See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/339446985

Characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented

milk (Jben) in respect of their technological and probiotic properties

Poster · March 2016

CITATIONS READS

0 46

2 authors, including:

Abdelbasset Mechai
Université de Tébessa
20 PUBLICATIONS 133 CITATIONS

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

microbiological caracterization of traditional fermented milk View project

Extended-Spectrum Beta-Lactamase–Producing Enterobacteriaceae View project

All content following this page was uploaded by Abdelbasset Mechai on 24 February 2020.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 Characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented
milk (Jben) in respect of their technological and probiotic properties

MECHAI Abdelbasset01, 02 & KIRANE Djamila02

01 : Université de Tébessa, 12002, mecha.abdelbasset@yahoo.com
02: laboratoire de microbiologie, faculté des sciences, université de Badji-Mokhtar, Annaba 230000
RESUME
Dans le présent travail, une collection de souches lactiques a été établie, elle comprend des souches isolées à partir d’un fromage traditionnel «
Jben ». Les résultats des aptitudes technologiques indiquent que l’ensemble des souches présentent de bonne propriétés fonctionnelles
(acidifiante, protéolytique, texturante, et aromatisante) qui peuvent être exploitées. Les aptitudes probiotiques sont aussi révélées intéressantes.
La recherche de l’antagonisme bactérien dans le milieu solide a été réalisée suivant la méthode de double couche et la diffusion en puits. Les
résultats ont montré que les souches productrices de bactériocines sont fréquemment isolées des produits laitiers. Les bactériocines produites
par les souches sélectionnées notamment (Lactobacillus. curvatus LB65, Lb. brevis LB93, Lb. plantarum JB44) possèdent de larges spectres
d’activité avec un effet bactéricide et sont thermorésistantes et stables dans une large gamme de pH.
la souche Lactobacillus. curvatus LB65, produit une bactériocine dénommée curvaticine LB65. La procédure de purification de la
curvaticine LB65 comporte une filtration du surnageant de culture de la souche productrice, suivie d'une précipitation au sulfate d'ammonium
suivie d’une étape de chromatographie sur résine de QAE sephadex A-25 et une HPLC sur échangeur anionique DEAE. Le poids moléculaire de la
bactériocine a été estimé à 3,2 KDa par l’électrophorèse en SDS-PAGE et la nature protéique de la bactériocine concentrée a été confirmée par la
perte de son activité à la suite d'un traitement aux protéases, elle est également thermorésistant (121°C, 10min) et stable dans une large gamme
de pH. Ces caractéristiques confèrent à la curvaticine LB65 un grand intérêt technologique dans le cas de son utilisation dans la biopréservation
des aliments.
Mots clefs : bactéries lactiques, protéolyse, lipolyse , bactériocines, biopréservation.
MATERIEL ET METHODES
Les souches lactiques utilisées dans le présent travail sont isolées d’un fromage traditionnel « Jben » (Mechai et Kirane, 2009) et ont été criblées pour
leurs activités; acidifiante (l’évolution du pH des différentes cultures en fonction du temps et dosage simultanément l’acidité totale par la soude);
l’activité protéolytique des bactéries lactiques (sur la gélose MRS additionnée de lait écrémé à 10%); La lipolyse (sur gélose aux triglycérides); la
production des exopolysaccharides (réalisée par la technique décrite par Mozzi et al. (2001). La recherche de l’antagonisme bactérien a été réalisée
suivant trois méthodes; la méthode de détection directe (double couche) Barefoot et Klaenhammer (1983), la méthode de détection indirecte (
Méthode de diffusion en puits) Tagg et McGiven (1971) et la méthode de diffusion en gélose (disques) Tagg et McGiven (1971). La nature des agents
anti-microbiens a été étudiée selon la méthode de Shillinger et Lücke (1989).
La procédure de purification de la curvaticine LB65 (fig 01) comporte une filtration du surnageant de culture de la souche productrice, une
précipitation au sulfate d'ammonium suivie d’une dialyse, une étape de chromatographie sur résine de QAE sephadex A-25 et une HPLC sur
échangeur anionique DEAE. Le poids moléculaire de la curvaticine LB65 purifiée a été estimé par l'électrophorèse en SDS-PAGE. Le dosage des
protéines totales après chaque étape de purification a été effectué selon la méthode de Lowry (Lowry et al., 1951).
Sur un total de 167 souches lactiques criblées pour la production d’agents inhibiteurs en employant trois méthodes (la méthode de diffusion en puits et la méthode
de double couches). 68 souches ont montré une activité antagoniste dirigée contre L. monocytogenes ATCC7644. Le nombre de bactéries productrices de
bactériocines isolées des échantillons testés montre que le choix effectué en allant rechercher ce type de bactéries dans ces produits est un choix judicieux.
Parmi l’ensemble des bactéries isolées, 5 souches dénommées, Lb. curvatus LB65, Lb. brevis LB93, Lb. plantarum LB44, Lc. lactis subsp. Lactis RB22, et Lc. lactis
subsp. Lactis JB31, ont particulièrement attirées notre attention puisqu’elles produisent des facteurs antimicrobiens autres que les acides organiques. Les
substances anti-microbiennes produites par les 05 souches bactériennes sélectionnées répondent aux critères retenus par Klaenhammer (1988) et Tagg et al. (1976),
et peuvent donc être considérées comme des bactériocines.
Suivant leur sensibilité aux différents traitements enzymatiques et physicochimiques (tableau 01), les bactériocines étudiées peuvent être classées en deux
catégories :
1. Des complexes protéiques hétérogènes pouvant regrouper des fonctions lipidiques et/ou glucidiques (cas de la bactériocine produite par Lc. lactis subsp. Lactis
JB31).
2. Des substances sensibles uniquement aux protéases testées et donc à structure protéique probablement homogène (cas des bactériocines produites par les 4
autres souches)
Lactobacillus curvatus LB65, souche isolée à partir du ‘Jben’, produit un agent antibactérien de nature protéique et présente un spectre d'action centré sur les
espèces phylogénétiquement proches du microorganisme producteur. Cette étude a ainsi permis de démontrer la substance antibactérienne produite par Lb.
curvatus LB65 présente donc un mode d'action de type bactéricide (figure 02).
Trois étapes de purification ont été effectuées. Le rendement et le facteur de purification obtenus suite à la précipitation au sulfate d'ammonium du surnageant
centrifugé et dialysé sont présentés au tableau 01. l’addition du sulfate d’ammonium jusqu'à une concentration finale de 80%, aboutit à la précipitation de 80% de
l’activité totale de la bactériocine, ce qui a permis de faire passer l'activité spécifique de la bactériocine de 16,39 à 71,11 U.A./mg, en augmentant l’activité spécifique
d’un facteur de 04 fois ce qui justifie l’efficacité de la concentration par cette méthode
Les échantillons lyophilisés et concentrés par une précipitation été dialysés. Les chromatographies
sur résine de QAE sephadex A-25 (fig 03)et par HPLC sur échangeur anionique DEAE (fig 04), sont
les deux méthodes les plus prometteuses en vue d’une éventuelle purification de la bactériocine. Les
étapes de purification réalisées ont permis de faire passer l’activité spécifique de la bactériocine de
16,39 à 4266,66 U.A/mg, avec un rendement final de 0.4%.
La curvaticine LB65 purifiée a été soumise à une séparation par l'électrophorèse SDS-PAGE, dans le
but d’estimer son poids moléculaire. En effet, Le poids moléculaire de la bactériocine a été estimé à
3,2 Kda (fig 05).
La nature protéique de la curvaticine LB65 concentrée a été confirmée par la perte de son activité à la
suite d'un traitement aux protéases, elle est également thermorésistante (121°C, 10 min) et stable
dans une large gamme de pH. (tableau 02).

Culture de Lb. curvatus (bouillon MRS, 18h, 37°C)

Centrifugation à 2700xg (10min, 4°C)

Surnageant
Filtration sur de l’acétate de cellulose (diamètre du pore 0,45µm)
(Fraction FI)
L’ajout du sulfate d’ammonium jusqu’à 50% de saturation en sel
(avec agitation sur un bain de glace à 4°C)
Culot
Figure 03 : Chromatogramme de la purification par
échangeur anionique, sur résine de QAE sephadex A-25
de la curvaticine LB65. L'élution est suivie par lecture de
l'absorbance à 280 nm ( ), mesure de l'activité
inhibitrice par la méthode de la dilution critique en
U.A/ml ( ).

Centrifugation à 10000xg (30min, 4°C)

Surnageant Culot

L’ajout du sulfate d’ammonium jusqu’à 80% de saturation en

sel (avec agitation sur un bain de glace à 4°C) Figure 02 : Comportement de L. monocytogenes ATCC 7644 en présence de l'extrait de
culture de Lb. curvatus LB65 (■) et en absence de l'extrait (▲).
Centrifugation à 15000xg (30min, 4°C)
Tableau 01 : Rendement des étapes de purification de la curvaticine MB65.
Culot Surnageant Rendement
Unité Concentration Protéine Activité
Activité de Facteur de
Volume arbitraire de la protéine totale spécifique
resuspendre le culot dans le Tris HCl 100 mM, pH 8.8 contenant de l’urée 3M échantillon totale (UA) purification purification
(ml) (UA/ml) (mg/ml) (mg) (AU/mg)
(%)
Surnageant de l’extrait
Dialyse de la solution de protéines (18h) contre un tampon Tris HCl 10 mM, pH 8.8 à 4°C cellulaire
500 256 128000 15,62 7810 16,39 100 100
Précipitation par les
sulfates d’ammonium
à 80% dialyse et
100 512 51200 7,20 720 71,11 40 4
Lyophilisation (Fraction F II)
liophilisée
QAE sephadex A-25
QAE
10 1024 10240 1,80 18 568,88 08 35
Chromatographie sur échangeur anionique à pression normale (QAE sephadex A-25)(Fraction F III)
HPLC sur échangeur Figure 04 : Chromatogramme de la purification
anionique DEAE
0,5 1024 512 0,24 0,12 4266,66 0,4 260
par HPLC sur échangeur anionique DEAE de la
Chromatographie HPLC sur échangeur anionique DEAE (Fraction FIV) curvaticine LB65. L'élution est suivie par lecture de
Tableau 02 : Effets des différents traitements sur la curvaticine LB65 (tests effectués avec L. l'absorbance à 220 nm ( ), mesure de l'activité
Figure 01 : Présentation schématique du protocole d’extraction et de purification de la curvaticine LB65. monocytogenes ATCC7644 comme souche indicatrice). inhibitrice par la méthode de la dilution critique en
U.A/ml ( ).
Traitements Zone d’inhibitrice (mm)
RESULTATS ET DESCUSSION pendant 30 min +++ 1 2 3 4 5

Traitements pendant 30 min +++

thermiques pendant 15 min ++ 45 KDa
Dans notre travail, nous avons d’abord isolé des bactéries lactiques à partir d’un fromage fabriqué de façon artisanal (Jben), produit par des ateliers
avoisinants de la région de Tébessa. Ces bactéries une fois isolées ont fait l’objet d’études approfondies pour bien les identifier et les caractériser. pendant 10 min ++
36 KDa
2 +
Les tests d’identification ont permis de cribler 167 souches lactiques à partir de 48 échantillons de (Jben) et appartenant aux genres Lactobacillus, 4 +++
Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus . Certaines espèces appartenant à ces genres sont connues pour leur rôle en industrie laitière,
pH 6 +++ 24 KDa
notamment les espèces ; Lc. lactis subsp. lactis, Sreptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lb. delbrueckrii subsp. lactis et Lb. casei subsp. casei .
8 +++
L’activité acidifiante est l’une des principales fonctions des bactéries lactiques. D’après les résultats, nous remarquons que la totalité des bactéries 10 +
14.2 KDa
lactiques identifiées présentent une production progressive en acide lactique. Cette dernière est accompagnée d’un abaissement du pH du milieu. 12 +/-
Les espèces Ln. lactis, Lc. lactis subsp. lactis et Lc. raffinolactis étaient les plus acidifiantes avec une quantité d’acide lactique moyenne de 6.5 g/l, La protéase -
6.46g/l et 6.42g/l respectivement après 24h d’incubation. Un maximum de 7.2g/l d’acide lactique a été produit par la sous espèces Lc. lactis subsp. La trypsine - 6.5 KDa
Lactis JB31 après 24 h d’incubation. En parallèle, les valeurs de pH atteintes avec ces souches oscillent entre pH4.83 et pH5.17. Une moyenne de 6.27g/l
Enzymes La catalase +++
d’acide lactique est produite par les souches de Lc. lactis subsp. cremoris. La cinétique d’acidification a montré que les souches Lc. Lactis subsp.
diacetylactis, St. salivarius subsp. thermophilus et Ln. mesenteroides subsp. cremoris étaient moins acidifiantes en produisant des quantités variables l‘α-chymotrypsine ++
d’acide lactique dont les moyennes sont de 5.96g/l, 5.52g/l et 5.43g/l respectivement. I‘α-amylase +++
La lipase ++
Les résultats de l’activité protéolytique illustre que parmi les 167souches testées, 20 souches présentent une croissance avec une activité protéolytique
traduite par l’apparition d’un halo clair autour des disques. Il apparaît clairement que l’espèce Lc. lactis ssp. lactis est fortement protéolytique - : pas de zone d’inhibition Figure 05 : le poids moléculaire de la curvaticine LB65 par SDS-
comparativement aux autres espèces avec une moyenne de 14.33mm de diamètre, suivi de Lc. lactis subsp. Diacetylactis et Lc. raffinolactis avec des + : zone d’inhibition entre 6 et 10 mm PAGE. Le marqueur de poids moléculaire (ligne l); la fraction (FI) le
zones d’hydrolyse de 12.30mm. St. salivarius subsp. thermophilus ; Lc. Lactis subsp. cremoris et Ln. lactis ont montré des diamètres de 12.23mm, ++ : zone d’inhibition entre 10 et 15 mm surnageant précipité par les sulfate d’ammonium (ligne 2) ; la
+++ : zone d’inhibition ≥ 15 mm fraction (FII) après passage sur la colonne QAE sephadex A-25 (ligne
11.88mm et 11mm respectivement. Alors que l’espèce Ln. mesenteroides subsp. cremoris est jugée la moins protéolytique avec un diamètre de 10.33mm.
3) ; la fraction (FIII) après passage sur une colonne HPLC échangeuse
Les résultats de l’activité lipolytique des souches lactiques montrent que les bactéries lactiques ne présente pas une activité lipolytique appréciable sauf CONCLUSION anionique DEAE (lignes 4 et 5).
quelques sous-espèces qui sont révélées positives en formant des dépôts autour des disques de croissance. Il s’agit des St. salivarius subsp. thermophilus
codée JB10, JB12, JB14; Lc. lactis subsp. cremoris JB24, Lc. lactis subsp. diacetylactis JB02 et Ln. mesenteroides subsp. cremoris JB30.
Dans le présent travail, une collection de souches lactiques a été établie, elle comprend 167souches isolées à partir 48 échantillons de Jben . Les résultats
de tests des aptitudes technologiques indiquent que les souches sélectionnées présentent un bon pouvoir acidifiant, protéolytique, texturant et
La quantification des EPS produits a porté sur les espèces présentant des résultats positifs sur la gélose hypersaccharosée. Les résultats montrent que
lipolytique L'étude des bactériocines de ces souches dirigées contre des souches pathogènes, pourrait aboutir à leur utilisation comme agents naturels
40/167 des souches étudiées sont capables de se développer sur un milieu hypersaccharosé en formant des colonies à aspect plus ou moins gluant
pour une meilleure conservation des produits alimentaires fermentés. Cette application, en cours avec la nisine, doit être développée par l'apport de
témoignant une production d’un agent épaississant, les exopolysaccharides .Sur milieu MRS, la quantité la plus élevée des EPS produite est de 2.01g/l
nouvelles bactériocines. Une meilleure compréhension de leurs propriétés physiques et chimiques, de leur production et de leur mode d'action est
obtenu avec la plupart des souches de espèce Ln. mesenteroides subsp. cremoris .
nécessaire afin d'optimiser cette utilisation.
View publication stats