante

(en g pour 100 g de farine) :

eau résiduelle 10
matière sèche totale 90
amidon 83
sucres réducteurs 3
 61

protéines
lipides
cendres

Cette farine a servi de substrat carboné pour la préparation des

différents milieux de culture. Elle se réhydrate très facilement,
jusqu'à 50 - 60 % d'eau, en petits agglomérats qui restent individua-
lisés et évite la formation d'une pâte.

3 - PREPARATION DE L'INOCULUM VE SPORES

Les souches de champignons ont êté conservées sur un milieu gélosé

incliné ayant la composition suivante :

farine de manioc 20 9
sulfate d'ammonium 39
phosphate monopotassique lg
acide orthophosphorique 9 N 0,4 ml
agar-agar 15 9
eau distillée 1 litre

Le pH de ce milieu est de 3,5.

Les inoculums de spores sont préparés dans des fioles de 300 ml conte-
nant 17 g d'un milieu pâteux ayant la composition suivante pour 100 g
de farine :

(NH41 2 SO4 89
urée 29
KH2P04 49
eau distillée 230 ml

Le pH est ajusté à 3,5 avec H3P04 9 N. La pâte obtenue par mélange

de la .solution et de la farine a une teneur en eau de 70 %. Les fioles
contenant le milieu pâteux sont stérilisées à 120" C pendant 20 minu-
tes. Elles sont alors ensemencées â partir des spores provenant d'un
 62

tube de milieu gélosé et placées dans une étuve à 30" pendant une se-
maine.

Les spores sont alors mises en suspension dans un volume de 150 ml

d'eau distillée additionnêe de 0,5 ml de TWEEN 80, oar une agitation
magnétique de 10 minutes. Cette suspension est filtrée sur une gril-
le de 0,5 mm pour éliminer les débris de mycélium. La numération des
spores sur une dilution au 1/20 du filtrat est effectuée par compta-
ge direct sur une cellule de MALASSEZ en microscopie optique.

La quantité de SBOES obtenue dans ces conditions à partir d'une fio-

le est comprise entre 3 et 4.10101 ce qui permet d'inoculer 1 a 2 kg
de farine.

4 - CùNVSTlONNEMENT DU SUBSTRAT

En fonction de la teneur en eau, du pH et de la densité d'i-

noculum désires on calcule la quantitë d'eau nécessaire dans laquel-
le sontdissous les sels minëraux (phosphate monopotassique, sulfate
d'ammonium, urée), et à laquelle on ajoute la quantité de spores né-
cessaire. Le pH est alors ajusté avec de l'acide sulfurique ou de
l'acide phosphorique. Une courbe d'étalonnage donnant le pH de la so-
lution à ajouter en fonction du pH du produit solide obtenu après le
mélange doit être établie au préalable. (A titre d'exemple, pour ob-
tenir un pH de 4,5 dans le produit humidifié, le pH de la solution â
ajouter doit être ajusté à 2,7).

La solution est alors ajoutée à la farine et on mélange soigneuse-

ment. Pour des petites quantités (100 à 300 gx l'homogénéisation peut
être obtenue à l'aide d'une spatule '; après 10 minutes de gonflement,
le produit peut être passé à travers un tamis de 4 mm pour améliorer
l'homogénéité. Pour des quantités plus impoulantes, le mélange de la
solution et de la farine peut être réalisé dans un mélangeur du type
pétrin de mënage ou de boulangerie qui donne d'excellents résultats.
On obtient dans tous les cas des petits agrégats poreux ensemencés
dans leur masse. Le temns auquel la solution est ajoutée à la farine
est compté comme le temps zéro.
 63

Le produit humide ainsi obtenu est transféré dans les dispositifs

d'incubation.

5- QlSPUSlTlF V'lNCUBAT70N

Les incubateurs de laboratoire que nous avons utilisés sont simple-

ment constitués de colonnes réactionnelles comportant deux comparti-
ments (figure 5).

Le substrat amylacé,humidifié et inoculé,est introduit dans le com-

partiment supérieur à raison de 20 g par dispositif, ce qui est suf-
fisant pour effectuer les différentes analyses. Un tassement régu-
lier et modéré doit être effectué de façon à obtenir un garnissage
homogène et à éviter la formation de poches d'air et de passages
préférentiels.

Le compartiment inférieur contient de l'eau distillée qui permet

d'humidifier le flux d'air par barbotage avant son passage à travers
le produit.

L'ensemble du dispositif est immergé dans un bain-marie régulé à la

température d'incubation désirée.

Chaque incubateur est relié à une vanne à aiguille qui permet d'ajus-
ter le débit d'air à la valeur souhaitée grâce à un débit-mètre à
bille (0 - 20 l/h) qui permet de contrôler le débit d'air sortant.

Pour les différentes études que nous avons effectuées nous avons
utilisé une installation de 24 incubateurs (figure 6) qui peuvent
être prélevés individuellement sans entraîner de perturbations pour
les autres dispositifs.
 64

I disque papier filtre f.Lgule. 5 - PAbpan.i;ti~

d’&cubtion peuh CL&-
tic en naeu bo.Pide.

, substrat solide humidifie

/disque papier filtre

laine de verre

T
E
0
0
c

Figae. 6 - Eqtipwmut de 24 tiponitidh d’.Lncubaüoti

a ) vanne. z aiguLUe POWL aju&eh Le @Lx d’ain, bl débLt-
nr&LU (0 - 20 L/h) peuh covct.tôlen. te. déb.iA ; cl uvuX d’ln-
cuba;tLon ; d) bti-mde hégulé
En vue de leur analyse, les &kanéJllons sont trait& de la faf;sn
suivante :

contenu d'un -- - - -- -3 Poids total d'8chantfllon

incubateur

1
produit. dila- ----+ 5 9 Etuve 105" C --* Teneur en
céré 24 h eau

5 g d'échantillon
'3.
50 ml d'eau distillée

Ultra-Turrax ____-- --*pH

2 mn - 20.000 t/mn

1
dilution 1/50

I
Polybroyeur
(POTTER)

I
Protéines Sucres Hydrolyse Activité
libres Amidon résiduel amylasique

1
Sucres totaux
De façon 8 ameliorer la precision des mesures et a r8duire 1'6cart
de variabilité des resultats, les analyses sont effectubes en double
exemplaire sur le contenu de chacun de trois incubateurs. Tous les
résultats représentent donc la moyenne de 6 déterminations. Le
contenu de chaque incubateur est pesé, puis dilacéré à la spatule.
Une fraction de l'échantillon (4 a 5 g) sert à la détermination de la
teneur en eau par séchage à l'étuve à 105' C jusqu'à poids constant.
Sur chacun des échantillons on determine la teneur en eau, le poids
total de matière sèche, le pH, les protéines, les sucres résiduels et
l'activité amylasique.

Le dosage des sucres résiduels totaux nécessite l'hydrolyse préalable

de l'amidon. Elle est réalisée par une amyloglucosidase SIGMA Grade
II no A 7255 de la façon suivante : 5 ml de la solution à doser et
1 ml d'une solution d'amylogluc~~;~ -1Aase à 1 g/l dans 1 tampon citrate
- phosphate à pH 4,5 sont incubés 20 minutes à 55" C et les sucres
réducteurs sont dosés au Technicon selon la technique décrite ulté-
rieurement.

Pour tenir compte des variations du poids de matière sèche au cours

de la fermentation nous n'avons pas rapporté les résultats par rap-
port au poids sec de l'échantillon, mais par rapport à la quantité
initiale de substrat amylacé. De cette façon on exprime les quantités
réellement apparues ou disparues, et les résultats peuvent être com-
parés entre eux et avec ceux des fermentations classiques en milieu
liquide.
Nous avons automatise la methode de LOWRY& Coll. (95) qui consiste
& suivre B 660 nm le développement d'une coloration bleue, resultant
de l'action combit-&e du biuret avec les liaisons peptidiques et de la
réaction de Folin donnée par la tyrosine et le tryptophane,

Auparavant l'échantillon à doser a subi une attaque alcaline qui a

pour effet de briser les paroies et de libérer les proteines contenues '
dans le mycélium : à 2 ml de la solution à doser on ajoute 1 ml de
NaOH (N) et on porte au bain-marie bouillant pendant 5 minutes.

Les échantillons sont ensuite rapidement refroidis et partiellement

neutralisés par l'addition de 1 ml HC1 0,8 N avant d'être déposés
dans le distributeur d'échantillon,d'un appareil d'analyse automati-
que TECHNICON AUTOANALYSER II (Technicon Instruments Corporation,
Tarrytown, New York 10591). On établit une courbe de référence avec
une solution de sérum albumine bovine (Sigma Chemical Company)
N" A 4378 ayant subi le même .! traitement que les échantillons à do-
ser.

3 - DOSAGE DES SUCRES REDUCTEURS

Nous avons employé un circuit analytique basé sur la méthode au fer-

ricyanure préconisé-par Technicon (Industrial Method no 142 71 A ;
Manifold no 116 D 209 - 1972), qui utilise la technique de PARK &
JOHNSON (96).

Par chauffage en milieu alcalin, les sucres réducteurs réduisent le

ferricyanure de potassium. Leur action se traduit par une diminution
de l'absorption de la solution de ferricyanure mesurée à 420 nm.
Le pouvoir réducteur de référence est celui d'une solution de glucose
de concentration connue.
 68

4 - DOSAGE VE L'ACT'IVZTE AMYLASIn,UE

Le principe du dosage est basé sur l'augmentation du pouvoir réduc-

teur d'une solution d'amidon en fonction de la quantité d'enzyme in-
troduite dans le mélange réactionnel.

Le malange ri%ctionnol contient :

- 2,5 ml d'une solution d'amidon a 15 g/l

- 2 ml de tampon citrate-phosphate 0,l M
- 0;5 ml de solution à doser

La réaction est poursuivie pendant quinze minutes exactement. Elle

est stoppée en plongeant le tube pendant 5 minutes dans un bain-
marie porté à ébullition. Après refroidissement,les échantillons sont
dosés pour leur teneur en sucres réducteurs estimés en glucose, selon
la méthode précédente. On réalise les témoins suivants :

- témoins sans enzyme (0,5 ml H20)

- témoins temps zéro avec enzyme

Les activités sont exprimées en unités enzymatiques internationales.

Une unité enzymatique étant définie comme la quantité d'enzyme qui
libère une micromole de glucose par minute dans les conditions optima
de dosage.

Pour le dosage des activités amylasiques, nous avons vérifié que

l'apparition des sucres réducteurs dans le milieu est une fonction li-
néaire du temps pendant toute la durée de la réaction et est propor-
tionnelle à la quantité d'enzyme introduite dans le mélange réaction-
nel.
 69

Cette étude ayant été entreprise dans l'optique d'une application

de la fermentation solide I la mise au point d'une technique d'enri-
chissement en protéines de substrats amylacés,destinés a l'alimen-
tation animale, le champignon à utiliser doit répondre à un certain
nombre de critères parmi lesquels :

- croissance rapide
- production intense d'amylase
- absence de toxicité
- teneur en protéines élevée
- composition alimentaire favorable
- rendement de croissance élevé
- tolérance vis-à-vis de la température et du pH

A cet effet nous avons réalisé une série d'isolement et de sélection

de souches de champignons,pour déterminer les plus compétitifs et les
mieux adaptés sur des milieux contenant la farine amylacëe comme seul
substrat carboné.

1 - TSOL&M&NTS

Les isolements ont été faits sur boîtes de Pétri contenant un milieu
gëlosë à l'amidon de manioc auquel on a ajouté de la streptomycine
et du chloramphënicol pour supprimer les colonies bactériennes. Les
étalements ont etë faits à partir de différents échantillons de sols
et de manioc frais ou fermenté. Les boîtes ont été incubëes 2 à 3
jours à 30" C puis exposées quelques instanisaux vapeurs d'iode pour
colorer l'amidon en bleu et visualiser ainsi les zones d'hydrolyse.
Les germes présentant une bonne activité am.ylolytique ont été alors
purifiés par plusieurs repiquages et conservés en tubes de gëlose
inclinée.

Une première série d'isolements nous a permis d'obtenir 45 souches

de champignons et également quelques levures amylolytiques. Par la
 70

suite nous avons refait une sërie d'isolements qui nous a fourni 30
nouvelles souches dont certaines ont été isolëes à 45°C.

2 - SCREENING DES SOUCHES ZWLEES

Afin de rëaliser unel>première sélection, tous les isolats ont étë

cultivés sur milieu liquide en erlen de 250 ml contenant 50 ml d'un
milieu contenant pour 1 litre i 20 g de farine de manioc, 3 g de sul-
fate d'ammonium et 1 g de phosphate monopotassique. Les cultures ont
été mises en incubation pendant 48 heures à 30°C sur une table d'agi-
tation.

Le tableau VI rassemble les résultats obtenus pour les isolats ayant

montré une croissance sensible sur le milieu. Le poids sec de mycélium
et les protéines formées ont été déterminés à partir de 25 ml de cul-
ture filtrés sur une grille de 100 um. L'activité amylasique et les
sucres résiduels ont été déterminés sur le filtrat.

Il faut remarquer tout d'abord que les valeurs obtenues n'ont qu'une
valeur comparative, les conditions optimales n'ayant pas été réalisées
dans la plupart des cas. Ce test nous a cependant permis de classer
les souches et d'apprécier leur capacité à croître sur amidon de ma-
nioc.

Si on compare nos résultats avec ceux de BROOK & coll. (8) nous cons-
tatons que la moitié des souches que nous avons isolées sont favora-
blement comparables aux souches amylolytiques de collection que ces
auteurs ont cultivées dans des conditions assez voisines.
 71

! ! !
Numéro de l'isolat f tlycélium produit : Protéines fom8es Sucres résiduels ! Activite
! ! ! !
amylasique
! ! ! ! ! !
411 90 dl
! ! ! ! ! !
10 ! ! ! ! !
9.69 2,48 0 tttt
7 ! ! ! ! !
Il,27 2,25 0 tt+
12 ! ! ! I !
9233 2,07 0 +ttt
24 ! ! ! ! 1
8.44 2,02 0
11 ! ! 3 ! .!
7,89 1,82 2,4 tt+
8 ! ! ! ! !
7,92 1,77 2,5 +++
45 ! I ! ! !
5,07 1.76 6,7
9 ! I ! ! !
8,04 1,67' 3.0 +t
14 ! 8 I ! !
7,74 1,65 3.8 +
51 ! ! ! ! I
6.39 1,65 7.6
52 ! ! ! ! !
7,DZ 1,58 6,6 !
34 ! ! ! !
7,21 1,50 5,2 41
17 ! ! ! ! !
5,25 1,16 936
53 ! ! ! ! !
4,31 1,lO 13,3
46 ! ! , I !
4,62 1,08 10,7
I I ! ! !
49 4,70 0,99 10,8 - .
6 ! ! ! ! !
6,37 0,98 6,7
48 ! ! ! I !
5,20 0,93 10,5
32 ! ! ! ! !
4,54 0,89 11,7 nd
13 ! ! ! ! !
,
3,57 0,84 832 !
nd
! ! !
Ca 4,21 0,78 11,5 nd
18 ! ! ! ! !
3,94 0,76 11.2 nd
27 ! ! ! ! !
3,50 0,71 12,2 nd
25 ! ! ! ! !
3,94 0,66 16;7 nd
15 ! ! I ! !
3,82 0,64 12,5 nd
47 ! ! ! ! I
5.03 0.57 14.4
29 ! I ! ! !
3,22 0,52 14,o nd
54 ! I ! 1 !
4,00 os2 13:5
41 ! ! ! 1 I
3,06 0,41 13,2 nd
26 I ! L , !
2,95 0,37 16.0 nd
30 ! ! ! t !
3.47 0,35 14.0 nd
! ! ! ! !
Cl 3,40 0,23 15.4
I ! ! ! I
50 2,99 0,El 13.1
55 ! I ! ! !
3,54 0,21 14,6
33 ! ! ! I !
3,ll 0.20 17,7 nd
42 ! ! t ! I
3,12 0,19 15.7 nd
! I ! ! !

Tab&au V7 - Schee.nhg des AnokTm% cw mARieu Liquide (+ : poh!i,j,

- : négtid ; nd : non d&te,mhé)
 72

On s'aperçoit également que pour certaines souches ayant transformé

l'amidon de façon efficace, l'activité amylasique est très faible,
alors que pour d'autres elle. est très élevée. Ceci semble indiquer
que chez certains champignons l'amylase reste liée à la paroi comme
cela a été montré dans le cas de certaines levures amylolytiques (97).

La détermination des différentes souches que nous avons isolées n'a

pas été faite de façon systématique. Cependant parmi les plus effi.ca-
ces, on rencontre principalement des germes aopartenant au groupe
AnpehgZkTti et présentant des fructifications noires (no 7, 10, 12),
grises (n' 11, 24) ou verdâtres (no 14, 51, 45).

3 - RENDEMENl-SDE CROZSSANCE

Afin de connaître de façon plus précise les rendements de transfor-

mation de l'amidon de manioc en biomasses et en protéines, les souches
les plus actives ont été cultivëes en fermenteur agité. Le fermen-
teur contenant 12 litres de milieu de culture à 20 g/l de farine de
manioc a été stérilisé à l'autoclave et inoculé avec 1,5 litre d'une
préculture de 24 heures. Après 24 heures de fermenttion, la biomasse
a été récoltée par centrifugation et séchée. Les sucres résiduels
ont été dosés dans le surnageant. Les protéines vraies ont été mesu-
rées par la méthode de LOWRYet les protëines brutes par la méthode
de KJELDAHL (N x 6,25) à partir de la biomasse récoltée.

Les résultats que nous avons obtenus (tableau VII) sont très satis-
faisants et sont en accord avec ceux des auteurs canadiens (6) qui
ont travaillé sur manioc avec une souche d'AspeXgZk.b @m.Qa;ocS.
Ils sont sensiblement supérieurs à ceux de BROOK & coll. (8) qui
étaient contraints d'ajouter jusqu'à 2 % d'extrait de blé germé dans
leur milieu de culture pour obtenir une croissance satisfaisante avec
des souches de Mucoh et de Rhizopun .
! N” sou-! Biomasse ! !
Protéines récoltées Rendement de transforma-!
! ! ! !
che récoltée tion par rapport aux su-!
! 1 ! ! !
cres consommés %
! I ! ! !

! ! !Matière !Protéines!Protéi-!
! N x 6,25 ! LONRY , nes
! l I I ! sèche ! brutes 'vraies!
! 1 9 ! 9 ! g I ! I !

I I
7 ! 1-q
UC,7 42,6 ! 31.5 ! 44,7 ! 21,7 ! 16,8 !
! 10 ! 112,5 ! 48,5 ! 30,4 ! 49,3 i 22,6 ! 1436 !
! 12 ! 99,2 ! 43,4 ! 29,8 ! 50,9 ! 24,4 ! 17,4 !
*1 24 ; Y4,Ï I* 40,3 ! 20,9 ! 46,l ! 21,3 ! 11,9 !
! 11 101,7 ! 41,2 ! 35,8 ! 45,4 ! 20,2 i 17,8 !
*1 51 ! 101,4 ! 38,5 ! 27,8 ! 50,3 ! 20,8 ! 15,5 !
! ! ! ! ! ! ! !

TabLeu V77 - Rendemen.& de Xhann@iuntion de .C'amLdon en biamanoe et

e.n ptrotéinu LOU de cuLtuhe.s Liyu.ide~ agktéen.
CondLtLoMd opéhato.iken = twlp&tratuhe 30’ C,
pH = 3,s ; agktion 400 tlnw ; néha-tion 4 k!/mn
uohme : 12 .t ; concenttation en Juc'Le6 : 20 g/kT

4 - CUh4PUSlTiUN DES BZUWASSES

Pour connaître de façon plus précise la valeur des biomasses récol-

tées, l'analyse des constituants a éte réalisée. Les résultats
(tableau VIII) concernant la teneur en protéines des mycéliums sont
en général satisfaisants ; la teneur en lipides est beaucoup plus
variable.
 74

I ! ! !
! N" de la ' Protéines Lipides Cellulose ! Indigestible ! Cendres
! ! ! ! !
souche ! N x 6,25 ! glucidique
! ! ! ! ! !
g% 9% ;g% g% I 9%
! ! ! !

! 7 ! 38,4 ! 2,ll ! 11,77 ! 14,59 ! 5,03 !

! 10 ! 41,2 ! 1,ll ! 10,85 ! 13,19 ! 5,53 !
! 11 ! 39,0 ! 0,85 , / 7,66 ! 9,36 ! 5,23 !
! 12 ! 40,6 ! 2,36 * 12,42 ! 13,05 ! 5,84 !
! 24 ! 40,9 ! 7,86 ! 7,45 ! 16,39 ! 4,98 !
! $1 ,! 37,8 ! 8,98 ! 7,56 ! 8,36 ! 7,Ol !
! ! ! I ! ! !

5 - THER~4OTOlERANCE

La tolérance des organismes vis-à-vis de la température a été également

un critère de sélection dans la mesure où elle permet une régulation
grossiere de la température sans modification notable de la vites-
se de croissance du mycélium. D'autre part, une température optimale
de croissance élevée permet de simplifier les problèmes de refroidis-
sement au cours de la fermentation.

A cet effet les isolats ont été cultivés sur milieu gélosé à l'amidon
de manioc en boîtes de Pétri inoculées au point central. Après la
phase de germination le diamètre de la colonie est mesuré résulièrement
pendant 4 à 5 jours. Dans ces conditions la croissance linéaire du
diamètre des colonies est un phénomène bien connu qui a été étudié en
particulier oar PIRT (98) et TRINCI (99). Cette méthode est pratique
et beaucoup plus rapide que la détermination de la vitesse de croissan-
ce en culture liquide agitée.
 75

Sur le tableau IX nous avons rapporté les vitesses de croissance

des isolats à différentes températures d'incubation, exprimée en vi-
tesse d'augmentation du diamètre des colonies en mm/24 h.

!
1 N" isolat ! Vitesses de croissance des colonies (mm/24 h)
! I
-- !

!
! 25°C ! 300 c ! 35O c ! 37“ c ! 400C !
I I ! ! I ! I
-----_ . . _---
! ! ! !.14 ! ! !
7 10 11 14 10
! ! ! ! ! ! !
10 10 13 14 I6 10
I ! ! ! ! ! !
12 9 1C 16 15 10
! ' ! !9 ! : !
11 4 5 8 8
! ' ! ! ! ! 1
24 8 9 11 9 6
1 j ! 111 1 ' I
53 8 g 0yl 2
!A __._ j ._.." _..-_. !... _....._!.__ _. .. .._......l -.._......... !‘

6 - CUNCLUS7UN

A l'issue des differents tests de sf?lection qui ont ete pratiques et

en fonction des criteres de croissance, d'amylolyse, de competitivit&,
de thermotolerance, de productivîtes en proteines et de la composition
du mycélium, nous avons choisi l'isolat no 10 pour la suite de notre
travail consistant a étudier les mécanismes de croissance d'un champi-
gnon filamenteux sur substrat amylacé solide suivant la technique de
culture que nous avons décrite précédemment.

Toutefois, nous remarquerons que cette souche particulière a été re-

tenue pour des raisons pratiques mai?%autres souches testées auraiett
également pu etre utilisées, En effet nous avons pratiqué ulterieure-
ment des essais de cultures en milieu solide avec de nombreuses sou-
ches qui ont également donné des résultats très satisfaisants comme
nous le v&rrons dans un prochain chapttre.

La technique de culture que nous avons utilis6e n'est donc pas lige
3 l'emploi d'une souche particul+ère, mals peut au contraire &tre
pratiqutle avec de nombreuses souches de champignons filamenteux.

IV. CARACTERISTIQUES DE L’ORGANISME UTILISB

I - CARACTERES~40RPffflLOGIQUES

- aspect deA co8oniti

Pour la détermination de ses caractères morphologiques et physiologi-

ques, la souche no 10 que nous avons utilisée dans la suite de notre
travail a &t@ cultivée sur milieu gélosé 8 l'extrait de malt en boite
de Pi$tri et incubao 8 30a C.
Les spores germent h partir de la 8&me heure d'-lncubation et forment
des colonies ou 7'on observe entre 20 et 24 heures l'apparition de
fructifiqakion agriennes. A la loupe binoculajre, les jeunes têtes
sont initialement hyalines puis, en Ponction du degr@ de maturation,
elles prennent une coloration blanche, marron et noir intense, d0e 1
la formation des phialides et des conidies.

Nous avons note l'aspect étoilé de la colonie, causée par le dévelop-

pement du mycélium et les replis qu'il forme à la surface de la gélose,
ainsi que l'aspect craquelé de l'arrière de la colonie (figure 7).

- formation des spores

Les observations ont été poursuivies au microscope photonique et au

microscooe à balayage sur le matériel cellulaire prélevé après 24
heures de culture.

Après coloration au bleu coton, on note la présence d'un mycélium

cloisonné qui se vacuolise.

Il se forme alors des cellules dites podales (figure 8 e, c) qui

s'allongent pour donner des conidiophores ampouliformes (vésicules)
qui deviennent globuleux (figure 8 b, d, e) ; ces vésicules qui ont
une taille de 40 1-1environ portent des phialides sur toute leur
 77

Figwte 7 - hpmt de Ru c/roi~nance de La bouche no 70 nwt WLZL~

géloné à .t’eM de ma,.@ : a - c&té aE.Cen, b - CVULL~IL~
de .ta boZte.

surface. A partir de ces phialides se forment les conidies qui sont

libérées en chaines (figure 8 d, e) et ont un diamètre moyen de 3,5
à 4 1-1. L'observation en microscopie à balayage (figure 8, f) montre
l'aspect échinulé de la surface de ces conidies.

D'après ces différentes observations, on peut classer notre souche

no 10 dans le genre AnpehgU et dans le groupe RsptigXus tigeh,
se'lon RAPER & FENNEL (21).
 ‘8

Figue 8 - Anpeot de4 conidiophones

t’obntiua;üan en m.khobeopie de La souche no 70 .
 25 30 35 40, 45
température PC> température (OC)

2 - CARACTERESPHYSlOLOGl$lES

La vitesse de l'élongation apicale de notre souche sur milieu malt

agar à 30' C, mesurée selon la technique de RYAN & Col. (117) est de
5 mm/j. En milieu liquide, sur glucose et sur amidon soluble, son taux
de croissance est respectivement de 0,55 h-l et de 0,5 h-I.

D'après la figure 9, on note que la température optimum de croissance

et de germination se situe entre 35 et 40" C. La température maximale
est de 47" C ; à 20" C la croissance est encore importante. Notre or-
ganisme possède8donc une thermotolérance importante, ce qui était
d'ailleurs recherché lors de la sélection que nous avions faite
(Cf. p. 69).

Sur amidon l'organisme synthétise une amylase de type amyloglucosi-

dase dont les caractéristiques sont décrites plus loin (Cf. p. 121).

La composition des protéines du mycélium est donnée dans le tableau X.

3 - DETERMTNATTONVE L’URGANSSME

Les caractères qui ont été observés permettent de ranger notre orga-
nisme dans le genre AnpagZku, qui selon ALEXOPOULOS(126) et CHADE-
FAUD (127) peut être rangé parmi les Eurotiacées, de l'ordre des
Eurotiales qui sont des Ascomycètes Pyrénomycètes.
 .- -
! Alanine 7,67 g pour 100 g de prot&ines ' 1
! Arginine 508 4 II II !
! Ac. Aspartique 7,51 g n II !
! 1/2 Cystine 0,4a g 11 II !
! ,I !
Ac. Glutamique 10,71 g fi
! Glycocolle 4,62 g ” II !
! II !
Histidine 2,79 g ”
! II !
Isoleucine 3,70 rj In
! I# !
Leucine 6,52 g ’
! Lysine 7,28 g ’ 1, !
! Il !
Yéthionine 1,44 ‘J lt
! II !
Phénylalanine 3,47 g ”
! II !
Proline 2,46 g ’
! II !
Sérine 4,36 g ’
! II !
Théonine 4,47 g ”
Trytophane !
: Tyroslne . 3,40 g In II
! Valitie 4,72 g ” II
!
! ic protéines : N x 5,25 !
! !
Tableau X - Compontian en acide,& CUYI&~A deb p~otéiwb de Ra bouche
no 70.
Ces caracteres morphologiques montrent que ce champignon appartient au
groupe Abpmgi.fYub rtigen, mais qu'il diffère de l'espèce type Aspe,~~-
g%.ub tiges van Tieghem qui nous a été aimablement fournie par la
C.C.M. (Czechoslovak Collection of Microorganisms - BRNO) par l'aspect
étoilé (et non concentratique) de la colonie, sa vitesse d'élongation
supérieure et sa thermotolérance.
Enfin, la détermination précise de la.souche no 10 a été réalisée par
le Central bureau voor Schimmelcultures de Baarn (Hollande) qui l'a
identifiée comme appartenant à l'espèce : Abpe,+r.g~ub hennebengfi
(citée par BLOCWITZ (128) du grouoe Abpehg.iLYub tige&.
 CHAPITRE 3

RECHERCHE
DES CONDITIONS OPTIMALES DE CULTURE
 83

Pour étudier les mécanismes et les paramètres de la croissance de no-

tre souche no 10 cultivée sur substrat amylacé solide, il était
indispensable de connaître les conditions optimales de culture. A
cet effet nous avons été amenés à étudier l'influence des facteurs
de l'environnement.

Nous nous sommes efforcés dans la mesure du possible de standardiser

au maximum les conditions expérimentales afin de ne pas introduire
des causes de variations indépendantes du facteur étudié. En parti-
culier,nous avons veillé à utiliser des inoculums de spores préparés.
toujours dans les mêmes conditions.

Nous avons ainsi effectué des études cinétiques de croissance en fai-

sant varier chacun des facteurs pris isolément, les autres étant
maintenus constants. Cette méthode est peu pratique et critiquable
dans la mesure où elle ne tient pas compte des interactions éventuel-
les entre ces différents facteurs. Cependant elle nous a permis de
progresser rapidement.

Etant donnée l'impossibilité de mesurer directement la biomasse

mycélienne formée, comme dans le cas des cultures liouides, nous
avons apprécié la croissance par la mesure des nrotéines synthétisées
qui sont en relation directe avec la biomasse.
 84

1, INFLUENCEDESFACTEURSDEL'ENVIRONNEMEN'I'

1 - TENEUR EN EAU VU SUBSTRAT SOLIDE

Les champignons sont capables de se développer à des humidités rela-

tives beaucoup plus faibles que celles requises pour le développement
des bactéries ou des levures (100). Il faut faire ici une distinction
importante entre l'humidité relative de l'atmosphère (H.R.) et la te-
neur en eau du substrat (Hz0 %). Les champignons peuvent se dévelop-
per sur des substrats comportant au moins 12 % d'eau et à des humidi-
tés relatives supérieures à 60 % (T?U).

Nous avons vu dans le premier chapitre que l'eau joue un rôle capital
dans ce type de fermentation. La quantitét d'eau solvante et le degré
d'activité de cette eau ont une influence déterminante sur le dévelop-
pement du mycélium.

L'humidité du produit est en relation avec la pression osmotique qui

joue un rôle sélectif sur la croissance des microorganismes. En ef-
fet, contrairement aux levures et aux bactéries, les moisissures to-
lèrent et même préfèrent,en général, des milieux à pression osmotique
élevée. Ce facteur, lié à l'utilisation d'un pH acide, peut permettre
d'effectuer des cultures fongiques dans des conditions non stéri-
les, sans avoir de contaminations bactériennes importantes.

Enfin, la teneur en eau a également une influence sur la porosité du

produit, une humidité excessive peut être un obstacle à la diffusion
des gaz au sein des agrégats.

Pour ces différentes raisons, nous avons É!té amené à déterminer le

seuil d'humidite qui permet une croissance optimale de notre souche
sur milieu solide à base de farine de manioc.

Dans un premier temps nous avons étudié les cinétiques de croissance

obtenues à partir de teneurs en eau allant de 35 à 60 % (figure 10).
 10 20 30

temps (h)

amy&cé AWZ La cm&sance de La bouche d'A. hp,nn&m&

no 10. Vo& contions de #mLuanee. a.u Tabkkau Xi.

Nous avons ensuite cultivé le champignon sur des produits comportant

six humidités différentes étalées de 42 à 60 %, et nous avons
analysé les produits après 30 heures d'incubation à 30' C (Tableau
XI).

Les résultats obtenus montrent qu'il existe un optimum d'humidité se

situant entre 50 et 55 % d'eau. Avec un produit trop sec,la phase de
germination est très longue et la croissance du mycélium est ralentie.
%Avec des teneurs en eau initiale supérieures à 55 40, les risques de
contaminations bactériennes'sont plus ë1evë.s , surtout pendant les
 86

quelques premières heures d'incubation représentant la phase de ger-

mination des spores.

! ! !
Humidités initiales (g d'eau/
! ! !
100 g de produit htimide)
! ! !
! ! 42 ! 46 ! 5o ! 53 ! 56 ! (-0 !
! !' ! ! ! I ! !
! ! 8. ! 71 ! 7. ! 71 ! 71 !
Poids sec final ! 92
! (% du po+ds sec initial) ! ! ! ! ! ! !
! ! ! ! ! ! ! !
! PrntP!nes synth$tis&s 631 ! 103, CU! 11,6!11,8 ! 9,7 ,
! (g pour 200 g de substrat) i
! ! ! ! ! !
! ! ! ! ! ! ! !
Sucres consommés
i (g pour 100 g de substrat) ! 23y3 ! 36s4! 46s5! 4g~7!4g~l 1 46 !

! ! ! ! ! ! ! !
! Rendement de transformation !
0,26 ! 0,28! 0,26! ü,$ 0,24: ",2$
! (protëine.s/sucres) ! ! ! !
! ! ! ! ! ! ! !
! pH final ! 5,8 ! 4,1 ! 3,2! 3,1 ! 3,O ! 3,O !
! ! ! ! ! ! ! !

Tableau XI - REnuRtatj de -ta cna.i&arzce d’A. henneboryii &.UL @uke

de manioc ci c&@/zev&ti hutxi.dLié~ .i~Ueb.
Cancltiorti de cm&havtce put 700 g de. @cine ;
5 g de Ktt2P04 ; 17,25 g de (NH4)2S04 ;7,? g d’wcéc. ;
pH ini;tiae du <oduLt : 5 ; tempénatum 30’ C ;
a@ukLon 4 L/h/incubnteti. DuMe de R'LneubcuXon 30 h.
 87

On remarque que l'augmentation, de la teneur en eau favorise la consom-

mation des sucres et la perte du poids sec. Par contre au-delà de
50 % d'eau,la synthèse des protéines et le rendement global de la
croissance n'augmentent pas. D'autre part, au cours de l'incubation
il se produit une humidification progressive du produit. En partant
d'une teneur initiale de 50 % d'eau on obtient,après 30 h,un pro-
duit contenant environ 63 % d'eau. Cette humidification n'est pas ,
liée à la seule perte de poids sec car la quantité totale d'eau con-
tenue dans l'échantillon augmente en fonction de la croissance du
mycélium: Cette augmentation est dûe vraisemblablement à l'eau méta-
bolique produite lors de la combustion du glucose :

C6H1206 + 6 02 --9 6 CO2 + 6 H20 11

Malgré cette augmentation de la teneur en eau totale, on peut se de-

mander si la quantité d'eau dans le produit amylacé résiduel est suf-
fisante en fin d'incubation. En effet, le mycélium possède une te-
neur en eau voisine de 80 %. Cette eau de constitution cellulaire
n'étant pas de l'eau libre, la teneur en eau disponible dans le pro-
duit amylacé résiduel peut devenir inférieure à 30 % et provoquer le
ralentissement ou l'arrêt de la croissance. Cette question de la li-
mitation de la croissance par manque d'eau sera étudié plus en détail
dans un chapître suivant.

2 - INFLUENCE VE LA TEMPERATURE

La température joue un rôle prépondérant sur la croissance, la ger-

mination et la sporulation des champignons, mais aussi sur leur mé-
tabolisme. En effet l'influence de la température sur les moisissu-
res est complexe. En particulier, les températures extrêmes de crois-
sance, de germination et de sporulation peuvent être très différen-
tes. La thermotolérance est très variable suivant les espèces :
A. nigeh tolère une température maximale de croissance proche de
50" C, mais pousse encore à une température inférieure à 20" C (26).

Nous avons vu précédemment que notre souche d'A. hennetgi,( possède

 88

un spectre de thermotolérance tout à fait en accord avec la littéra-

ture, bien que son optimum de croissance situé entre 35 et 38" C soit
relativement élevé. En plus de son influence sur l'organisme lui-même,
la température agit également sur l'activité de l'eau et sur les cour-
bes de sorption. Sans avoir voulu aborder tous les aspects de ce pro-
blème, nous avons cherché à déterminer pour la souche d'A.henn@@ CV?
nusavons utiliséeles meilleures conditions d'incubation pour sa cultu-
re sur substrat amylacé solide.

Pour cela nous avons réalisé des études cinétiques de la croissance

à 30, 35,.40 et 45" C en utilisant un produit initial à 50 % d'eau.
Les résultats qui sont rapportés sur la figure 11 montrent que les
meilleures croissances sont obtenues pour une température située en-
tre 35 et 40" C, ce qui correspond effectivement à la température op-
timale de croissance de notre organisme.
 10 20 30

temps ( h)
Fig#e II - ln#hcncc dc la Aempéhahhe d’i.ncubtian AWL La
C~OiAAariCe en Od?ieu AU&dC

A 45" C on observe une augmentation importante de la phase de germi-

nation. Toutefois la vitesse de croissance du mycélium est encore
relativement importante. Ceci montre que la souche que nous avons uti-
lisée peut supporter des variations de température importantes. De
même les températures optimale et maximale de germination des spores
sont relativement élevées. Nous rappellerons à ce sujet que la ther-
motolérance êtait.un critère de sélection de l'organisme, car elle
'permet de simplifier les problèmes de refroidissement des produits
en fermentation.
 3 - CONTROLE '>AUTOGENE" DU pH

Le pH du milieu est un facteur essentiel dans ce type de fermentation.

11 doit être suffisamment acide dès le début pour éliminer les ris-
ques de contaminations. Cependant lors de la croissance, il se pro-
duit une acidification très importante qui amène rapidement le pH aux
environs de 2,4, lorsqu'on utilise un mélange de phosphate monopotas-
sique et de sulfate d'ammonium: Cette forte acidification tend à ra-
lentir et même à stopper la croissance du mycélium après 10 à 15
heures d'incubation. C'est pour cette raison que nous avons cherché
un moyen simple de tamponner kmlleuen apportant l'azote sous forme
d'un mélange de sulfate d'ammonium et d'urée.

REAOE & GREGORY(88) ont observé qu'en partant d'un milieu liquide
à pH 3,5 et en apportant tout l'azote sous forme d'urée, le pH était
pratiquement stable tout au long de la phase de croissance d'A. @ni-
gatud. Ceci leur a permis de supprimer les appareils de contrôle et
de régulation de ce paramètre.

L'urée présente l'avantage de ne oas libérer d'acide minéral fort

dans le milieu lors de son assimilation, comme c'est le cas avec le
sulfate d'ammonium. En léger excès, son hydrolyse conduit
à l'accumulation d'ions ammonium qui peut compenser une éven-
tuelle acidification par des métabolites acides. Cependant si l'excès
est trop important, il peut entraîner une alcalinisation trop forte,
favorisant les contaminations.

Il apparaît donc qu'un mélange de sulfate d'ammonium et d'urée peut

avoir un effet tampon sur le pH du milieu et donc favoriser la
croissance du mycélium. Nous avons fait des expPriences dans cette
voie pour déterminer les conditions optimales d'utilisation de l'urée.

Des études cinétiques de croissance ont donc été faites sur des pro-
duits ayant reçu des doses croissantes d'urée, la quantité d'azote
total étant constante. Le substrat initial contenait 50 40 d'eau. Le
liquide contenant les sels minéraux et les spores a été ajusté à
 91

pH 3,5. La température d'incubation était de 30" C.

Pour réaliser les différents mélanges tampon, tout en conservant une

dose constante d'azote total, les quantités suivantes de sulfate d'am-
monium et d'urée ont été ajoutées en solution avec 5 g de phosphate mo-
nopotassique et mélangées à 100 g de farine de manioc :

! % N - urée! 4: N-NH3 ! Sulfate d'ammonium ! Urée g/lOO g de !

! ! ! I
g/lOO g de farine L farine
! I l I I
0 ; 100 ; 15,0 I 0 !
!
! 10 ! 90 ! 13,5 ! 0,68 !
I
! ! 12,0 1,35
20 80
! ! ! !
! 40 ! 60 ! 930 ! 2,70

! 60 ! 40 ! -530 ! 4,05

D'après les résultats qui sont rapportés sur la figure 12, on consta-
te une influence très nette de la dose d'urée sur l'évolution du pH
du produit et sur sa teneur en protéines , montrant ainsi l'effet bé-
néfique de l'apport d'urée. La dose optimale d'urée est dans ce cas,
assez faible car le pH initial du produit était relativement élevé
(pH = 5,2). .

Nous avons fait une seconde série d'expëriences, en abaissant plus

fortement le pH initial du produit, et en partant de 6 doses d'urée,
allant de 0 à 100 % de la quantité d'azote ajouté (figure 13). Dans
cette expérience tous les prélèvements ont été faits après 30 heures
d'une incubation à 35" C et comportant une aération de 4 litres/heure/
incubateur. Pour obtenir un pH initial du produit de 3,5, la solution
contenant les sels minéraux et l'inoculum de spores a été ajusté à
pH = 2,25 avec de l'acide sulfurique pur.
 6

10 20

temps (h)

F.Lgwte 12 - in@uenee de t?léfCangeA atampon amwdutn - u,tEe clwr Le pH

eaz ~?CLctrodbance en JJL&&?.u M!i.de. Po~cwNW d'N-~W
?J Jbtd:
0% u 20% M 40 %
60 % M 80%
8

Le fait d'apporter l'azote sous forme d'un mélange d'urée et de sel

d'ammonium dans les proportions optimales permet de doubler la
quantité de protéines synthétisées par rapport à celle obtenue lors-
qu'on n'utilise que du sulfate d'ammonium.

Il est donc possible de contrôler et d'orienter la croissance en

jouant 2 la fois sur le pi! initial du milieu solide et sur les pour-
 94

centages d'azote apporté sous forme d'urée et de sulfate d'ammonium.

4 - TNFLUENCE DE L’AERATION

La quantité d'oxygène mise a la disposition du mycélium est un fac-

teur important de son développement. Cette quantité doit être suffi-
sante pour ne pas limiter sa croissance. Elle dépend de la vitesse
de diffusion du flux gazeux dans la masse du produit,de la vitesse
de transfert de l'oxygène dans' le milieu et de la vitesse de consom-
mation d'02 par le mycélium pour sa respiration.

Nous n'avons pas étudié ici en détail tous les aspects de cette
question qui sera reprise de façon plus approfondie dans un chapitre
ultérieur (cf. respiration). Nous avons seulement voulu vérifier si
le debit d'air que nous avions fixé arbitrairement était suffisant
pour apporter l'oxygène nécessaire a la croissance du mycélium dans
les dispositifs d'incubation que nous utilisons.

Pour cela nous avons fait une expérience dans laquelle nous avons
aéré les incubateurs à 0 ; 0,5 ; 2 ; 4 et 8 litres/h Des analyses
ont été effectuées après 22 heures et 30 heures d'incubation à 30" C
en prélevant pour chaque débit 3-incubateurs servant de répétitions.

12 30 h

H-Q-- - - --*-L--- - -0
22 h
 95

Les résultats de la figure 14 montrent qu'un débit supérieur à 2

litres/heure/incubateur est nécessaire pour obtenir une bonne crois-
sance. Une aération plus importante n'augmente pas sensiblement la
croissance d'A. tigti dans les conditions de cette expérience.

Les échantillons qui n'ont pas été aérés (débit 0) révèlent une
croissance limitée après 2~ heures d'incubation, mais cette croissan-
ce est loin d'être négligeable. LecI peut paraître.surprenant puis-
qu'il s'agit d'une croissance essentiellement aérobie. Toutefois
on peut expliquer cette croissance en remarquant que les incuba-
teurs utilises sont des systèmes ouverts à l'air libre, et que Le
produit est essentiellement poreux ce qui permet des échanges gazeux
non négligeables.avec l'atmosphère.

Nous n'avancerons pas plus ici dans nos conclusions, mals nous re-
tiendrons qu'une aération de 4 l/h/incubateur est largement suffi-
sante pour assurer une bonne croissance. Etant donnée la quantité
de substrat contenu dans l'incubateur (10 g), on constate que le
transfert d'oxygène est très efficace dans notre technique de cultu-
re. Pour assurer une croissance identique en milieu liquidaagité,
il faut en effet utiliser un débit d'air au moins 4 a 5 fois supé-
rieur.

5 - DENSITE DE L1iEIuCf.f~UM VE SPQORES

L'inoculation par les spores de la souche de champignon doit être

suffisante‘ pour assurer un ensemencement homogène du substrat et un
démarrage rapide de la croissance de façon à éviter une éventuelle
compétition avec des contaminants.Cependant l'inoculum ne doit pas
ëtre trop important, d'abord pour aes raisons pratiques évidentes ,
ensuite parce qu'une densité de spores trop élevée peut entraîner
des phénomènes d'inhibition et diminuer le pourcentage de germina-
tion.

Pour déterminer Id quantité adéquate de spores à apporter, nous avons

surivi la croissance dans aes echantilluns ayant reçu des doses de
0 ; 4.10.5 > 4.107 et 4.108 spores par gramme ae farine-substrat
 96

(figure 15).

Les résultats montrent que les échantillons n'ayant pas été inocu-
16% par les spores ne révèlent pas de croissance micro-
bienne sensible. Les contaminations spontanées ne provoquent donc
pas de croissance décelable, du moins pendant les 30 premières
heures d'incubation, même dans les conditions non stériles.

o------w- o--e- - - -

1'0 2'0 temps h

0

o----cl : PU.A d'i~~ocuhn ; D-43: 4.7@ hpOkeci/g

- : 4.107 npo@.b/g ; - 4sog 6pOhe.4/g
 97

Les échantillons ayant reçu l'inoculum le plus concentré démarrent

plus rapidement que les autres, cependant,la croissance s'arrête plus
tôt et devient rapidement linéaire. Par ailleurs un examen microsco-
pique du produit après 30 heures révèle qu'une proportion importante
de spores n'a pas germé.

Les cinéttques de croïssance correspondant aux deux autres inocula-

tions sont assez voisines. L'examen microscopique révèle qu'une très
faible proportion de spores n'a pas germé dans les échantillons ino-
culés avec 4.107 spores/g ; aucune spore non germée n'a pu être ob-
servée après 30 h dans les échantillons ayant recu 4.106 spores/g.

Nous pouvons donc conclure qu'une dose d'inoculum de 2.10' spores/g

de farine, est suffisante pour obtenir une bonne croissance, et ne
semble pas excessive. Cette concentration a donc été adoptée par la
suite.

II. Dl?TERMINATION DES CONDITIONS OPTIMALES

L'étude de l'influence des facteurs de l'environnement nous a permis

d'obtenir de nombreux renseignements concernant la conduite de la
culture d'un champignon sur substrat amylacé.

A partir des résultats obtenus, nous avons pu déterminer des condi-

tions optimales d'incubation pour la croissance de notre souche
d'A. hennebe+U sur farine de manioc en milieu solide (voir page
91). Ces conditions ont été adoptées pour toute la suite de notre
étude.

La figure 16 représente l'évolution cinétique de la synthèse des

protéines, du pH, de la consommation de substrat et de la teneur en
eau du produit lors de la croissance d'A. Ggcti n" 10 cultivée
sur farine de manioc dans de telles conditions.
 98

COMPOSITION DU MILIEU SOLIDE

- Substrat : 100 g de farine de manioc cuit

- Solution : 59 KH2P04

9975 g (NH412 SO4

2,4 9 Urée

2.10g Soores

95 ml d'eau

pH ajusté à 2,7 avec H3P04 9 N

CONDITIONS OPERATOIRES

- Humidité initiale : 50 g d'eau/lCO g de produit humide

- Inoculation : 2.107 spores /g de farine

- pH initial du produit : 4,5

- Poids d'échantillon/incubateur : 20 g

- Température : 35” c

- Aération : 4 1 d'air/h/incubateur
 99

o----o PH

68

56
A partir des résultats obtenus on est amené à faire les remarques
suivantes :

- On constate un arrêt de la croissance alors qu'il reste encore

30 à 40 % de sucres non consommés.

- La quantité de protéines synthétisées passe par un maximum à 24

heures d'incubation. La diminution ultérieure de la quantité de
protéines est dûe à l'action des protéinases et est liée à un début
d'autolyse du mycëlium. .

- La teneur en eau du produit augmente de la même façon que la con-

sommation de sucres, ce qui semble confirmer que cette augmentation
est bien liëe a l'activité respiratoire du champignon comme nous
l'avons dit précédemment.

Le problème essentiel dans ce type de culture vient de l'arrêt de

la croissance alors qu'il reste encore une quantitê importante de
sucres assimilables. La suite de notre travail a donc porté sur
l'analyse de la microflore, de la réaction d'hydrolyse de l'amidon
et sur l'étude cinétique des paramètres de croissance, afin de con-
naître les causes de cette limitation et proposer des solutions
permettant d'améliorer l'efficacité et le contrôle de la croissance
en milieu solide.
.. -.

CHAPITRE 4

BVOLUTIOM DE LA MICROFLORE
FONGIQUE ET BACTERIENNE
 103

1. COLONISATION DU SUBSTRAT SOLIDE PAR LE MYCELIUM

Le principe de la méthode de culture repose sur la transformation du

substrat amylacë servant de support solide au milieu de culture en
mycélium de la souche du champignon inoculé.

Dans la technique de culture liquide, le milieu est constamment agi-

té, ce qui permet de véhiculer à la fois le substrat et l'organisme
qui peut ainsi explorer tout son environnement.

Au contraire, dans notre technique de culture en milieu solide stati-

que, l'organisme doit se déplacer par ses propres moyens. Cela est
possible pour les champignons filamenteux grâce à leur mode d'allon-
gement apical et de ramification qui représente une façon efficace
d'explorer le substrat.

Pour mieux nous rendre compte du mode de croissance du mycélium et

de la façon dont le substrat est colonisé, nous avons effectué une
série de clichés au microscope électronique à balayage sur des
échantillons prélevés au cours de l'incubation (planche 1).

Le clichéla représente les grains d'amidon d'une farine de manioc

cru, qui n'a donc pas subi le traitement thermique que nous avons
décrit. On observe la forme sphérique de ces grains d'amidon très
denses et peu accessibles aux enzymes.
PLanche 7 - Obbenva.tion en michodcopie c?.Letiotique ii balayage de
!.a colon&tion du hubhatkaat amyk?.acé pah .te mycé.tium
d’A. hennebugü
(Lu cLLch?h ont tié tréa.LihEh au RabohaXoike d’Eeo.togie GénWe du
Mti ém Na;tional d’ ft.i&oltLe Natwr~,Ue à Btutno y)
a = g&ns d’amidon de manioc crrr~
b = Apoh@A d’A. he.nrzbtig.ü
Hanche 1 (nui&
c = gxaiti d’amidon cti LnocuRéd avec &A npohes (X01

d = g~&akLon des sponed (Incubation b he.uhti)

e = déveLoppemwt du mycG.Lium à la bwqiace de-h gnainh d’amidon

b = edtion de pana% myctienn evctne &A gn& d’amidon (A: = 16 h

g = aspect généAa.t du p-todti à t = 20 h d’ikcubaüon
h = c?.tWakinAeJneti ;to;tae e,t digestion du gna.& d’amidon [R = 24 h)
 106

Le clichélb représente les spores de la souche d'A. he.vuwbe@ti

utilisée pour l'inoculation du produit.

Sur le c ichë lc on peut observer l'aspect du substrat au temps

zéro de 'incubation, après l'addition des sels minéraux et de l'ino-
culum de spores que l'on remarque à la surface des grains. La farine
utilisée ici ayant subi le traitement thermique que nous avons dé-
crit, on constate que les grains d'amidon gëlatinisé sont plus gros
que les grains d'amidon cru ; ils ont acquis une forme plus angu-
leuse stratifiée et poreuse.Ils peuvent retenir plus d'eau capillai-
re et sont beaucoup plus accessibles à l'attaque des amylases.

Après 6 heures d'incubation (d)tisspcws cnt émis leur tube germinatif

qui ne présente pas encore de ramification. Par la suite le mycélium
se développe et se ramifie à la surface des grains d'amidon (e) qu'il
recouvre entièrement. Des ponts mycéliens (f) se créent, reliant
les grains d'amidon entre eux et provoquant la prise en masse du
produit après 14 à 16 heures d'incubation. Après 18 - 20 heures d'in-
cubation (g) tous les grains d'amidon sont recouverts d'un tapis de
mycélium, mais conservent une structure cristalfine que l'on devine
encore. Enfin après '24 heures d'incubation (h) les amylases secrê-
tées à l'intérieur des grains ont provoqué l'hydrolyse de l'amidon.
Le mycélium a pu alors pénétrer en profondeur et envahir totalement
le substrat. A ce stade la structure du produit n'est plus assurée
par l'amidon qui est entièrement hydrolysé mais par le feutrage du
mycélium qui conserve au produit sa nature spongieuse et poreuse.

A la lumière de ces clichés on peut constater la relative homogénéi-

té du mycélium qui se trouve toujours dans la phase de développe-
ment végétatif et qui n'a pas encore entamé de processus de diffé-
renciation et de fructification à ce stade de la culture, comme en
témoigne l'absence de conidiophores et de têtes conidiennes.
 107

Les renseignements que l'on peut obtenir grâce à l'observation en

microscopie électronique à balayage indiquent que le développement
mycélien en milieu solide ne se réalise pas de la même manière qu'en
milieu liquide agité (figure 17).

En culture liquide, lorsque la croissance est filamenteuse,on cons-

tate un développement mycëlien sans organisation particulière qui
semble s'orienter au hasard. Dans le cas de la formation de'pellets"
la croissance du mycêlium, partant d'une spore qui reste centrale,
tend à la formation d'une pelote. Le développement du mycélium se
déroulant à la périphérie et le substrat disponible se trouvant à
l'extérieur du.:lpelle$: la taille de ia pelote peut augmenter tant
qu'il reste du substrat dans-le milieu de culture.

Au contraire, dans le cas de la culture sur le substrat solide, on

constate une organisation du développement mycêlien qui se produit
essentiellement,à la surface du substrat. La surface des grains d'a-.
midon étant un paramètre physique déterminé dès le début de la fer-
mentation, la croissance mycêlienne conduit à la saturation de la
surface disponible. Le mycélium pénètre alors à l'intérieur des
grains. Mais là encore,le développement sera limité par le volume
occupé par le substrat. En effet contrairement à ce qui se produit
dans le cas des'pellet;: c'est le mycêlium qui se trouve â la sur-
face extérieure et le milieu contenant le substrat carboné et l'eau
qui se trouve à l'intérieur (figure 17).
I grain d’amidon
en coup d

milieu liquide milieu solide

 109

On conçoit ainsi que si la nature du mycélium et les processus biolo-

giques restent les mêmes, les mécanismes de croissance en milieux so-
lide et liquide sont très différents. Dans ces conditions il est dif-
ficile d'envisager de pouvoir appliquer telles quelles les connaissan-
ces acquises en culture liquide. Il est donc indispensable d'étudier
les processus de croissance sur substrat solide pour pouvoir expli-
quer les cinétiques de croissance, connaître les causes de la limita-
tion du développement mycélien et contrôler les fermentations solides.

II. EVOLUTION DE LA MICROFLORE BACTERIENNE AEROBIE

La technique de culture n'utilise pas de substrat stérile ni de con-

ditions aseptiques pour la préparation du milieu solide et pour l'in-
cubation. Le développement sélectif du mycélium doit donc être assuré
par des conditions sélectives du milieu à savoir : un pH acide, une
faible teneur en eau et un inoculum massif des spores de la souche
étudiée.

Les études au microscope à balayage ont bien montré le développement

massif'du mycëlium, toutefois il est apparu nécessaire d'étudier
l'évolution des contaminants bactériens au cours de cette croissance
aérobie, car les substrats non stérilisés contiennent une microflore
bactérienne initiale souvent importante.

L'étude cinétique de l'évolution de cette microflore bactérienne a

été suivie pendant la croissance en milieu solide d'A. tige& n" 10
dans les conditions standard écrites dans le tableau XII. Des incu-
bateurs en 3 exemplaires ont été prélevés au cours d'une incubation
de 30 heures. La microflore aérobie totale a été mesurée sur les dif-
férents échantillons par la méthode de dilution, étalement sur boîtes
de Pétri et comptage des colonies. Pour cette détermination nous
avons utilisé un milieu standard P.C.A. (Plate Count agar, réf.
Institut Pasteur S 6462 contenant pour 1 litre : 5 g de peptone,
2,5 g d'extrait de levure et 1 g de glucose et ayant un pH = 7).
Les résultats rapportés sur la figure 18 montrent que le niveau de
la microflore est pratiquement stable tout au long de la période
de croissance du champignon. Lorsque le pH du produit descend au-
dessous de pH 4, après 20 heures d'incubation, le nombre de contami-
nants aërobies diminue rapidement en quelques heures. En fin de
culture, on obtient près de 10 fois moins de contaminants que dans
la farine initiale.
 111

Il est important de noter que lors de la culture du champignon sur un

substrat amylacé solide en conditionsnon stériles, on n'observe pas
de prolifération des contaminants bactériens dans les conditions que
nous avons choisies et que le nombre de ces contaminants diminue
même de façon importante lorsque le pH devient acide. Ceci confirme
bien les observations microscopiques et nous permet d'affirmer que
l'augmentation de la quantité de protéines est bien liée au dévelop-
pement du champignon filamenteux.

Le nombre relativement élevé de la microflore aérobie totale

(2,5. 10" germes/g) correspond à ce que l'on obtient généralement dans
les farines utilisées en alimentation animale. Le nombre de contami-
nants dépend essentiellement du mode de préparation de la farine
(lavage des tubercules, conditions de cuisson et de sèchage). En pre-
nant les précautions nécessaires, on pourrait parvenir à la prépara-
tion d'une farine exempte de contaminations importantes. Cependant
puisque l'objectif visé était de parvenir à la mise au point d'un
procédé de fermentation simple ne faisant pas intervenir de condi-
tions aseptiques strictes, nous n'avons pas voulu compliquer inu-
tilement' la technique.

Il est intéressant de constater que cette microflore initiale ne

gêne pas le développement sélectif de la souche du champignon amylo-
lytique et que ce type de fermentation en milieu solide tend, au
contraire à améliorer la qualité bactériologique du produit.
III. GENERALISATION DE LATECHNIQUEDECULTURE

Pour que la méthode de culture que nous avons mise au point à par-
tir d'une souche d'A.I~~~7u~bV~giX orésente un interêt réel,
il est indispensable qu'elle puisse s'adapter facilement à la
culture d'autres souches de champignons, et à d'autres types de
substrats amylacés. Pour cette raison, nous avons réalisé des cultu-
res en changeant la souche utilisée pour l'inoculation ou en chan-
geant le substrat amylacé tout en conservant les conditions d'incu-
bation précédemment décrites.

1 - INFLUENCE VE LA S0UCHE DE CHAMP'IGNON

Pour connaître la spécificité de la technique vis-à-vis de la sou-

che de champignon filamenteux utilisé, nous avons rëalisé une série
de cultures sur farine de manioc à partir des souches que nous
avions isolées et qui fournissaient de bons rësultats lors du scree-
ning en milieu liquide. Nous avons également testé de nombreuses sou-
ches de champignons provenant de collections et dont la plupart sont
impliquées dans la préparation traditionnelle d'aliments fermentés
asiatiques. Sur une centaine de -souches qui ont été testées, la
moitié a fourni des résultats satisfaisants en culture solide. Le
tableau XIII rapporte les résultats des souches qui ont révèlé les
meilleures croissances sur farine de manioc. On constate des varia-
tions importantes concernant les vitesses de croissance et l'effi-
cacité de la transformation du substrat en biomasse. L'évolution du
pH révèle également des différences notables.

Il faut toutefois remarquer que les souches les plus faciles à cul-
tiver par cette technique appartiennent en grande majorité au genre
A.~pe~gi&Tu~ et que l'emploi de la méthode est conditionné par la
possibilité d'obtenir des quantités de spores suffisantes.

Des souches appartenant au genre Pcrn.iciJ!Lkt~~ ont pu éqalement être

cultivées par cette technique. Par contre les espèces appartenant
au genre Rhizoyus et E4uco4 que nous avons utilisées n'ont pas tou-
 I ! ! ! !
Souche . Protéines formées Sucres consomnés pH final Pendment
! ! ! ! H
1 ! ! ! ! g
2 A. nigisrn. 145 69,4 331 mg
! ! ! ! ! !
7 A. ni@n 12,0 54.0 391 2L9
Y
! ! :
, 10 A. hennebehg.ü 14.1 73,0
!
392 !
19.3
E
! 11 AbpehgLP.& 4p. 6.8 50,l ! 698 ! I3,6 g
! 67,l ! 3,65 ! 18.3 !
14 A. .tticofa 12.3
1 ! I !!
, 39 Aspe>igiLba 6~. 10,5 62,2 5,7 16.9
! ! fi
! 72 A6peq.Uuh 6~. 12,3 74,9 ! 493 ! 16.4 !
1 E
! I 20.6 ! w
Tempeh Aspchg&!u~ dp. 13.8 67.0 * 339
! ! ! b
!
Ragi 3 A. ~em~icoCa 12,2 64.2 ! 336 ! 19,Q 2
, 61 A~~pe'~g~Uu~ 6~. ! 13.0 ! 65,5 I 4.0 ! I9.R k
! I , I I !
, t.102 Aapcngtieub np. ! 10,l ! 64,5 ! 630 ! 15,6 3
! MS4 A. ohyzac ! 13,8 ! 71,5 ! 4,O ! 19.3 E
! ! ! l ! !
H 101 Abpc4ggit&U bp. 10,5 76.4 * 430 13.7
! ! ! ! !
M 147 AbpckgiQPub SP. 10,4 73,l 4.7 14.2
! ! ! ! ! "
! FI 140 A. umnii ! 15.0 ! 81,0 ! 336 I 18.5 !
! ! ! 1 ! k
jours donné de résultats satisfaisants.

2 - INFLUENCE VE LA NATURE VU SLBSTRAT AMYLACE

Différents substrats amylacés ont été testés suivant ndre technique

de culture en utilisant la souche d'A. hennebe~ggii comme inoculum.
Les matériels amylacés ont été-traités de la même façon que les raci-
nes de manioc pour obtenir une farine qui a été utilisée
comme substrat pour la constitution du milieu solide.

Tous les substrats ont été testés dans les conditions opératoires
habituelles (Cf. Fage 31) et analysés après 24 heures d'incuba-
tion.

?es rosultats obtenus indiquent que les différents substrats amylacés

testés ont permis une croissance importante du mycélium du champignon
comme en témoignent les changements de la composition des produits
en protéines et en sucres assimilables (Tableau XIV). Ceci montre que
la technique de culture en milieu solide n'est pas liée à l'emploi
d'une farine amylacée particuliere , et que de nombreux substrats
amylacés, convenablement traités, peuvent être utilisés.
 125

I 1
! Composition initiale ! Composition finale
! Substrat ! ! !
! ! ! ! ! !
Protéines Sucres Protéines Sucres
! ! !
!assimila- ! assimilables!
! ! ! bles ! ! !
! ! ! ! ! !
Manioc 2,5 90 18 30
! ! ! ! ! !
! Banane ! 654 ! 80 ! 20 ! 25 !
! Résidu banane ! 6,5 ! 72 ! 17 ! 33 !
! ! ! !
Pomme de terre 5,0 ! 90 . ! 20 35
! ! ! ! ! !
! Pulpe de pomme ! !
! ! !
! de terre 530 ! 65 ! 18 28
! ! !
! ! ! ! ! !

TabLe.au XIV - CaoM6ance d’A. hmwbetr_o.ü bu& di~~éketi subn.ttti

cmdméb. CondLGon~ de cuRtwru déchiteb E La
pwe 97 ; dutEe d’incubation 24 h ; héd~

exphUnés en poticentage du poti bec de .tféchaMon.

IV. CONTRÔLES BACTERIOLOGIQUES

Puisque ces recherches sur la culture de champignons filamenteux,

réalisée en conditions non stériles, étaient destinées à conduire
éventuellement à la fabrication de produits devant être utilises en
alimentation animale, nous avons été amenés à effectuer des analyses
bactériologiques concernant la recherche de contaminants microbiens .
pouvant poser des problèmes sanitaires.

Ces contrôles sanitaires ont été effectués sur les échantillons ob-
tenus à partir des souches cultivées sur farine de manioc et dont
les résultats de la fermentation ont été rapportés dans le tableau
XIII.
! I ! I ï
N" Souche Microflore aérobie! Microflore anaé- Test coliformes Test Salmonellec ! Cicroflore fongique! Mycotoxines
I ! I ! I ! ?
colonieslg ' robie colonies/o colonies/? coloniesf~ colonieslg
! I I ! I ! I ! !
~-_. _-
! 2 ! 1 ! ! ! !
4. Hil)e? 1,2 x d ' négatif néptif nép,itif ?,C x 1c2 negatif
! ! ! l ! I ! !
4. Higc t ! 1,5x107 , négatif , négatif néytif ! 2,3 x 103 I nëgatif
! ' ! !
! 10 A. IzwwbcttgLL ! 1,3 x 10~ ! négatif ! népatif ! népatif ! 32x103 1 négatif c
I ! H
! 11 b:!.mgiefw AI). ! 1,0x107 ! l,o x 104 ! 2,0x103 nécrtif ! 2,3 x 103 nëgatif
! I ! ! ! ! ! !
! 14 A . tc’i’iicrh7 ! 5,0 x 10’ , négatif nénatif , népatif ! 3,O x 1Q3 I négatif !I
!
! 6,O x 106 ! G,O x 103 ! ne:atif ! négatif I 8,0 x 104 ! négstif
I I I 5,6 x 104 !
! 1,5 x 107 ' négatif ' négatif ' négatif n&Jatif
! I ! ! !
! l,o x 106 , négatif , négatif , néoatif 8,0 x 104 négatif
! x
! 3,0 x 107 ! nénatif ! nénatif ! négatif 2,5 x 103 ! négatif n
! ! ! !
! 3,o x 107 nCgatif néoatif négatif 1,l x 103 nëgatif
! ! I I I !
] 1,o x 107 , 2,o x 103 ! 2,2x103 , négatif ! 5,0x 1c* negatif

! 4,0 x 107 ! 2,6 x 103 ! négatif ! négatif ! 1,4x103 négatif

I I
! Il 101 Aqx'igiCkl& ip. ! 1,s x 107 ! 4,0 x lC3 n+atif négatif ! 2,5 x 105 négatif
I ! ! I I I I
7 2 ? 7
! El 147 45yecgirPu5 ,p. ! 1,6 x 10’ ! l,o x 10’ , 3,2x 10' , @atif ! 1,0x10’ 1 négatif
!
I ! ! I I 1 I ?
----
 117

Les analyses concernant la détermination de la microflore anaérobie

totale, des germes Coliformes, des Salmonelles et de la microflore
fongique ont été réalisées selon les méthodes classiques dans les la-
boratoires du T.I.S.T.R. à BANGKOKen ThaTlande. Les analyses concer-
nant la recherche de la présence éventuelle de mycotoxines dans les
échantillons ont été réalisées dans les laboratoires de la Société
SANDERS à ATHIS-MONS, France, par la méthode A.F.N.O.R. de STOLOFF
basée sur la fluorescence U.V. des mycotoxines après chromatographie
sur -laque des échantillons.

Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau XV. Ils montrent
que la microflore aérobie dans les échantillons obtenus après 30 heu-
res de fermentation est sensiblement toujours du même ordre de
grandeur quelle que soit la souche utilisée (107 germes/g de poids sec).
Ce résultat montre que le comportement de la microflore baclérienne
aérobie n'est pas liée à la souche de champignon mais plutôt aux condi-
tions mêmes de 1-a technique de culture en milieu solide.

La microflore anaérobie totale est toujours très faible et dans la plu-

part des cas infërieure à 103 germes/g. Les conditions d'oxygénation
du produit en fermentation sont donc parfaitement bien maintenues
dans la technique de culture en milieu solide que nous utilisons.

Quant aux germes pathogènes (coliformes et salmonelles) les résultats

des tests sont en général négatifs, à quelques exceptions près pour
les coliformes. Ils ne sont en aucun cas supérieurs à quelques mil-
liers par gramme, ce qui ne représente pas d'inconvénient majeur dans
l'optique d'une utilisation en alimentation animale.

La très faible teneur des produits enrichis en spores de moisissures

(quelques milliers/g) est également intéressante à noter, car elle
montre d'une oart que la majorité, sinon la totalité des spores que
nous avons ajoutées initialement ('Z.107 spores/g) ont bien germé, et
que d'autre part nous n'avons pas obtenu de sporulation significative
du champignon après 30 heures d'incubation.

Enfin le tableau XV indique l'absence de mycotoxines dans les pro-

duits obtenus à partir des souches que nous avons utilisées.
V. CONCLUSIONS

L'étude de l'évolution de la microflore au cours de l'incubation nous

a fourni des résultats importants.

Les observations en microscopie à balayage électroniquetoLsoti permis

d'obtenir des renseignements sur le mode de colonisation du substrat
amylacé par le mycélium du champignon. Celui-ci se développe essen-
tiellementsWla surface des grains d'amidon, puis à l'intérieur des
grains lorsque l'attaque enzymatique permet aux filaments d'y péné-
trer. Ce mode de développement, essentiellement différent de ce qui
se produit en milieu liquide agité, peut conduire à une limitation
de la croissance, dont les causes sont spécifiques d'une croissance
sur substrat solide. Dans ces conditions, l'application directe des
connaissances de la culture en milieu liquide ne peut suffire à ex-
pliquer les cinétiques de croissance, et l'étude des mécanismes de
croissance en milieu solide est indispensable.

L'évolution cinétique de la microflore bactérienne, ainsi que les

différents contrôles bactériologiques effectués montrent qu'on n'ob-
serve pas de prolifération des bactéries aérobies et anaérobies au
cours du développement mycélien. La croissance sélective du mycëlium
n'est pas liée à l'emploi d'une souche de champignon particulière,
mais plutôt à la nature du substrat, aux conditions de l'environnement
et à la technique même de culture sur substrat solide;

Les résultats des analyses montrent que les conditions aérobies sont
bien maintenues tout au long de l'incubation.

La méthode de culture que nous avons mise au point spécialement pour

la réalisation de cette étude n'est pas liée à l'emploi d'un substrat
amylacé particulier ou à une souche de champignon filamenteux. Au
contraire, un grand nombre de souches appartenant à des espèces diffé-
rentes d'Anpe4gZ&n ont été cultivées avec succès par cette méthode.
D'autres champignons appartenant à des genres différents sont suscep-
 119

tibles d'être utilisables à condition qu'ils présentent une activité

amylasique importante et que l'obtention d'un inoculum de spores suf-
fisant ne pose pas de problème insurmontable.

Différents produits amylacés convenablement traités peuvent être uti-

lisés comme substrat pour la préparation du milieu et la culture de
champignons sur substrat solide. Ceci permet d'envisager la possibi-
lité de faire varier la composition du milieu de culture, en fonction
des exigences des organismes à cultiver, grâce à l'emploi de farines
de composition et de nature différentes, ou même de mélanges de fari-
nes.
 CHAPITRE 5

ETUDE BIOCHIMIQUE
DE LA FERMENTATION
 123

1. ETUDE DU SUBSTRAT AMYFACE

7 - COMP0SiTiON CHiMl2UE

Le substrat amylacé utilisé dans cette étude a été préparé à partir

de tubercules de manioc suivant le protocole décrit dans le chapî-
tre 2. Nous y avons également donne la composition de la farine uti-
lisé-comme substrat. Comme l'amidon représente environ 90 $ du poids
sec, nous nous attacherons surtout à l'étude de ce composant essen-
tiel du milieu de culture.

L'amidon de manioc, comme les autres amidons, est formé d'unités

glucose liées entre elles par des liaisons a 1 - 4 dans les chaînes
linéaires d'amylose et par des liaisons C( 1 - 6 pour les ramifica-
tions dans l'amylopectine. Sa formule brute s'écrit : (C6H1006)n.

Pour connaître le degré de ramification de l'amidon nous avons dosé

le nombre d'extrémités réductrices par unité de poids d'amidon. Le
rapport nous donne une approche du degré de polymérisation de l'ami-
don utilisé. Nous avons ainsi trouvé que l'amidon contient 1 unité
glucose réductrice pour 160 unités - glucose polymérisées, soit une
"unité de poids moléculaire" de 26.000.

Pour servir de substrat aux microorganismes, l'amidon doit être

préalablement hydrolysé en sucres assimilables. Hydrolyser l'ami-
don c'est couper les liaisons glucosidiques pour obtenir des chai-
nes de plus en plus petites et obtenir finalement du glucose.
L'hydrolyse de l'amidon s'accompagne ainsi nécessairement de l'aug-
mentation du nombre d'unités réductrices. Elle nécessite la parti;
cipation de l'eau comme réactif ; la réaction globale s'écrit :
 i24

(C6H1005)n + n H20 n C6H1206 (AH = 4200 cal/g)

amidon eau glucose chaleur d'hydrolyse

L'hydrolyse de l'amidon peut être réalisée soit chimiquement en mi-

lieu acide et à haute température, soit enzymatiquement par des amy-
lases.

2 - PROPRIETES PHYSlQLIES

Nous avons vu que le conditionnement du substrat est un paramètre

important dans la culture en milieu solide, car il détermine la po-
rosité du milieu, donc les conditions de perméabilité aux échanges
gazeux, ainsi que la surface de contact entre le flux d'air et ce
milieu de culture donc les vitesses de transfert d'oxygène.

La surface et le volume des grains d'amidon sont également des para-

mètres physiques importants dans le cas d'une croissance fongique
impliquant un contact étroit entre le mycélium et le substrat. C'est
pourquoi nous avons effectué le calcul des masses volumiques réelles
et apparentesdu milieu, et de la-surface disponible pour le dévelop-
pement du mycëlium.

Mab6e voh.mQue
-_--L------- héeUe
- ----- ---- : p

Le calcul a été fait pour le substrat solide humidifié à 50 Z d'eau,

et pour des incubateurs contenant 20 g d'échantillon .

Le volume occupé par le substrat dans la masse du produit s'écrit :

% 2-z 12,5 cm3

3 = - =
PS 058
avec :

!l = masse de la farine substrat = 10 g

S

= masse volumique de la .farine sèche = 0,8 g/cm3

clS
 125

Le volume occupé par l'eau est : Ve = 10 cm3.

Le volume total réel du produit dans l'incubateur est donc :

VR = Vs +,V, = 22,5 cm3

La masse totale dans l'incubateur :

MT = MS t Me + Msels = 21,71 g

La masse volumique réelle du produit humide est donc :

MT
p = -= 0,96 <L 1 g/cm3,
vR

Elle est approximativement égale à celle de l'eau.

Masne.
------------votkmnbyue
---- a~paente
------

Dans l'incubateur de 1,85 cm de diamètre le produit occupe une

hauteur de 12,5 cm soit un volume de :

VT = 33,O cm3

La masse volumique apparente est alors :

92- = 21,71
= 0,65 g/cm3
vT 33,6

POtrOAité du AubA;Drcd
-------_______-_____

La porosité du substrat humidifié est égale au rapport de la diffé-

rence entre les masses volumiques réelle et apparente sur la masse
volumique réelle :
/
= 0,33
 i26

Ce résultat montre que dans l'incubateur 1/3 du volume est occupé

par le flux d'air et les 2/3 du volume sont occupés par le produit
humidifié. Le produit se présentant sous une forme divisée, on conçoit
que les échanges gazeux peuvent se réaliser dans de bonnes conditions.

Taux de secortvtrement
----_------------_-------------- du sub&tic&

Si l'on admet que les grains diamidon sont assimilés à des sphères
d'un diamètre moyen de 60 p, et que les soores ont un diamètre de
395 u, on oeut faire un calcul permettant d'estimer le taux de re-
couvrement du substrat par les spores.

Dans ces conditions oour recouvrir la totalité d'un grain d'amidon

il faudrait :

N = Surface de la sphère d'amidon

Surface d'une spore

soit :

R2
N= 4.n. A ,!. 1 200 spores/grain d'amidon
n . R2
A

Le volume d'un grain d'amidon

va=5 II. R3 = 1,13 x 105 ,m3

3 A

Le volume d'un gramme de farine étant :

VF = L-.- = 1,25 cm3 = 1,25.1012 um3

078
 127

On peut donc estimer le nombre de grains d'amidon dans un gramme

de farine :

"F = 1,l x 107 grains d'amidon/g farine

na =
"a

Pour recouvrir la totalité du substrat, il faudrait donc :

N, = 1,l. 107 x 1 200 = 1,32. 101' /g de farine

Une telle densité représenterait la saturation de la surface et le

mycélium n'aurait pas la place de se développer. Le taux de recouvre-
ment serait égal â 100 % de la surface disponible.

Pour l'inoculum de 2.107 spores/g de farine que nous avons utilisé

lors de cette étude, le taux de recouvrement initial par les spores
serait seulement de l'ordre de 0,15 % de la surface disponible, ce
qui laisse au mycélium toute la place nécessaire pour se développer.

Si l'on suppose que la surface de contact entre le mycélium et le

substrat est proportionnelle à la biomasse, le taux de recouvrement
du substrat doublera en même temps que la biomasse. On peut alors
calculer le nombre de doublementsqui conduit â un taux de recouvre-
ment de 100 %. On trouve ainsi qu'après 9 doublements le taux de re-
couvrement&76,8 %. On voit ainsi que la croissance de surface se
trouve rapidement limitée puisque le dizième doublement ne pourrait
pas s'effectuer uniquement à la surface du milieu. Sans accorder
une confiance trop grande à ce type de calcul toujours très approxi-
matif, on se rend compte pourtant de l'importance de la surface dis-
ponible et de la densité d'inoculum dans ce type de croissance sur
substrat solide.
Comme les autres microorganismes, les champignons doivent trouver
dans leur environnement tous les mat&iaux necessaires à la constitu-
tion de leur organisme et une source d'énergie qui leur permette d'ef-
fectuer les transformations nécessaires. Ces matériaux sont essen-
tiellement un substrat organique carboné, une source d'azote assimi-
lable et de l'eau. Pour leur approvisionnement en énergie les cham-
pignons ont besoin d'une source de carbone, d'oxygène et d'ions phos-
phate qui participent à l'élaboration des liaisons phosphorylés ri-
ches en énergie et qui servent au transoort de l'énergie récupérée
lors de la combustion du substrat donné.

Ici le substrat carboné est l'amidon qui sert à la fois à la cons-

titution de la biomasse et à la production d'énergie. La source
d'azote est constitué par un mélange de sulfate d'ammonium et d'urée.

1 - -REACTiON V'HYVROLYSE DE 1'AMVON

(C6H1005)n + n H20 + [FA‘1 > n C6H1206 + [Fpj rG7

amidon glucose

La réaction est catalysée par l'amylase EA, et la vitesse de produc-

tion de glucose est de la forme :

rglucose =
Kl.[‘pl.bd- h’,d t131
km f b'l . [@

lorsque les quantités d'amidon et d'eau sont en excès

rqlucose = K
1' kJ
 129

La concentration en amylase est proportionnelle à la quantité de my-

célium :

Donc la vitesse de production de glucose, lorsque l'amidon et l'eau

ne sont pas limitants, est proportionnelle à la quantité de mycélium

rglucose= K. [xl

L'hydrolyse de l'amidon est la première étape de la transformation

en mycélium. Elle est donc d'une importance capitale puisou'elle
détermine la concentration en substrat directement assimilable par
le champignon. L'étude des amylases et de la vitesse d'hydrolyse
lors de la croissance fera l'objet d'une attention particulière.

2 - REACTZONDE COMBUSTIONVU SUBSTJZATET RESPIRATION

Pour se procurer l'énergie nécessaire aux biosynthèses de matériel

cellulaire, les champignons comme les autres microorganismes, oxy-
dent le glucose suivant la réaction :

A 6 CO2 + 6 H*O (AH =-673 Kcal/mole)

'gH12'6 + 6 '2

Lors de la croissance, l'énergie libérée est récupérée lors du trans-

fert des électrons - les cytochromes. L'oxygène sert d'accepteur
final d'électrons et produit de l'eau.

L'ensemble de ces réactions constitue la respiration du glucose.

D'après l'équation de combustion on voit que le nombre de molécules
d'oxygène consommé est égal au nombre de molécules de CO2 produit.
Le quotient respiratoire est donc égal à 1.
Nombre de molesde CO2 pro<!uit
Q.R. = = 1
Nombre de moicsde O2 consommé
 ;30

Lorsque les conditions de croissdnce devietment 1 imltantes ou iors;

que le métabolisme est dévié vers la productioh d'un métabolite
autre que le C02, le quotient respiratoire peut changer.

L'énergie récupérée lors de l'oxydation du glucose est utilisée es-

sentiellement pour synthétiser une nouvelle quantité de matériel
cellulaire. Il peut également arriver qu'elle soit utilisée à d'au-
tres fins, dans le cas du découplage énergétique et conduireà l'ac-
cumulation de métabolites ou sc'rvir à la maintenance du matériel
cellulaire déjà constitué.

3 - --REACTION D'ASSlA17LATlUN DU SUKSTRAT ET BSOhjASSE

Le mycélium des champignons est constitué essentiellement de carbone,

d'hydrogène, d'oxygène et d'azote. Si on écrit sa formule brute :
C Hx Oy N, l'équation chimique de la biosynthèse devient :

a C6H1206 + b (NH4+, OH ) ,i CH, Oy NZ + c Hz0

Pour connaître la formule brute de la biomasse, nous avons effectué

l'analyse élémentaire du mycélium d'A. hPnnPbetig.;i cultivé sur fari-
ne d'amidon de manioc en milieu liquide. Sur la base de la matière
sèche nous avons obtenu :

c = 47,l % H = 6,4 %
N = 7,s '; o= 38%

A partir de cette composition élémentaire, nous avons calcul@ la

formule brute de la biomasse :

(' H1,62 OO, N0,14) = 2535

Cette formule brute du mycëlium d'A. h,~nnohctigii correspond bien aux

formules données dans la littérature pour les biomasses de microor-
ganismes (101).
Si oh admet que les protéines du mycélium, comme celles de la
plupart des autres microorganismes, contiennent 16 % d'azote
(protéines = N x 6,25) on peut estimer que la biomasse de ce champi-
gnon contient : 7,5 x 6,25 = 47 % de protéines, ce qui correspond
effectivement aux résultats trouvés précédemment et est en accord
avec les données de la littérature (102).

En supposant que le pourcentage de protéines dans le mycélium est

constant pendant la phase de croissance, on pourra alors calculer
la quantité de biomasse formée à chaque instant en divisant par
0,47 la quantité de protéines dosées.

Pour déterminer les coefficients stéchiomètriques de la réaction de

la synthèse de biomasse, i 1 suffit d'établir le bilan des 4 corps :
C, H, 0, N

C : 6a = 1

H: 12a + 5 b = 1,62 t 2 c

0 : 6a+b = 0,62 + c

N : b = 0,14

Disposant de 4 équations pour 3 inconnues, nous pouvons ainsi déter-

miner a, b et c et écrire l'équation stoéchiometrique de biosynthèse
du mycélium

1 C6H1206 + 0,14 (NH4+ OH-) + tc H1,62~0,62~0,14) + oy53 H2°

6

ou encore :

C6H1206 t 0,84 (NH4+ OH-) ----+ 6 (C H

1,62°0,62N0,14) + 3'18 H2°

Cette équ,ation permet de calculer un rendement théorique en matière

sèche de 85 % par rapport au glucose réellement assimilé. En consi-
dérant que le mycélium frais contient, comme la plupart des tissus
vivants, environ 80 % d'eau, la formule du mycélium frais devient :
Et la formule de synthese de la biomasse s'bcrit :

C6H1206 t 0,84 (NH4' OH-) c 30,4 Hz0 ----+ ml

g le H1,52 00,62No,14 ; 5,6 H$I)

4 - 2-...--.-..---
EoUATiON STOECHZ0METRZn,E GLOBALE VE LA CROTSSANCE

Le glucose consommé pendant la croissance est égal à la somme du

glucose dégrade par la respiration et du glucose assimile pour la
synthèse de biomasse : Si a + b = 1, on peut écrire :

1n (C6H10054, + $0 '- C6H1206

a 1C6H1206+6 O2 : 6 CO2 + 6 Hz0 1

b C6H1206 t 0,84 NH40H t 30,4 Hz0

6 (' H1,62 OO, N0,14 ' 5y ' H2°)

1

R (C6H1005)n + 6 a O2 t 0,84 b NH40H t (30,4 b - 6 a + 1) H*O

il61
6 b (C H1,62 OO, No,14 ; 5, 6 H*O) + 6 a CO2

Pour résoudre cette équation chimique il est nécessaire de calculer

a ou b, par exemple en déterminant la quantité de CO2 dégagé ou
d'oxygène consommé par rapport à la quantité de sucrgconsomrnés.
C'est ce qui sera réalisé lors de l'étude du métabolisme respiratoi-
re.
 133

III. ETUDE DE L'ACTIVITCAMYLASIQUE

De nombreux microorganismes synthétisent des amylases de différente

nature. On distingue ainsi :

CL- amylases - Ces enzymes coupent spécifiquement les liaisons gluco-

sidiques c1- (1 - 4) aussi bien en bout de chaîne qu'au milieu des
chaines d'amylose. Leur action fournit donc dès le début un mélange
de glucose, de maltose et de dextrines qui sont des sous-unités d'a-
midon plus ou moins longues et plus ou moins ramifiées. En fin de
réaction on obtient du glucose et des résidus correspondants aux
liaisons c1- (1 - 6) qui sont situées aux points de ramification
des chaînes.

B- amylases - Les 8- amylases coupent également les liaisons gluco-

sidiques c1- (1 - 4) mais uniquement à partir des points de ramifi-
cation et libèrent que le dimère du glucose c'est-à-dire du maltose.
Pour conduire au glucose une enzyme supplémentaire (maltase) est donc
nécessaire. L'action des B - amylases fournit donc dès le début sur-
tout du maltose qui est ensuite transformé en glucose.

Amyloglucosidases - Ces enzymes coupent les liaisons glucosideiques

CL - (l-4) uniqumt & partir des extrémités non réductrices et libè-
rent exclusivement du glucose. Leur action initiale est donc assez
limitée lorsque l'amidon est fortement polymérisé, mais on n'observe
que du glucose comme produit d'hydrolyse. On notera que l'action cou-
plée avec une c1- &@ase qui mltiplie les extrémités non réductrices
augmente de façon très importante l'action des amyloglucosidases.

D'après la littérature, AbPtigkUlLr\ ~I&X% produit essentiellement

des amyloglucosidases exocellulaires en présence d'amidon (20, 21,
103).

Etant donné l'importance de l'étape d'hydrolyse, nous avons étudié

en détail la nature, les caractéristiques et la cinétique du système
enzymatique nroduit au cours de la culture de notre souche.
 J.34

I - .-- NATIRE
ET LQCAL~SA~-SCJN
BE
-- L'ACTIViTE AWYLASTQUE

L'étude a été conduite sur des prélevements réalisés apres 40 heures

de fermentation pour le milieu solide et 24 h pour le milieu liquide.

L'activité amyiasique des echan-killons a G-L2 di3torwlnéa 3 la fois

par 1~ dosage des sucres r6dueteurs suJvant la m&hade au fewicyanu-
re et par le dosage specJfique .du glucose par la methode enzymatique
du "Glucostat".

Les quantités de sucres libérés dans le mélange réactionnel, dans les

conditions optima de dosage des enzymes, sont données dans le tableau
XVI.

-
! ! ! !
Origine de l'enzyme Sucres réducteurs Glucose
! ! ! !
estimés en glucose
! ! ! !
mg/1 mg/1
! ! ! !
! ! ! !
Milieu solide 174,2 167,l

! ! I !
Milieu liquide 137,6 117,6
! ! ! !

Tubeeau XVI - Natulle des buchccS tréducteum obtenus 10x5 de L’hgdxo&y-

OP de e’arnidon ~LXXt.e.6 ay&tCmeb mgLa&yues d’A. benne.-
be/rgii cuftiué en tniLieu liquide ou 4oLide.

Il apparaît ainsi que le produit de l'hydrolyse de l'amidon soluble

est dans les deux cas essentiellement du D - glucose. Les
systèmes amylasiques sont donc bien constitués en grande partie par
des amyloglucosidases.

Plous avons tenté de localiser le siège de cette activité par le dosa-

ge de l'enzyme dans le culot cellulaire et dans le surnageant obtenus
,aprës centrifugation.
 135

! ! !
Milieu solide Milieu liquide
! ! !
! ! !
Surnageant! culot !Surnageant culot
! ! ! ! !
! ! ! ! ! !
glucose : mg/1
! !
dans le mélan- 71,5 ! 153,4 ! 69,7 ! 201,4 L
! ! ! ! !
ge réactionnel !
! ! ! ! ! !
! I ! I I !
! % de l'activi- ;
31,8 ! 68,2 ! 25,? ! 74,3 !
L té amylasique L
! ! ! !
L totale
! ! ! ! !

TabLeau Xii?i - ioc&tiouz de L’ativtiE myh.shpe dans .W

m,iLikux de CU&WL~. d’A. hennebehg2 à btie de @Lne
de matioc.

Pour cela les échantillons provenant de la culture en milieu liquide,

et les échantillons provenant de la culture sur substrat solide, di-
luësselon le protocole décrit au chapître 2, ont été simplement centri-
fugés à 10.000 t/mn pendant 10 mn. Il apparaît, selon les résultats
rapportés dans le tableau XVII que dans les deux cas environ 70 % de
l'activité amylasique restent dans les culots de centrifugation. Il
semble donc que les enzymes amylolytiques synthétisés, quoique de
type exocellulaire restent fixés assez fortement à la paroi du mycé-
lium. Ce résultat est à rapprocher des travaux de MOULIN (97)
qui a 'montré la nature pariétale de certaines activités amylasiques
chez les levures. D'après cet auteur , il est possible de libérer
ces enzymes amylolytiques par des solutions tampon de pH déterminés.
 2 - ----e.--"--
PRQPRICTES DU SYSTEME AMYLASIflLIE
-----,A%-.

Cette étude a port6 sur des échantillons prélevés après 24 et 44

heures de fermentation en milieu solide et sur un échantillon préle-
vé après 24 heures d'une culture en milieu liquide réalisé en fermen-
teur BIOLAFFITTE de 2 litres. Le milieu de culture contenait 10 g/l
de farine de manioc. Le pH a été régulé à 3,5. Les autres conditions
opératoires sont les mêmes que pour la culture en milieu solide. Le
milieu a été inoculé avec 2.107 spores/g de substrat.

L'effet du pH sur l'activité enzymatique a été déterminé en utilisant

une gamme de tampons citrdir-phosphate ul!ant de pH 3 à 7.0.

La réaction a été conduite pendant 15 minutes à la température

optimum pour le type d'enzyme à doser. Les résultats obtenus sont
norti?s sur la fiqure 19.
A
Unités / 9. farine
Unités g. farine
A /
700
A 6

./“.
500 ./ 500
0 44h
/
e \
300

100

3 4 5 6 7 PH 3 4 5 6 7
PH
 137

Le pH optimum d'activité du système amylasique produit en milieu

solide se situe à pH = 4,5. L'enzyme présente une forte activité
dans ia zone située entre pH = 4 et pH = 5. A pH = 7 on n'observe
pratiquement plus d'activité.

Pour le système amylasique produit en culture liquide, l'optimum

d'activité est proche de pH = 5. D'après les soectres d'activité
obtenus, on constate que le système amylasique produit en milieu so-
lide tolère beaucoup mieux les pH acides que le système synthétisé
en milieu liquide. En effet dans le cas du milieu solide on n'observe
très peu de variations entre pH = 4 et pH = 5, alors que dans le
cas du milieu liquide on a perdu près de 40 % de l'activité pour une
même variation du PH.

- E44eX de La Remptitiwce
---_--_----- -------

Pour déterminer l'influence de la température, la vitesse d'hydrolyse

de l'amidon soluble, à partir des systèmes amylasiques provenant des
cultures liquide et solide, ont été suivies à des températures variant
de 30 à 85" C pendant 15 minutes, aux pH optima respectifs. La figure
20 montre les résultats obtenus.

Les enzymes synthétisées en milieu solide après 24 et 44 heures d'in-

cubation subissent les mêmes effets de la température et présentent
un maximum d'activité à 70" C.

Pour l'activité amylasique synthétisée en milieu liquide la tempéra-

ture optimum de réaction est de 50" C.

L'allure différente des courbes obtenues à partir des deux sortes de

milieu indique que les deux systèmes amylasiques ont un comportement
nettement différent vis-à-vis de la température.
 138

Unlt6e /g, tarino

e e
/ 24 h
0-o
/ 0’
0
_ ./ pRd \\
p/+o \, e
I I w
30 40 50 60 70 60 30 40 50 60 70 80
température “C température “C

Nous avons mesuré la valeur de la constante d'affinité apparente de

MICHAELIS MENTEN (Klm) pour l'amidon soluble avec des échantillons
prélevés après 24 et 40 heures d'une culture en milieu solide et
après 24 heures dans le cas de la culture en milieu liquide.

Le mélange réactionnel contenant 2 ml de tampon citrate-phosphate,

0,5 ml de la solution enzymatique à doser et 2,5 ml de la solution
d'amidon soluble à la concentration requise a été incubé 10 minutes
au bain-marie à température constante. Les conditions opératoires
adoptées sont rapportées dans le tableau suivant :
 139

!
!pH ; Température !mg échantillon !
! ! !sec dans la prise!
! ! ! ! d'essai
!
! ! ! ! ! !
! Milieu solide ! 24 h ! 435 ! 65” C ! 0,60
!
! ! I I I !
! ! 40 h ; 435 ; 65’ C ; 0,45
!
! I I I !
! Milieu liquide 24 h ; 5,0 ; 50” c ; 0,60
!

La valeur numérique dU k, a été déterminée selon la représentation

graphique de LINEWEAVER & BURK (104) et exprimée en g/l car le poids
moléculaire exact de l'amidon n'était pas connu (figure 21).

24h

1
s( mg amidon
dans 5ml )
~igwte 2 l- Vc!&,mintion ghapkique du Km appatrent du dyntèmeb amyla-
biquen bynthéLLbC!b en milieu na!.ide ti en cWe liquide.
 140

! ! Vitesse maximale 1 Valeur du Km apparent!

! ! ! !
911
! I ! I !
1 Milieu ! 24h! 230 I 1 1
L solide I ! I !
! 4Oh! 2,80 1
! ! !
! I I !
1 Milieu liquide 24 h ! 3,90 0,57
! !

Les résultats obtenus sont présentes dans le tableau XVIII.Vis-à-vis

del'amidon l'affinitê du systfme enzymatique synthétisé en milieu li-
quide est plus élevéeque celle du système produit en milieu solide.
Cependant les affinités restent du même ordre de grandeur.

Une approche de la mesure du poids moléculaire de l'amidon soluble a

été réalisée par l'étude du nombre de fonctions réductrices libres
pour un poids donné d'amidon. La valeur obtenue est de l'ordre de
26.000. Dans ces conditions, le Km apparent de l'enzyme en milieu so-
lide serait de 3,8.10m5 M et en milieu liquide de 2,2.10m5 M. Ces
valeurs sont à rapprocher de celle obtenue par PHILIPPS & CALDWELL
(105) pour l'amyloglucosidase de Rkzopub dehwc (4,4 10m5 M).
 141

- Dé-n thmigue --
______-_______-____

L'inactivation par la température a été étudiée en dosant l'activité

enzymatique résiduelle, après différentes durées d'incubation à des
températures comprises entre 30 et 85" C.

Les échantillons sont traités dans l'eau pendant des temps variables
de 0 à 30 minutes à des températures situées entre 30 et 85' C. Apres
ce traitement, le dosage de l'activité amylasique effectue, soit à
55" C pour l'échantillon prélevé après 40 heures d'une culture en mi-
lieu solide, soit à 40' C pour l'échantillon prélevé après '24 heures
d'une culture en milieu liquide. Une étude préalabiement avait établi
qu'aucune dénaturation ne se produit à ces températures de dosage.

% activiti % activitd
ordonnbs logarithiniquos ordonnier logarithmiques
t t
40145,
 142

Pour les enzymes provenant du milieu liquide, la dénaturation par la

chaleur aoparait pour des températures supérieures à 45" C. Après 15
minutes à 60" C, on observe une perte d'activité de 50 %. Un traite-
ment de 15 minutes à 65" C suffit pour détruire complètement l'enzyme.
Au contraire, un traitement à 65O C ne diminue pas l'activité de l'en-
zyme nroduit en milieu solide, même après 30 mn de chauffage.

3 - ClNETlQiE D'APPAR'ITION DES AMYLASES

La figure 23 montre les cinétiques d'apparition de l'activité amylasi-

que au cours de la croissance de la souche d'A. I~cw~cbehgti en milieu
solide (courbe 1) et en culture liquide (courbe 2). Les indications
ont été ooursuivies jusqu'à 60 heures pour connaître l'évolution des
systèmes amylasiques aprës la période de croissance.

1’0 2’0 3’0 f 0 5’0 60

temps 0h
 143

Les activités amylasiques apparaissent dès le début de la croissance,

après la phase de latente correspondant à la germination des spores.
Pendant la phase de croissance elles suivent grossièrement l'évolution
des protéines synthétisées (Cf. fig. 16) jusque vers 30 heures d'incu-
bation. Pendant cette période la production d'amylase en milieu Iiqui-
de est nettement supérieure à la quantité produite en milieu solide.

Après cette période on observe une évolution totalement différente de

l'activité amylasique dans les deux types de culture. En milieu Iiqui-
de la quantité d'amylase synthbtisée reste constante pendant quelques
heures puis diminue très rapidement. En milieu solide au contraire,
la quantité d'amylase synthétisée, après un palier entre 28 et 30 heu-
res, augmente de façon très importante jusque vers 60 heures d'incuba-
tion. Ainsi la quantité maximale d'amylase synthétisée en milieu Ii-
quide.ne représente que 70 % de la quantité qui peut Stre synthétisee
en milieu solide à partir de la même quantité de substrat.

Cette différence dans l'évolution du métabo.Iisme du champignon est à

rapprocher du phénomène d'autolyse. L'organisme cultivé en milieu Ii-
quide ayant complètement épuisé le substrat disponible après 30 heures
de culture, ne dispose plus de source d'énergie et se Iyse rapidement.
Par contre en milieu solide, la croissance s'arrête alors qu'il reste
encore près de 35 % de sucres disponibles. Le mycélium dispose alors
d'une source d'énergie pour maintenir un métabolisme secondaire effi-
cace et résister à la Iyse du matériel cellulaire constitué.
 144

IV. CONCLUSIONS

L'étude biochimique de la fermentation nous a permis de connaître de

façon plus précise les caractéristiques de croissance sur substrat
amylacé solide.

Le conditionnement de la farine de manioc et le dispositif d'incuba-

tion que nous avons utilisés oermettent d'obtenir un milieu de cul-
ture solide et des conditions d'incubation performantes. En effet le
1/3 du volume étant occupé par le flux d'air et les 2/3 par le produit
lui-même, le transfert d'oxygène dans le milieu peut être rapide.

Le calcul théorique et approximatif que nous avons effectué nous a

permis de montrer que la surface offerte par le substrat est un para-
mètre très important. En effet à partir d'un inoculum représentant
un taux de recouvrement de 0,15 %, la surface totale du substrat est
recouverte de mycélium après moins de 10 doublements de la biomasse
initiale, ce qui peut conduire à une limitation de la vitesse de
croissance du champignon.

Grâce à la détermination de la composition élémentaire du mycélium de

la souche utilisée, nous avons pu- établir l'équation stoéchiomètrique
globale de la croissance. Toutefois la détermination complète des
coefficients nécessite une étude comolémentaire du métabolisme respi-
ratoire qui sera réalisée dans le chapître suivant.

L'étude détaillée du système amylasique permettant d'hydrolyser l'ami-

don nous a confirmé qu'il est composé essentiellement d'amyloglucosi-
dase qui ne libère que du glucose directement assimilable, et qu'il
se trouve essentiellement lié à la oaroi du mycélium. L'étude compa-
rative des propriétés du système amylasique synthétisë en milieu
solide et en milieu liquide nous a révèlé des différences notables.
En effet'les amylases synthétisées en milieu solide présentent une
tolérance vis-à-vis de l'acidité et de la temoërature qui est bien
supérieure à celles des amylases synthétisées en milieu liquide.

La thermotolérance plus élevée du système synthétisé en milieu solide

 145

présente un intérêt à la fois fondamental et aopliqué. Les études sur

l'hydrolyse de l'amidon par les amyloglucosidases sont nombreuses et
ont fait l'objet d'une analyse récente (124). On sait en particulier
que les amyloglucosidases sont toutes des glycoprotëines, et qu'elles
sont généralement comoosëes de deux isoenzymes. Il serait intéressant
de savoir si dans les deux systèmes amylasiques synthétisés par notre
souche en milieu liquide et en milieu solide, la quantité de glucides
liés aux protéines varie ou si les pourcentages des isoenzymes sont
différents ; en effet cela pourrait fournir une explication aux varia-
tions observées concernant la thermotolérance.

L'étude cinétique de l'apparition des amylases a également révélé

des différences importantes entre les deux types de milieu de culture.
Ces différences apparaissent essentiellement après le ralentissement
de la croissance. Elles sont donc en relation avec le métabolisme
secondaire et la lyse du matériel cellulaire.

L'ensemble des résultats acquis jusqu'ici montre que les caractéris-

tiques de la croissance, le métabolisme et les propriétés des amyla-
ses synthétisées par la souche présentent des différences importantes,
selon qu'elle est cultivée en milieu liquide ou solide. Nous avons
donc été amené à étudier de façon plus détaillée l'évolution cinéti-
que des paramètres de la fermentation solide.
 CHAPITRE 6

ETUDE CINETIQUE DES PARAMÈTRES

DE LA FERMENTATION SOLIDE
 149

1. BIOSYNTHÈSE DU MATERIEL CELLULAIRE

7 - ETUVE CiNETlQUE VE LA CRULSSANCE

L'essentiel des informations concernant la cinétique de croissance

des champignons filamenteux a été acquis grâce à la technique de
culture en milieu liquide, ou par culture sur surface gëlosëe
en boîte de Pétri. Nous avons vu que les caractéristiques
de la croissance sur substrat solide sont très différentes de celles
que l'on observe en milieu liquide. On peut donc s'attendre à ce que
l'évolution du mycëlium ne se déroule pas de la même façon. De plus
nous utilisons un inoculum de spores et non du mycélium déjà dans
la phase végétative. Pour pouvoir comparer les cinétiques suivant
le type de milieu de culture, nous avons donc été amené.à effectuer
une étude cinétique comparative en réalisant parallelement la culture
de la souche d'A. hennebehgti sur la farine de manioc en milieu solide
et en milieu liquide. Pour pouvoir réaliser cette comparaison nous
avons identifié au maximum les conditions de culture et nous sommes
partis dans les deux cas d'un même inoculum de spores. Les conditions
habituelles d'incubation ont été réalisées (Cf. page 91).

Sur la figure 24 nous pouvons observer l'évolution du pH, des protéi-

nes formées, des sucres libres et des sucres consommés, au cours de
l'incubation en milieu solide et en milieu liquide.

Malgré les conditions opératoires tout-à-fait comparables, nous pou-

vons observer des différences importantes en fonction de la phase
de la croissance.
 ,A :i
0
8L
a

.7

.6

I
a
5

25
4

Figute 24. - EuoLuaXon cAG;üque. du pH 1 0-- - --OI, du p&otéinen

l-1, de,tt ~UCJUS héducateti .-!ibhti 1-l est du
ouche6 coitiommén [C-r) -, au coti de .& choLb6ance
d'A. hennebehgii cu.tXivé .AWL &dne de matioc en milieu
noLLde (A) e;t en, ntieu .LLqtie 181.
 151

En ce qui concerne les protéines , et le pH on observe peu de diffé-

rence pendant cette phase de latente où par définition il ne se
passe pas d'importantes transformations. Dans les deux cas sa durée
est d'environ 8 heures. Pour les sucres réducteurs on observe par
contre un démarrage beaucoup plus rapide dans le cas de la culture
liquide puisqu'aussi bien l'apparition de sucres réducteurs libérés
dans le milieu aar hydrolyse de l'amidon, que la consommation des
sucrespar le champignon commencent dès le début de l'incubation.

- CkOi.AAUnCe
__________---___-___-- à dhhe eXpOneti&e
______--__

La vitesse de croissance et la durée de la phase exponentielle de

croissance en milieu liquide sont plus importantesqu'en milieu solide.
Pendant cette période, on observe une légère alcalinisation du milieu
solide dueà une vitesse d'hydrolyse de l'urée supérieure à la consom-
mation de l'ammonium par le champignon. Ce phénomène n'est pas obser-
vé en milieu liquide,dans lequel on obtient plutôt une
acidification qui est compensBpar un apport automati-
que de soude pour maintenir le pH à 3,5. D'autre part, pendant cette
période, l'accumulation des sucres réducteurs dans le milieu liquide
est plus importante qu'en milieu solide, indiquant une plus grande
vitesse d'hydrolyse de l'amidon.

- ~aleti~emewt
- ---- -- ---- - ------de .!.a
-_----ctroihance
_-----_

Cettepériode commence lorsque la quantité de sucres libres dans le

milieu diminue du fait d'une vitesse de consommation supérieure à la
vitesse d'hydrolyse de l'amidon.~lles'arrête lorsque la quantité de
protéines synthétisées n'augmente plus ce qui traduit l'arrêt de la
croissance<

Dans le cas du milieu liquide cette phase dure 4 à 5 heures entre

15 et 20 heures d'incubation. Pendant cette période le substrat est
 152

nratiquement épuisé. De plus on assiste à une alcalinisation du mi-

lieu.

Dans le cas du milieu solide au contraire on assiste à une rapide aci-

dification du milieu essentiellement dûe à l'utilisation des ions
ammonium. La phase de ralentissement est beaucoup plus longue et
s'étale sur 10 heures entre 16 et 26 heures d'incubation. Lorsque
la croissance s'arrête, il reste encore une quantité importante de
substrat non transformé.

- Pha.be 6tciaXonn~e et a&oLyAe--

__________-__--_----_______

La dernière période de l'incubation correspond à la phase stationnai-

re et à l'autolyse du mycélium. Dans le cas de la culture liquide
l'autolyse est très rapide comme en témoignent la brusque remontée
du pH et la chute de la quantité de protéines.

Dans le cas de la culture en milieu solide par contre on n'observe

oas de lyse aussi nette et l'alcalinisation du milieu est beaucoup
plus faible. D'autre part on constate une poursuite de la consomma-
tion du substrat,qui en l'absence‘d'une augnentadonb kou=~,bte&d~,
peut traduire l'activité du métabolisme secondaire ou la consomma-
tion de substrat permettant de maintenir la biomasse en état d'acti-
vité.

En conclusion, si la cinétique globale de la croissancecb chanpignon

en milieu liquide et sur substrat solide amylacé comporte les mêmes
séquences de germination, croissance exponentielle, ralentissement,
arrêt et autolyse, on observe des différences importantes dans l'évo-
lution des paramètres qui soulèvent un certain nombre de questions.
En particulier quelle est la raison du ralentissement et de l'arrêt
de la croissance sur substrat solide alors qu'il reste encore des
sucres assimilables en quantité non négligeable ? En milieu aqueux
dilué le mycélium est rapidement lysé alors qu'il semble beaucoup plus
stable lorsqu'il s'est développé sur substrat solide ; est-ce dû aux
quantités de sucres résiduels non encore transformés qui permettent I
de poursuivre les activitës'mëtaboliques, ou le mycëlium est-il pro-
 153

..
tëgé par le support solide ? Autant de questions auxquelles nous avons
tentéderépondre en étudiant les paramètres de la croissance en milieu
solide et en ëtudiànt le métabolisme respiratoire.

2 - PARAAIETRES’YE LA CROISSANCE EN MILIEU SOLTDE

Pour connaître de façon plus' $écise la croissancedum@lium en mi-

lieu solide, nous avons calculé, à partir des cinétiques des protéines
et des sucres, les principaux paramètres de la croissance (taux de
croissance spécifique, coefficient de maintenance, coefficient de
synthèse protéique et rendement global de la biomasse). Pour cela nous
avons utilisé la théorie de croissance.exponentielle autocatalytique
qui est la plus couramment employée.

- Taux de chohdance
-----____--------___c--- ~nécL&igue
- --

En traçant la cin6tique des prot&lnes en coordonnées semi-logarithmi-

que, on obtient deux portions de droites indiquant un taux de crois-
sance spécifique de 0,3 h-I entre 8 et 12 h d'incubation suivi d'un
taux de croissance spécifique de 0,16 h-l entre 12 et 20 heures (fi-
gure 25). Une cinétique semblable est décrite dans la littérature
avec une culture liquide de Geo,?%&um .tati (99) pour laquelle les
auteurs interprétent cette seconde phase comme la phase de ralentis-
sement de la croissance.

Ces taux de croissance spécifique obtenus sur farine de

manioc en milieu solide sont proches des.valeurs trouvées dans la
littérature (Cf. Tableau'I) pour des cultures réalisées en milieu li-
quide. Ce résultat montre que la capacité maximale de croissance qui
est une caractéristique de l'organisme ne varie pas sensiblement avec
le type de culture, et que le champignon peut croître aussi rapide-
ment à la surface d'un substrat solide que dans un milieu liquide
agité, tout au moins dans les premiers stades de son développement.
 154

10 20
temps (h)
 155

- Rendemw&
---------- global de JZLXctotihance
----------------------

La figure 26 indique la quantité de protéines formées en fonction de

la quantité de sucres consommés.

SC
+.xp

protéines(g/lOOg substrat)

Figuhe 26 - Biohytihèhe du ~ottinecr en ~oncation de la conhommtion

de nuo>teh pan A. henn@bpagii cukXvé hwr @h.ine de man.Loc
en milieu bolide.
 156

La mesure de la pente des droites obtenues nous permet de calculer

le rendement global de la transformation :

RP= Protéines formées (g)

Sucres consommés (g)

Nous avons alors trouvé que pendant la première partie de la crois-

sance qui correspond au 15 premieres heures d'incubation et au taux
de croissance spécifique le plus élevé, la valeur du rendement est
constant et voisin de RP= 0,25. Cette valeur est très proche du ren-
dement global obtenu lors de la culture-de nombreux microorganismes
(20) et montre l'efficacité de la croissance au cours de cette pério-
de de la culture en milieu solide.

Apres 15 heures d'incubation, au cours de la phase de ralentissement

de la croissance, le rendement de transformation chute de façon impor-
tante et se stabilise àRp= O,L5 jusqu'a l'arrêt de 'la croissance.

La forme particulière de la courbe après l'arret de la croissance

traduit une consommation de sucres alors que la quantité de protéines
diminue. Dans ces conditions le rendement devient négatif. Ce phéno-
mène correspond au début de l'autolyse et du métabolisme secondaire
du mycélium.

Ces valeurs du rendement de transformation des sucres en protéines

sont en accord avec 'les valeurs trouvées lors du screening des sou-
ches en milieux liquida(O,ld t RP < 0,20) et qui sont des valeurs
moyennes calculées en fin de fermentation.

En fait le bilan global en fin de fermentation est plus proche du

rendement calculé pour la phase de ralentissement pendant laquelle
s'effectue la majorité de la transformation dans le cas de la cultu-
re en milieu solide.
 157

- Maintenance ct ~endemnt de ctohhancc

__________---_________________________

En fait ce facteur de rendement global ne tient pas compte des su-

cres consommés éventuellement pour la maintenance de la biomasse, et
pour cette raison il est plus généralement admis de calculer le fac-
teur de maintenance (m) et le rendement de croissance (Y).

Figuhe 27 - Vtition de. v.&.bhe bpéti&@Ue de COnbOf?~~~On du hu-

CheA en ~oncation de la v.i&hh~ hpéei&ue de ctroibbance.
 158

Pour cela on étudie la vitesse spécifique de consommation des sucres

(activité métabolique) en fonction du taux spécifique de croissance
(u). A cet effet on écrit que la vitesse totale des sucres consommés
est égale à la vitesse de consommation liée à la croissance du micro-
organisme plus la vitesse de consommation qui est indépendante de la
croissance mais proportionnelle à la quantité de biomasse présente à
l'instant t :

1
+m. X r173
rS=T rx

que l'on peut écrire :

-. l r 1
sa-.--, -,1 rx em
X s Y X

En traça'nt I . r (activité catabolique) en fonction de

X

1
rx (taux de croissance spécifique) on peut calculer
i-

m (coefficient de maintenance et'

Y (rendement de croissance)

La figure 27 montre en effet que l'on obtient une droite qui ne

passe pas par l'origine.

Le tableau XIX rassemble les résultats concernant le calcul des dif-

férents paramètres de croissance obtenaà partir de différentes
cultures d'A. /lennebtigG sur farine. de manioc. On constate que les
valeurs moyennes des paramètres de fermentation en milieu solide ne
sont pas identiques à celles obtenues en milieu liquide. Les résul-
tats semblent indiquer que la croissance sur substrat solide est
légèrement moins efficace qu'en culture liquide agitée.
 159

! I.I (h-l) ! Y ! M ! R _ Protéines !

! ! ! ! ' Sucres !

! M.S1 ! q : 0,30 ! ! !
! ! 0933 ! 092 ! 0,25
! : 0,ll
p2
! ! ! ! !
! MS2 : 0,3
p1 0,36 0,18 0,22
! : 0,16
y2
I

! MS3 v1 : 0,23
1 0,43 CI,15 0,26
1-17: 0,155
! !
! ! ! ! !
! M.S4 ! q : 0,28 ! 0,40 ! 0,15 ! 0,23
! ! p2 : 0,16 ! ! !
! ! ! ! !
! M.S ! Pl : 0,27 ! 0,38 ! 0,17 ! 0,24
!
!(moyenne) ! p2 : 0,15 ! ! ! !
! ! ! ! ! !
! I I I I !
! M.L. ; ‘1 : Oy3 ; 0943 ; 0315 ; 0,28 !
: 0,23 ! !
! ! v2 ! !

TabLeau X7X - Paamè;Urti de Bu ckoikance d’A.hwnebengti a.&%@

awr @Cne. de, manioc, en mZ.ie.u solide lA4.S. 1 et en m.iAXeu Liquide
(M.L.). L~A cah~& ont étE &ia% AWL &x banc den ~ucneo consommés
e;t du /?~ottiu bytihétiék?b.
I.I : &~LX de eho.&ance bpéti&ique mentié en coaxdonnées demi-.EogUh-
miqueb
Y : trendemment de chohbance.
IV : coe~,$Lticn.t de maintenance (g de buchelg de photéinelheuhel
R1,: he.mdement de. aTxanb~oh.macion de6 buc.mb en phottineo
 160

La variabilité observée dans le résultat des calculs des différents

paramètres de la croissance est dûe essentiellement au manque de
sensibilité de la méthode qui consiste à doser les protéines synthé-
tisées et les sucres consommés, surtout au début de la croissance,
lors de la germination et du démarrage de la phase exponentielle.
Par la suite nous avons donc cherché à suivre la croissance grâèe
à une méthode plus précise en mesurant tout au long de la croissance
le CO2 dégagé et l'oxygène consommé lors de la respiration.

II. METABOLISME RESPIRATOIRE ET CROISSANCE

L'étude précédente a montré tue kscbs~~esdes protéines et des sucres

consommés ne sont pas suffisamment sensibles pour étudier les mé-
canismes de croissance du moins pendant les 10 premières heures d'in-
cubation. Nous avons alors cherché à mesurer un paramètre de la
croissance plus précis et qui permette un enregistrement continu
pendant toute la période d'incubation.

A cet égard trois paramètres peuvent etre pris en considération, à

savoir:le CO2 dégagé, l'oxygène consommé et les calories produites
au cours de la dégradation aérobie de l'amidon par le champignon.
Ces trois paramètres sont directement liés à la respiration qui
fournit l'énergie nécessaire aux biosynthèses réalisées par le
mycélium et sont donc étroitement liés à la croissance (52, 106,
107).

L'étude du métabolisme respiratoire et des échanges est capitale

en raison de la nature aérobie de la croissance du champignon.

Pour des raisons de commodité et d'équipement, nous avons commencé

notre étude par la mesure du CO2 produit. Par la suite nous avons
complèté, cette analyse par la mesure de l'oxygène consommé, de fa-
çon à pouvoir calculer le quotient respiratoire.
 161

7 - MESURE VU CO2 TOTAL. DEGAGE

Le flux d'air qui a passé à travers le produit est recueilli à la

sortie des incubateurs, et le CO2 contenu est piégé par barbottage
dans une solution aqueuse dont le pH est maintenu à 11,5 par apport
automatique de soude 1 N. La quantité de soude utilisée enregis-
trée automatiquement nous a permis de calculer la quantité de
CO2 total dégagé depuis le temps zéro jusqu'à la fin de l'incubation.

L'essentiel des travaux concernant la mesure

des paramètres de croissance des champignons filamenteux cultivés
en milieu liquide agité a été réalisé à partir d'inoculum composé
par du mycélium de la souche provenant d'une préculture, et non pas
directement à partir des spores. C'est la raison pour laquelle nous
avons réalisé deux cultures en milieu liquide. L'une à partir d'un
inoculum de mycélium destinée à permettre la com-
paraison avec les résultats de la littérature. L'autre à partir
d'un inoculum de spores de la même souche destinée à comparer les
cinétiques de croissance en milieu liquide et en milieu solide avec
le maximum de similitude dans les conditions opératoires.

Les résultats de la figure 28 montrent que malgré les conditions

opératoires identiques, l'évolution du CO2 en milieu liquide n'est
pas semblable à celle observée en milieu solide. En particulier la
phase de démarrage en milieu liquide est plus rapide. D'après ce
graphique,on constate également qu'un inoculum de mycélium permet
d'obtenir une croissance bien plus rapide qu'un inoculum de spores.

Nous avons porté, ces résultats en coordonnées semi-logarithmiques

(figure 29) de façon à savoir si le dégagement de C02, et par voie
de conséquence la croissance, était de type exponentiel. En ce qui
concerne la culture en milieu liquide à partir de l'inoculum de my-
célium, nous n'avons pas pu mettre en évidence de phase exponentiel-
le. Cette observation est à rapprocher des résultats de nombreux
auteurs et en particulier de MARSHALL & ALEXANDER (37) qui ont utili-
sé les paramètres de la respiration et n'ont pas trouvé de linéarité
en coordonnées semi-logarithmiques pour différentes espèces de cham-
 162

3oc

20(

10

F.igwa 28 - EvoUon du CO2 ;toh.t dégagé au cow de b’incuba.Cion..

1 : c-e. en wiLLtu .tYquid~, inocuhn de mycél?ium d’une pkécuR;twLe

2 : c&uhe en tnLi!-Leu Liquide, inocuhn de bpohC!A (2.103/g)
‘3: c&uhe en mi&eu 6oRide , " ,P 1,
 temps ( heures)
Figwre 29 - Evoktion du CO2 au coum de la c&oLsbance.
Leb hébu.&& potiéb en coondonnéb 1/ 2 &ogUh-
m.ique,s come.-spondent à ceux de la &gune 28.

pignons.

Pour les cultures à partir d'inoculum de spores on observe,par con-

tre;une première phase exponentielle puis un changement de pente
très net après 10 ou 15 heures d'incubation. On trouve dans les tra-
vaux de TRINCI (33) sur la croissance de surface d'd. niduI.an~ des
cinétiques de croissance comportant également une première partie
exponentielle avec une rupture de pente après 10 à 12 heures d'incu-
baC.on. Si la théorie de TRINCI concernant la croissance de surface
 164

peut se concevoir dans le cas de notre culture

solide, son application à la culture en milieu liqu$de n'est pas pos-
sible et il faut chercher d'autres explications à ce changement de
pente qui traduit un changement de métabolisme ou une limitation de
la croissance.

D'après l'équation générale de la croissance !17 ,ce n'est pas la

quantité totale de CO2 formé qui est directement relié à la croissan-
ce du mycélium, mais la vitesse du CO2 formé à l'instant t :

1
rCP2 = - * rX + m CO2 - x
Yco2

que l'on peut écrire :

si l'on écrit l'activité respiratoire du CO2 :

P
QC02
=- + mco2 PI
Yco2
on obtient

r~02=Qco;X

Dans le cas de la croissance exponentielle le coefficient respiratoi-

re est constant et l'on peut écrire :
 165

In .rCn
.2
= In X + este = ut + este 1211

en portant la vitesse de formation du CO2 en fonction du temps sur

des coordonnées semi-logarithmiques, on peut donc calculer le taux
de croissance spécifique. C'est pour cette raison que nous avons
cherché à mesurer directement ia vitesse de formation de CO2 au
cours de l'incubation.

2 - VITESSE VE FURMATiON VE CO2

Nous avons enregistré en continu la vitesse de dégagement de CO2

dans le flux d'air à la sortie des incubateurs pour la culture en
milieu solide. A cet effet nous avons utilisé un appareil BECKMANLB2
comportant une sonde thermostatée à infra-rouge permettant de doser
spécifiquement le CO2 dans un flux gazeux, exprimé en pourcentage
du volume. La vitesse de dégagement de CO2 est donné par la relation

pco2= -%100
9 . D (en ml/h) wl

avec :

D = débit d'aération de l'incubateur (ml/h)

% CO2 = mesure donnée par l'appareil
 166

20
temps b)

F.&ULQ 30 - vi,tenoe de. podution de COp au CO#LA de la @k.hhaRW

d’A.henn&pJqz cz.u.&%vé bWl @.bine. de manioc eM m.ikkU
,so.Li.de (condiiioti OpétiohU : page 91) tran~ofi,ttPe
hein une. éch&!Le anicthrné-üque ou .l?ogatihnkpe.
 167

La figure 30 nous montre l'évolution de la vitesse de production du

CO2 en fonction du temps d'incubation. Après une latente de 3 heures
on observe une phase d'accélération, suivie d'une croissance expo-
nentielle avec un temps de doublement de 2,5 heures (ul = 0,277 h-l).
Après 11 heures d'incubation on observe toujours un changement de
pente avec un temps de doublement de49 heures (1-1, = 0,161 h-l).
Ceci confirme tout à fait les valeurs trouvées précédemment à par-
tir des protéines synthétisées (Cf. Tableau XIX).

Après 23 heures d'incubation la vitesse de production de CO2 diminue

jusqu'à une valeur constante obtenue après 34 heures. Cette produc-
tion constante de CO2 lorsque la croissance de la biomasse est nulle
indique une activité respiratoire du mycélium en ahase stationnaire.
Cette activité peut être interprétée de différentesmanières:elle @ut
traduire la consommation de substrat pour la maintenance, ou pour la
production de métabolites secondaires. Dans l'optique de l'enrichis-
sement en protéines d'un substrat amylacé,cette consommation de
substrat sans augmentation des protéines est un phénomène in-
désirable qui conduit à une diminution rapide du rendement de la
transformation. Cette activité parasite doit donc être contrôlée de
façon à pouvoir stopper l'incubation dès qu'elle se manifeste. A
cet égard, l'enregistrement en continu de la vitesse de production
de CO2 peut se révèler très utile ; en effet comme on peut le cons-
tater sur la figure 30, le pic correspondant au maximum de la
vitesse de croissance de la biomasse est très facile à déceler,
ainsi que le plateau correspondant du début de la consommation
parasite de substrat.

L'étude de la croissance en milieu solide grâce à la mesure de la

vitesse de production de CO2 présente d'ailleurs de très nombreux
avantages. Elle permet de mesurer directement le taux de croissance
spécifique et l'évolution cinétique sur un même échantillon tout au
long de la période d'incubation, et cela sans apporter de per-
turbation à cet échantillon. Dans le cas de la culture en milieu
solide T'a mesure du'C02 oertiet de supnrimer le problkme d'homogé-
néité .
 168

et de représentativité des prélèvements. Enfin la précis9on de la

mesure est un point particulièrement important à souligner.

Ces différents arguments nous ont tres fortement incité à poursuivre

l'étude du métabolisme respiratoire, et nous avons complèté la mesure
du CO2 par celle de la vitesse de consommation d'oxygène.

3 - QUUTTENT RESPiRATQIRE

Pour étudier le métabolisme respiratoire de façon plus complète nous

avons mesuré à la fois la vitesse de formation du CO2 et la vitesse
de consommation de l'oxygène en dosant automatiquement les pourcenta-
ges de CO2 et d'02 dans le flux d'air à la sortie de l'incubateur.
Pour la mesure de 1'02 nous avons utilisé une sonde polarographique
BECKMAN et un dispositif semblable à celui décrit par MOLETA (108).

La figure 31 montre que les vitesses de production de CO2 et de con-

sommation d'oxygène évoluent de la même maniêre pendant les 20 pre-
mieres heures d'incubation. Par la suite la vitesse de consommation
d'02 reste nettement supérieure à la production de C02.
 169

F.@wre. 37 - EvoWon dw acCvLtëh heApiha,toineh au cowt6 de la

cho.Lhhance d'A. hennebehg.ü clivé en m.LGeu bolide.
[VO2 ViateAh~ de conhommaA.Lon d’02 ; Vco , Vtiebhe de
pkodution de. C02, expiméed~~en mk?pah ?ncubc&wr conte-
nati 10 g de hubhtmt) . 2. R. = @oa?Lüeti henph.aAoim.

A partir de ces deux mesures, on peut calculer le quotient respira-

toire :

"CO?
Q.R. =
 170

En portant le Q.R. en fonction du temps d'incubation (figure 31) on

constate qu'il reste constant et voisin de 1 pendant toute la durée
de la phase de croissance, indiquant que l'équation de respiration
du glucose est bien vérifiée.

-100

5 10 15 20 25
temps h

Figwte 32, - CatcuR du Taux de cho.ibbance npéc.Lf,ique a pmuWc ded

v4%?.bbeb de cotiommaa%on d’02 eA de p~odution de C02.
Led vahum pofl;téeA cowmpondent aux hébuktti de La
!ggwle 31.
 171

Par la suite le Q.R. diminue rapidement pendant la phase de ralentis-

sement, et se stabilise â une valeur proche de 0,5 lorsque la crois-
sance s'est arrêtée. Ceci indique un changement de métabolisme respi-
ratoire qui peut traduire l'utilisation de réserves endogènes ou l'ac-
cumulation d'un métabolite autre que le C02,‘comme un acide organique
par exemple.

En coordonnées semi-logarithmiques on obtient bien les mêmes valeurs

du taux de croissance, en se basant sur le CO2 dégagé ou sur l'oxy-
gène consommé (figure 32).

En considérant la cinétique la vitesse de consomma-

tion de l'oxygène (figure 31) on peut constater que la croissance
du mycélium n'est pas limitée par des problèmes de vitesse de dif-
fusion. En effet si tel était le cas la vitesse de consommation de
l'oxygène se maintiendrait â une valeur constante correspondant â
la vitesse de transfert maximum de 02. Au contraire on observe une
diminution rapide de la consommation d'oxygène indiquant que la vi-
tesse de la réaction de croissance est limitée par un autre facteur.

4 - DEFINITiON VE L’EQUATION STQECHIOMETRI~UE

Nous avons vu au chapitre précédent que la détermination des coeffi-

cients de l'équation stoéchiomètrique de la croissance nécessitait
la détermination des quantités de glucose transformé par respiration
et par assimilation. Nous avons utilisé les paramètres du métabolis-
me respiratoire â cet effet.

A partir de la quantité d'oxygène consommé pendant la croissance

nous avons pu calculer la quantité de glucose consommé pour la res-
piration (tableau XX). Connaissant par ailleurs les quantités de
sucres totaux consommés on peut, en traçant la courbe des sucres
respirés en fonction des sucres consommés (figure 33), calculer les
pourcentages "a" et "b" de glucose transformé respectivement par la
respiration.
 172

! 0 ! !
!
’ 8 ! 0,13 ! c,33 ! 0,15 ’ 0,04 ! 0,Ol ’ 7 ! 5 ! 1,5 ! 28 0
! !
’ 9 I 0.20 ’ 0,33 ! 0,20 ! 0,os ’ 0,oz ! 12 10 ! 1,2 ! 56 0,04
!
! 10 ! 0,28’ ! 0,30 ’ 0,35 ! 0.08 ! 0,04 ! 15 ! 15 ’ 1,02 ! 84 0,lO
! !
' 11 I 0,36 ’ 0,24 ! 0,45 ! 0,lO !. 0,06 : 22 ! 20 1,lO ’ 112 0,17
! ! !
12 ’ 0,47 ! 0,23 ! 0,60 ! 0.15 ! 0.09 28 30 1 0,96 ’ 168 0,25
! ’ ! ’ ! ! ! !
13 0,57 0,18 0,75 0,20 0,13 38 39 ! 0,97 ! 217 ! 0,36
! !
! 14 ! 0,70 ! 0.18 ! l,oo ’ 0.28 ! 0,18 ! 48 48 ! 0,98 ’ 270 0,48
! !
! 15 ! 0.83 ! .0,15 ! 1.25 ’ 0,36 ! 0.24 ! 59 57 ! 1,02 ’ 318 0,60
l l
! 16 ! 0,98 ! 0.15 ! 1,50 ! 0,47 ! 0,31 ’ 70 71 ! 0,98 ’ 399 0,73
1 I
! 17 ’ 1,13 ’ 0,13 ’ 1,90 ’ 0,60 ’ 0,39 ! 84 87 ’ 0,97 ’ 486 0,88
1 0,QQ ’ 553 1 1,03
’ 18 ‘1 1334 ; 0,16 ’ 2,30 ’ 0,75 ’ 0,48 ’ 98 ’ 99
i 1
19 1 1,65 0,14 ; 2,75 ’ 0,93 ’ 0,59 ’ 115 ’ ml 1 0,96 ’ 672 1,2z
1 1 ’ 1,oo
20 ! 1,85 I 0,16 3,20 ’ 1,13 f O,73 f 136 135 ’ 156 ’ 1,44
1 I
21 ! 2,13 ’ 0,13 ’ 4,00 ; 1,36 0,87 156 ’ 155 ! 1,rJrJ ’ Em 1,65.
’ 22 ’ 2,32 ’ 0,08 4,60 1,60 ’ 1,04 ’ 150 ’ 160 ’ 0,94 ’ 896 ’ 1,e.z
l 1
’ 23 1 2.44 ’ 0,05 : 5325 ; 1,83 ’ 1,21 ! 125 155 ’ 0,84 l 868 1,EO
! 1 l
24 l 2,55 ! 0,04 ’ 5,70 2,05 ! 1,39 ’ 104 145 ’ 0,71 ’ 812 1,50
l l !
25 ’ 2,61 ‘. 0,02 ’ 6,00 ’ 2,25 ’ 1,58 ’ 92 135 ! 0,68 ’ 756 1,EO
! ! I !
26 ! 2,63 ’ 0.01 ’ 6,30 ! 2,45 ’ 1,76 ! 82 130 ’ 0.63 ! 728 0,90
! ! l
27 ! 2,66 ! 0,oo ’ 6,55 ! 2,63 ! 1,95 ’ 76 125 ! 0,61 ’ 700 0,80
! I !
! 28 ! 2,68 ! 0 ! 6,830 ’ 2,81 ! 2,14 ! 70 120 . 0.59 ! 672 0,80
! ! 2,35 ! 67 ! !
29 ! 2,68 ! 0 ’ 7,05 ’ 2,99 115 ! 0,58 ! 644 0,80
! ! 2,51 ! 64 ! !
30 ! 2,66 ! - 0,Ol ! 7,25 ! 3,16 115 ! 0,56 ! 644 0,75
! !
! 40 ! 2.55 ! - 0,02 ! 7,80 ! - ! Z-,70 ’ 61 110 ! 0.56 ! 616 0,75
! ! ! ! ! ’ ! ! ! ! !
 sucres consommés (g)
Figutre 33 - @atién de AUCJUA heApihé.6 en &mdion des 6ueheb con-
bomméb. Vdew~s caLcuRéti kappotiéti clan.~ Le ;tabLeau XX.

Nous avons ainsi trouvé que pendant la phase de croissance du mycé-

lirm 35 90 des sucres sont dégradés en CO2 et H20 et 65 % sont. assi-
milés pour la constitution de la biomasse. En portant ces valeurs
dans l'équation globale de la croissance 16, on obtient :

C6Hl206 + 2,l O2 + 0,54 (NH4+ OH ) + 17,6 Ii20 - 1231

3,9 (CH1,62 Oo, N0,14 ; 596 H20) + 2,1 CO2

Cette équation générale de la croissance permet de calculer le rende-

ment global de la transformation du sucre en mycélium, et on trouve :
RX = 0,55 g de biomasse/g de glucose consommé et RP = 0,26 g de
protéines/g de glucose consommé.

Ces rendements calculés sont proches des valeurs généralement trou-

vées dans la littérature et correspondent bien aux valeurs que nous
avons trouvées expérimentalement (Cf. Tableau XIX).
 174

III. Ml?,TAEiOLISMEDE L’EAU

A partir de l'équation globale de la croissance [23] , on consta-

te que pour transformer 1 mole de glucose, la réaction consomme 17,6
moles d'eau pour la synthèse de la biomasse à 80 % d'eau. Dans ces
conditions pour transformer 10 g de sucres la réaction consommerait
17,6 g d'eau. Or notre milieu solide contient 60 % d'eau, c'est-à-
dire 10 g d'eau pour 10 g de substrat. On voit ainsi que la réaction
de croissance est nécessairement limitée par manque d'eau et non par
manque de substrat. Ceci constitue un résultat particulièrement im-
portant pour l'optimisation des croissances en milieu solide.

20 3’0
temps (h)

f.igwLe 34 - b’aGat.ion de Ca yuanti;tE d'eau ;ta;taee 171, e;t de L'eu~

cow,ommée cathdée nun Ca base den bucm~ Axati~oméb
(2) e,t deb pJLotéineb by&&ibéeb (3) en ru%?iAati e’é-
yuaLLon b~otackiomètiyue globale de eho.hance.
 175

Si à partir des sucres consommés on calcule la quantité d'eau consom-

mée par la réaction de croissance,on s'aperçoit que la transformation
des sucres s'arrête lorsque toute l'eau a été utilisée (figure 34).
En effet, dans ces conditions les réactions enzymatiques, et parti-
culièrement l'hydrolyse de l'amidon sont fortement ralenties, comme
cela a été montré par DRAPRON(93) pour des aliments à faible humidi-
té.

En se basant sur les protéines synthétisées, on s'aperçoit que la

rëaction.de croissance devient' limitée lorsque la moitié de l'eau
présente a été consommée, et qu'elle s'arrête totalement lorsque 70 %
de l'eau totale a été utilisée pour la constitution de mycélium. Dans
ces conditions, la quantité d'eau disponible représente alors seule-
ment 15 % .d'humidité. On sait que pour de telles valeurs on n'ob-
serve pratiquement plus de développement microbien (26,89).

Pour que le mycëlium puisse transformer la totalité des sucres dispo-

nibles suivant l'équation de la croissance, il faudrait théoriquement
que le milieu contienne 17,6 g d'eau pour 10 g de sucre soit un milieu
à 63,7 % d'eau au lieu de 50 %. Il s'agit là d'un point très important
qui sera pris en considération lors de l'application de la technique
de culture pour‘l'optimisation de la fermentation solide et la mise
au point d'un procédé d'enrichissement en protéines.
 176

IV. CONSOMMATION DE SUBSTRATPOUR LAMAINTENANCE

Selon +RROP\IE(I%] la consommation du substrat carboné par un organisme

vivant peut être différenciée en trois parties :

- une fraction est utilisée pour l'élaboration des matériaux de cons-

truction de la cellule,

- une fraction est utilisée pour libérer l'énergie nécessaire à la

synthèse de ce matëriel cellulaire à travers la respiration,

- une fraction enfin représente la dépense nécessaire au maintien de

b structure de l'organisme.Ella es t indépendante de la croissance et
doit exister du seul faSt que l'organisme doit Fournir un travail
pour se maintenir en vie,

La première fraction correspond a ce que nous avons appelé'bubstrat

assimild'et la seconde aux 'lucres respiré&:

La dernière fraction est également appelée ration d'entretien ou de

maintenance. Ce concept de maintenance est sujet à controverse.
MONOD(28) considérait que pour les bactéries, la consommation de
substrat carbonë destiné à assurer leur maintenance était trop faible
pour prendre en considération la "ration d'entretien", sans toutefois
apporter une réponse définitive à cette question. SENEZ & Col1 (52,
109) ont montré par microcalorimétrie que les bactéries en phase
stationnaire ne révèlent pas de dégagement de chaleur sensible, et
lient ces éventuelles consommations de substrat,non utilisés pour la
croissance,à un découplage énergétique entre la croissance et le mé-
tabolisme respiratoire.

Par contre d'autres auteurs, travaillant soit avec des bactéries en

chemostat (110) soit avec des champignons filamenteux (39), et en
particulier avec A. nigeh (Ill),ont observé une consommation de main-
tenance relativement importante. Elle est généralement considérée
comme une réaction d' oxydation stricte du substrat et correspond
à une respiration.
 177

En supposant qu'il n'y a pas de production de métabolites secondai-

res pendant la phase de croissance rapide du champignon, nous pouvons
écrire que la vitesse de consommation des sucres est égale à la vi-
tesse de consommation de substrat pour la croissance plus la vitesse
de consommation des sucres pour la maintenance :

rS = PS, + rSm 1241

ou encore :

1
r
S=T S - rX +ms'X

Si la croissance est exponentielle l'équation devient :

1
rS = - y . y. X + m,.X
S
ou encore :

1 1
=-.~+m,
-. rr p53
3
X
yS

Suivant cette équation, si tout le substrat consommé est utilisé

pour la croissance,la courbe :

A
-.
rS = f (Y) doit passer par l'origine.
X

Nous avons déjà constaté que ce n'est pas le cas en ce qui concerne
la croissance de notre champignon (figure 27).

En nous basant, non plus sur les sucres consommés mais sur la vites-
se de consommation de l'oxygene (figure 35) nous retrouvons une or-
donnée à l'origine correspondant à une utilisation de l'oxygène pour
une croissance nulle.
 178

0 031 032
IJ (h-l)
Figtie. 35 - VWono de La vhkbbc npéci&.que de conbommua%on d’of
en ~om,t.Lon dLc ~ZU.LXbpé&$iqUt? de cnoihbance..
1; . ho2 ebt expuhé en g d’02/h et pah g dc biombbe

La valeur trouvée pour mo2 (0,07 g d102/g de mycëlium/heure) corees-

pond bien à la valeur obtenue à partir des sucres (Cf. page 144

“S = 0,15 g de sucre/g de protéine/h ou ms = 0,07 g de sucre/g de

mycélium/h). Ceci montre bien que cette fraction de sucre est
bien essentiellement oxydée.
La pente de la droite obtenue sur le graphique de la figure 35,
permet de calculer le rendement de biosynthèse par rapport à l'oxygène
 179

La valeur obtenue pour Y02 indique une biosynthèse de 2,85 g de bio-

masse par q d'oxygène consommé. Ce rendement limite d'utilisation
de l'oxygène est bien supérieur au rendement global obtenu à partir
de l'équation globale de la croissance ( 1,48 g de biomasse formée
par g d'oxygène consommé.).Cette différence peut indiquer une con-
sommation d'oxygène par le mycélium à d'autre fin que celle de la
biosynthèse du matériel cellulaire, par exemple pour l'accumulation
de réserves endogènes ou l'excrètion de métabolites.

1 2
biomasse formée (g /lOg substrat)

Figu/re 36 - CaFa.d du eoe.~~icien.t de ~‘nc.ttnv.Lté rrebpi.mto.ine C&,

2
 180

En traçant la vitesse de consommation d'oxygène en fonction de la

biomasse synthétisée on peut calculer les coefficients spécifiques de
l'activité respiratoire : Q02 et QC, avec:
2
QR . . =9,,,

Qo2

On écrit la vitesse de consommation d'oxygène de la même façon que

celle du CO2 :

Vo2 =(c2 + mo2). X @7

et l'on pose :

Q,, = - + m02 II271

vo2

A partir de la figure 36 nous avons calculé que Q02 = 0,125 g dl021

g de biomasse/h.

On peut constater que la relation 27 est bien vérifiée pour la deu-

xième partie de la phase exponentielle (~2 = 0,165 h-l) :
0,165 + OSO7 = 0,127 g d'02/g de biomasse/h
402 = 2 *s
,

Mais elle ne l'est plus lors de la première partie de la phase expo-

nentielle (pl = 0,277 h-l). La consommation de substrat parasite
serait alors bien moins importante si elle existe. D'ailleurs, en
observant attentivement la figure 35 on s'aperçoit que la relation
-1
n'est linéaire que pour 1-1< 0,16 h et que la portion de droite re-
présente la 2ème phase de croissance'exponentielle et la phase de
ralentissement.

Il apparaît donc ainsi que la consommation parasite d'oxygène et de

sucre ne fait aucun doute pendant les deux dernières parties de la
croissance au cours desquelles la plus grande partie du substrat est
,transformée. En revanche, il n'est pas certain que la maintenance soit
importante pendant la première partie de la phase exponentielle au
 181

cours de laquelle seulement 13 % des sucres totaux consommés sont

transformés.

A partir de la valeur du coefficient de maintenance que nous avons

trouvée, et en nous basant sur la réaction d'oxydation du glucose par
respiration, nous avons calculé la quantité théorique de substrat
consommé pour la maintenance au cours de la fermentation (tableau XX).

La figure 37 indique que pendant la phase de croissance cette consom-

mation parasite représente 21 % des sucres consommés ; en fin de
fermentation 71 % des sucres consommés ne sont pas liés à une activi-
té de croissance.

Cette consommation parasite du substrat par le champignon est très

importante puisqu'elle a une incidence directe sur le rendement final
de la croissance, surtout si l'objectif est de transformer les su-
cres en protéines. Les valeurs élevées que nous avons trouvées sont
en accord avec celles données par RIGHELATO & Coll. (39) concernant
P. chhy60genum qui, selon ces auteurs, consomme 10 % du substrat
pour la maintenance lorsque la vitessepde croissance est maximum et
jusqu'à 70 % lorsque la croissance est limitée.

Il semble que cette consommation de maintenance et l'activité respi-

ratoire correspondante du mycélium non proliférant soiantessentielles
à la survie de ce mycélium, car lorsque la vitesse de consommation
du substrat devient inférieure à la valeur du coefficient de main-
tenance, on observe une diminution de la quantité de protéines tra-
duisant une lyse d'une partie de la biomasse (figure 26).

Ce phénomène de lyse est d'ailleurs beaucoup plus rapide en milieu

liquide puisque la croissance s'arrête lorsque la totalité des
sucres a été consommée. Dans ces conditions la "ration d'entretien"
ne peut plus être assurée.
 5
sucres consommés

Figme 37 - Compahahon de La consommation de bubb.tm.t non L&T~

la choLh0anc~ avec la con5omma;tion ;to.Wk.
 183

V. PRODUCTION ET TRANSFERT DE CHALEUR

7 - MESURE VE LA CHALEUR DEGAGEE

Différents auteurs (106, 107) ont montré que lors de la croissance

des microorganismes, il existe un rapport constant entre la demande
en oxygène et la production de chaleur.

-dQ =K 5
.dt ' dt

Les résultats rapportés par ces différents auteurs montrent que la

quantité de chaleur dégagée par mole d'oxygène consommé est cons-
tante pendant toute la durée de la culture. Elle semble indépendante
du taux de croissance, du substrat utilisé et du type d'organisme.

Les valeurs de la constante K qui ont été rapportées sont comprises

entre 0,09 et 0,14 Kcal/m mole d'02, soit une valeur moyenne de :

K = 0,115 2 0,025 Kcal/m mole O2

Si on considère la réaction d'oxydation du glucose :

- 6 CO2 + 6 H20 (oH = - 673 Kcal)

C6H1206 + 6 O2

la quantité de chaleur produite par m mole d'02 serait :

K' = 0,673
= 0,112 Kcal/m mole d'02
6

Cette valeur est tout à fait comparable aux valeurs mesurées expéri-
mentalement. On peut donc estimer que la quantité de chaleur dégagée
est directement liée à la respiration, et calculer, à partir de la
quantité d'02 consommée, la quantité de chaleur qui est dégagée au
cours de la fermentation (tableau XX).

D'autre part, dans notre dispositif de culture en milieu solide,nous

avons msuré directement, les variations de température dans la masse

 184

du produit, grâce à la mise en place d'une sonde thermique au début

de l'incubation.

Sur la figure 38, nous avons rapporté les valeurs calculées de la

production de chakuretles variations de la température au cours de
la croissance. Nous constatons qu'il y a une très bonne corrélation
entre la vitesse de production de calories, mesurée à partir de la
vitesse de consommation d'02,et la variation de la température du
produit enregistréeau cours de la croissance.

1000 2

dQ

temps ( heures )

F&pte. 3b - CottrtéRrction em% la v.Lt~~~e de podution de caloties

eA La v&on de La aZemptiuhe du phodu& au CO~L~ de
La crro.hancc d'A.h@-nncbtigfi bar. &&ne. de mabtioc en
Jtu’,t%?u ,t,o&ide. Leb M!&&&A ConceJcnent L’Lncuba.tem con-
tenant 10 g de bub&tmt.
 185

2 - CALCUL VU COEFFICIENT VE TRANSFERT VE CHALEUR

Etant donnée l'importance de la quantité de chaleur produite, il

est capital d'évacuer rapidement les calories afin d'éviter une élé-
vation rapide de la température du produit qui conduirait à une li-
mitation et même à un arrêt de la croissance.

Différents auteurs (106, 111, 112) ont étudié le bilan thermique de

la croissance. En l'absence totale de refroidissement la quantité
de chaleur accumulée dans la masse du système est égale à la quanti-
té de chaleur produite par la croissance. Celle-ci se traduit alors
par une élévation de la température selon la relation :

dQ-K. fi
L-
dt dt
r293
K étant la capacité calorifique du système :

K = (Mm CP)eau + (M. 'p)substrat + (MS 'p)incubateur

Pour notre dispositif d'incubation, nous avons :

Poids Chaleur spéci- Capacité calori-

fique fique

(9) (cal/g- "C) Cal/incubateur/"C

Eau 10 1 10

Substrat 10 053 3

Tube pyrex 100 052 20

TOTAL 33
 186

La vitesse de production de chaleur pouvant atteindre des valeurs

de 800 cal/h, la température pourrait ainsi s'élever de 25' C en une
heure seulement, si les calories n'étaient pas évacuées.

En l'absence de refroidissement, pour que notre produit atteigne une

température de 45' C il suffirait d'un dégagement de 330 calories ce
qui est réalisé après 10 heures d'incubation, c'est-à-dire dès le
début de la croissance. On voit donc l'importance capitale du refroi-
dissement, qu'on obtient dans notre cas par un transfert des calo-
ries dans l'eau d'un bain-marie à 35" C,à travers la paroie du tube
pyrex.

FALCH (111) a proposé une méthode permettant de calculer le coeffi-

cient de transfert de chaleur pour un système de refroidissement.
Pour cela il écrit le bilan thermique :

4’ - M.cp. c = U.A. (T - Tr) L303

dt dt

avec :

-dQ = vitesse de-production de calories

dt

M.C = capacité calorifique de l'incubateur

P

dT
- = vitesse d'augmentation de la température
dt

U = coefficient de transfert

A = surface d'échange

T et T2 = températures respectives du produit et du

liquide de refroidissement

Connaissant 2 , Mcp et l'élévation de température en fonction du

temps nous avons pu calculer graphiquement la vitesse de transfert

des calories (U.A.) dans notre dispositif (figure 39). On trouve
 187

ainsi que l'on peut évacuer 500 cal par heure pour un écart de IOC
entre la température du produit et la température de l'eau de re-
froidissement. En calculant la surface de refroidissement
(A = surface des parois du tube), nous avons pu calculer la valeur
du coefficent de transfert dans notre dispositif d'incubation :

U = 53 Kcal/h/m2/ (Y)

F&WW 39 - ~éakmin&on de la capac.Lté de Anati6ent dw cuhtien

dam Lc! dhpo~LCL~ d’incubation.
Pour un fermenteur métallique et un refroidissement par double pa-
roi, FALCH avait calculé un coefficient de transfert de 426 Kcal/
h, m2."C.

Ce type de calcul peut se révèler très utile lors de la conception

et l'extrapolation de réacteurs destinés à la fermentation en milieu
solide, car les vitesses de production de calories par unité de
masse sont beaucoup plus élevées que dans le cas des cultures en
milieu liquide dilué.

VI. CONCLUSLONS

L'approche biochimique que nous avons réalisée nous a déjà permis

d'avancer très rapidement dans la connaissance des mécanismes de la
croissance d'un champignon sur un substrat amylacé.

La transformation de l'amidon en biomasse a été schématisée par 3

réactions :

1 - hydrolyse de l'amidon en glucose

2 - oxydation du glucose : respiration
3 - assimilation du glucose : biomasse

Chacun de ces étapes a été étudiée en détail de façon à mesurer les

différents paramètres de croissance et à établir l'équation
stoéchiomètrique globale de la réaction.

L'étude cinétique comparée des paramètres de fermentation en milieu

solide et en milieu liquide, sur la base des protéines synthétisées
et des sucres consommés, a permis de montrer qu'il existe des dif-
férences importantes concernant l'évolution des paramètres et la
limitation du développement mycélien. La seule application des con-
naissances acquises sur la culture du mycélium de champignon en
milieu liquide agité ne peut donc suffire à expliquer les résultats
obtenus lors de la croissance du champignon sur substrat amylacé
solide.
 189

L'étude du métabolisme respiratoire a été réalisé grâce à la mesure

de la vitesse de consommation d'02 et de production de C02. La mesure
de ces deux paramètres s'est révèlée un outil particulièrement pré-
cieux pour l'étude des mécanismes de croissance en milieu solide.
En effet, cette méthode très précise permet de suivre et même d'enre-
gistrer automatiquement l'évolution de la croissance sans nécessiter
le prélèvement d'échantillons, cela permet de ne pas perturber le mi-
lieu réactionnel et d'éviter également les imprécisions liées à l'hé-
térogénéité du milieu.

L'établissement de l'équation stoéchiomètrique de la croissance a

permis de constater que l'eau est le principal facteur limitant de la
réaction de croisance. En effet pour transformer la totalité du
substrat il faudrait que le milieu contienne initialement plus de
64 % d'eau. Ceci peut constituer une explication du fait que la
croissance du champignon sur notre substrat amylacé à 50 % d'eau
s'arrête lorsque seulement 70 % du substrat a été transformé.

Grâce à la mesure de la vitesse de consommation d'oxygène, nous avons '

pu montrer qu'il existait une consommation de maintenance qui n'est
pas en relation avec la croissance du champignon. Cette consommation
est loin d'être négligeable et doit être soigneusement prise en con-
sidération dans l'optique d'une optimisation de la croissance en mi-
lieu solide pour l'enrichissement direct en protéines de substrats
amylacés.

Nous avons également montré que la quantité de chaleur produite, esti-

mée à partir de la consommation d'oxygéne, est en corrélation étroite
avec l'évolution de la température à l'intérieur du produit solide.
Nous avons pu ainsi calculer le coefficient de transfert de chaleur
dans notre dispositif. Ce paramètre est également très important pour
l'optimisation et le contrôle des fermentations solides.

Lors de l'&tude cinétique de la croissance en coordonnées semi-

logarithmiques, nous avons observé un changement de pente très net
 190

après 15 heures d'incubation, traduisant un ralentissement de la

vitesse spécifique de croissance. L'explication de ce phénomène ne
peut être trouvée à la seule lumière des connaissances acquises sur
la culture des champignons en milieu liquide. Par contre, il peut
être en relation avec la nature du développement mycélien à la sur-
face du substrat solide, ou avec la quantité d'eau disponible, qui
sont des caractéristiques de la croissance du champignon en milieu
solide.

Dans la suite de notre travail nous avons donc tenté d'interpréter

l'ensemble des résultats expérimentaux que nous avons obtenus et
d'élaborer un modèle cinétique de croissance,spécifique de la cul-
ture en milieu solide.
 CHAPITRE 7

ELABORATION D’UN MODÈLE CINETIQUE

DE LA CROISSANCE EN MILIEU SOLIDE
 193

1. INTERPRQATION DES RESULTATS EXPItRIMENTAUX ET BASES

DU MODiCLE

1 - ZNFLUENCE ûU MZLiEU VE CULTURE SUR LA CROiSSANCE

A partir d'un inOCUlUmd?sorIres Cult*es sur farine de manioc en milieu

liquide et en milieu solide, on observe une croissance de type expo-
nentiel dans les premières heures du développement du mycélium. Celle-
ci est dûe à une vitesse d'allongement apical qui est caracteris-
tique de l'organisme, et à une fréquence de ramification qui dépend
des conditions de l'environnement.

Dn peut interprêter l'influence du milieu sur la fréquence de rami-

fication en considérant qu'une ramification se produit lorsque la
partie non apicaledu mycélium fournit à l'apex un flux de nutriments
c'est-à-dire une puissance de croissance supérieure â sa capacité
d'élongation.

Physiologiquement cela s'explique par le fait que les échanges avec

le milieu se font sur toute la surface du mycélium et que les
substrats sont véhicules vers l'apex grâce aurcalrants cytoplasmiques
particulièrement actifs chez les champignons filamenteux.

Dans ces conditions, pour une même surface de mycélium,les échanges

sont rapides dans un milieu favorable, entraînant un flux élevé de
nutriments vers l'apex, une fréquence de ramification importante, et
donc une croissance rapide. Lorsque le milieu est moins favorable,
 194

les éhanges sont ralentis, fa Prequence de ramification diminue et

le taux de croissancè chute rapidement.

Ce mode de régulation du taux de croissance specifique est donc tres

sensible aux conditions de l'environnement, et au milieu de culture.
On comprend ainsi les différences que nous avons obserséesLa culture
du mycélium en milieu liquide agité favorise les échanges avec le
mycélium qui peut épuiser le substrat. La culture sur substrat solide
peut conduire à une limitation- des échanges par épuisement du milieu
à la proximité de la surface du mycélium et non par disparition
totale du substrat.

C'est ce que nous avons constaté puisque en milieu liquide la dispa-

rition du substrat est totale alors qu'en mil-éu cDlict2 la croissn-
ce s'arrête avant que tous les sucres aient été consommés D'au-
tre part les vitesses de croissances spécifiques sont différentes
ainsi que les caractéristiques des amylases synthétisées qui peuvent
entraîner des vitesses d'hydrolyse différentessuiti les conditions
utilisées. Enfin pendant la phase stationnaire nous avons constaté
une lyse rapide du mycélium en milieu liquide, alors qu'en milieu
solide la biomasse est beaucoup plus stable et poursuit un métabolis-
me actif.

Ces nombreuses différences nous montrent que le comportement du mycé-

lium est bien différent suivant qu'il se développe en milieu liquide
ou sur un substrat solide.

2 - NECESSITE D'UN A4ODELESPECZFI@IE

Comme d'autres auteurs ( 33 ) nous .avons constaté que la phase

de croissance exponentielle initiale se poursuit pendant-assez peu
longtemps et-l'on observe une rapide limitation de la vitesse.

Lorsque nous avons porté les paramètres

. de croissance en coordonnées
semi-logarithmiques, nous avons observéaolusieurs reprises un point
particulier qui se traduit,par une rupture de pente. Nous avons cons-
 195

taté ce phénomène sur milieu solide pour toutes les espèces que nous
avons cultivées sur farine de manioc.

L'explication de ce changement de pente n'est pas une chose aisée,

et ne peut être trouvée dans les différents modèles de croissance
qui ont été proposés pour les champignons filamenteux.

Les théories exponentielles et les modèles de limitation par la

concentration en substrat selon MONODou par la loi racine cubique
selon PIRT ne peuvent pas traduire une telle cinétique. Quant aux
nombreuses formules basées sur le postulat d'une croissance logis-
tique,elles ne sont basées sur aucune donnée physiologique concrète
et néoassilent l'ajustement mathématique de la formule pour chaque
type de cinétique observée.Cela conduit à la mise en oeuvre d'ordi-
nateurs qui fournissent oes coefficients d'ajustement n'ayant souvent
aucun rapport avec la physiologie de l'organisme ou avec les condi-
tions opératoires.

Quant à la théorie de croissance des colonies sur surface gélosée

( 33 ) elle conduit à une cinétique de croissance linéaire tout- à-
fait différente de celle que nous observons. Il est donc nécessaire
d'établir un nouveau modèle cinétique,spécifique de la croissance
sur substrat solide, pour expliquer les résultats obtenus. Pour cela
nous pouvons formuler plusieurs hypothèses .

- On peut invoquer le vieillissement du mycélium, ce qui a été sou-

vent observé du point de vue morphologique, puisque les parties dis-
tales du mycélium se vacuolisent même dans des conditions de crois-
sance favorable. Snit X la biomasse totale et X, la fraction de la
biomasse stationnaire ; la vitesse de croissance du mycélium devient:

rX
= j’ (X, - Xs) 1311
Si on exprime la biomasse stationnaire en terme de taux de mortalité
nar raoport à la biomasse totale (Xs = kX).
On peut alors écrire que :

'"x. = (u - k) X 1322

D,ans les premiers stades de l'incubation le taux de croissance

spécifique est égal à 1-1. Quand le vieillissement apparaît il di-
minu et devient égal à p - k.

- On peut également expliquer le changement de pente par un phénomène

de diauxie. En l'occurence le mycélium utilise préférentiellement les
sucres réducteurs libres presents dans la farine: puis,lorsqu'ils
sont épuisés se développe aux dépens de l'amidon. Toutefois nous de-
vons remarquer que dans les deux cas le substrat directement assimilé
est le glucose. Il ne s'agirait donc pas d'une vraie diauxie, mais
plutôt de l'apparition d'une limitation de la vitesse d'hydrolyse de
l'amidon.

Pour tenter de choisir parmi ces deux hypothèses, nous avons étudié
de facon précise la croissance du champignon dans les premiers stades
de son développement. A cet effet nous avons utilisé l'enregistre-
ment automatique de la vitesse de production du CO*, pour des cultu-
res sur milieu solide ayant reçu des densités d'inoculum de 2.106,
2.107 et 2.1G8 spores par gramme de farine. Nous avons alors consta-
té que le point de rupture de la pente se produit à une période qui
dépend de la dose d'inoculum mais qui correspond toujours au même
degré d'avancement de la réaction de croissance, c'est-à-dire pour
une quantité de biomasse définie.

Ceci est en contradiction avec l'hypothèse du vieillissement, car

dans ce cas le point de rupture aurait dû se produire au même moment
dans tous les cas, et les différentes inoculations auraient entraîné
la formation de quantités différentes de mycélium.

En première conclusion on peut donc estimer que la croissance du

champignon filamenteux sur substrat solide amylacé est de type expo-
nentiel dans les premiers stades du développement, et que par la
suite la vitesse de croissance est limitée par la vitesse d'hydroly-
 197

se de l'amidon.

3 - CAUSES VE LA LZMITATiON ET BASES DU MOVELE C'INET'IQUE

Pour établir un modèle cinétique spécifique de la croissance sur

substrat solide il nous faut déterminer les causes probables de la
limitation de la croissance. Pour cela nous nous baserons sur les
résultats que nous avons obtenus.

- L'étude du mode de colonisation du substrat solide a montré que

le mycélium se développe essentiellement à la surface des grains
d'amidon. La réaction d'hydrolyse de l'amidon par l'amylase que nous
avons trouvée assez fortement fixée à la paroi du mycélium, se passe
donc essentiellement à la surface de l'amidon et peut être assimilée
à une réaction de catalyse de contact.

- Nous avons montré également pour un produit contenant 50 % d'eau,que

la réaction de croissance est obligatoirement limitée par la dispari-
tion de l'eau disponible. Or l'eau intervient en tant que réactif
dans la réaction d'hydrolyse. Sa disparition conduira donc au ralen-
tissement de la production de glucose.

Ces deux paramètres, catalyse de contact et eau disponible, n'inter-

viennent pas dans le cas de la culture en milieu liquide. Ils sont
spécifiques de la croissance sur substrat solide et peuvent expliquer
la limitation de la croissance avant l'épuisement total du substrat.

Le modèle que nous avons établi a donc été basé essentiellement sur
la limitation de J’hydrolyse du substrat par les phénomènes de
catalyse de contact ou par la disparition de J 'eau disponible. Nous
verrons que ces deux causes de limitation conduisent à l'éta-
blissement de la même équation de la vitesse d'hydrolyse, et donc
au mêmemodèle cinétique.
 198

L'hydrolyse de l'amidon est une réaction enzymatique de type autoca-

talytique. C'est une réaction enzymatique pure puisqu'elle se dérou-
le en dehors de l'organisme ; elle est autocatalytique car Je produit
de la réaction permet au champignon de synthétiser plus de biomasse
et d'augmenter ainsi la vitesse de synthèse d'amylase, ce qui en re-
tour augmente la vitesse de la réaction d'hydrolyse.

Comme toute reaction enzymatique, la vitesse d'hydrolyse de l'amidon

est proportionnelle a la concentration en amylase et est également
fonction de la concentration en rëactif limitant selon la formulation
générale, de MICHAELIS - MENTEN . En considhant que l'eau est le
réactif limitant on peut alors W-ire :

[HZ01
rSH = Vmax. [El . 1321
K + tH201

K étant une constante égale à la concentration en eau dans le milieu

pour laquelle la vitesse d'hydrolyse est egale à la moitié de Vmax.

Pour un milieu amylacé solide à 50 % d'eau, la réaction d'hydrolyse

s‘écrit au temps t pour un gramme de substrat et un gramme d'eau :

Ln W6H1005),,
+ H20 IE3
> 'gH12'6 1331

(1 - a X) (1 -bX) WI

- X étant Ja quantité de mycélium synthétisé au temps t

- a et b les quantités nécessa G-es de sucre et d'eau pour synthétiser
1 gramme de mycélium, calculés d'après l'équation stoéchiomëtrique
de croissance [222.
 199

Ainsi :

(1 - bX)
rSH = Vmax. E L343
K + (1 - bX)

D'autre part la vitesse de synthèse d'amylase est proportionnelle a

la quantité.de biomasse :

rE = k. X-= k.X,.e nt

ce qui permet d'écrire après intégration :

E=k.Xo.eUt + E, = k' X + E, P5’J

U

La quantité initiale d'enzyme étant négligeable par rapport, à la

quantité d'enzyme synthetisée au temps t (figure 23 ) on peut &Cri-
re :

= k' X
Et

En combinant 3Iet35 on obtient :

(
1 - bX)
rsH = vmaxs . k'.X.
K + (1 - bX)

que l'on peut mettre sous la forme :

1 b71
rsH, = kl. X. -
l+K
1 - bX

Le terme (1 - bX) représente la quantité d'eau disponible dans le

milieu solide. En milieu liquide ce terme serait ( OD - bX) et K
serait négligeable. La vitesse d'hydrolyse s'écrirait alors d'après
l'équation 35:
 200

rSH = Vmaxe k'.X = V,,,. k'.X o&

En milieu solide par contre, le terme (1 - bX) devient rapidement

très faible par rapport à K.

Dans ces conditions- K

devient élevé et nous pouvons effectuer
1 - bX

une approximation en négligeant 1 devant ce facteur élevé, on obtient

ainsi :

1 ‘L 1 = 1 - bX
1+ K K K
1 - bX 1 -bX

La vitesse d'hydrolyse s'écrit alors d'aprës 37 :

rSH = kl. X.
1 - bX
K

ou encore :

rSH = u. x (1 " U'X) Nl ’

avec u = VmaxJ- . 1
!J K

et u'=b
 201

7.2. Ca;taeybe de covctact

L'étude microscopique de la colonisation du substrat (Cf. p. 94-97)

nous a révèlé que le mycélium se développe initialement au contact
des grains d'amidon. D'autre part le calcul théorique du taux de re-
couvrement (Cf. p. 114-115) a montré malgré une approximation grossiè-
re, que la totalité de la surface disponible pouvait être rapidement
recouverte par le mycélium. Si l'on considère que la réaction d’hydro-
lyse de l'amidon est une catalyse de contact entre le substrat et le
mycélium,, sa vitesse peut donc être limitée.

Considérons le cas d'un grain d'amidon A, sur lequel le mycélium

représente une surface x. Il a formation d'un complexe "grain
d'amidon - mycélium" et la réaction d'hydrolyse s'êcrit :

[x]+iA] 2. [xA] -, k'd x t glucose ml

k'a

A L'état stationnaire on a :

rxA = ka. [$.[A]- k' a [xA}- k'd [xA]= 0

d'ou

[xA]= ka IXE (AI

1401
k’atk’d

D'après la réaction 139Jla vitesse de production de glucose (S")

s'écrit :

rSH = k'd lx A] 1411

 202

Si on pose :

Sg = surface du grain

S = surface de contact d'une spore ou d'une portion de

mycélium correspondant

f = taux de recouvrement

SO = * = noinbre de sites disponibles sur un grain d'ami-

S
don .

Dans ces conditions on peut écrire que :

b A]= SO. f et [A]= SO (1 - f)

L'équation40 peut alors s'écrire :

So.f= ka * 14 . SO (1 - f-1
k'a + k'd

En posant K' = ka on trouve que

k'a t k'd

f = K'. X
K'. [xl+ 1

L'équation 4ls'écrit alors

k'd. SO. K' . IX~

rSH =
K' [xl + 1

La biomasse X est proportionnelle à.\xI

x=p. [xl

En posant Vm = SO. k'd et K A

K'

on obtient :
 203

Vm. X
rSH = 143"
X+K

qui est une expression du type de MCHAELIS - MENTEN

Cette expression peut se mettre sous la forme :

rSH = h. II443
K

Au cours de la croissance, le terme X/K est petit devant 1 car la

vitesse de formation du complexe mycélium - amidon qui est lié à la
vitesse de croissance est beaucoup plus petite que la vitesse d'hy-
drolyse de l'amidon. Dans ces conditions on peut faire un développe-
ment limité du premier ordre :

1 * l-- X
K
1Z
K
La vitesse d'hydrolyse s'écrit alors :

=Vm. X .(lA 1
rSH
K K ‘

en posant

u=Vm fatu'=- 1
K K

on peut écrire :

rSH = u. x (1 - U’X) I 46j

Cette expression de la vitesse d'hydrolyse de l'amidon est identique

à l'équation que nous avons obtenue sur la base d'une réaction
autocatalytique limitée par la quantité d'eau disponible.
 204

C'est un résultat tout-à-fait intéressant qui montre que les deux

paramètres spécifiques de la croissance sur substrat solide, condui-
sent à la même cinétique de l'hydrolyse de l'amidon.

La vitesse d'hydrolyse est donc de la forme

= u. x (1 - U'X)
%H

On peut écrire également

1 = u (1 - U’X)
-.
X rSH

Pour déterminer u et u' on trace donc ?- . dSH = f (X) à partir des

X dt
résultats expérimentaux des dosages des sucres consommes et des
sucres réducteurs libres

SH = SC + Sl

La figure 40 montre qu'on obtient bien une droite de pente nfgative

en accord avec la formule de la vitesse d'hydrolyse. On peut ainsi
définir :

-1
u = 0.52 h

u’= ~ 1 = 2,86 g/gx

0,35

d'où :

= 0,52 X (1 - 2,86 X) \ 47:

?H
 205

-
.. u = 0,52

-\
‘& \u’ - 0,35
\
8 0,2 0,3
X (g/g substrat)

Figu&e, 40 - VLteh~e. .spéci@que d’hgdkolgse en dontion de. .fTa bhmaAe

Agnthéhhée p bti La base des G-ailYti e.x/&imetix de
la cuRtune d'A. hennebtigii cu&iXvée en milieu bolide.

2 - E2UAJION ClNETlO,LIE VE L'HYVROLYSE VE L'AMUIUN

Pour établir l'équation cinétique des sucres hydrolysés il nous faut

intégrer l'équation de la vitesse d'hydrolyse t47J

Pour cela nous devons exprimer X en fonction des sucres hydrolysés.

Si on porte sur un graphique les valeurs expérimentales des sucres
hydrolysés en fonction de la biomasse synthétisée, on obtient une
Y,H = 0,44 repr&sente le rendement de transformation des sucres
hydrolysBs en biomasse ; on peut donc kkrire :

x = 0,44. SH

I I
091 cv 013
X (g/g substrat)

Figu&e 47 - @antia?iA de 6uct(ec> hydmlqcrén en donction de La bi.omas-

Ae &mée au COLL&Ade La clto.hbance en wieieu Ao.t?.ide,buh
la base deci ~~ébui!RatA expédnentaux

En reportant cette valeur de X dans l'équation 47 on obtient :

= 0,226. SH (1 - 1,24 SH) PS7

rSH
Pour intf&rer cetta Bquation on la mf2t soua le forme p'lua simple :

rS m Y. s (1 - V~S)

que l'on peut écri-re :

dS
= v. dt
s (1 - V'S)

On déconipose la fraction rationnelle d

s (1 - V'S)
en'éléments simples et l'on obtient :

1 =-+- 1 V’
s (1 - V’S) S 1 - v’ s

d'où l'intégration de l'équation 4949

!G+ v’ * =v . .dt
S 1 - v’ s

on obtient ainsi :

1 - V'S - = v.t.
In -L- - In
SO 1 - V’SO

d'oû l'on tire après calcul :

-=1 1 - V’SO . eevat + v’

S SO
ou

So. evt
s= m
vt
(1 - v'S0) + y'S0.e
 208

La vitesse d'hydrolyse de l'amidon est donc fournie par l'equation :

.. çô, ,0,226 t
.~
'H e t-52!
(1 - 1,24 SO) + 1,24 So.eo9224 fi

3 - VERlF7CAJlON EXPERiWENJALE

Pour effectuer la vérification expérimentale, il nous faut tracer la

courbe théorique de l'évolution des sucres hydrolysés en fonction du
temps et la comparer avec les points experimentaux. Pour cela il
nous faut déterminer SO.

En posant 1: .v.lS" =v
SO

l'équation 50 s'écrit :

- 1 = V.emvt +v'ou V=(-

1
- v'). e
vt
SH SH

Pour déterminer la valeur de V, on peut soit doser la ouantité d'a-

midon hydrolyse au temps initial, ou plus facilement, utiliser une
valeur expérimentale de SH à un temps déterminé de la réaction.

Par exemple à t = 20 heures on a SH = 0,436 o/gF, on obtient ainsi :

v = (1 - 1,24) . e"y226. t = 95
0,436

ce qui correspond à une valeur de

SO = 0,Ol g de sucre/g de farine

c'est-à-dire qu'au temps initial on a 1 I de sucres réducteurs dans

un gramme de farine de mani.oc, ce qui correspond effectivement aux
 209

dosages expWimenlaux.

Finalement l'équat9otï cinetique des sucres produits-par l'hydrolyse

de l'amidon s'écrit : ~,

.sp.y 1
'g5 e- 0,226 t
+ 1,24

Sur la figure 42 nous pouvons constater que les valeurs expérimenta-

les sont particulièrement bien ajustées avec la courbe théorique, ce
qui indique que le modèle cinétique que nous avons établi traduit
bien la cinétique de l'hydrolyse de l'amidon et l'importance de l'eau
libre dans cette hydrolyse en milieu solide.

Cette observation est à rapprocher des résultats qui ont été rappor-
tés par DRAPON& Col1 (93) concernant l'influence de l'eau sur l'hy-
drolyse de l'amidon
s dans les aliments. Ces auteurs ont montré nette-
ment que l'hydrolyse de l'amidon est en rapport étroit avec l'activi-
té de l'eau qui infl<ence..non seulement la vitesse d'hydrolyse mais
détermine également la limite du-taux de conversion de l'amidon.
 210

-0,226t
1 = 95.e * 1,24
sh
 211

III. MODÈLE CINETIQUE DE LA CROISSANCE

1 - VZTESSE VE CRUiSShlCE

1
Nous avons vu que S,, = ~ . X
'SH

donc

1
?H = - .r
X
'SH

Dans notre hypothèse initiale nous avons supposé que la croissance

du champignon est limitée par la réaction d'hydrolyse, donc si
tous les sucres hydrolysés sont utilisés pour la synthèse de biomas-
se on peut' écrire :

P-. 1
rSH = rSc rX
Yc

avec :

Yc = rendement de croissance sur glucose

donc d'après l'équation 47 :

= Yc. 0,52 X. (1 - 2,86 X) $4)

rX

SC on porte JX- . rX= f (X) à partir des valeurs expérimentales

obtenues par le dosage des protéines synthétisées (figure 43) on

constate que la vitesse spécifique de croissance diminue effective-
ment lorsque la quantité de biomasse synthétisée augmente.
 212

La diminution du taux spédflque do crai~kw33 n'e3t pas oxaictemenl

l!nBaire, car elle pr%senta un palier vers le m494eu de la creis~anee.
Il faut cependant remarquer que 'la determination du taux spécJfJque
de croissance par le dosage des proteines synthetisées en milieu soli-
de présente une certaine imprécision et que la détermination des va-
leurs de la vitesse de croissance par interpolation graphique de la
courbe expérimentale ajoute à cette imprécision.

FXguke 43 - Taux de ctro.Lbnance &péc&Lque en done.tion de &a quatié

de biomabbe 4+&%tiée, 2 pa&& du vaIe.tib expéti~en-
tale.4 obteizueb .L.oks de La clLe;tuhe en milSeu 6o.lide.
 213

On peut cependant tracer une droite moyenne de régression qui prhen-

te une pente négative en accord avec notre formulation de la vitesse
de croissance. D'après la figure 43, on peut determiner les valeurs
de 1-1et P' telles que :

I
= .d (1’ - y’ X.) ,
I rx

et l'on trouve :

= 0,3 x (1 - 3,3 X) ‘55’

- .
rX

Si donc tous les sucres consomhés étaient utilisés pour la croissan-

ce, les équations 54 et 55 devraient ëtre équivalentes, ce qui n'est
pas le cas.

On est ainsi amené à-considérer une consommation de naintenance telle

que :

1 f mS X
rSF! X
- r5c = -Y- - r

ou

= Yc. ( rSH - mS X)
rX

En remplaçant rSH par sa valeur dans l'équationf46 on obtient

aprihs calcul :

= Yc. (u - m,) . X (1 - ” - ’ . X)
rX
u-m
S
 214

On pose

u = Yc (u - m5)

1-I'= ~ u u'
u-m
S

Puisque nous connaissons les valeurs de u et u' d'après l'équation

47et les valeursde v et JJ' d'après l'équation \55,l on peut calculer
les valeurs de Yc et m5.

On obtient ainsi :

YC = 0,66 g de biomasse/g de glUCOSe

= 0,072 g de glucose/g de X/h

mS

Yc represente le rendement théorique maximum de la transformation du

glucose en biomasse, lorsque le taux spécifique de croissance est
maximum et que la consommation parasite est nulle.

mS représente la vitesse de consommation de maintenance. La

valeur que nous avons obtenue à partir de notre modele cinétique
correspond bien à la consommation parasite que nous avons mesurée
expérimentalement (Cf. Chapitre 6).

2 - E@JATION CINETIQUE VE LA CROISSANCE

Pour obtenir l'équation cinétique de la croissance nous devons inté-

grer la vitesse de croissance par rapport au temps.

La vitesse de croissance :

= vx (1 - p' X)
rX

est de la même forme que la vitesse des sucres hydrolyses (équation

$Bl)et s'intègre donc de la même façon (Cf. paragraphe II.2.).
 215

On obtient alors une équation de la forme :

Yo. eut
x=
.!-561
(1 - Fr’ X0) t p' Xo.ept

Rappelons que dans cette formule la biomasse synthétisée est expri-

mée en gramme par gramme de farine. Elle a été établie
pour un : milieu solide contenant 50 % d'eau c'est-à-dire 1 g
d'eau pour 1 g de farine. Si l'humidité initiale du produit était
djfférente, la concentration d'eau résiduelle au temps t s'écrirait
(k - b x) et la formule générale de la vitesse de croissance serait :

rx = VX. (k - b x)

On obtient ainsi la formule générale de la croissance en milieu soli-

de.

x= .. k. Xo. ek pt j;5;:
(k - b Xo) t-b. XO.ekut

Chacun des paramètres de cette équation générale possède une signi-

fication concrète :

k = représente la quantité d'eau initiale pour 1 g de farine elle

est doncconnue pour des conditions expérimentales définies

b = la quantité d'eau consommée pour synthétiser 1 g de biomasse

sa valeur est obtenue par l'équation stoéchiomètrique

1-I = est le taux de croissance spécifique maximum dans le milieu

considéré

XO = la biomasse initiale qui est déterminée par la densité de

 216

l'inoculum

t = le temps de la réaction à partir du début de l'incubation

X = reorésente la quantité de biomasse exorimée en g par g de substrat.

Il ne s'agit donc pas réellement d'une concentration en biomasse,
mais d'une variable réduite adimensionnelle qui représente le ren-
dement global de production en biomasse.

Ce mode d'expression particulier de la biomasse est lié à la nature du

milieu solide. En effet en milieu liquide il est aisé d'effectuer un
prélèvement homogène d'un volume de milieu représentant une fraction
constante du volume total et l'on a ainsi l'habitude d'exprimer la
biomasse en concentration. En milieu solide. cela est beaucoup olus
difficile étant données les variations du poids sec total, de la te-
neur en eau et de la densité du milieu. C'est pour cette raison que
nous avons préféré suivre la croissance grâce à cette variable rédui-
te qui permet d'éviter les risques d'erreurs, et qui nous a paru la
plus pratique.

A cet égard, nous noterons que les similitudes que nous aurions pu
déceler entre les cinétiques obtenues en milieu liquide et solide
ne Peuvent être généralisées. Elles sont liées au fait que pour les
nécessités de la comparaison nous avonsdû utiliser une quantité
totale de substrat identique dans les deux types d'incubateurs et
que nous avons choisi pour cela
 217

une concentration en substrat de 10 g/l pour le milieu liquide. ,

Il est d'ailleurs important de noter que si nous avions utilisé un
milieu à 50 g de substrat/l, nous aurions obtenu une cinétique de
croissance différente puisque nous aurions divisé par 5 le r&sultat
de la biomasse rapporté à 1 g de substrat.

Cette remarque a été faite pour montrer la spécificité et les limi*

tes du modèle cinétique que nous avons élaboré, qui n'est applicable
sous cette forme que pour la croissance sur substrat solide.

En ce qui concerne notre milieu solide à 50 % d'humidité initiale,

i'équation 5C peut se mettre sous la forme :

X0. eut
x =
ltu’ Xo(eFLt- 1)

On constate que lorsque la durée de la crois-

sance augmente, la quantité de biomasse synthétisée tend vers I
!J'
qui représente la quantité maximale de biomasse pouvant être synthé-
tisée à partir d'un gramme de farine compte-tenu de la concentra-
tion initiale du réactif limitant,c'est-à-dire l'eau,ramenée a 1
g de farine.

Notons que d'après le mode d'expression adopté, la valeur de X est

obligatoirement inférieure à 1.

D'autre part si X0 est très petit, le terme B'XO (eut- 1) est

négligeable devant 1.

Dans les premiers stades de la croissance, on a ainsi : X = X0. eut

et la croissance peut se réaliser de façon exponentielle, comne nous
l'avons,constaté.

Par la suite lorsque t augmente le terme 1.1'Xo (eut - 1) devient de

moins en moins négligeable et la croissance n'est plus exponentielle.
Dans ce mode d'exoression de la croissance nous voyons l'importance
de la quantite de biomasse initiale, c'est-a-dire de la densité de
l'inoculum de spores. Lorsqu'on augmente la valeur de X0, la crois-
sance est plus rapidement ralentie et la durée de la phase exponen-
tiel.le est moins longue. Ceci est en accord avec les résultats que
nous avons obtenus lors de la recherche de la quantité optimale de
l'inoculum de spores (Cf. Chapître 3).

3 - UERIF7CATTON EXPERTMENTALE

Pour faciliter les calculs, nous pouvons écrire l'équation~5~souS

la forme :

1
-= 1-p’X0 <,-lJt+$ 759.
X x0

Pour effectuer la vérification expérimentale il nous faut détermi-

ner V, ii' et X0.

Nous avons déjà déterminé précédemment (Cf. 111.1.) que :

1-1= 0,3 h-l et U' = 3,3 g d'eau/? X

Pour déterminer Xo, on peut mesurer directement le poids d'inoculum

introduit (ici 2 x 107 spores/g). On peut également déterminer Xo
par le calcul en prenant une valeur expérimentale quelconque par
exemple a t = 10 heures, X = 0,02 g/g de farine.

Si on pose : " = 1 - vx0

x0

On peut écrire, d’après l'équation~5$ :

1
-=U. e - 053 t10 t 3,3
x1O
D'oiI l'on.tire,:

IJ = 830
et
Xo = 0,0012 g/l de farine

L'ëquation cinétique de la croissance s'écrit donc :

-!-.z ‘830. e- Oy3 t + 3,3 g/g de substrat

X

Sur la figure 44 nous avons représenté en trait plein la courbe

théorique correspondant à cette équation cinétique. Les points re-
présentent les valeurs -expérimentales. ,

On constate que l'on obtient une très bonne représentation de la

croissance depuis le temps zéro jusqu'à 25 heures. Le décalage ul-
térieur peut être dû à un début de lyse du mycélium.

On observe également que la courbe théorique tend vers une limite

(0,3 g/g de F) qui est très proche de celle obtenue expérimentale-
ment (0,28 g/g F) et qui est de plus en excellent accord avec
l'équation stoéchiomètrique que nous avons établie au chapitre pré-
cédent. En effet d'après cette équation stoéchiomètrique, 23.0~ voit
que pour un milieu contenant 1 g d'eau pour.1 g de farine, on peut
obtenir 0,297 g de biomasse.

. . <
Un dernier point restait à éclaircir concernant la ruoture de pente
que nous avons observée lors de la représentation graphique de la
croissance en coordonnées semi-logarithmiques.

Pour ceia nous avons porté en coordonnées semi-logarithmiques les

valeurs de X calculées d'après l'équation$Q et nous les avons com-
paré avec les valeurs expérimentales (figure 44). On s'aoerçoit
alors que l'on peut tracer deux droites qui correspondent parfaite-
ment aux observations que nous avions faites.
 ,O,l

-
10 20
temps
(9
F.Lgum 44 - Companahon de ta cowrbé théotiyue. de La c/ro&sance LWL
sub&Omat solide avec .&A ~é~ul.tc& exptientaux obtenus
Lom de .!.a CU.&WL~d’A. hwncbengc M.IJL@Lne- de. matioc
en ttieu hoUde.
l : vde~hn exp&imentien éche&e am%.tnétique
a : V&~LL~U expi?himetiaEes écheUcz togcvu%mique
-: J?LLW~de La combe khéotique nelon R’équa.do~~ ciné;tique
de. Oa b,iotna,sclc
 221

Cela est dû à ce nue dans $s3p;emières heures de la croissance n'

est,negligeable devant U.e ' , mais en réalité la pente s'inflé-
chit très légèrement. Il convient donc d'être orudent dans cette in-
terprétation. En particulier, si on ,observe une bonne corrélation
entre les points expérimentaux et la courbe théorique, cela ne
constitue.pas une indication suffisante Four expliquer la rupture
de nente observée au cours de la croissance.

Nous voyons une fois de plus que notre modèle cinétique est en très
bon accord avec les résultats expérimentaux et qu'il permet de ren-
dre'compte des observations que nous avions faites pré-
cédemment.

IV. BILAN DES DIFFERENTS CONSTITUANTS

A parti.r du modèle cinétique de la croissance en milieu solide, nous

pouvons étudier l'évolution des différents constituants de la réac-
tion globale de croissance.

Rappelons que Cette réaction globale a été déterminée

précédenwnent en séparant la réaction de respiration et la réaction
de biosynthèse du mycelium (Cf. p 420 j. A cet , effet nous avons
utilisé la formule élémentaire du mycélium d'A. tigeh no 10 cultivé
sur farine de manioc en milieu liquide, et le pourcentage des su-
cres respirés,mesuré par l'intermédiaire de l'oxygène consomné.

Nous avions ainsi établi la réaction stoéchiomètrique suivante :

t 2,l o* t 0,54 (ÎIH4t OH-) + 18,6 Hz0

'SH12'6
180 g 6796 9 3?4,8 g

- 3,9 (CHI,64 Oo', N0,14 ,536 H20) + 231 CC2

99,45 g 92,4 9
 222

Cette Gquetion permet de calculer les dWQrents rendements de

crodssance pour chacun des constituants, et de connattre leur Pva-
lution 6 partir de la cinetique de croissance, lorsqu'J1 n'existe
oas de métabolisme secondaire non associé a la croissance.

Or nous avons vu à plusieurs reprises qu'il existe une respirati,on

parasite que nous ne pouvons négliger. Ainsi nous avons pu déter-
miner une consommation parasite de sucre de 0,07 g/g de X/h.
D'après la mesure de l'oxygène consommé nous avons calculé une
maintenance du même ordre. Si le quotient respiratoire était
égal à 1: lors de cette respiration résiduelle, la production
corresoondante de CO2 serait de 0,103 g de C02/g X/h.

Or nous avons calculé un Q.R. = 0,55 durant cette période (Cf,

et la maintenance de CO2 devient : mCO = 0,055 g/g X/h,
ce qui correspond bien à la quantité de CO2 2 dégagé en l'absen-
ce de croissance (voir figure 30 ).

Pour effectuer le bilan des différents constituants au cours de

la croissance, nous avons tenu compte à la fois de l'équation stoé-
chiomètrique et de l'activité respiratoire de maintenance.

1 - CINETiO_E QES SUCRES CONSOA4MES

La vitesse de consommation du glucose s'écrit :

1
r sc - - . rX t m, . X
Y.5

D'après la réaction stoéchomètrique globale :

Ys = 0,55 g de biomasse/g de glucose consommé

D'autre part nous avons vu lors de l'étude expérimentale que

“S = 0,07 g/g X/h

 223

On obtient ainsi par intégration de la vitesse

!-
1
SC -- (X - X0) + 0,07 X.dt
0,55 J
b”

11 nous reste donc à intégrer, d'après l'équation de la croissance :

f- e
s t;
X.dt =
s
t,. 830.e - Oy3 t t 3,3
1 -. dt

&Je l'on peut ecrire :

t 17
)(.dt= -ii . dt
J 393 f 830 .e-093 t + 1.
te t:0 G

On posé :

=83o.e - 0,3 t = a e- 0,3 t

a 0'
3-3

avec :

830 = 251
ao= 33
9

La dérivée de a s'écrit :

da=-0,J.z.e - 0,3 t .dt

,
d'où :

‘& I - da = -- da
0,3, 830 . e - Os3 t 0,3 a
3,3.
 224

On
aa’ot
: d / 4
s to
X.dt= - 1

0,99
.
s4
0
da
a (a + 1)
1L
4
0
da
a (a + 1)

fr et

s
te
X.dt =-
E n --a--
ao
-In a+1
ao + 1 1
que l'on peut mettre sous la forme

ft 1
JI=n X. dt = In .(l+L)J
a
En remplacçant a et a, par leur valeur respective, on obtient
enfin :
*

$.'dt = In [ =In 251t eOe'

p]
252

L'équation cinétique des sucres consommés s'écrit donc :

SC = 1,8 (X - X0) t 0,07. 251 + e OS3 t

In $2)
252

Le premier terme de cette formule représente les sucres consommés

pour la croissance ; le second terme représente la quantité de
sucres consommés par la biomasse par découplage énergétique ou
pour la maintenance.

Par cette formule, nous pouvons ainsi connaître à chaque instant

la quantité de sucres consommés et la répartition de cette consom-
mation.

C'est ce que nous avons représenté sur la figure 45.

 225

On constate tout d'abord qu'il y a un bon accord entre la courbe

théorique et les points expérimentaux. Pendant les 20 premières heu-
res de la croissance, les sucres consommés semblent servir essentiel-
lement pour la croissance car les points expérimentaux sont sur la
courbe de consommation des sucres liés à la synthèse de protéines.

Après cette période, e t lorsque la croissance se ralentit, on obser-

ve une augmentation très rapide de la maintenance qui
représente après 30 heures,33 % de la consommation des sucres, alors
qu'à 20 heures elle ne représente que 15 90 de la quantité totale de
sucres consommés. On voit ainsi tout l'intérêt que l'on à connaître
cette répartition, et à cet égard l'équation cinétique que nous avons
établie paraît tout à fait utile.

2-o 3-o
temps (h)
 226

2 - CONS0MMA-l70ND'OXYGENE

En effectuant la même démarche que pour les sucres, on peut écrire :

= U,O7 g d'02/g X/h

mo2
Y = 1,55 g de X/g d'02
O2

L'équation cinétique de l'oxygène s'écrit alors :

.02 = U,64 (X - X0) t 0,07 In 251 t e0y3t k33

252

La figure 46 indique que nous obtenons un bon accord entre la cour-

be théorique et les points expérimentaux.

I O2
=0,64X+0,07InM

temps (h)

Figure 46 - CompaJu&on de. la quantité d’oxygène cotiommk calkLEe

d’ap-+& t’ équation 63 e,t &A V~&UJIA exptientae~
i- couhbe tlzéotique ; e vdewl expéhevttaee)
 227

3 - DEGAGEMENTVE GAZ CARBUNl$lUE

L'applicakion des mêmes calculs nous donne pour l'évolution du CO2 :

"CO2 = 0,055 g de CO2/g X/h

Yco; = 1,12 g de X/g de CO2

L'équation cinétique de production de CO2 s'écrit :

251 t e Oy t
.C02 = 0,89 (X - X0) t 0,055 In @$
252

CO2 = 0,69 X +0 055 In M

D3

02

2 ’ temps ( h)3 ’

F-iglule 47 - EvoCtion du CO2 to.tat dégag& au com de la c&oi&ance

d’A.hennebehgti MOL oubbkrrat amq!.acé bolide. Com,pax&-
bon de la coutbe théotigue [-1 et des vaLewra
expZ/timentf&c4 I 0 ).
 -!b,j~;~j;f;:;,.!':
La figure 47 indique que ~~g,'bai'~~~i,thgoriques-sont,legerement su-
périeures aux valeurs obtenues par la mesure du,.C02,c&gag~,, dw moins
; pE3nda& i~dii~fj&#&~ .h@?*iv$'&p , q/i'&&lt;: &y +&i?fo$$ L I;!f fde.'
,y ', &Ci5tire bi 5

la cinétique est essentie'llement'ico~~a~ab%le.i~ ,..'.: t" - ,~ 5

a

Nous avons vu (Cf. Lhapître 6,I.I) q~e-~l!on!,pout'~tilise~,ll'a mesure

des vitesses de consommation d'OZ ou de production de CO2 comme
paramètre précis.de~l~a~icsoij~ance~,~~r~ sbbs$rab sa'l'i'd~'iiP~oü-Sia3ônS:' 1
donc cherché à établir l'é&akion cinétique de la vitesse de produc-
tlon-,de fi :. L.!‘ ,,i /,xr; ,f ,* {. - 7_:I 3:;:.
i 1’. .’ A.!
c* ,.C’?‘. CO2 . .__,?. ‘?”*d...^. -._-. ‘1
5 :\
.

0,03

D,O2

II,01
 229

La vitesse de production de CO2 s'écrit :

D'après l'équation cinétique de la vitesse de croissance (55 ) on

-. .,
a:

Yo =h2-
,
0,3 x. ‘(1 - 3,3 X) f 0,055 x

Après calcul on obtient :

‘1~ = U,32 X - u,88 X2 j67j

Cn2

La figure 48 montre la courbe théorique et les valeurs expérimenta-

les provenant de l'enregistrement direct de la vitesse du CO2
formé.

Cette fois encore nous obtenons-une très bonne corrélation entre

les valeurs obtenues à partir du modèle cinétique et les valeurs
expérimentales obtenues lors de la croissance de notre champignon
sur substrat solide amylacé.

4 - BILAN VE L'EAU CON.SOMMEE

La vitesse de consommation ,de l'eau au cours de la croissance sur

substrat amylacé est donnée par la formule :

I rH20 ,= f - rsH + +-- . rX - mH x rd

~. Ii 20
hz0

avec
 230

= Rendement de l'hydrolyse par rapport I l'eau consommée ;

YH
YH = 10 g de sucre/g d'eau

Y - Rendement de croissance par rapport à l'eau nous avons d'a-

Hz0 -
près l'équation stoéchiomètrique YH o = 0,3*g Xfg H20
2

= production d'eau lors de la respiration correspondant C?ila

mH20
maintenance, calculée d'après la consommation d'02, on
= U,O4 g- H,O/g X/h.
trouve mH20

- La quantite d'eau consommée au cours de la croissance sera donc

donnée par :

- 1 1
Ii u -- * s * x - n:n4 In M
*c 10 cy- +(J,3
ou
=.O,l . SH + 3,3. x - 0,04 In M F+I
H*OC

- La quantité d'eau totale dans le milieu au cours de la croissance

est donnéeloar la formule suivante :

H20T = H20i + H20r - H20H

H*O, = 0,56 O2

H20H = 0,l SH

d'où : H20T = + 0,56 O2 - 0,l SH

H20 0

- L'eau libre résiduelle dans le produit est la différence entre

l’eau totale et l'eau de constitution et peut être calculée suivant
la formule :

H201 = H20T - H20c

 231

F.Lguhe 49 - EvoluZ.Lon de.h d.L~~&entes domeh de l’eau dam te miLieu

au coum de ta c.ko.&ance (1 : eLlll.tata-
Le ; 2 : eau conAommée ; 3 : eau tibrre ~ésidue.UeJ
-: counbeh théotiyueb ; 0 vdeuu exptientaeeb.

Sur la figure 49 nous avons représenté l'évolution de l'eau totale (l),

l'eau consommée (2) et l'eau résiduelle au cours de la croissance.
Pour la vérification expérimentale, nous n'avons pu comparer que la
quantité d'eau totale contenue dans l'échantillon. On observe une évo-
lution parallèle, mais les valeurs expérimentales sont sensiblement
plus élevees que les valeurs théoriques. Ceci peut être dû au phénomè-
ne de sorption, lié à la diminution de l'eau libre,donc de l'activité
de l'eau (89). Nous constatons effectivement que la quantité d'eau
résiduelle diminue très rapidement. L'écart que nous constatons entre
les valeurs calculées et mesurées de l'eau totale représenterait donc
 232

la quantité d'eau adsorbée,apportée par le flux d'air humidifé. Nous

voyons toutefois que cette quantité d'eau transférée reste limitée.

Nous avons tenté de réaliser des mesures de l'a, et de la quantité

d'eau solvante. Malheureusement les différentes techniques décrites
par BIZOT et col. (89), que nous avons cherché à adapter dans le
cas de notre produit au cours de la fermentation, ne nous ont pas
fourni de résultats exploitables. En effet ces techniques sont
basées sur des variations de poids peu élevées des échantillons,à
des états d'équilibres en atmosphères contrôlées qui sont trës longs
à.obtenir. Dans ces conditions nos échantillons continuent d'évoluer
ce qui rend les mesures inexploitables.

En fin de croissance, la quantité d'eau résiduelle calculée ne repré-

sente que 20 90 de l'eau totale mesurée. Puisqu'à cette période nous
avons mesuré un pourcentage d'eau total de 63 %, l'eau résiduelle ne
représente plus que 13 % du poids total. On sait que pour de telles
teneurs en eau dans ce type de produit la croissance des champignons
est stoppée (26, 89). On voit ainsi que malgré une augmentation de
la teneur en eau totale, la croissance du champignon peut être rapi-
dement limitée par un manque d'eau disponible.
 233

V. RESUMEDU MODÈLE CINETIQUE

1 (C6HlC,06)n + H20 ---!--

C6H1206
n

-dSH = Y. X (1 - Y' X) = 0,52. X (1 - 2,86. X)

HYDROLYSE
dt

S" =
SO. evt
; -
1
= 95.e - 0,226t + 1,24
l 1 + "'.So.p - 1)
SH

..
dSH_ L
-- dX + m x
dt Y 'dt
CROISSANCE i
!Lx !IX.(1 - p' X) = 0,3 x. (l- 3,3 X)
:' dt
x0. eut
; - + 3.3
i- x = 1 : e’yo. (?Ut _ 1) h : = B30-e-0’3 t

RESPIRATION . 6 CO2
0,35 C6H1206 + 6 O2 -A, + 6 H20 ; AH = 673 Kcal

ASSIMILATION f 0,65 C6H1206 + 034 (NH4+ OH-) + 30,4 H20 ~2

' (' H1,62 '0.62 NO,I4 ' 5s6 H2o)
1
-1
EQ. STOECHION. , C6H1206 + 2,l O2 + 0,54 (NH4+ OH ) + 17,6 H20

L
~3,9 (C H1,62 Oo,62 :$14 ; 596 H20) + 291 CO2
i

mS = 0,07 g S/g X/h

BILAN SUCRES M = 251 x e- 0*3t
Y, = 0,55 g x /gs
252
S, = 1,8 (X - Xo) + 0,07 In M
L

m. = 0,07 g 02/g X/h

2
OXYGENE Yo2= 1955 9 Xl9 o2

O2 = 0,64 (X - X0) + 0,07 In M

L

mco2 = 0,OWg

= 1,12 g x/g
C02/g

CO2
X/h

Yco2

CO2 dC
02
-j$- = 0,32 X - 0,88 X2

= 0;89 (X - Xo) + 0,055 In M

CO2

!
H20T = H20 o + 0,52 O2 - 0,l SH

H20, = 0,l SH + 3,3. X.- 0,04 In M

Hz0 H20, = H20T - H20,

 234

En nous basant sur 'les resultats experimentaux nous avons constate

qu'une simple équation exponentielle ne peut pas traduire de façon
satisfaisante la croissance d'un champignon filamenteux sur subs-
trat solide amylacé. En effet si on observe effectivement une crois-
sance de type exponentiel au début de la croissance, celle-ci se
trouve plus rapidement limitée que lorsqu'elle se produit en milieu
liquide. De même, les autres modèles cinétiques disponibles concer-
nant la croissance des champignons filamenteux en milieu liquide ne
pc~mettcnt pas de ïéririr? compte des dittérences que nous avons trou-
vées.Ilsne tiennent pas compte des caractéristiques essentielles de
la croissance en milieu solide que nous avons démontrées,à savoir
ia wuissance de surface sur le substrat amylacé, et la limitation
de la croissance par la quantité d'eau disponible.

Nous avons ainsi été conduit a élaborer un modèle de croissance

spécifique du d&]oppe~nt d'un chamoignon filamenteux sur subs-
trat solide. Pour cela nous nous sommes basés sur les caractéris-
tiques propres au milieu solide, qui conduisent à limiter
la vitesse d'hydrolyse,donc la croissance.

En considérant que l'hydrolyse de l'amidon est une réaction auto-

catalytique limitée par la quantité d’eau résiduelle, nous sommes
parvenus à la même formulation de la vitesse de l'hydrolyse, qu'en
nous basant sur la catalyse de contact entre le mycélium et le
substrat. L'équation cinétique ainsi etablie traduit très fidèlement
les résultats expérimentaux concernant la quantité de sucres
hydrolysés.

L'influence de l'eau libre sur ia cinétique de l'hydrolyse de

l'amiddn est en accord avec les résultats des auteurs ayant étudié
l'influence de l'activité de l'eau sur l'hydrolyse de l'amidon
dans les substrats solides à faible teneur en eau.
 235

A partir de la cinétique d'hydrolyse de l'amidon nous avons établi

Ja cinétique de la croissance du champignon filamenteux sur substrat
solide amylacé. Le modèle obtenu permet de traduire de façon très
satisfaisante les résultats,expérimentaux et les observations qui
ont été.réalisées,dans notre étude.

Schématiquement le modèle que nous avons établi traduit le fait

que qa croissance d'un champignon sur substrat solide estune crois-
sance de type exponentiel qui est elle-même limitée de façon expo-
nentielle.

.Les quantités d'eau et de biomasse initiale apparaissent comme

les facteurs essentiels de la limitation.

L'intérêt du modèle que nous proposons réside dans ce qu'il résulte

de considérations physiologiques caractéristiques du milieu
solide et dans l.e fait que les différents paramètres de l'équation
cinétique ont tous une signification bien précise et 'sont des cons-
tantes: qui peuvent être déterminées expérimentalement.

A partir de l'équation cinétique de la croissance, et.en nous ba-

sant sur l'équation stoéchiomètrique globale de la croissance,
nous avons pu déduire l'évolution cinét+que::des différents cons-
tituants chimiques de la réaction. Là aussi nous avons observé
une excellente corrélation entre les courbes théoriques calculées
et les valeurs expérimentales.

Nous avons montré, en particulier pour la consommation du substrat,

que la formulation de-l'équation cinétique nous permet de connaî-
tre à chaque instant de la réaction non seulement la quantité tota-
le des sucres consommés, mais également la répartition de leur uti-
lisation pour la croissance elle-même ou pour une activité métaboli-
que non liée à la croissance. C'est un point important dans la
mesure OU cette-répartition joue un rôle capital dans le rendement
global de la croissance et donc de la transformation des sucres
en protéines.
 236

Ce modele specifique de la croIs.sance en milieu solide permet éga-

lement de prévoir l'&olution des paramètres lorsqu'on change
les conditions exp&imentales commela teneuwen eau initiale ou
la quantité d'inoculum ou la température d'incubation. C'est.un
outil qui dojt donc se rWi?ler tr& utile pour l'optimisation et
le contre)le des fermentations en mJ1ku sol4de.
 CHAPITRE 8

APPLICATION DES RESULTATS

A LA PRODUCTION D’A.F.E.P.
 239

1. ORIGINALITE ET INTERÊT DES RESULTATS OBTENUS

1 - RAPPEL DES OBJECTZFS ET VES PROBLEMESPOSES

Au début de ce mémoire, nous avons clairement exposé les motivations

qui nous avaient conduit à entreprendre l'étude de la croissance des
champignons filamenteux sur substrats amylacés solides. Il s'agissait
d'étudier la possibilité d'utiliser les champignons pour mettre au
point d'une technique d'enrichissement en protéines de substrats glu-
cidiques en vue de la production d'Aliments Fermentés Enrichis en
Protéines (A.F.E.P.) destinés à l'alimentation animale.

Jusqu'ici, les résultats obtenus par les différents auteurs (8, 9)

étaient peu encourageants en raison des faibles rendements de transfor-
mation des sucres en protéines et des taux d'enrichissement des pro-
duits limités à quelques pour cent de protéines. De plus, mis à part
les travaux de HESSELTINE sur les-techniques de fermentations solides
traditionnelles, les connaissances acquises sur le développement des
champignons sur substrat amylacé solide restaient très limitées.

En raison du faible coût des protéines conventionnelles, il était

nécessaire d'élaborer un procédé de culture simple, rustique, ne
nécessitant pas de conditions stériles strictes, mais fournissant
des taux d'enrichissement et des rendements, sinon obligatoirement
maxima., du moins largement suffisants, pour permettre une exploitation
économique et une utilisation pour l'alimentation animale.

Les problèmes à résoudre et les difficultés rencontrées, peuvent

expliquer le nombre peu élevé de travaux dans ce domaine, et parti-
culièrement en France, où l'on constate l'absence d'équipes de recher-
che fondamentale dans ce domaine des fermentations solides, alors que
'dans les pays Asiatiques et particulièrement au Japon ces techniques
 240

de culture continuent d'être appliquées industriellement, et sont étu-

diées activement dans les centres de recherche microbiologiques.

Notre travail montre que ces recherches peuvent conduire à des résul-
tats intéressants aussi bien du point de vue des connaissances fonda-
mentales, que du point de vue des applications que l'on peut en tirer.

2 - ORZGTNALITE VE LA TECffN7QUE VE CULTURE

Le principe de cette technique réside dans le conditionnement et la

oréparation du substrat, la répartition homogène de l'inoculum de
spores et de sels nécessaires à leur développement, ainsi que dans le
dispositif d'incubation original et simole. Elle permet de réaliser,
même en conditions non stériles, la croissance spécifique du mycélium
du champignon filamenteux, qui se développe de façon homogene dans
toute la masse du substrat, et qui se maintient dans sa phase végé-
tative.

Nous avons montré que notre technique peut s'appliquer à un très

grand nombre d'esoèces de champignons filamenteux, et particulièrement
à ceux qui appartiennent au grand groupe des AbperrgSIw qui sont
parmi les plus répandus et qui jouent un rôle important aussi bien
dans le domaine alimentaire que dans le domaine industriel. D'autre
part la technique de culture permet de cultiver ces champignons sur
de nombreux substrats amylacés tels que le manioc, la pomme de terre,
la banane, ainsi que les résidus et sous-produits de ces productions
 241

agricoles. Actuellement nous étudions la possibilité de l'étendre à

la culture de champignons sur substrats cellulosiques.

3 - ETUVE DES MECANISMES VE CRO'ISSANCE

Grâce à cette méthode de culture, nous avons pu réaliser de très nom-

breuses observations et étudier en détail les mécanismes de croissan-
ce du mycélium sur un tel milieu solide.

Les cinétiques de croissance quoique globalement comparables à celles

obtenues en milieu liquide, font apparaître des différences essentiel-
les qui sont caractéristiques de la croissance sur substrat solide et
sont en relation étroite avec la limitation en eau disponible et le
mode de colonisation de surface, spécifiques de ce type de milieu so-
lide.

L'étude cinétique de la biosynthèse du matériel cellulaire et de la

respiration nous a permis de mesurer les différents paramètres de la
croissance en milieu solide, qui bien que légèrement inférieure
à la croissance en milieu liquide, présente des capacités tout à
fait intéressantes.

A partir des résultats expérimentaux et des observations que nous

avons faites, nous avons établi un modèle cinétique, spécifique de
la croissance des champignons filamenteux sur substrat solide, qui
permet de traduire les résultats obtenus de façon très satisfaisantes.

L'ensemble de ces résultats nous a permis d'acquérir des connaissan-

ces nouvelles et de progresser considérablement dans le contrôle et
l'optimisation des fermentations en milieu solide. Nous avons démon-
tré-en particulier l'importance de la quantité d'inoculum, de l'état
de division du substrat et de l'évolution de la teneur en eau au cours
de la fermentation.
 242

4 - ENRICHISSEA4ENTEN PROTEINES

Les résultats que nous avons obtenus montrent que l'on peut
obtenir,après 24 heures de culture un produit fermenté contenant
18 % de protéines sur la base du poids sec final. Ce résultat est in-
comparablement supérieur à ceux obtenus par les auteurs ayant tenté
d'appliquer directement les techniques traditionnelles de fermentation
de tempeh (5) et qui n'obtenaient guère que quelques 3 à 5 % d'enri-
chissement.

Dàns nûs cûndîtîûns de culture l-u-

I" 5 avons calculé un rendement de
transformation des sucres consommés en protéines vraies d'environ 20 %
pour différentes souches d'A6peRgU testées (Cf. tableau XIII). Ce
résultat est proche, sinon supérieur à celui obtenu généralement lors
de la culture du mycélium en milieu liquide (6). Il n'est pas non plus
éloigné des 25 % théoriques qui représente le rendement maximum de
transformation obtenu lors de la culture des levures (5).

Les études microscopiques ont montré la sélectivité du développement

nlycélîen dans le milieu solide. Les résultats des contrôles bactérîo-
logiques ont établi que malgré des conditions opératoires non stéri-
les, et le niveau initial élevé de la microflore totale dans la fa-
rine substrat, les produits fermentés obtenus présentent les garan-
ties nécessaires oour leur utilisation en alîmenta-
tion animale (Cf. Tableau XV).

Le calcul des masses volumiques réelles et apparentes (Cf. p. 113)

montre qu'un volume utile d'un litre contient environ 3013 g de
.
substrat, soit 30 fois plus que dans un milieu liqui-
de à 10 g/l. D'autre part, à partir des cinétiques de biosynthése
des protéines de la figure 24, on peut calculer les productivités des
deux types de culture. Dans le cas du milieu liquide, on mesure une
quantité de 0,15 g de protéines synthétiséeslg de substrat après 20
heures de culture.ce0.d correspond à une productivité globale de
0,075 g de protéines/h/ et par litre de volume utile. Dans le cas de
la croissance sur substrat solide, on obtient une biosynthèse de
 243

0,14 g de protéînes/g de substrat après 24 heures de culture, ce qui

représente une productivité globale de 1,75 g de protéines/h/litre
de volume utile, soit une productivité 20 fois supérieure à celle de
la culture liquide.

Si nous avions utilisé un milieu de culture à 50 g de substrat par

l.itre, ce qui représente une concentration limite étant donnée la vîs-
cosîtë obtenue dans de telles conditions, et en supposant que la croîs-
sance du mycélîum ne soit pas limitée par les transferts d'02, nous
aurions obtenu une productivité limite de 0,375 g de protéine/l/h.
Une telle.valeur est comparable à celle obtenue par READE et GREGORY
(6) . Avec une souche d'A. ~um@cctus à 45" C sur un milieu
contenant 40 à 50 g de substrat ces aUtarS sont parvenus à une pro-
ductivité de 0,45 g de protéiw'llh, mais sur la base de N x 6,25 et
non pas des protéines vraies mesurées par la méthode de FOLIN.

Mais même dans ces conditions limites de la culture de mycélium en

milieu liquide, la productivité en protéines de la technique en milieu
solide resterait encore 4 à 5 fois plus élevée. Si on considère par
ailleurs que cette productivité élevée est obtenue avec une technique
très simplBenëcessitant pas d'appareillages compliqués, ni de dépenses
élevées pour l'agitation, l'aération et les régulations, on peut
alors juger de l'intérêt que peut présenter ce nouveau mode de pro-
duction de protéines alimentaires.

C'est la raison pour laquelle nous avons déposé un brevet concernant

cette'mëthode d'enrichissement en protéines (114, 115), et que des
recherches ont été entreprises conjointement par 1'O.R.S.T.O.M. et
par 1'I.R.CH.A. en vue de l'extrapolation des résultats du laboratoi-
re et de la réalisation d'unités pilotes d'enrichissement en protéines.
 244

IL EXTRAPOLATION DE§ RESULTATS DE LABORATOIRE

7 - LES PROBLEMESPOSES

Malgré tout l'intérêt que pouvaient présenter les résultats de labo-

ratoire sur le p+an théorique, un certain nombre de problèmes dîffi-
cîles devaient être résolus pour juger des possibilités d'application.
L'extrapolation des résultats $ un niveau pilote proche d'une
exploitation réelle n'était pas le moindre des problèmes, car un dis-
positif entièrement nouveau devait être mis au point, vu qu'aucun
type d'appareillage de fermentation existant permettait de réaliser
cette technique de croissance sur substrat solide. Il fallait donc
tout d'abord déterminer le type de réacteurs adaptés à ce procédé de
culture et mettre au point les régulations indispensables.

Qmme nous .avons vu lors de notre étude fondamentale, les

principaux paramëtres de la fermentation solide concernent :

- le conditionnement du substrat sous une forme divisle

et poreuse,
- le maintien de la température et du pH à une valeur
proche de l'optimum
- le contrble de la teneur en eau du produit.

Le conditionnement du substrat SOUS une forme divisée et poreuse per-

met d'assur- un transfert d'oxygène rapide grâce à la grande surface
d'échange avec le flux d'air humidifié. L'importance de la surface
totale offerte par le produit est également capitale puisque nous
avons vu que la croissance se réalise essentiellement à la surface
des grains du produit, et que la catalyse de contact peut conduire
à une limitation de la croissance.

Le maintien de la température à une valeur proche de la tempéra-

ture optimale de croissance doit être réalisé pour permettre
d'obtenir une croissance rapide et un rendement optimum. Nous avons
,vu à cet égard l'importance de la quantité de calories dégagées par
le métabolisme respiratoire *qu'il faut éliminer rapidement sous peine
 245

de voir la température du produit s'élever très vite dès le

démarrage de la croissance du mycélium pour atteindre le seuil de la
température maximale de croi.ssance et provoquer l'arrêt de la fer-
mentation. Le calcul que nous avions fait avait indiqué l'impor-
tance de ce flux de calories â éliminer.

Le pH est également un facteur important à considérer puisque nous

avons vu que nous pouvions doubler la croissance en agissant sur la
vitesse d'acidification. D'autre part ce paramètre est en relation
avec les risques de contaminations.

Enfin le contrôle de la teneur en eau du produit est essentiel

et dnit être aMimis+.

2 - EXTRAPOLATION VU SYSTEME STATIQUE EN COLONNES

REACTTONNELLES

Le réacteur de type colonne réactionnelle qui a été utilisé dans

les études de laboratoire est tout â fait attrayant en raison de sa
simplicité fondamentale, et de l'efficacité dans l'utilisation du
flux d'air nécessaire au maintien des conditions aérobies. Nous avons
alors cherché à déterminer les limites de ce type d'incubateur en
étudiant l'influence du diamètre de la colonne et de la température
de refroidissement sur l'élévation de la température du produit et
sur l'enrichissement en protéines obtenus.

Des colonnes de diamètresdifférents mais de même longueur ont été

testées. dans lesmêmes conditions que les incubateurs utilisés pour
les analyses de laboratoire. Pour juger de l'influence du diamètre
de 1.a colonne et de la,température de refroidissement, nous avons
introduit au début de l'incubation, une sonde thermique dans l'axe
de la colonne de produit. L'enregistrement automatique de la tempéra-
ture au centre du produit et la détermination de la teneur en pro-
téines vraies des échantillons en fin d'incubation ont été réalisés
,pour estimer l'efficacité de la croissance du champignon.
 246

4!

4c

ôsa
OI
0
cE
B
s

i
-3c

25

temps (h)

minaLion ~2 .f.a .tempéhaZwre au centrée. du pwdu.Lt au CO~CA

de. ta cnoh~~~~ d’A. hennebtigti - (1) : B.M. i2 35” C,
(21 : B.M. à 30° C ; (3) : B.M. ii 25’ C ; (4) : A.& à
20’ C - Vhme. des coiTonnes : 4 cm. Les &?ch~ i~uzdi-
quent .!.a &in de la phase de gczhmkm%n.
30
B. M.= 35’C

B. M.= 30°C

0 10 20 30
durée d’incubation heuree
( 1
Figtitre 50 - In@xnce dc L?a tmpénatune de ~e&oiti~em~nt e.t du
cLiamWe de la colonne 6wr &a tempékafwx du phoduk
(1=02cm;2= 04cm;3 =06 cm;4 =0 bcm;
5=07Ocm) ,
La figure 49 nous Jtidlquë, peur une eefenne d’un d’fem&hre do 4 em,
l'influence de la LempWrture de regulat‘ian du badn-marie sur 'la du-
r& de la phase de germination et sur flevolution de la température
du produit au cours de la croissance d’A. hemebeq&L sur farine de
manioc. On constate que la durée de la phase de germination augmente
de façon très importante lorsque la température d'incubation diminue.
Cela confirme les résultats que nous avons obtenus précédemment et en.
particulier lors de l'étude des caractéristiques physiologique de
la souche que hous avons utilisée Nous remarquons d'autre
part que lorsque la température de refroidissement diminue, la vites-
se d'élévation de la température diminue, ce qui est bien en accord
avec l'estimation du coefficient de transfert des calories que nous
avons faites au chapitre 6.

Sur la figure 50, nous avons représenté les graphiques d'enregistre-

ment de la température au centre du produit pour des colonnes de 2,
4, 6, 8 et 10 cm de diamètre. Nous avons réalisé des expériences en
régulant la température du bain-marie à 35, 30 et 25" C. Comme nous
l'aviohs déjà remarqué,la diminution de la température d'incubation
augmente la durée de la phase de germination donc la durée totale
de la fermentation. Aussi avons-nous réalisé une nouvelle expérience,
représentée sur le quatrième graphique, dans laquelle la température
du B.M. a été régulée à 35" C pendant.les dix premières heures d'in-
cubation, puis le réchauffage a été arrêtée ce qui a entraîné une
diminution progressive de sa température jusqu'à 25' C. Dans ces con-
ditions, on constate que pour les colonnes de 2 et 4 cm, la tempéra-
ture du produit suit l'évolution de la température du B.M. indiquant
que les échanges thermiques se déroulent de façon satisfaisante. Pour
les colonnes de 8 et 10 cm, la chute de température du B.M..n'est pas
suffisante pour permettre l'évacuation des calories dégagées.
 249

J !, 1
" Temp&rature du bain-marie
1 Na diametre ! I
! ! 35" c ! 30” c ! 250 c ! 35 4 25oc !
! ! ! ! ! !
2cm !, 2i;8 ! ! ! !
20,2 17,5 19,9
! 1 ! !
! (2) 4 cm 1637 ! 17,l 1637 19,Ol
!
!
! (3) 6 cm 15,0 ! 19,0 18,2 ! ‘?.l,% !

18,4 18,8 ! 17,6 !

f (4) 8 cm 12,3 !
I 1 !
! (6) 10 cm 1135 ! 14,l 1530 14,7
! !
! I I I ! !
! ! ! ! ! !

Tableau xx - In@z.nce du d,lamè;ttre de !.a coitonne. e,t de La tetnpWe

de /re$~oiti~emti NJL la .tenu en bottines du matioc
eticki ~CVLC-Q d’A. hennebe@.i ap.tès 30 heuna
d’hcabtion. (LU hi?A~ dont QX~JUXLS en % de ptro-
tébzes (FOLiN ~WL ta bue du poi& nec &inat

A la lumière de ces résultats, on constate qu'il est possible d'effec-

tuer un contrôle de la température du produit sur ce type d'incuba-
teur, mais on rencontre cependant rapidement des limites concernant
la possibilité d'évacuer les calories produites car la surface d'échan-
ge avec le liquide de refroidissement augmente linéairement avec le
rayon de la colonne, alors que le volume du réacteur, donc la quantité
de produit contenu et la quantité de calories dégagées, augmente avec
le carré du rayon de la colonne. D'autre part, la différence entre la
température au centre du produit et à.la périphérie provoque un gra-
dient relativement important qui peut entraîner une hétérogénéité du
produit, et un décollement du produit au contact du réacteur. Cela
peut provoquer alors un passage préférentiel de l'air et donc une mau-
vaise aération du produit.

Cependant les résultats concernant les teneurs en protéines que nous

avons obtenues et qui sont rapportées dans le tableau XX sont encore
 2.50

satisfaisantes et ce type de réacteur pour la culture statique en

milieu solide mériterait des études de bio-enginiérie plus poussées.

En raison des limites de ce dispositif et pour réa1 iser des

contrôles et des régulations des paramètres essentiels de la fermen-
tation solide, différents réacteurs mélangeurs ont été testés.

3 - MISE AU POTNT VE REACTEURS AGITES

3.7. CyI!..Gldne kowLnuti

Le dispositif de culture en colonne réactionnelle s'étant révëlé

difficile à extrapoler directement, du fait de la grande quantité de
calories à évacuer, nous avons alors conçu et réalisé un nouveau dis-
positif d'incubation basé sur le principe du tambour tournant séquen-
tiellement, avec une aération constante par passage d'un flux d'air
humide a travers la masse du produit. La température a été régulée
par le déclenchement de la rotation du cylindre et la pulvérisation
d'un brouillard d'eau dans l'atmosphère du tambour lorsque la tem-
pérature du produit atteignait la température de consigne. Nous avons
utilisé dans ce cas les conditions opératoires suivantes :

- humidité initiale : 50 %, N sous forme d'urée : 30 40

- pH initial : 4,5 - aération : 1 m3/heure

- température de régulation : 40" C

- canacité : 1 kq de matière sèche

 251

Le dispositif,d'une capacitéde 2 kg de produit,que nous avons réali-

sé est pré-sente sur la figure 5.1. Il nous a permis de ré-
guler la température à la valeur déterminée et de maintenir une te-
neur en eau du produit convenable. La rotation et la pulvérisation
d'eau déclenchées séquentiellement par l'intermédiaire d'une sonde
thermique se sont révèlées très efficaces pour l'élimination des calo-
ries. Le passage permanent d'un flux d'air humide dans la masse du
produit s'est révèle nécessaire à l'aération et à la bonne croissance
du champignon. Enfin comme nous l'avons montré,la teneur en eau du
produit doit augmenter sensiblement au cours de la fermentation pour
ne pas devenir un facteur limitant. Ce dispositif a l'avantage de
permettre l'apport d'eau nécessaire à cet ajustement.

Les résultats concernant la teneur en protéines et en sucres rési-

 252

duels (tableau XXI) indiquent un bon rendement de transformation,

une teneur élevée du produit enrichi en protéinegtun taux de transfor-
mation de l'amidon important.

Sur la base de ce dispositif et de son principe de régulation,

1'I.R.CH.A. a pu mettre au point un appareillage.pilote de grande
capacité.

3.2. hW.ang ewt- PékiUkt

Le travail de développement technologique de la fermentation en mi-

lieu solide a été réalisé â 1’I.R.CH.A. en collaboration avec (4x0)
DESCHAMPS, MEYER et PREBOIS, avec comme objectif prioritaire, l'utili-
sation d'un matériel simple et peu coûteux disposant toutefois des
régulations indispensables permettant d'obtenir une croissance contrô-
lée et un produit de qualité constante.

En raison des contraintes observées dans les cultures en colonne et

des résultats obtenus précédemment, la recherche s'est orientée vers
des appareillages du type mélangeurs ou malaxeurs permettant d'une
pwt de réaliser l'homogénéisation du produit pour favoriser l'élimi-
nation des calories, d'autre part d'envisager une intervention sur
les paramètres de croissance au cours de la culture.

Divers types de matériels ont été étudiés (tambour tournant, mala-

xeur horizontal â bras hélicoïdal, etc...). Chacun des appareils,
modifié afin de permettre le passage d'un flux d'air à travers le
produit, présente des avantages et des inconvénients. Ils ont été
écartés au cours du développement technologique sans pour autant que
leur utilisation possible soit définitivement éliminée.

L'appareil correspondant le mieux aux études entreprises et qui a été

retenu pour développer la technique est un mélangeur de type pétrin
de boulangerie constitué d'une cuve circulaire tournant librement
autour d'un axe vertical et disposant d'un bras â trois doigts for-
mant un angle de 30" avec l'axe de la cuve. Ce matériel (figure 52j
a été modifié par la mise en place d'un double fond permettant l'in-
 253

traduction d'air par l'intermédiaire de trous percés dans le fond

de la cuve et par l'adjonction d'un second moteur permettant de con-
trôler la vitesse de rotation de la cuve.

Fhguhe 52 - RéacXewr méRangewt de ;type p&x7&. min au poiv& pa4

L'1.R.CH.A. powr Ra cu&wre. de. champignora bwt milieu
bolide. Capacité b - 10 kg de mdtitie sèche
(Photo :Debhayeb - T.R.CH.A.1

Une sonde thermique plongée dans le produit permet de maintenir sa

température â la valeur désirée grâce au système de refroidissement
qui comnorte le retournement et le mélange du produit et une
vaporisation simultanée d'un brouillard d'eau à la surface du pro-
duit. Une sonde de pH permet de contrôler la valeur du pH et de l'a-
juster â la valeur désirée par l'intermédiaire du pompage d'une so-
lution d'urée dans le liquide vaporisé. L'appareil étant posé sur un
dispositif de pesée permenante, il est possible de connaître le poids
total du produit et de programmer une prise de poids permettant
ainsi de contrôler la teneur en eau du produit.
 254

! ! ! !
Composition du pro- Colonne sta-! Cylindre Pétrin
! ! ! !
duit final tique (capa-! tournant capacité 8 -
!
: cité 1 kg PSf (capacité ! 10 kg PS) !
! !
! 1 - 2 kg PS)!
! ! ! ! !
! ! ! !
.Protéines vraies
! 16,2 ! 19,3 ! 18,l
! % P.S.
! ! ! !
! ! I f
! Sucres réducteurs ! ! !
36,3 15,O 25,s
L résiduels !
! ! !

TabLeau XXI - CompUon de la compostion du &uulned de matioc

ervLch,iti pan c.uLtme d’ A. henne6errg.ü en tcikku Aolidk?,
à pua2.h de did6énen& type6 de néacteu& (~?AuLta&
exphmés en % du p0.i.d~ Aec ~hxL).

Les résultats obtenus (cf. Tableau XXI) ont permis de confirmer lar-
gement les données que nous avions obtenu au laboratoire, sur
plusieurs types de substrats amyl.acës et avec différentes souches de
champignons filamenteux. La réalisation de ce nouveau matériel de fer-
mentation spécifique de la culture sur substrats solides a conduit
1'I.R.CH.A. à déposer un brevet français (116) et à entreprendre en
collaboration avec 1'O.R.S.T.O.M. la mise au point d'une unité pilote
d'enrichissement en protéines destinée d'une part à tester les maté-
reils et calculer les coûts de fonctionnement et d'autre part à four-
nir les quantités de produit nécessaires pour effectuer les analyses
nutritionnelles sur animaux d'élevage.
 255

III. MISE AU POINT D’UNE UNITE PILOTE DE FERMENTATION EN MILIEU

SOLIDE

7 - PRINCIPE VU VlSP0S'177F DE FERMENTA7TON

Sur la base de cette technologie et conservant toujours le principe

même de la méthode de culture que nous avions mise au point au niveau
du laboratoire, un fermenteur de 1.200 litres et d'une capacité de
200 kg de matière sèche a été construit (figure 53). Les différentes
étapes de cuisson, d'inoculation et de fermentation sont réalisées
dans le même appareil.

Figue 53 - Fenmetieuh paote de 1.200 .i?iZ~~en pow~ L’ enhhhhement

en pJ~&ties de AuhLm-tA AoUden.
(Photo : Pe.~haye~ 1.R.Ctl.A.)
 256

Le schéma de principe de cet appareillage est représenté sur la fi-

gure 54,

Le produit amylacé contenant 30 à 35 % d'eau est cuit par de la vapeur

qui est envoyée à travers les perforations du double fond, pendant 7
à 10 minutes sous agitation permanente et qui maintient le produit
à 70 - 80’ C.

Lorsque la cuisson est terminée et que le substrat est refroidi, on

ajoute la solution aqueuse des sels contenant l'inoculum de spores
et on homogénéise grâce au système d'agitation de l'ap-
pareil. On installe alors les sondes de pH et de température et l'on
branche les systèmes de régulation.

ENREGISTREUR
-43
I

1 1
I REGULATION
DE
32 II TEYW!IATURE
I

2?M” I

r-4 REGULATION
WHUMIDITE
I

F@u,te 54 - Schéma de puktipe de .L”umLté p&bte de cuetuhe en IELL&U

home (Adon PREBOiS - 7.R.Cff.A.)

22 - Cuve du fermenteur
23 - Double-fond perforé
24 - sonde de température
 257

25 - sonde de pH
28 - barboteur
29 '- bras d'agitation
30 Y moteur - réducteur du bras d'agitation
31 - verin ,de la sonde de pH
32 - spray de refroidissement
35 - air d'alimentation du spray
36 - moteur d'entraînement de la cuve
38 - rég‘ulation de pH proportionnel7e
39 - électrovanne de débouchage
40 - pompe à débit variable pour l'urée
4i - réserve d'urée
42 - régulation de température
43 - enregistreur
50 - ëlectrovannes du vérin

2 - MT.% AU POINT DES REGULATTONS ET VES COMROLES

Pendant la phase de démarrage correspondant à la germination, le

milieu est régulièrement homogénéisé grâce au déclenchement automati-
que du système d'agitation 1 à 2 fois toutes les heures, ceci pour
éviter le sëchage en surface. Après le début de la croissance, et
lorsque la température atteint le point de consigne, le système de
refroidissement est commande par la sonde thermique.

Ce dispositif comoorte la mise en route du moteur d'agita-

tion, du moteur qui contrôle la vitesse de rotation de la cuve et
de la pompe qui alimente en eau le dispositif de vaporisation. Cette
action dure aussi longtemps que le substrat n'est pas revenu à la
températurè de consigne soit en moyenne de 30 sec. a 1 min. La durée
de ces cycles de refroidissement est à peu près constante au cours de
la fermentation mais la fréquence est évidemment fonction du stade
de développement du mycélium. L'enregistrement de la fréquence des
 258

cycles est une bonne représentation de la croissance du microorganis-

me et permet en outre de mettre en évidence le début de la phase de
ralentissement. Il est important de noter qu'au cours de la fermenta-
tion qui dure environ 20 heures, le temps total de fonctionnement des
moteurs d'agitation ne dépasse pas 3 heures ce qui représente une
I,,, I
- tempbrature -- .
-- du produit --
I
- ,J.
--
--
~+---- croissance
--
_-
.-- dbclin

- - - -
-

_-
[ 0 2
_-
-
-

I
.

_ __..température
__ _. _--de -.-
consigne
.- - - -- -//pYl/flY
.
.

1 -croissance
i o/
-4
-*
phase de latente
I-.
\Cycle de refroidissement I
i
Figuhe 55 - Schéma de R’ enteghtiment de .!.a toq&uA~~e du ~L&U&,
du nombne de cycle eA: de la dw&e de &vct-Lonnw~ent du
6y.&ètnc de /~e&~hii~~ement e.X d’agLt&bn.

importante écornanie d'énergie.

- RéguLaCon de L'aWon

Pour des raisons aussi bien économiques que pratiques, il n'est pas
souhaitable de conserver, tout au long de la fermentation, un flux
d'air maximum. En effet, dans les premières heures où la quantité de
biomasse est faible, le besoin en oxygène l'est également. Parallële-
ment une aération trop importante à c.e stade, provoque une évapora-
tion intense et refroidit le produit de ce qui limite la croissance
du microorganisme.

C'est pourquoi l'air humidifié dans un barboteur est introduit par

l'intermédiaire d'une vanne motorisée dont l'ouverture est directe-
ment liée aux cycles de refroidissement. Au cours de chacun des cycles
le moteur de la vanne est actionné pendant un cours instant calculé
 de telle façon que l'ouverture totale soit obtenue durant les 3 heures
con.sacrées aurefroidissement. Dans ces conditions, la quantité
, ci.oxygène apportée est proportionnelle à la quantité de biomasse pré-
sente dans le fer-menteur.

Un tel asservissement est indispensable. En effet si pour une raison

quelconque le développement du microorganisme était retardé l'augmen-
tation non controlée du débit d'air provoquerait une accélération de
l'évaporation d'eau, donc un refroidissement du produit, ce qui au-
rait pour effet de retarder encore plus la croissance.

Cette régulation est réalisée très simplement grâce à une vanne d'air
à ouvertuelinéaire, commandée par une minuterie à double effet.

- hé~~On du ptl

La régulation de pH qui a été mise au point,permet d'éliminer l'ap-

port de sulfate d'ammonium. Il a été possible de trouver sur le mar-
ché une sonde de pH fournissant une valeur exploitable dans le milieu
solide. Cependant il s'agit d'une sonde en verre et par conséquent
fragile, qu'il n'est pas possible de maintenir dans le milieu au
cours des cycles de refroidissement. En conséquence le systëme de ré-
gulation a été conçu de la façon suivante : lorsque l'appareillage
est à l'arrêt, la sonde, portée par un vérin pneumatique, est plongée
s dans le.milieu. Lorsque commence un cycle de refroidissement, le
système de régulation prend en mémoire la valeur du pH du produit et
la sonde est sortie du milieu. Si la valeur du pH lue est différente
de la valeur de consigne, la différence est prise en compte pour
.* agir sur la vitesse d'une pompe à débit variable qui introduit,
dans le circuit d'eau de refroidissement, une solution de correction.
1 Dans ce cas le liquide correcteur est apporté avec le même débit
tout au long du cycle. Lorsque celui-ci est terminé la pompe est
. ,. stoppée et la sonde est à nouveau plongée dans le milieu.

Dans tous les cas étudiés jusqu'à présent, la croissance du champi-

gnon a provoqué une acidification du milieu et la correction du pH
a été obtenue par l'apport d'une solution d'urée. Ceci permet d'une
part de limiter la quantité d'urée ajoutée au départ et d'éviter
ainsi une forte alcalinisation au cours de la phase de germination,
d'autre part d'apporter au cours de la croissance la source d'azote
directement, utilisable par le microorganisme. Ainsi en controlant
la vitesse de la pompe doseuse et la concentration de la soluti0n
d'urée utilisée, il est possible d'obtenir une régulation à + 0,2
unité pH.

- RégufkZon de 1’ hmidi;cé

Comme nous l'avons constaté à plusieurs reprises au cours de notre

étude, l'humidité totale du produit doit augmenter au cours de la
fermentation pour passer de 50 - 60 % au départ à 65 - 70 X à la
fin de la croissance. Ceci est dii au fait que le mycélium lui-Mme
contient 80 % d'eau de constitution. Ainsi lorsque la biomasse
est importante l'humidité totale du produit doit tendre vers cette
valeur. Nous avons d'ailleurs montré que l'eau libre du milieu était
le premier facteur limitant dans ce type de fermentation.

Comme il n'a pas été possible de trouver une sonde permettant de

mesurer directement l'humidité dans ce type de produit, la régulation
a été basée sur le poids total de la préparation. En effet bien
qu'une partie du substrat soit éliminée sous forme de CO2 au cours
de la croissance, le poids total de la préparation doit augmenter
du fait de l'accroissement de l'humidité. Afin d'étudier et d'opti-
miser cette augmentation de la teneur en eau, l'unité pilote a été
posée sur des jauges de contrainte permettant de connaître en per-
manence lepoids total de la préparation. Le système de régulation
mis au point permet d'afficher une pente définie d'augmentation du
poids. Avant chaque cycle de refroidissement, une comparaison est
effectuée entre le poids réel et le poids souhaité à ce stade d'avan-
cement de la fermentation. L'écart entre ces deux valeurs est pris en
compte pour ouvrir ou fermer la vanne apportant l'eau de refroidisse?
ment.

Cette régulation relativement complexe n'a de réelle utilité que

pour déterminer, au stade expérimental, la courbe idéale de prise
 261

d'humidité pour une préparation et une souche déterminée.L 'expérien-

ce a montré que l'on pouvait ensuite, simnlifier notahlement l'ins-
tallation en.fixant. un annort d'eau convenable permettant d'obtenir
une croissance optimale

3' - VESCRiPTiUN DU FONCTIONNEMENTVE L'UNITE PILOTE

VE FERMENTATION SULZVE

Les résultats et les enseignements acquis au niveau du laboratoire

nous ont permis de mettre au point et d'optimiser rapidement ce procé-
dé d'enrichissement en protéines par la croissance d'un champi-
gnon filamenteux sur substrat solide. 11 est base sur une répartition
homogène de spores du champignon et des sels minéraux dans toute la
masse du substrat mis sous une forme convenable. La préparation d'un
matériel.poreux et divisé,avec un pH et une humidité adéquate est
essentielle pour assurer une aération convenable et une croissance
rapide du mycélium.

Le substrat amylacé grossierement broyé est mis dans le fermenteur

et ajusté à 30 - 35 % d'humidité.'11 est maintenu à 70 - 75' C pen-
dant 10 minutes par passage de vapeur d'eau de façon à gélatiniser
les grains d'amidon. Après refroidissement à 40" C la préparation
est mélangée avec de l'eau contenant l'inoculum (spores), la source
d'azote (urée) et du phosphate de potassium, de façon à obtenir une
humidité de 55 %. Par agitation mécanique le substrat inoculé se
met sous forme de petits agglomérats de 2 à 3 mm de diamètre qui res-
tent bien séparés.

Le principe du procédé d'enrichissement par fermentation en milieu

solide, tel qu'actuellement pratiqué, est représenté sur la figure
56. '

La fermentation proprement dite s'effectue ensuite en deux phases :

,une phase'de latente correspondant à la germination des spores et
une phase.de croissance correspondant au dévelonoement du mycelium.
 262

Pendant la période de latente (8 - 10 h) le produit est faiblement

aéré et agité quelques minutes séquentiellement (toutes les 2 heures)
de façon à maintenir une homogénéité de température et d'humidité.

La phase de croissance (15 - 20 h) se caractérise par un important

dégagement de calories. Le maintien du produit à une température
constante est obtenu par des cycles de refroidissement dont la durée
et la fréquence sont proportionnelles aux calories dégagées.

Ces cycles de refroidissement (en moyenne 1 - 2 minutes toutes les

10 - 15hrinutes) comprennent :

- une mise en rotation de la cuve du fermenteur,

- un retournement du produit,
- une aspersion d'eau en surface.

Pendant çes cycles on peut également effectuer :

- une régulation du pH par vaporisation d'urée en surface

si nécessaire,
- une augmentation de l'aération du milieu pour couvrir
la demande croissante en oxygène du microorganisme.

La croissance étant terminée, le produit est recueilli dans

son intégralité et séché.

Cette méthode a été utilisée pour enrichir différents substrats amy-

lacés tels que le manioc, la pomme de ten-e,la pulpe de féculerie de
pomme de terre, les bananes et les refus de bananes. Les résultats
obtenus ont largement confirmé ceux obtenus au laboratoire et mon-
trent qu'après 30 heures d'incubation, on obtient un produit conte-
nant en.moyenne 20 % de protéines vraies, mesurées par la méthode de
LOWRY, et 25 - 30 40 de sucres résiduels, le taux de conversion des
sucres en protéines est de 20 - 25 %.

Les expérimentations ont été faites avec la souche d’A.hwwebwgti

que nous avions sélectionnée pour sa haute activité amylolytique et
 263

0,61 d’eau
sels minbraux
spores

I température
1 FERMENTATION

““““‘7
Y AUCUN EFFLUENT I
I A TRAITER i
L ------me- J

Figwrc 56 - Sch&na de ptintipe. du phocédé U.R.S.T.O.M. - 1.R.CH.A.

d' cm~.Ati~emeti en p~otéinivles par de&ncWon en WW

JkYLtie
 264

pour sa composition en acides aminés essentiels. Toutefois, nous no-

terons que d'autres souches de champignons, et particulièrement des
souches utilisées traditionnellement en Asie pour la consomation hu-
maine, ont été testées avec succès par cette technique.

La figure 57 représente l'évolution des protéines, des sucres et du

pH lors de l'enrichissement de sous-produits de pomme de terre. La
durëede régulation (courbe Q), est d'un intérêt tout particulier car
elle indique que après 30 heures d'incubation le système de refroidis-
sement et de régulation n'a fonctionné réellement que pendant 4 heu-
res, c'est-à-dire seulement 1/7 du temps. Ceci montre l'efficacité
de ce dispositif de refroidissement. De plus cela correspond à une
très faible consommation d'énergie, un point d'une importance capita-
le pour le coût de fabrication du produit et la faisabilité du procé-
dé en milieu rural.

Les avantages de cette technique de fermentation solide, sur la fer-

mentation liquide portent sur plusieurs points :

- elle utilise des milieux beaucoup plus concentrés (300 à 400 g/l
au lieu de 50 à 60 g/l), et permet ainsi d'atteindre des productivi-
tés des matériels élevées en protéines par unité de volume utile,

- elle met en oeuvre des matériels beaucoup moins sophistiqués, ce

qui permet de réaliser d'importantes économies d'investissements,

- elle consomme beaucoup moins d'énergie dans la mesure où elle per-

met d'éviter, d'agiter et de réguler en permanence d'importantes
quantités d'eau (21 kg/kg de manioc en liquide ; 2 kg/kg de manioc
en phase solide). La quantité d'eau à éliminer par séchage est plus
faible (1,5 l/kg en milieu solide contre 25 l/kg de produit préala-
blement centrifugé en liquide),

- elle peut aussi bien s'adapter à des substrats agricoles dispersés

ou en quantité limitée dans le cas d'une coopérative ou d'un élevage
qu'à une exploitation de type industriel.
 265

+- +P E
0 -aa
O- 0 s. c.
a- + H20%
A-A PH

5 -7a
-----------

-60

F.iguhe 57 - i%o.&tion CuzWyue den d.L~~c5,tti parrame;Dred au coum

de ta cu.Ltw~e d’A. hennebengti AWL ~AOUIA amylacé bolide
dam .ETunLté pA!o.te de ~e/crnedzCo~z (dubn&ca.t : tr@%idu de
pomle de ketrhe)
 266

Une étude de prédéveloppement est en cours avec un industriel pour

la valorsiation de sous-produits de l'industrie féculière. L'unité
de 1.200 litres pouvant traiter 200 kg de matière sèche est actuelle-
ment opérationnelle. Elle permettra d'effectuer les tests nutri-
tionnels sur porcs et poulets, les essais de faisabilité,et de cal-.
culer les coûts de productions.

I-l est également envisagé de réaliser, sur la base de cet appareil-

lage, des unités expérimentales en zone tropicale (Afrique et Asie ,
du Sud-Est) de façon à adapter le procédé aux conditions climatiques
et agro-économiques, dans l'optique de la réalisation d'une exploi-
tation intégrée.

IV. CONCLUSIONS

L'exoloitation des résultats acquis au cours de notre étude de labo-

ratoire a permis la mise au point d'un nouveau procédé de fermenta-
tion en milieu solide pour la production d'A.F.E.P. destinés à l'a-
limentation animale.

Des essais réalisés sur divers substrats amylacés et sur diverses

souches de champignons filamenteux amylolytiques ont permis de véri-
fier la fiabilité de cette technique,. Une unité pilote de 1.200 1
capable d'utiliser 200 kg de produit sec est implantée chez un in-
dustriel pour l'enrichissement en protéines de pulpes de féculeries.
Elle correspond à une unité de fermentation en milieu liquide de
4 m3 utiles. Une telle technologie n'utilise pas de conditions asep-
%“' tiques mais les études de contamination ont montré que la quantité
de bactéries dans le produit fini était bien plus faibles que dans le
 267

produit initial.

Cet appareillage simple et fiable, facilement adaptable à différents

types de substrats et à différentes souches, permet d'envisager la
valorisation de sous-produits agricoles.Le'type de mélangeur
utilisé présente des limites mais compte-tenu des connaissances
que nous avons acquises au cours de cette étude dans la conduite des
fermentations en milieu solide, il est possible de concevoir, dès à
présent, d'autres types d'appareils mieux adaptés, capables de trai-
ter plusieurs tonnes de produits par jour. Par ailleurs des travaux
sont en cours pour réaliser cette fermentation en continu.

En dehors de la production d'A.F.E.P., les résultats que nous avons

acquis permettent d'envisager d'autres types d'application de la cul-
ture des champignons sur substrats solides. Nous avons en particulier
commencé des études concernant la possibilité d'utiliser cette techni-
que de f,ermentation solide pour la production d'amylases et de cellu-
lases fongiques.
 268

CONCLUSIONS GL?Nl?RALES

Les champignons filamenteux, qui se développent essentiellement sur

des substrats solides sont d'une très grande importance à bien des
titres : écologique, économique, alimentaire et industriel.

Les progrès scientifiques réalisés dans le domaine des fermentations

en milieu.liquide ont conduit à l'abandon de nombreuses techniques
de culture en milieu solide, et de ce fait on constate un retard
considérable dans ce domaine, du moins dans nos pays Occidentaux.

On peut pourtant se demander si dans certains cas la croissance sur

substrat solide ne permettrait pas de trouver des solutions plussim-
ples et plus économiques, particulièrement pour la production de pro-
I
téines alimentaires.

C'est ainsi que nous nous étions fixé pour objectif d'étudier les
mécanismes de croissance des champignons filamenteux se développant
sur des substrats solides, de façon à mieux connaître les possibilités
d'exploitation de l'énorme potentiel biochimique que représentent ces
microorganismes.

Pour cela nous avons tout d'abord mis au point une technique de
culture originale permettant l'étude du développement sélectif du
mycélium sur un milieu solide amylacé.

Cette méthode est basée sur le conditionnement du substrat solide

sous forme granulaire poreuse, uniformément inoculé par les spores
du champignon filamenteux. Grâce à un dispositif d'incubation très
simple, et à des conditions sélectives, nous avons pu contrôler le
developpement du mycélium dans sa phase végétative et ainsi étudier
la physiologie, la biochimie et les mécanismes de son développement
en milieu solide.
 269

Une étude préliminaire nous a permis de sélectionner, parmi les

nombreuses souches que nous avions isolées sur milieux à l'amidon de
manioc, une souche d' A. h~nncbekgii qui présente des caractéris-
tiques intéressantes dans l'optique de Ta mise au point d'un procédé
d'enrichissement de substrats amylacés en milieu solide.

Cette souche présente des performances plus élevées qu'une souche

d'A. tigeh type van Tieghem de collection. Son taux de croissance
est nettement supérieur ; elle'possëde une tolérance élevée vis-à-vis
de la température, et sa composition globale est favorable à une
utilisation alimentaire vue la teneur en acides aminés essen-
tiels de ses protéines. Quoique la technique de culture sur substrat
solide ne soit pas liée à l'emploi d'une souche particulière, nous
avons bas@ T'essentie de nos travaux sur cette souche d'A. hcnne-
berrgii.

Grâce à l'observation en microscopie électronique à balayage, nous

avons pu obtenir des renseignements concernant le mode de colonisa-
tion du substrat et montrerque l'envahissement total du produit par
les filaments mycéliens passe par une première étape de croissance
de surface au contact des grains d'amidon.

L'étude des facteurs de l'environnement, et en particulier de la

teneur en eau du produit, de la température, du pH et de la densité
d'inoculum, nous a permis de mieux comprendre l'influence des paramè-
tres et de définir les conditions optimales pour lesquelles la crois-
sance du champignon peut se dérouler dans de bonnes conditions. Nous
avons ainsi déterminé les conditions expérimentales qui nous ont per-
mis par la suite d'étudier les mécanismes de la croissance.

L'étude biochimique de la croissance sur substrat amylacé a été réa-

lisée en séparant :

- l'hydrolyse de l'amidon,
- la multiplication du mycélium
- l'activité respiratoire.
L'&lx~de de 'Ilkydrolystz de l'amidon en mJ'lieu so'ldde a permis de mon-
trer que l~am~laso syntk&ls& par la souche est essentiellement parie-
tale et de type amy'loglucosidasique. La cln8tique de production des
amylases pr&ente des differences notables avec celle observee en mi-
lieu liquide. La comparaison avec le systeme enzymatique synthétisé
en milieu liquide a rëvëlë des différences importantes concernant les
caractéristiques physico-chimiques. En particulier le système amyla-
sique‘produit en milieu solide présente une thermorësistance nettement
plus importante.

L'étude globale de la croissance a ensuite été réalisée en étudiant

la transformation des sucres hydrolysës en protéines par le dosage
chimique de ces constituants. Nous avons pu ainsi établir l'évolution
cinétique globale de la croissance en milieu solide, qui, si elle
pr&sente quelques analogies avec les cinetiques obtenues en milieu
liquide au cours du d&marrage de la reaction, presente des diffgrences
fondamentales concernant la nature, l'intensité et la vitesse d'appa-
rition des facteurs limitants, ainsi que dans 'l'evolution du metabo-
lisme au cours de la phase stationnaire.

L'ëtude du métabolisme respiratoire a été réalisée grâce a l'enre-

gistrement automatique.des concentrations en oxygène et en CO2 dans
le flux d'air sortant de l'incubateur. Elle nous a permis de confir-
mer et de préciser les résultats précédents surtout dans les tous
premiers stades du développement.

L'étude du métabolisme respiratoire nous a été particulièrement utile

et nous a permis d'améliorer considérablement nos connaissances des
mécanismes de! croissance des champignons sur substrat solide amylacë.

Nous avons pu ainsi définir l'équation stoéchiométrique globale de la

croissance et montrer sans équivoque l'existence d'une consommation
parasite de substrat essentiellement oxydé à travers le métabolisme
respiratoire.

Cette activité mëtabolique qui n'est pas liée à la multiplication du

 271

matériel cellulaire, est loin d'être négligeable puisqu'elle repré-

sente 10 à 20 % de la consommation pendant la phase de multiplication
végétative et peut représenter jusqu'à 75 % de la consommation de
substrat pendant la phase stationnaire.

Cette respiration qui peut correspondre à un découplage énergétique,

ou à la maintenance des fonctions physiologiques de la biomasse,
est vraisemblablement en relation étroite avec le métabolisme secon-
daire particulièrement important chez les champignons filamenteux.
Il correspond en effet à une phase physiologique de leur dëveloppe-
ment pendant laquelle sont synthétisés la plupart des métabolites
donnant lieu à des application industrielles.

Cette consommation de substrat, non associée à la multiplication

du mycélium, nécessite des études complémentaires que l'on aurait
donc intérêt à poursuivre en association avec l'étude du métabolisme
secondaire chez les champignons filamenteux.

La corrélation entre le métabolisme respiratoire et le dégagement de

calories lors de la croissance, nous a permis de calculer le coeffi-
cient de transfert de calories dans notre dispositif d'incubation.
Il s'agit d'un facteur très important pour la régulation thermique
et le contrôle des fermentations solides.

L'établissement de l'équation stoéchiomètrique globale de la crois-

sance nous a permis de montrer l'importance capitale de l'eau, qui
est le principal facteur limitant de la réaction dans les conditions
expérimentales que nous avons utilisées.

Les différents résultats expérimentaux et les observations qui ont

été faites ont montré que la phase végétative de la croissance en
milieu solide ne peut être représentée par une simple équation de
type exbonentiel ni par les autres modèles proposés pour la croissan-
ce fongique en milieu liquide. Nous avons ainsi été amenés à établir
un modèle cinétique spécifique de la croissance sur substrat amyla-
cé solide, en nous basant sur l'hypothèse d'une limitation de la
vitesse d'hydrolyse de l'amidon par la quantité d'eau résiduelle
 272

disponible pour la réaction ou par la catalyse de contact, qui con-

duisent à la même formulation.

Pour l'hydrolyse de l'amidon le modèle cinétique, que nous avons

ainsi établi, traduit fidèlement les résultats expérimentaux concer-
nant la production de sucres hydrolysës, ce qui constitue un argu-
ment important en faveur de l'hypothèse que nous avonsformulée.

Le modèle cinétique que nous avons établi pour la croissance propre-

ment dite traduit ëgalement de façon très satisfaisante les résultats
expérimentaux que nous avions obtenus précédemment. Il indique que
la croissance initiale peut être de type exponentiel mais se trou-
ve rapidement limitée de façon exponentielle par la disparition.. de
l'eau résiduelle ou de la surface de contact disponibles pour la pour-
suite de la réaction. La biomasse synthétisée tend donc vers une li-
mite qui est déterminée par ce facteur limitant.

Il est important de noter que tous les paramètres contenus dans le

modèle cinétique que nous proposons possèdent une signification phy-
siologique concrète directement reliés à la croissance sur substrat
solide, et qu'ils peuvent être facilement déterminés expérimentale-
ment.

Les paramètres que nous avons ainsi déterminés pour notre équation
cinétique sont en accord avec les résultats que nous avions obtenus
-1
expérimentalement (11 max = 0,3 h , U' = I = 3,3 g d'eau consommée
Xa
par g de biomasse synthétisée) sur la base de la mesure des protéines
synthétisées et de l'équation stoëchiométrique globale de la crois-
sance.

A partir de l'équation cinétique de la croissance et de l'équation

stoëchiomëtrique, nous avons pu établir le bilan des différents
constituants de la fermentation. Là aussi nous avons d&nu un exellent
 273

accord avec les valeurs expérimentales.

L'établissement d'un tel modèle cinétique représente une étape

importante dans la connaissance des mécanismes de la croissance des
champignons filamenteux sur substrat solide. Il permet en particulier
de calculer et de prévoir l'évolution des différents constituants en
fonction des conditions expérimentales, et nous a permis d'avancer
rapidement lors des études d'optimisation et de contrôle des fermen-
tations solides.

L'application de nos résultats que nous avons d'ores et déjà réali-

sée pour la mise au point d'un nouveau procédé d'enrichissement en
protéines pour la production d'Aliments Fermentés Enrichis en
Protéines (A.F.E.P.) est une démonstration de l'intérêt qu'il y a
à poursuivre les recherches fondamentales dans le domaine des crois-
ances fongiques sur substrats solides naturels.

L'intérêt principal du procédé de fermentation solide réside dans

les faibles coûts de fonctionnement, des faibles dêpenses d'énergie,
et dans le faible investissement nécessaire. Une telle technique
peut parfaitement s'adapter à différents substrats amylacës solides
(pomme de terre, céréales, manio‘c, bananes) et s'intégrer dans une
économie rurale de type coopérative, regroupant la culture du subs-
trat, l'enrichissement en protéines et l'élevage. Elle peut également
s'adapter à d'autres substrats solides et se développer jusqu'au
stade semi-industriel, compatible avec la taille d'une industrie de
type agro-alimentaire (118, 119).

Ei:dehors de la production d'A.F.E.P., d'autres applica-

tions de nos résultats peuvent être envisagëes.En particulier des
recherches sont entreprises concernant la valorisation de substrats
cellulosiques, la production d'enzymes comme les amylases ou les
cellulases, ou encore pour la production industrielle de métabolites.
 275

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TABLE DES MATIERES

ABSTRACT .... ..t....'f.t.).)~..~..................~.~..~ ......

1IWPfXUCTION ................................................. 1

cYHAPITRE1. GENERALITES ..................................... 7

1. Rappels sur la croissance des chmnpignons filamenteux ....... 9
1. Biolcgie et physiologie des champignons .................. 9
2. Théorie de la croissance des champignons ................. 10
2.1. Croissance non limitée .............................. 11
2.1.1. Croissance expcnentielle......................ll
2.1.2. Allcngmxznt apical et ramifications...........i 3
2.2. Limitations de la croissance.........................1 5
2.2.1. Substrat limitant - Modèle de Mxcd .......... 15
2.2.2. Croissance racine cubique et pellets ....... ..l6
2.2.3. Vieillissement du mycelim ................ ..J 7
2.3. Croissance logistiqe .............................. a8
2:4. Maintenance et autolyse.............................~ 0
3. Conclusions ............................................ 21

II. Les fermen tations en milieu solide..........................2 3

1. Définition des fermsntaticns Solides.....................2 3
2. Les fermentations alimentaires traditionnelles...........2 4
2.1. Frcmages ........................................... 24
2.2. Champignons comestibles ............................. 25
2.2.1.
Champiynon de couche Aga&zus bispoms .... ..2 5
2.2.2.
Champignon ae paille de riz : VoZvatieZZa
vohacea .................................. ..2 6
2.3. Fennentations orientales traditionnelles............2 7
2.3.1. Le Kcji ..................................... 30
2.3.2. Le T&II-&I ................................. ...3 2
2.3.3. L'Ontjcm .................................... 33
3. les applications industrielles des f exmentations solides.34
3.1. Production d'enzymes................................3 4
3.1.1. Amylases.....................................3 4
3.1.2. Cellulases ................................ ..3 fj
3.2. Production de métablites...........................3 g
 3.2.1. Actie galliwe ,..........~.~.~..~........~~~. 39
3.2.2. &iae citiigue; ,.1.~1”.*....“1.*..1~..*~.“.... 39
3.3.3. Flycot~he~ L~““,~~*~L”“~~,~~*~~*.*.*.~“~..,,~ 40
4. Production d'aliments fermentis c?2lrl.~s ell prcrté~es... 41
4.1. Substrats cellulokiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*a* 42
4.2. Substrats amyla&s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...*. 43
5. Caractérisriques des croissances sur substrats solides.. 44
5.1. Ccmparaison des femen tations liquides et solides.. 44
5.2. Nature et aspect du substrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
5.3. Maintien des conditions optimales.................. 48
5.4. Disponibilité de l'eau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4S
6. Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

CBAPITRE 2. MATEKtELETMETWODES............................... 55

1. Technigue de culture sur substrat~lacé solide .............. 57

1. @Ancipede laméthcde de culture ...................... 59
!F!. Préparation du substrat amylacé ........................ 60
3. préparation de l'inoculum de spores......................6 1
4. Conditionnement du substrat ............................ 62
5. Dispositif d'incubaticm ................................ 63

II. Traitement et analyses des &chantillons ..................... 65

1. Traitement ............................................. 65
2. Dosages des protéines .................................. 67
3. Cosage des sucres réducteurs ........................... 67
4. Dosage de l'activité an!ylasique ........................ 68

III. choix de l'organisne ........................................ 69

1. 1solerssrlts .............................................. 69
2. Screening des souches isolées .......................... 70
3. Rerdementde croissance ................................. 72
4. Ccqmsition des biamsses .............................. 73
5. Thern-otolérance ........................................ 74
6. Conclusion ............................................. 75
IV. Caractéristiques de llorganisma utilisé ..................... 76
1. Caractères morpholcgiques .............................. 76
2. Caractères physiologiques .............................. 79
 289

3. D&ennination de l'organisms .......................... 79

CHAPITRE 3. RECHERCHE
DES CONDITIONSOE'TII'W DE CUL- ....... 81

I. Influence des facteurs de llenvironnement ................... 84

1. Teneur en eau du substrat solide ...................... 84
2. Influence de la temarature ............................ 87
3. Contrôle . autcgène . du pH ........................... go
4. Influence de l'aération .............................. ..g 4
5. Densité de llincculumde spores ........................ g5
II, Détermination des conditions optimales ....................... 97

CHAPrrRE 4. BVOLUTIONDE IA MICRCFLCREIQ'KtÇBB ET BACTERIE!~...10 1

1. Colonisation du substrat solide w le mycelium ........... ..103
II. Evolution de la microflore bactérienne aérobie...............10 9
III. Généralisation de la technique de cuLture....................112
1. Influence de la souche de chmnpignon ................ ..112
2. Influence de la nature du substrat amylacé.............114
IV. Contrôles bactériologiques ................................. .l15

V. Conclusions ................................................ U.8

cHAl?m 5. ETUDEBICCI-IlIJX)UE DE IA ~ION................~2 1

1. Etude du substrat amylacé .................................. ~23
1. Ccmposition chimique ................................. 123
2. Propriétés physiqes ................................ ,124

II. Bguation stoechicmétrique de la croissance..................;L2 8

1. Réaction d'hydrolyse de l'mnidon ................... ..a2 8
2. Réaction de canbustion du substrat et respiration......l2 9
3. Réaction d'assimilation du substrat en bicmasse.......U 0
4. Equation stoechianétrique.globale de la croissance....&3 2
III. Etude de l'activité amylasique ............................. .L33
1. Nature et localisation de l'activité amylasique.......U 4
i. Propriétés au système amylasique ..................... a36
3. Cinétique d'apparition des crmylases...................a4 2
Iv. Conclusions ................................................ a44
 I. Bicsynthèse au ~mtikiel cellulaire .......................... 149
1. 'Etude cin&ique de la croissance ....................... ..~4 9
2. Paramètres de la croissance enmilieu sclide..............~ 5-3
II, M&&olime respiratoire et croissance ................... ..16 0
l..Mesur e du CO2 total dégagé ............................... 161
2. Vitesse de formation du CO2 .............................. 165
3. Wtientrespiratoire .................................... 168
4. Définition de l'équation stcechianétrique ................ 171

III.&Wakclisme de l'eau ........................................ 374

N.Consam-ationde substrat pour lamaiutenance ................ 176
V.Pmduction et transfert de chaleur .......................... 183
1. Usure de la chaleur dégagée ............................. 1.83
2. Calcul du coefficient de transfert de chaleur ............ 185

VI.Conclusions ................................................. 188

CHAPITRE7. ~~IOND'UN~D~CIMEaQUEDELAC~IS~
ENMILlEU SOLIDE .................................. 1 QI.

1. Intexprétaticm des résultats expérimeutaux et bases durrrodèle.193

1. Influence durnilieu de culture sur la croissance..........19 3
2. Nkessité d'un mdële cinétique ........................... 194
3. Causes de la li~&~i%n et base ~Uële....-..........:;19 7
II.Cinétique d'hydrolyse de l'amidon .......................... ,198
1. Vite.sse dKhydrolyse de l'amidcm ......................... -198
1.1. Limitation par l'eau di~le.....................~9 8
1.2. Catalyse de contact ................................. 2al
1.3. Détembation des coefficietbs ................... ...20 4
2. Equation cinétique de l'hydrolyse de l'amidon .......... ..20 5
3. Vé+.ficati& ex@rimentale ............................... L-D8
IIIJkdèle cin&ique de la croissance ........................... 2.n
1. Vitesse de crcissance ...................................
2. Equation cinétique de la croissance ....................... 4
 291

3. Vérification expérimentale ............................. 218

IV. Bilan des différents constituants ........................ 221
1. Cinétique des sucresconmés ......................... 222
2. Consmtion d'oxygène ................................. 226
3. Dégagment de gaz cartinique ........................... 227
4. Bilan de l'eau cons-e ............................... 229
V. Résumé du rrcdèle cinétique ................................ 233
VI. Conclusions ............ . .................................. 234
CHAPITRE 8. APPLICATION DES RESULTATS A L?a PRODUCTION D'A.F.E.P." 237
I. Originalité et intérêt aes résultats obtenus .............. 239
1. Rappel des objectifs et des problSmes posés ............ 239
2. Originalité de la technique de culture .................. 240
3. Etude de5 m&anismee de crbwance ..................... 24%
4. Fltnrich.lesmt en prskt%Jl~s ............................ 242
II. ExtrapzWAm des r&ult.ate de iabratoire ................ 244
1. Le5 problëmss posés .................................... 244
2. iZxtra~latlon du qstkne etatfque en colonnes r&&lon-
l¶~llQS ................................................. 245
3. Mise au point de riSacteurs agit& ...................... 250
3.1. Cylindre tournant .................................. 250
3.2. Mélangeur - Pétrin ................................ 252
IIIXise au point d'une unité pilote de fermentation en milieu
solide .................................................... 255
1. Principe du dispositif de fermentation ................. 255
2. Mise au pint des régulations et des contrôles ......... 257
3. Description du fonctionnement de l'unit@ pilote de fer-
mentation solide ....................................... 261
IV. Conclusions ............................................... 266
cYxcLus1oNs GEsmmIm .......................................... 268
REFERENCElSBIBLICGRAPHI-UES ,,,,,,,,...,,,,....................... 275
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