Le microbiote représente la communauté entière de micro-

organismes vivant dans un écosystème particulier. Pour étudier ces

micro-organismes, différentes techniques sont utilisées,
notamment l'isolement, l'extraction de l'ADN, la PCR (réaction de
polymérisation en chaîne) et le séquençage Sanger. Il est
intéressant de noter que seulement environ 10% des micro-
organismes sont cultivables, ce qui souligne la diversité souvent
non explorée de ces communautés.

Depuis 2007, avec l'avènement du séquençage de nouvelle

génération (NGS), notamment dans le domaine du séquençage du
génome humain, une approche plus globale est adoptée. Au lieu de
se concentrer sur des micro-organismes cultivables, on extrait
désormais l'ADN total, qui comprend l'ensemble des séquences
d'ADN des micro-organismes présents dans notre environnement.
La PCR est alors utilisée pour cibler des gènes spécifiques,
présents dans divers micro-organismes et différents pour chaque
individu, permettant ainsi une analyse plus fine de la diversité
microbienne.

Le microbiote des plantes, par exemple, est constitué d'une

flore microbienne diversifiée associée à différents compartiments

1
tels que l'anthosphère, la carposphère, la caulosphère, le
phylloplane, la phyllosphère, l'endosphere, la rhizoplane et la
rhizosphère. Chacun de ces compartiments offre un
environnement unique pour la colonisation et l'interaction des
micro-organismes, contribuant ainsi à la santé et au
développement des plantes.

Impact du microbiote des plantes sur la croissance, le

développement et la santé végétale :

1. **Croissance et développement de la plante**:

- *Résistance à la sécheresse*: Certaines souches de
Pseudomonas et Acinetobacter favorisent l'augmentation de la
biomasse en présence de sécheresse.
- *Résistance au stress salin*: Certaines souches de
Pseudomonas favorisent également l'augmentation de la biomasse
en présence de stress salin.
- *Modulation de la cinétique de floraison*: La composition du
microbiote de la rhizosphère modifie la cinétique de floraison,
notamment dans le contexte de l'agriculture intensive pour lutter
contre les effets de gelée.

2. **Santé des plantes**:

2
 - Dans la *phyllosphère* (partie supérieure): Certains membres
du microbiote réduisent les symptômes causés par Melampsora
chez le peuplier.
- Présence de certaines y- et B-proteobacteria dans la
*rhizosphère* (partie du sol): Ils empêchent la transmission
d'agents phytopathogènes. La composition du microbiote du sol
peut conduire à un sol conducteur (favorisant les maladies jusqu'à
60%) ou un sol suppressif (diminuant les maladies).

Objectif de l’étude du microbiote associé aux plantes :

Évaluer la diversité microbienne pour une meilleure
compréhension de sa structuration et de son fonctionnement dans
le but de manipuler le microbiote afin de :
- Favoriser l’absorption des nutriments (par exemple, fixation de
l'azote).
- Favoriser les micro-organismes compétitifs vis-à-vis des agents
phytopathogènes.
- Favoriser les micro-organismes activant les défenses de la
plante.

Processus d’assemblage du microbiote des plantes :

3
1. **Processus de niches** :
- *Sélection par la plante* : Les plantes ont la capacité de
sécréter des composés chimiques spécifiques qui peuvent favoriser
la croissance de certains micro-organismes bénéfiques tout en
inhibant la croissance d'autres. Cette sécrétion sélective crée des
conditions propices au développement d'une communauté
microbienne spécifique dans leur environnement.
- *Sélection par l’environnement* : Les conditions
environnementales, telles que la composition chimique du sol, le
pH, l'humidité et la température, influent également sur la
composition du microbiote. Les micro-organismes présents dans le
sol ou dans l'air environnant peuvent coloniser les racines ou les
parties aériennes des plantes en fonction de ces conditions.

La plante exerce une influence directe sur la sélection du

microbiote dans la partie aérienne (phyllosphère), tandis que dans
la rhizosphère, l'environnement joue un rôle prédominant dans ce
processus de sélection.

2. **Processus neutres** (peu étudiés) :

Ces processus sont caractérisés par une absence de contrôle de la
part de la plante ou de l'environnement.

4
 - *Dispersion* : Les micro-organismes ont la capacité de se
déplacer et de coloniser de nouveaux environnements, souvent via
des vecteurs tels que le vent, l'eau, les animaux ou même les
activités humaines. Cette dispersion peut se produire sur de
courtes périodes et contribue à la diversité du microbiote des
plantes.
- *Dérive écologique* : Des fluctuations aléatoires dans
l'abondance relative des micro-organismes peuvent se produire en
raison de facteurs environnementaux ou de processus biologiques
intrinsèques. Ces changements aléatoires peuvent conduire à
l'expansion de certaines populations microbiennes et à l'extinction
d'autres au fil du temps.
- *Diversification* : Ce processus implique la génération de
diversité génétique au sein des populations microbiennes,
notamment par le biais de mutations génétiques et de transferts
horizontaux de gènes. Contrairement à la dispersion et à la dérive
écologique, la diversification nécessite plusieurs générations pour
être pleinement observée.

Ces processus d'assemblage du microbiote des plantes

permettent d’observer comment les micro-organismes sont acquis
et colonisent les plantes :

5
- L'environnement agit comme un vecteur de transmission
horizontale, permettant aux micro-organismes présents dans le sol
et dans l'air de coloniser les surfaces des plantes.
- Les graines, en tant que vecteurs de transmission verticale,
peuvent également héberger des micro-organismes qui
influencent le développement du microbiote des plantes dès le
stade initial de leur croissance.

Transmission des micro-organismes aux graines :

Les micro-organismes peuvent être transmis aux graines selon

plusieurs voies :

1. **Voie vasculaire** :
- Les micro-organismes peuvent accéder aux graines à travers
les tissus conducteurs, notamment pendant la formation de la
graine. Ils peuvent être transportés par la sève brute et atteindre les
parties en développement de la graine via le système vasculaire de
la plante.

2. **Voie florale** :
- Certains micro-organismes peuvent accéder aux graines par le
biais des fleurs. Pendant la formation de la graine, les micro-

6
organismes présents dans le pollen ou les parties florales peuvent
se retrouver dans la graine en développement. Cette voie de
transmission est particulièrement importante pour les micro-
organismes qui ont une relation symbiotique avec la plante hôte.

3. **Voie externe** :
- Les graines peuvent entrer en contact avec des micro-
organismes présents dans le sol ou dans le milieu de culture. Cette
voie de transmission est généralement observée à un stade plus
tardif du développement de la graine, car elle nécessite que la
graine soit déjà formée. Les micro-organismes du sol ou du milieu
de culture peuvent adhérer à la surface de la graine et coloniser
son environnement externe.

Il est important de noter que certains micro-organismes ne

peuvent emprunter qu'une seule voie de transmission, tandis que
d'autres peuvent utiliser plusieurs voies. Cette capacité peut
dépendre des caractéristiques spécifiques des micro-organismes
ainsi que des conditions environnementales et de la physiologie de
la plante hôte. La diversité des voies de transmission contribue à la
complexité de l'assemblage du microbiote des graines et à la
variabilité de sa composition microbiologique.

7
Pourquoi s’intéresser au microbiote des graines ?

L'étude du microbiote des graines revêt une importance capitale

pour plusieurs raisons, notamment :

1. **Transmission verticale des microorganismes** :

Les graines peuvent être le vecteur de transmission de
microorganismes, qu'ils soient phytopathogènes ou bénéfiques, de
génération en génération. Comprendre cette transmission verticale
est essentiel pour évaluer les risques de propagation de maladies
ou pour favoriser la présence de microorganismes bénéfiques.

2. **Impact sur la vigueur des semences** :

Le microbiote des graines peut influencer la vigueur des
semences en affectant des processus tels que la levée de la
dormance. La composition du microbiote peut donc avoir des
répercussions directes sur la germination et la croissance des
plantes issues de ces graines.

I- Plan expérimental

6. *Raison de la deuxième vérification* :

8
 La deuxième vérification permet de garantir que les deux
échantillons ont une concentration équimolaire à la fin du
processus, afin d'assurer un séquençage équitable. Sinon, des
différences de concentration pourraient entraîner des biais dans les
résultats.

9. *Pool équimolaire* :
À la fin de l'étape de préparation des échantillons, les deux
échantillons doivent être combinés dans un pool équimolaire, où
chaque échantillon contribue de manière égale à la concentration
finale. Cela garantit que chaque échantillon est représenté de
manière équitable lors du séquençage, évitant ainsi tout biais dans
l'analyse des données.

Analyse bio-informatique des données de séquençage

1. *Assemblage des reads* :

Les séquences brutes obtenues du séquençage sont assemblées
pour reconstruire les séquences complètes, facilitant ainsi l'analyse
ultérieure.

2. *Identification des séquences conservées* :

9
 Les séquences sont alignées sur des références connues pour
identifier les séquences conservées, et les lacunes (gaps) sont
éliminées pour assurer une analyse précise.

3. *Nettoyage des séquences* :

Les séquences uniques sont conservées tandis que les séquences
chimériques sont éliminées pour garantir la qualité des données.

4. *Clusterisation des séquences* :

Les séquences similaires sont regroupées en clusters pour
simplifier l'analyse.

5. *Affiliation taxonomique des OTUs ou ASVs* :

Les unités taxonomiques moléculaires (OTUs) ou les séquences
d'amplicons spécifiques (ASVs) sont affiliées taxonomiquement
pour identifier les microorganismes présents dans les échantillons.

Variation dans la composition du microbiote des graines

La composition du microbiote des graines présente une variation

relative dans l'abondance des différents microorganismes. Les
genres Pantoea et Pseudomonas sont dominants parmi les
bactéries, tandis que les champignons Alternaria et Cladosporium

10
sont également présents. Cette variation dans la composition
reflète la diversité microbienne associée aux graines et peut avoir
un impact significatif sur leur développement ultérieur.
L'assemblage du microbiote des graines est donc un processus
complexe et dynamique qui mérite une attention particulière dans
les études microbiologiques.

Processus neutres dans l'assemblage du microbiote des graines

:

La théorie de la neutralité postule que chaque individu possède la

même "fitness", c'est-à-dire le même niveau de compétitivité, et
donc tous les microorganismes sont neutres pour la colonisation.
Pour tester cette hypothèse, le modèle de Sloan évalue la
dispersion et la dérive écologique.

Le test du modèle neutre de Sloan permet de distinguer deux

cas :

- Les OTU (unités opérationnelles de taxonomie) qui

correspondent au modèle neutre indiquent que les processus
neutres sont impliqués dans l'assemblage de certains membres du
microbiote des graines.

11
- Les OTU sélectionnées par la plante et contre-sélectionnées
suggèrent que les processus de niche (sélection) sont impliqués
dans l'assemblage de certains membres du microbiote des graines.

Les processus neutres d'assemblage du microbiote de la graine

présentent plusieurs aspects :

1. **Core microbiote conservé** :

Un ensemble de microorganismes, composé de 3 OTU
bactériennes et 19 OTU fongiques, est conservé dans la majorité
des échantillons de graines, représentant environ 75% de
l'abondance relative du microbiote. Cette conservation suggère
une possible sélection par la plante. Il reste à démontrer
expérimentalement si ces microorganismes jouent un rôle
bénéfique pour la plante et, le cas échéant, quelles voies de
transmission sont impliquées.

2. **Primo-colonisateurs** :
Il est également envisageable que ces microorganismes
conservés agissent en tant que primo-colonisateurs, colonisant les
graines dès le début de leur développement et fournissant ainsi une
base pour l'assemblage ultérieur du microbiote.

12
L'étude des processus neutres dans l'assemblage du microbiote des
graines offre des perspectives intéressantes pour comprendre la
dynamique de cette communauté microbienne cruciale pour la
santé et la vigueur des plantes. En identifiant les mécanismes
sous-jacents à la composition du microbiote des graines, il devient
possible de manipuler ces processus pour favoriser des
associations bénéfiques entre les plantes et leurs microorganismes
associés.

La graine en tant que vecteur de micro-organismes bénéfiques

pour la plante présente des implications importantes pour
l'agriculture et la santé des cultures. Une approche courante
consiste à utiliser l'inoculation de microorganismes pour améliorer
la croissance de la plante ou pour empêcher la transmission
d'agents pathogènes. Une technique utilisée à cet effet est
l'EndoSeed, qui vise à transmettre des microorganismes
bénéfiques pour la croissance de la plante par inoculation directe
dans les graines.

Cependant, des études ont montré que bien que l'inoculation de

PGPR (rhizobactéries promoteurs de la croissance des plantes) ait
des effets bénéfiques sur la plante, ces effets ne se transmettent
pas à la génération suivante.

13
La réponse du microbiote à la transmission des agents
phytopathogènes est également un sujet d'intérêt. La richesse du
microbiote, définie par le nombre d'OTU (unités opérationnelles
de taxonomie) ou d'ASV (variantes de séquences ampliconiques),
est un indicateur important. On a observé que l'introduction d'une
bactérie phytopathogène n'affecte pas la richesse microbienne,
mais l'introduction d'un champignon phytopathogène entraîne une
diminution de la richesse microbienne.

En ce qui concerne la structure des communautés bactériennes,

des études ont montré que l'introduction d'agents phytopathogènes
conduit à une diminution de la diversité. Il est intéressant de noter
que seules trois OTU sont abondantes dans ces cas.

Pour les communautés fongiques, des analyses de réseau de

corrélation montrent une diminution de la densité du réseau après
l'arrivée du champignon pathogène. Plusieurs hypothèses ont été
avancées pour expliquer ce phénomène :

1. La transmission tardive du champignon phytopathogène

pourrait perturber le microbiote déjà formé, qui a atteint un certain
équilibre.

14
2. Il pourrait y avoir une compétition pour les ressources nutritives
entre les agents phytopathogènes et les membres du microbiote
des graines, ce qui est soutenu par des analyses de profil
métabolique montrant une forte compétition pour les ressources.
3. Une compétition pour l'espace est également possible. Il est
envisagé que ces microorganismes se localisent dans le même
compartiment que la graine, ce qui pourrait être étudié grâce à des
techniques telles que la fluorescence in situ associée à la
microscopie confocale.

### Localisation

Une observation cruciale concerne la différence de localisation

entre Xcc (Xanthomonas campestris pv. campestris), qui occupe sa
propre niche, et les autres bactéries présentes dans le microbiote
des graines.

### Application et perspectives

#### Transmission des micro-organismes phytopathogènes

La transmission de micro-organismes phytopathogènes peut avoir

des effets précoces, tels que l'inhibition de la germination ou la

15
fonte des semis, ainsi que des effets tardifs, se manifestant par
l'expression de la maladie.

#### Sélection d’isolats compétitifs vis-à-vis des agents

phytopathogènes

1. **Identification des compétitions potentielles** :

Des méthodes telles que l'extraction d'ADN et le séquençage
permettent d'identifier les interactions compétitives entre les
microorganismes. Cette étape est cruciale pour la sélection
d'isolats compétitifs.

2. **Choix d’isolats pour l’utilisation en bioprotection** :

Les isolats compétitifs identifiés peuvent être choisis pour leur
utilisation dans des stratégies de bioprotection.

#### Test d’antagonisme direct

Des tests d'antagonisme direct sont menés, opposant les isolats

sélectionnés aux agents phytopathogènes. Ces tests permettent de
constituer une communauté microbienne synthétique à partir
d'isolats inhibiteurs des agents pathogènes. Cette communauté est

16
ensuite inoculée pour évaluer son effet sur la transmission à la
graine.

#### Effet de la communauté microbienne synthétique

L'effet de la communauté microbienne synthétique sur la santé et

la vigueur des semences est évalué. Cette évaluation comprend
l'analyse des fonctions microbiennes responsables de la protection
des semences.

#### Analyse de la diversité fonctionnelle

L'analyse de la diversité fonctionnelle implique l'extraction de

l'ARN total des échantillons, suivie d'une approche
métatranscriptomique et du séquençage HiSeq. Les données
obtenues sont ensuite analysées pour identifier les gènes exprimés,
permettant ainsi de comprendre les mécanismes sous-jacents à la
protection des semences.

### Introduction à la phytopathologie

La phytopathologie est la science qui étudie les maladies des

plantes, notamment des plantes cultivées. Ces maladies peuvent

17
être classées en deux catégories : les maladies infectieuses,
causées par une perturbation biotique, et les maladies ou désordres
d'ordre physiologique, causés par une perturbation abiotique. Elles
se manifestent par une altération de l'apparence ou de l'état
physiologique normal de la plante, affectant des processus vitaux
tels que la photosynthèse, le métabolisme, la reproduction et
l'absorption. Les maladies des plantes se manifestent par des
symptômes, c'est-à-dire des effets visibles de la maladie sur la
plante, incluant des changements de couleur, de forme et/ou de
fonction de la plante en réponse à un pathogène, des organismes
vivants qui infectent et parasitent la plante hôte.

### Diagnostic des maladies des plantes

Le diagnostic des maladies des plantes implique l'observation des

plantes malades pour identifier les symptômes, qui varient en
fonction du contexte et des microorganismes présents sur
différents organes. Des techniques moléculaires telles que l'ELISA
(sérologie), la PCR (réaction de polymérisation en chaîne), la PCR
en temps réel (qPCR), la métagénomique et le metabarcoding sont
utilisées pour déterminer la cause d'une nouvelle maladie,
rechercher la présence d'un agent pathogène connu ou identifier le
meilleur moyen de contrôler la maladie.

18
### Agents pathogènes des plantes

Les agents pathogènes des plantes peuvent avoir une origine

abiotique (non infectieuse), telle que des carences nutritionnelles,
des variations de température, un excès ou un manque d'eau, un
pH du sol inadapté, une exposition à la lumière ou des traitements
phytosanitaires. Ils peuvent également avoir une origine biotique
(infectieuse), comme les bactéries, les champignons, les pucerons,
les nématodes et les virus, qui sont transmis lors d'une piqûre de la
plante.

### Modes de vie des agents phytopathogènes

Les agents phytopathogènes ont des modes de vie variés. Les

bactéries, telles que Ralstonia, peuvent coloniser le système
vasculaire des plantes, se multiplier rapidement et se propager
activement. Les champignons, tels que Botrytis cinerea, se
multiplient grâce à des conidies (spores) et peuvent former des
sclérotes, une forme de conservation hivernale. Les oomycètes,
tels que le mildiou, produisent des spores qui se propagent sur les
feuilles et d'autres parties de la plante. Les phytovirus, comme le
tombavirus, infectent les plantes et peuvent causer des maladies

19
graves. Les nématodes, comme le nématode à kystes de la pomme
de terre, sont des parasites des plantes.

### Cycle de développement d'un agent phytopathogène

Le cycle de développement d'un agent phytopathogène comprend

plusieurs étapes, notamment la survie, la propagation et la
transmission à d'autres plantes.

### Conséquences des maladies des plantes

Les maladies des plantes peuvent entraîner une perte de

production agricole, affecter le paysage en raison de la présence
de champignons invasifs et avoir un impact sur la santé humaine,
comme c'est le cas avec Xylella fastidiosa, transmis par des
insectes vecteurs.

### Protection des plantes contre les maladies

Pour protéger les plantes contre les maladies, il est essentiel de

favoriser les mesures prophylactiques, d'adapter les pratiques
culturales, de déployer des variétés résistantes et de développer
des méthodes de substitution telles que le biocontrôle.

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