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Science de l'environnement total 730 (2020) 138921

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L'ajout de biochar renforce la coopération interspécifique microbienne dans la

méthanisation des déchets de betterave sucrière (pulpe)

Anna Pytlakun,⁎,1, Agnieszka Kasprzyckaun,1, Anna Szafranek-Nakoniecznab, Jarosław Grzundzielc,

Adam Kubaczyńskiun, KingaProcun, Paulina Onopiukb, Anna Walkiewiczun, Cézary Polakowskiun, Anna Galazkac,
Justyna Lalak-Kańczugowskad, rue Zofiaępniewskae, Andrzej Bieganowskiun
unInstitut d'agrophysique, Académie polonaise des sciences, Doœwiadczalna 4, 20-290 Lublin, Pologne
bInstitut des sciences biologiques, Université catholique Jean-Paul II de Lublin, Konstantynów 1 I, 20-708 Lublin, Pologne
cDépartement de microbiologie agricole, Institut des sciences du sol et de la culture des plantes - Institut de recherche d'État (IUNG-PIB), Czartoryskich 8, 24-100 PułAwy, Pologne
dDépartement de génétique des agents pathogènes et de résistance des plantes, Institut de génétique végétale, Académie polonaise des sciences, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań,Pologne
eDépartement de biochimie et de chimie environnementale, Université catholique Jean-Paul II de Lublin, Konstantynów 1 I, 20-708 Lublin, Pologne

POINTS FORTS RÉSUMÉ GRAPHIQUE

• L'ajout de biochar augmente la production de biogaz

à partir de la pulpe de betterave sucrière.
• Le biochar modifie la composition des
communautés microbiennes dans les boues de
fermentation.
• L'ajout de biochar entraîne l'enrichissement
deBacteroidalesetClostridiales.
• Le biochar sert d'habitat aux bactéries
hydrolytiques.
• La surface du biochar est de préférence
colonisée par un microbiote hydrophobe.

informations sur l'article abstrait

Historique des articles : La production de biogaz et la structure de la communauté microbienne ont été analysées comme un effet de l'ajout de biochar à une
Reçu le 15 janvier 2020 Reçu sous une boue de fermentation contenant de la pulpe de betterave à sucre. Des effets positifs du traitement, notamment une augmentation de
forme révisée le 17 avril 2020 Accepté le 21
l'efficacité du procédé et une meilleure qualité du biogaz, ont été notés. L'effet du biochar sur les communautés microbiennes AD
avril 2020
(processus de digestion anaérobie) a été étudié après extraction totale de l'ADN à partir de mélanges de fermentation modifiés au
Disponible en ligne le 23 avril 2020
biochar par amplification par PCR de fragments de gènes d'ARNr 16S bactériens et séquençage d'amplicon Illumina. Une combinaison

Editeur : Yucheng Feng d'analyses microbiologiques et physico-chimiques a été utilisée pour étudier le mécanisme par lequel le biochar influence le processus de
digestion anaérobie de la pulpe de sucre. Il a été constaté que la raison principale des changements dans la production de biogaz était le
Mots clés: remodelage des communautés microbiennes, en particulier l'enrichissement deBacteroidales etClostridiales.Il a été proposé que le
Biochar biochar, en plus d'être un conducteur pour la médiation du transfert d'électrons interspécifiques, sert également d'habitat pour les
Biogaz bactéries hydrolytiques. Il a été élucidé que la principale force motrice de la colonisation préférentielle des surfaces de biochar est son
Méthane hydrophobicité. La recherche présentée indique le potentiel élevé du biochar pour stimuler le processus de fermentation du méthane.
Structure de la communauté microbienne
Prévotelle
© 2020 Les auteurs. Publié par Elsevier BV Ceci est un article en libre accès sous licence CC BY (http://
creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

⁎ Auteur correspondant à : Département de biogéochimie de l'environnement naturel, Institut d'agrophysique, Académie polonaise des sciences, Doœwiadczalna 4, 20-290 Lublin, Pologne.
Adresse e-mail:apytlak@ipan.lublin.pl (A. Pytlak). Les deux auteurs ont contribué à parts égales à ce travail.
1

https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.138921
0048-9697/© 2020 Les auteurs. Publié par Elsevier BV Ceci est un article en libre accès sous licence CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
2 A. Pytlak et al. / Science de l'environnement total 730 (2020) 138921
1. Introduction
Le méthane est l'une des sources d'énergie les plus puissantes. En raison des
effets beaucoup moins nocifs pour l'environnement de sa combustion, le méthane
est considéré comme une alternative "verte" aux combustibles fossiles tels que le
charbon ou le pétrole. Le méthane provient principalement de sources
géologiques, car on le trouve souvent à côté des gisements de charbon et de
pétrole. Préoccupation croissante concernant la quantité de gaz à effet de serre
dans l'atmosphère (Ji et al., 2020;Pattełowska et al., 2011) ainsi que l'augmentation
de la demande énergétique ont entraîné le développement de méthodes de
production biologique de méthane par fermentation anaérobie de déchets
organiques (Bulak et al., 2020;Montusiewicz et al., 2008;Oszust et Frunvers 2018).
Bien que l'utilisation du procédé de fermentation pour la production de biogaz soit
technologiquement maîtrisée et largement utilisée, des travaux visant à
augmenter son efficacité sont toujours en cours. De nombreux chercheurs se
concentrent sur la bioaugmentation ou le prétraitement des matières premières
utilisées dans le processus de fermentation (Abraham et al., 2020;Akyol et al., 2019
;Ferraro et al., 2019;Kasprzycka et al., 2018;Lalak et al., 2016).
Un domaine d'étude émergent dans l'intensification de la fermentation
est l'ajout de biochar, qui est produit par pyrolyse de la biomasse et des
déchets biodégradables à haute température dans des conditions
anaérobies (Masebinu et al., 2019;Pan et al., 2019b). Il se caractérise par une
teneur élevée en carbone organique, mais en raison des structures formées
lors de la pyrolyse, il présente une sensibilité relativement faible à la
dégradation. La porosité élevée et la capacité de sorption sont des
propriétés importantes des biochars, ce qui contribue à leur large utilisation
dans de nombreux domaines scientifiques et pratiques. Bien que l'effet final
positif du biochar ait été sans aucun doute confirmé dans la fermentation de
divers déchets organiques (Cai et al., 2016;Fagbohungbe et al., 2017;Lu et al.,
2016;Sunyoto et al., 2016;Usman et al., 2019) on sait peu de choses sur les
mécanismes biocharmédiés impliqués dans la production de biogaz. Les
biochars testés comprenaient des matériaux d'origine différente (par
exemple dérivés de la paille de blé, du fumier de poulet, du bois fruitier, du
lombricompost, de la drêche de brasserie ou des déchets de cuisine
mélangés) ou pyrolysés à différentes températures (généralement de 300 à
600 °C) (Chen et al., 2017; Dudek et al., 2019;Fagbohungbe et al., 2016;Pan et
al., 2019a;D.Wang et al., 2017;S.Wang et al., 2017;Zhang et al., 2019). Il a été
suggéré que le biochar améliore la digestion anaérobie (AD) en fournissant
une surface pour la colonisation microbienne, l'adsorption de composés
inhibiteurs ou en créant une plate-forme pour le transport d'électrons
interspécifiques (IET). Cependant, l'ajout de biochar s'est également avéré
inhibiteur pour le processus examiné dans cette étude, en particulier à des
charges élevées (Dudek et al., 2019). Compte tenu de la grande diversité des
substrats méthanogènes et des biochars disponibles, chaque système
nécessite une optimisation des proportions entre les composants du
mélange de fermentation.
Il existe de nombreux substrats pour la production de biogaz. Dont
l'utilisation dépend de la disponibilité dans une zone donnée. Un de ces
substrats peut être le déchet de la production de sucre à partir de betterave
sucrière (Ziemiński et Kowalska-Wentel, 2017). La pulpe de betterave est
constituée principalement de polysaccharides (cellulose et hémicellulose), de
lignines et de protéines. De plus, il contient des sucres non extraits, des
quantités négligeables de matières grasses, de phosphore, de sodium et
une teneur en calcium relativement élevée par rapport aux autres résidus
végétaux (Huber, 2018). L'évolution des technologies d'élevage a entraîné
une baisse d'intérêt pour ces matériaux comme matière première animale
rendant ainsi la pulpe de betterave plus disponible pour la production de
biogaz (Ziemiński et Kowalska-Wentel, 2017). Compte tenu de ce qui
précède, nous avons entrepris une étude pour reconnaître l'influence de
l'ajout de biochar sur la digestion anaérobie de la pulpe de betterave à
sucre, qui n'a jamais été présentée auparavant. Les changements dans les
propriétés physiques et chimiques du mélange fermentatif ainsi que la
structure de la communauté microbienne ont été surveillés pour expliquer
les mécanismes de l'impact du biochar sur le processus de formation du
méthane.
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériaux
Le biochar a été produit dans le laboratoire de l'Institut d'agrophysique PAS
(Lublin, Pologne) à partir de sciure très fine provenant de la coupe de bois d'épicéa
dans une scierie. La pyrolyse dans une atmosphère d'azote a été effectuée à 650
°C pendant 0,5 h. La surface spécifique du biochar mesurée par la vapeur d'eau
était de 182 m2·g−1.
La pulpe de betterave à sucre a été obtenue à partir d'une usine de biogaz agricole.
Le pH était de 4,52. La matière sèche et la teneur en solides volatils étaient de 19,25 % (±
0,4) et 92,4 % TS (± 0,4), respectivement. Le carbone organique total et l'azote total
étaient de 37,98 % (± 0,5) et de 0,53 % (± 0,6) (valeur moyenne ± ET), en conséquence.
2.2. Digestion anaérobique
La fermentation du méthane a été testée dans des bioréacteurs discontinus
d'une capacité de 0,8 dm3. Le procédé a été réalisé dans des conditions
mésophiles (37 ± 1 °C), en système discontinu. Pour chaque répétition de
traitement de l'expérience, la même masse de pulpe de betterave sucrière a été
utilisée (104 g) avec la même teneur en inoculum (20 % de la charge organique).
L'inoculum pour le processus de fermentation provenait d'une usine de biogaz
agricole à Siedliszczki (Pologne) où les drêches de distillerie, le lactosérum et
l'ensilage de maïs étaient utilisés comme substrats. La teneur en matière sèche
dans notre bioréacteur était de 3,75 ± 1 % tandis que le pH était de 7 ± 0,1. Le
biochar a été dosé (0,25, 0,5, 0,75, 1 et 1,25 g·dm−3) simultanément avec l'inoculum
et la pulpe de betterave sucrière dans les bioréacteurs, qui ont ensuite été placés
dans un bain-marie. Des contrôles ont été établis sans biochar ajouté.
2.3. méthodes analytiques
La composition du gaz produit a été surveillée une fois par jour à l'aide d'un
analyseur automatique de biogaz (GFM 416, GasData, Royaume-Uni). L'essai s'est déroulé
en triple exemplaire. L'expérience a été menée jusqu'à ce que le rendement journalier
soitb1% du rendement total du biogaz (DIN 38414-S8) - en pratique, il s'agissait de 15
jours. Les valeurs de volume de biogaz résultantes ont été converties en conditions
normales (1013,25 hPa, 273,15 K).
Formes biodisponibles d'azote sous forme de nitrate (N-NO3), ammonium (N-
NH4) et phosphore (P-PO4) ont été mesurés dans les phases liquides (après
centrifugation, 14 000gpendant 10 min) à partir des combinaisons d'expériences
spécifiques, en utilisant un AutoAnalyzer 3 (Bran+Luebbe, Allemagne) (Wolińska et
al., 2016). Les formes de carbone total (TC) et inorganique (IC) et l'azote total (TN)
dans la phase liquide ont été mesurés au moyen d'un analyseur de carbone
organique total TOC-VCSH (Shimadzu, Japon). Les solides totaux (TS) et les solides
volatils (VS) ont été déterminés à l'aide de la méthode gravimétrique après
séchage à 105 et 550 °C, conformément aux normes EN 12880:2000 et EN
12879:2000 respectivement.
La réaction (pH) et le potentiel redox (Eh) ont été déterminés par
potentiomètre à l'aide d'un potentiomètre multifonctionnel pIONneer
65 (Radiometer Analytical SA, France) équipé d'électrodes : pour pH et
Eh (Cartode pH E16M340 et électrode Ag/AgCl E31M004, Radiometer
Analytical SA, France) (Stępniewska et al., 2018).
La teneur en micro et macroéléments dans les phases liquide et solide a été
déterminée à l'aide d'un spectromètre ICP OES-iCAP 6500 Duo (Thermo Fisher
Scientific, USA). Les échantillons solides ont été minéralisés avant analyse (0,5 g
d'échantillon avec 8 cm3eau régale et 1,5 cm3l'acide fluorhydrique a été minéralisé
dans un minéralisateur à micro-ondes Berghof Speedwave (Eningen, Allemagne)
en utilisant le programme de température : 20–200 °C pendant 35 min.).
Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Statistica 12 (StatSoft,
USA). L'homogénéité des variances et des distributions a été évaluée à l'aide des
tests de Brown-Forsyth et de Shapiro-Wilk, respectivement. Les données ont été
analysées plus en détail avec le test de Kruskal – Wallis pour déterminer la
signification des différences entre la variante de contrôle et l'ajout de biochar. Les
coefficients de corrélation ont été calculés avec l'algorithme de Spearman.
 A. Pytlak et al. / Science de l'environnement total 730 (2020) 138921
2.4. Analyse microbiologique
L'ADN génomique microbien a été extrait du mélange fermentatif après
environ 96 h d'expérience, en double, à l'aide d'un kit d'isolement d'ADN
PowerLyzer PowerSoil (Quiagen, Hilden, Allemagne), conformément aux
instructions du fabricant. La date d'échantillonnage a été déterminée comme le
jour où la production de biogaz est la plus efficace. La région V3 – V4 des
amplicons du gène de l'ARNr 16S a été séquencée (dans des échantillons
regroupés) avec la technologie MiSeq Illumina (Genomed Inc., Pologne). Les
variants de séquence d'amplicon (ASV) ont été résolus à l'aide du package DADA2
version 1.8 (Callahan et al., 2016) dans R version 3.5.1 (Équipe centrale de
développement R 3.0.1., 2013). Sur la base des séquences, des parcelles de qualité
et des lectures directes et inverses ont été ajustées respectivement à 250 et 240
pb, les séquences d'amorce ont été supprimées de toutes les lectures. Les
paramètres de filtrage étaient les suivants : maxN = 0, maxEE pour les lectures
directes = 3 et les lectures inversées = 5, truncQ = 2. Les autres paramètres ont été
définis par défaut. Les taux d'erreur ont été estimés par learnErrors en utilisant un
million de lectures. Les séquences ont été dérépliquées à l'aide de derepFastq avec
des paramètres par défaut et les variantes de séquence exactes ont été résolues à
l'aide de dada. Ensuite, removeBimeraDenovo a été utilisé pour supprimer les
séquences chimériques. La taxonomie a été attribuée à la dernière version de la
base de données RDP (version 11) à l'aide du classificateur bayésien naïf (Wang et
al., 2007) avec le paramètre minboot défini sur 80. Les tables de taxonomie et de
nombre de lectures résultantes construites dans DADA2 ont été correctement
converties et importées dans le package phyloseq (1.22.3) (McMurdie et Holmes,
2013). Les séquences appartenant au chloroplaste ou à l'ADN mitochondrial ont
été retirées.
Utilisation du logiciel PICRUSt (Phylogenetic Investigation of Communities by
Reconstruction of Unobserved States) (Langille et al., 2013), les gènes fonctionnels
ont été reconstruits sur la base de séquences de gènes d'ARNr 16S bactériens. Les
entrées ASV du flux de travail dada2 ont été regroupées en OTU (unités
taxonomiques opérationnelles) à l'aide de l'algorithme de référence fermée
implémenté dans le logiciel qiime2 (Bolyen et al., 2019) avec un seuil de similarité
de 97% et en utilisant la base de données GreenGenes (13.8) comme référence. Le
nombre de copies du gène ARNr 16S a été normalisé à l'aide de l'algorithme
normalize_by_copy_number.py implémenté dans le logiciel PICRUSt. Les
métagénomes ont été prédits à l'aide de l'algorithme predict_metagenomes.py et
les gènes fonctionnels ont été annotés dans la base de données KEGG à l'aide de
l'algorithme categorize_by_function.py. Les données de séquençage des
amplicons d'ARNr 16S générées dans cette étude ont été déposées dans le NCBI
Sequence Read Archive (SRA) sous le numéro BioProject PRJNA600403
(SAMN13818716, SAMN13818715 SAMN13818379).
Une PCR semi-quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide du
système en temps réel AriaMX (Agilent, USA). Les PCR du gène d'intérêt
(mcrA) et du gène de référence (ARNr 16S) ont été réalisées à l'aide des
mêmes échantillons d'ADN, qui ont été dilués au 1/4 avec de l'eau stérile
sans RNase et DNase jusqu'à une concentration finale de 136 ± 18 ng/ μl. Le
Fig. 1.Les volumes cumulés (pendant neuf jours de l'expérience) des volumes de gaz et de la concentration de méthane dans les contrôles et les variantes avec différentes doses de biochar (n = 3 ; les barres indiquent les
écarts-types ; les mêmes lettres au-dessus des colonnes signifient qu'il n'y a pas de différences statistiquement significatives entre les traitements, et les astérisques indiquent la signification statistique par rapport au
contrôle, test de Kruskal-Wallis non paramétrique ;Pb0,05).
3
L'échantillon de calibrateur a été préparé en mélangeant tous les échantillons en
quantités égales (10 μl chacun). Toutes les PCR ont été réalisées en triple en
utilisant le mélange réactionnel suivant : 2 μl d'ADN, 10 μl de SYBR Green QPCR
master mix (Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green, Agilent), 0,3 μl de chaque amorce
(provenant d'un stock de 10 μM), 0,3 µl de colorant de référence (Brilliant III Ultra-
Fast SYBR® Green, Agilent), 7,1 µl d'eau ultra pure. Les conditions de PCR étaient
les suivantes : 1 cycle de 95 °C pendant 3 min, 40 cycles de : 95 °C pendant 5 s, 52
°C pendant 10 s et 72 °C pendant 10 s. La fluorescence a été mesurée après
chaque étape d'extension. Les amorces universelles utilisées pour l'amplification
de l'ARNr mcrA (I) et 16S (II) étaient respectivement : I. ME1 (5′-GCMATGC
ARATHGGWATGTC) et ME2 (5′-TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT) II. 338F (5′-
ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) et 518R (5′-ATTACCGGGGC TGCTGG) (Hales et al.,
1996).
Le calcul de la quantité relative du gène mcrA était basé sur la
méthode 2^(−delta delta CT) décrite en détail parLivak et Schmittgen
(2001). Toutes les valeurs calculées de la quantité relative du gène mcrA
dans les échantillons testés étaient liées à la valeur du calibrateur prise
comme égale à 1.
3. Résultats et discussion
3.1. L'effet de l'ajout de biochar sur la quantité et la qualité du biogaz
Les quantités de biogaz produit et la teneur en méthane dans les
différentes variantes de l'expérience sont résumées dansFig. 1.
Généralement, l'ajout de biochar a eu un effet positif sur la production de
biogaz et de méthane. Une dose supplémentaire de 0,75 g·dm−3et plus a entraîné
une augmentation statistiquement importante à la fois du volume de biogaz
produit et de la concentration de méthane (Fig. 1). Les meilleures doses pour
l'efficacité du procédé étaient de 1 et 1,25 g·dm−3. Dans ces conditions, la
productivité (méthanisation de la matière organique) a augmenté de 20 à 30 % par
rapport au témoin. Des chiffres similaires ont été rapportés parShen et al. (2017)et
Caï et al. (2016).
3.2. Modification de la structure de la communauté microbienne
L'ajout de biochar a entraîné un remodelage évident des communautés
microbiennes. L'analyse de dissemblance de Bray-Curtis a révélé que les
microbiomes qui se sont développés dans les fermenteurs contenant du biochar
ont révélé plus de 85 % de similitude par rapport à 60 % dans l'échantillon témoin
(BootN = 999) (Figure 2).
La diversité alpha a également été affectée par l'ajout de biochar (Tableau 1). À 1 et
1,25 g·dm−3, le nombre d'OTU détectées a augmenté de 5 à 8 % par rapport à
l'échantillon de contrôle. Dans l'échantillon le plus efficace (en termes de production de
méthane), les indices de biodiversité ont indiqué des changements dans la structure de la
communauté, c'est-à-dire l'enrichissement de quelques taxons bactériens, qui dans le cas
de l'échantillon 1 g·dm−3évidemment étaient des représentants de Bacteroideset
Prévotelle (Figure 3). Il semble que les changements microbiens
4 A. Pytlak et al. / Science de l'environnement total 730 (2020) 138921
Fig. 2.Dendrogramme de clustering hiérarchique de l'analyse de dissemblance Bray-Curtis des
communautés microbiennes.
Tableau 1
Mesures de diversité alpha des communautés microbiennes traitées avec divers ajouts de
biochar analysés au 4ème jour du processus.
Traitement Observé Shannon Simpson
Contrôle 266 4.19 0,97
1 g·dm−3 290 3,93 0,95
1,25 g·dm−3 281 4.25 0,97
structure communautaire, en particulier l'enrichissementBacteroidaleset
Clostridiales,peut expliquer l'augmentation de la production de biogaz. Parmi
Bactéroïdales,les plus notables étaient les changements dansPrévotelle
occurrence. Ce genre bactérien était inférieur au seuil de détection dans
l'échantillon témoin tout en atteignant plus de 10 % des lectures dans les deux
échantillons traités au biochar (16 % dans le traitement produisant du biogaz le
plus efficace). Jusque récemment,Prévotellea attiré l'attention principalement en
raison de sa présence dans la cavité buccale humaine et de son rôle putatif dans
l'apparition d'autres maladies humaines (Garrett et Onderdonk, 2014). Cependant,
depuis quelque temps, de nouveaux outils d'identification des communautés
microbiennes ont révélé que lesPrévotellese retrouvent également dans les voies
digestives de l'homme et des animaux, les composts et divers fermenteurs. Il était
soupçonné de jouer un rôle clé dans la décomposition des fibres (Chen et al., 2017)
– l'étape souvent considérée comme un goulot d'étranglement dans la
fermentation des déchets agricoles. En outre,Prévotelleactivité
Fig. 3.Composition de la communauté microbienne des mélanges de fermentation amendés au biochar (au
niveau familial). Les familles qui ont une abondance minimale de 2 % dans l'un des échantillons ont été
sélectionnées et les autres sont regroupées dans « Autre ».
conduit généralement à la libération de propionate (Martinez-Fernandez et
al., 2016), qui est l'un des principaux substrats utilisés par les bactéries
acétogènes qui convertissent ce composé en acétate, CO2, et H2ou formaté
– un précurseur immédiat du méthane. L'apparition de ce mécanisme dans
nos fermenteurs et l'influence considérable dePrévotellesur la
transformation de la matière organique en méthane (non seulement en
favorisant l'hydrolyse mais aussi l'acétogénèse) a été confirmée par la
relation étroite entre son abondance et les abondances attendues révélées
par KEGG de gènes responsables de la synthèse d'enzymes impliquées dans
la génération d'acétate Wood– Voie de Ljungdahl, à savoir la monoxyde de
carbone déshydrogénase [EC 1.2.7.4] (Figure 4).
D'autres bactéries fortement enrichies en présence de biochar étaient
divers représentants deBactéroïdales,avec le plus abondant (jusqu'à 18%)
affilié àBactéroïdacées (Figure 3).Bactéroïdacéessont l'un des composants
essentiels des digesteurs anaérobies et sont connus pour sécréter
différentes enzymes hydrolysantes telles que les cellulases, les amylases, les
protéases et les lipases (D.Wang et al., 2017;S.Wang et al., 2017) jouant ainsi
un rôle clé dans la dépolymérisation de la matière organique en phase
d'acidogénèse. D'autres familles deBacteroidalesqui ont répondu
positivement au biochar étaientPorphyromonacées (Dysgonomonas) (Figure
3). Porphyromonadacéessont capables d'hydrolyse anaérobie de sucres
complexes et simples en acétate et propionate - substrats méthanogènes.
Gardant à l'esprit que dans l'expérience en cours, de la pulpe de betterave
riche en sucre a été ajoutée comme matière première, leur rôle dans
l'acidogénèse semble être important. D'autres bactéries fortement enrichies
en présence de biochar étaient des représentants deClostridiales,à savoir les
familles de Natranaerovirga (35 à 40 fois plus par rapport au témoin sans
biochar, jusqu'à 1,4% des ASV) etClostridiacées (12 fois plus, jusqu'à 3,3% des
ASV). Ces micro-organismes contribuent substantiellement à la dégradation
de la matière organique (cellulose, pectine, etc.) et à l'acétogénèse et se
retrouvent couramment dans les fermenteurs industriels ainsi que dans le
tractus gastro-intestinal de divers animaux (Sikora et al., 2019). Leur
enrichissement doit avoir eu sans ambiguïté un effet positif sur le processus
de formation du méthane.
La partie archéenne de la communauté a également été affectée par l'ajout de
biochar (Figure 5). Le premier effet notable a été une diminution du rapport
méthanogène dans la communauté microbienne totale. Dans le digesteur témoin,
méthanogèneArchéesreprésentaient près de 1 % de la communauté, tandis que
dans les digesteurs complétés par du biochar, seuls 0,34 % à 0,55 % des lectures
étaient affiliées à ce groupe. La diminution de la participation méthanogène dans
la communauté était également visible dans les résultats de qPCR, qui ont montré
quemcrUne abondance de gènes a diminué par rapport à une bactérie normalisée
ADNr 16Scopies. De plus, dérivé de KEGG mcrUne abondance a révélé une
distribution similaire confirmant ainsi les résultats de la qPCR (Figure 6).
Rappelant que les deux techniques fournissent des informations sur
l'abondance relative et que la génération de méthane a augmenté après le biochar
Fig. 4.Abondance relative de Prevotella (barres) et abondances attendues révélées par KEGG de
gènes de monoxyde de carbone déshydrogénase [EC 1.2.7.4] impliqués dans la voie génératrice
d'acétate Wood – Ljungdahl (ligne pointillée).
 A. Pytlak et al. / Science de l'environnement total 730 (2020) 138921
Fig. 5.Abondance relative des méthanogènesArchéesdans des traitements expérimentaux amendés avec
du biochar.
En outre, on peut supposer que les changements dans la structure communautaire ont
été un effet de l'augmentation deBactériescompte plutôt que la disparition du
méthanogène. Le métabolisme bactérien est beaucoup plus efficace en termes de
production d'énergie et de biomasse et donc les temps de génération bactérienne sont
beaucoup plus courts. La communauté méthanogène des digesteurs composée de
Methanobrevibacter, Methanotrix, Methanomassiliicoccuset
Méthanobactériedont tous ont leurs temps de génération mesurés en jours plutôt
qu'en heures. Par rapport à cela, les bactéries anaérobies doublent en quelques
minutes ou quelques heures.
Dans chaque traitement, la communauté était dominée par les
Méthanotrix,qui représentait plus de 50 % des lectures totales de
méthanogène et a été enrichi à près de 70 % dans un bioréacteur avec
1,25 g·dm−3biochar ajouté. Les résultats indiquant l'impact positif du
biochar sur ce genre archéen ont été présentés parLu et al. (2016), qui
a constaté que même si la majorité de la communauté était
hydrogénoclaste, Méthanotrixa été enrichi en présence de biochar (10
g·dm−3). L'expérience menée par Lu et al. était très longue (jusqu'à 100
jours) et après la dominance initiale,Méthanotrixa été remplacé par
Méthanosarcineau stade tardif avec le développement des deux genres
liés aux surfaces de biochar servant hypothétiquement d'habitat pour
ces lignées microbiennes.
Dans l'étude actuelleMéthanosarcineétait en dessous du seuil de
détection, ce qui peut s'expliquer par le fait que le processus de
Figure 6.Abondance relative des méthanogènesArchées (qPCR et analyse KEGG demcrA (sous-
unité alpha de la méthyl-coenzyme M réductase [CE : 2.8.4.1])) etBactéries (qPCR 16S rDNA).
5
la formation de méthane a été achevée dans des délais beaucoup plus courts. La
composition de la communauté microbienne a été capturée le 4ème jour. Le
manque deMéthanosarcinepersiste conformément à Lu et ses collaborateurs (Lu
et al., 2016) observations et indique que la concentration d'acétate dans les
digesteurs était aussi faible queMethanosaetaa été rapporté pour obtenir un
avantage concurrentiel sur d'autres méthanogènes acétoclastes à de faibles
concentrations d'acide (b1 mmol·dm−3).
Malgré la courte durée de l'expérience, la communauté méthanogène a
pu se différencier et le degré des changements semble refléter les capacités
métaboliques duArchéeset leurs longs temps de génération. Fait
intéressant, dans le digesteur complété par un ajout de 1 g·dm−3
de biochar et caractérisé par la libération de méthane la plus élevée, un rapport
accru de H2-dépendants méthanogènes a été trouvé. Les genres qui ont été
enrichis dans les digesteurs stimulés par le biochar étaient des méthanogènes
hydrogénoclastes connus pour leur métabolisme à rendement énergétique plus
élevé par rapport aux méthanogènes cultivés sur d'autres substrats. L'énergie
libre de Gibbs du bicarbonate ou H2-la réduction dépendante du méthanol est
d'environ -135 et -112 kJ mol−1par rapport à seulement
− 36 kJmole−1disponible à partir d'acétate (Buan, 2018). De plus, l'augmentation de
l'abondance (et très probablement la formation de méthane) des
hydrogénoclastesMéthanobactériespeut s'expliquer par le transport direct
d'électrons interspécifiques (DIET). Biochar a déjà été proposé pour servir de plate-
forme conductrice pour les électrons (Lu et al., 2016). L'ALIMENTATION entre les
partenaires syntrophiques joue un rôle important dans les environnements
anaérobies et dans le processus de formation du méthane (Barua et Dhar, 2017).
Ce phénomène pourrait en outre (en plus de la production de propionate)
expliquer comment la production de méthane pourrait être stimulée par des
bactéries hydrolytiques, à savoirPrévotelleetBacteroides.
3.3. L'influence du biochar sur la composition chimique du mélange
fermentatif
Les propriétés physiques et chimiques du mélange digestif ont été surveillées
au cours du processus. Dans l'ensemble, pendant toute l'expérience, le potentiel
redox (Eh) était faible et adéquat pour la production de méthane. Dans la
combinaison de production de gaz la plus efficace, il oscillait autour de
– 265 mV. Les mesures Eh prises au jour 4 de l'expérience, caractérisées par
une activité méthanogène maximale, n'ont pas montré de dépendance
significative au biochar.
Le pH était proche de la neutralité pendant toute l'expérience, bien
qu'une légère diminution au cours du temps ait été observée. La teneur en
biochar s'est avérée légèrement négativement corrélée avec le pH au jour 4,
lorsque l'activité méthanogène la plus élevée s'est produite (Tableau 3). Les
deux effets (liés au temps et au biochar) peuvent être liés à la sécrétion de
métabolites hydrolytiques, acidogènes et acétogènes dans le milieu digestif
décrit en détail parSikora et al. (2019).
L'ajout de biochar n'a pas entraîné de changements spectaculaires dans la
composition des digesteurs anaérobies. Bien qu'au fil du temps, des changements
importants se soient produits concernant le N-NH4, P-PO4et le COT diminue (
Tableau 2) dans tous les traitements expérimentaux, les coefficients de corrélation
de Spearman calculés pour ces paramètres au 4ème jour de l'expérience en
fonction de l'ajout de biochar ont révélé que l'adjuvant n'influençait pas la
composition du mélange (Tableau 3). D'autre part, le biochar a augmenté
l'abondance des CI, ce qui peut être lié à la stimulation de l'activité microbienne (à
la fois archéenne et bactérienne).
Les microéléments, étant un élément inhérent des systèmes enzymatiques des
deuxBactériesetArchées,peut modifier la structure de la communauté
microbienne. La dynamique des éléments traces, en particulier la privation de
métaux essentiels tels que par exemple Co, Mo, Ni, Mn, peut perturber la structure
de la communauté microbienne et, par conséquent, la production de méthane. Les
biochars se caractérisent par une grande capacité de sorption des cations et
peuvent ainsi éliminer une partie des microéléments de la solution, la rendant
indisponible pour le microbiote et conduisant au développement de conditions de
famine. Dans les travaux en cours, la plus prononcée était l'élimination de Co et
Fe, Mn et Na (Tableau 4). Cependant, même dans les échantillons complétés avec
la dose de biochar la plus élevée, le pool restant de l'investigation
6 A. Pytlak et al. / Science de l'environnement total 730 (2020) 138921

Tableau 2
Propriétés physico-chimiques de la phase liquide de variantes expérimentales particulières, valeurs moyennes ± SD, n = 6.

Variantes Dose de biocharbon P-PO4 TN N-NH4en % de Table des matières CI pH Eh (mV)

(g·dm−3) (mg·dm−3) (mg·dm−3) TN (mg·dm−3) (mg·dm−3)

Matériaux de départ
Inoculum 0 6,50 ± 0,04 65,44 ± 1,01 99,93 ± 7,84 81,91 ± 0,49 54,89 ± 0,29 7,45 ± 0,00 − 260,33 ± 0,71
Témoin (inoculum + pulpe) 0 22,01 ± 0,37 74,89 ± 0,14 99,90 ± 0,55 238,8 ± 3,04 28,02 ± 0,2 7,10 ± 0,01 − 222,33 ± 0,47

Jour de production maximale (4 jours)

Témoin (inoculum + pulpe) 0 6,38 ± 1,88 60,03 ± 5,24 99,89 ± 10,58 78,79 ± 17,60 53,07 ± 4,19 6,89 ± 0,11 − 274,30 ± 19,85
Inoculum + pulpe 0,25 7,08 ± 2,27 43,48 ± 14,01 99,57 ± 26,71 53,25 ± 19,61 37,66 ± 11,47 6,80 ± 0,02 − 260,18 ± 19,53
0,5 13,46 ± 0,36 43,27 ± 6,41 99,68 ± 19,98 53,27 ± 22,92 39,18 ± 4,67 6,76 ± 0,02 − 248,02 ± 17,42
0,75 19,38 ± 2,27 42,75 ± 3,17 99,69 ± 19,33 49,56 ± 11,93 38,63 ± 1,27 6,70 ± 0,01 − 268,15 ± 7,12
1.0 5,44 ± 1,47 53,46 ± 0,50 99,73 ± 23,28 74,44 ± 9,19 45,24 ± 0,86 6.800 ± 0.07 − 277,12 ± 5,15
1.25 8,13 ± 1,72 48,45 ± 11,58 99,76 ± 13,42 65,15 ± 15,56 43,64 ± 12,08 6,78 ± 0,01 − 277,90 ± 4,21

Tableau 3 diversifié avec une utilisation microbienne comme source de N jouant un rôle important.
Influence de l'ajout de biochar sur les paramètres physiques et chimiques de la phase aqueuse
Il convient de noter ici que l'ammoniac est une source majeure de N dans les conditions
des digesteurs anaérobies au jour 4 (activité méthanogène max.).
de digestion anaérobie. La diminution du N-NH disponible4dans les traitements amendés
Paramètres Corrélation de Spearman au biochar peut donc être liée à une poussée de croissance bactérienne. Cette hypothèse
coefficients semble confirmée par le fait qu'une diminution parallèle de la P-PO disponible4a été
P-PO4(mg·dm−3) N- 0,214 observé. Le phosphore, en raison de son rôle important dans le cycle de vie cellulaire
NH4(mg·dm−3) N- − 0,309 (formation d'acide nucléique, système de production d'énergie et activation dépendante
NON3(mg·dm−3) CT − 0,272
de la phosphorylation enzymatique) s'avère souvent être un facteur limitant la croissance
(mg·dm−3) − 0,113
qui, avec les changements susmentionnés dans la structure de la communauté
CI (mg·dm−3) − 0,372⁎
COT (mg·dm−3) 0,103 microbienne, semble confirmer l'hypothèse. qu'il a été utilisé par les bactéries.
TN (mg·dm−3) − 0,328⁎ Récemment, le phosphore a également été suggéré comme inhibiteur putatif de la
pH − 0,436⁎⁎ formation de méthane,
Eh (mV) − 0,170⁎⁎⁎
4
cependant, de la même manière que NH+, bon de commande3− 4concentrations retrouvées dans nos digesteurs
⁎Pb0,05. étaient beaucoup trop faibles pour être considérés comme un facteur inhibiteur.
⁎⁎Pb0,01.
Le biochar semble donc stimuler les habitants microbiens également via un
⁎⁎⁎Pb0,001.
autre mécanisme que la sorption physique des substances inhibitrices (Pan et al.,
2019b). Cependant, on sait peu de choses sur la relation entre les propriétés de
était suffisante et comparable aux concentrations trouvées par exemple dans les surface du biochar et les cellules microbiennes. Les études concernant
milieux conçus pour les cultures anaérobies (Khelaifia et al., 2013). l'hydrophobicité bactérienne ou archéenne sont également rares, mais sur la base
Parmi les formes azotées (TN), la dominante était N-NH4(au dessus des données disponibles, on peut supposer que les surfaces cellulaires de
de 99% de TN,Tableau 2). Certains chercheurs ont postulé que l'effet Méthanosarcinales (y comprisMéthanotrix)sont hautement hydrophobes, ce qui
positif de l'ajout de biochar au mélange digestif est dû à la sorption de facilite leur adhésion aux surfaces de biochar. De même, diverses espèces de
NH4+cations (Cuetos et al., 2017). En effet, dans notre travail, N-NH4concen- Prévotelleont été confirmés hydrophobes (Barbosa et al., 2015). Dans les travaux
ration a diminué au cours de l'expérience et la baisse était la plus élevée en cours, nous proposons que le biochar, en plus d'être un conducteur pour la
dans les digesteurs complétés avec du biochar. Cependant, les niveaux médiation du transfert d'électrons interspécifiques, sert d'habitat pour les
d'ammoniac qui conduisent à l'inhibition sont bien plus élevés que ceux bactéries hydrolytiques. Auparavant, il a été suggéré que certains méthanogènes
mesurés dans nos digesteurs. L'inhibition signalée de la production de Archéespoussent préférentiellement sur les surfaces de biochar (Lu et al., 2016).
méthane était liée au NH4concentrations de 1,5–7 g·dm−3, qui dépassent Les mécanismes responsables de la croissance préférentielle desMéthylosarcineet
plusieurs fois nos mesures (Yang et al., 2018). De plus, dans notre Méthanotrixsur les surfaces de biochar n'ont pas encore été élucidées. Nos
expérience, la quantité d'ammoniac éliminée de la solution était d'environ 15 résultats, montrant la prédominance deMéthanotrixdans les traitements amendés
à 32 mg·dm−3. En tenant compte de la capacité de sorption du biochar qui, au biochar persistent conformément aux conclusions deLu et al. (2016). De plus,
selon la littérature, peut atteindre 5,5 mg·g−1(Khalil et al., 2018;Sarkhot et al., nous affirmons que les propriétés de surface du biochar sont responsables de la
2013), NH4mécanisme de suppression doit avoir été colonisation préférentielle par MéthanosarcinalesetPrévotelle.C'est un
phénomène bien connu que l'hydrophobicité de la surface du biochar et la
capacité d'échange cationique (CEC) dépendent des conditions de préparation, la
Tableau 4
température jouant un rôle prédominant (Banik et al., 2018). Le biochar utilisé
Influence de l'ajout de biochar sur la concentration en micro et macronutriments de la phase
aqueuse des digesteurs anaérobies au jour 4 (activité méthanogène max.).
dans la présente étude a été préparé à 650 ° C. Les biochars produits à des
températures modérées (500 à 700 ° C) ont des surfaces dominées par des
Élément Corrélation de Spearman
groupes oxonium et sont donc hydrophobes (Banik et al., 2018). Cette
mg·dm−3 coefficients
caractéristique doit avoir eu une grande importance pour la colonisation
Californie 0,274 microbienne sélective des surfaces de biochar disponibles. Compte tenu de la très
Co − 0,706⁎⁎⁎
grande surface totale du matériau utilisé dans la présente étude (182 m2·g−1),
Cr 0,393
Cu − 0,121 l'impact élevé du biochar sur la structure de la communauté microbienne et, par
Fe − 0,565⁎⁎ conséquent, la stimulation de la fermentation méthanique de la pulpe de
mg 0,510 betterave sucrière ne devrait pas surprendre.
Mn − 0,093⁎
mois − 0,180
N/A − 0,450⁎
Ni − 0,123 4. Conclusions
⁎ Pb0,05.
⁎⁎ Pb0,01. Cette étude a évalué, pour la première fois, si l'ajout de biochar influence
⁎⁎⁎ Pb0,001. la production de biogaz à partir de pulpe de sucre. On peut conclure que
 A. Pytlak et al. / Science de l'environnement total 730 (2020) 138921
l'enrichissement du processus de fermentation du méthane avec du biochar
augmente considérablement l'efficacité et la qualité de la production de biogaz. Le
principal moteur de ce changement a été le remodelage des communautés
microbiennes, en particulier l'enrichissement desBacteroidalesetClostridiales. Il a
été proposé que le biochar, en plus d'être un conducteur assurant le transfert
d'électrons interspécifiques, sert également d'habitat pour les bactéries
hydrolytiques. Il a été élucidé que la principale force motrice de la colonisation
préférentielle des surfaces de biochar est son hydrophobicité. La recherche
présentée indique le grand potentiel du biochar comme moyen d'augmenter la
production de biogaz à partir des déchets agricoles.
Sources de financement
L'article a été financé par les activités statutaires de l'Institut
d'agrophysique, Académie polonaise des sciences, Pologne.
Déclaration de contribution de la paternité du CRediT
Anna Pytlak :Conceptualisation, Enquête, Analyse formelle,
Méthodologie, Rédaction - ébauche originale, Rédaction - révision et
édition. Agnieszka Kasprzycka :Conceptualisation, Enquête,
Conservation des données, Méthodologie, Rédaction - ébauche
originale, Rédaction - révision et édition.Anna Szafranek-Nakonieczna :
Enquête, Curation des données, Méthodologie. JarosławGrzundziel :
Investigation, Analyse formelle, Curation des données, Méthodologie,
Visualisation.Adam Kubaczyński:Enquête.Proc Kinga : Enquête.Paulina
Onopiuk :Enquête.Anna Walkiewicz :Enquête.Cézary Polakowski :
Enquête.Anna Galazka :Ressources.Justyna Lalak-Kańczugowska :
Enquête.Rue Zofiaępniewska :Supervision, Acquisition de financement.
Andrzej Bieganowski : Conceptualisation, Rédaction - révision & édition,
Supervision, Acquisition de financement.
Déclaration d'intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents ou
de relations personnelles connus qui auraient pu sembler influencer le
travail rapporté dans cet article.
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