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Évaluation de l’impact de nouvelles formulations nettoyantes qui associent

des dérivés de pin et des enzymes sur la réduction du biofilm microbien

Article · December 2016

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Michel Le Hénaff
Bordeaux Sciences Agro
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 É T UD E & É VA LUAT ION

Évaluation de l’impact de nouvelles formulations

nettoyantes qui associent des dérivés de pin et
des enzymes sur la réduction du biofilm microbien

Michel Le Hénaff1, Nicolas Huguet2, Annie Richard1, Marion Vaillant2, Sandrine Papillon1, Anne Le Gallet2
1 – Bordeaux Sciences Agro, Gradignan
2 – Action Pin, Castets
✎✎ Michel Le Hénaff – Bordeaux Sciences Agro – 1, cours du Général de Gaulle – 33170 Gradignan – E.mail : michel.lehenaff@agro-bordeaux.fr

B
eaucoup de microorganismes peuvent adhérer sur
de nombreuses surfaces biotiques comme des cel­
lules de muqueuses, ou abiotiques, les surfaces
d’équipements ou d’instruments à la ferme, à l’usine ou à
l’hôpital, à l’exception notable des matériaux en cuivre qui
présentent des propriétés antimicrobiennes [1]. Sur ces
différents supports, les microbes peuvent s’y multiplier
en mettant en œuvre un processus particulier condui­
sant à la formation de biofilms. Il n’est pas question ici
de faire un inventaire exhaustif de la littérature sur les
biofilms (voir la revue récente publiée dans Hygiènes sur
les biofilms en milieu hospitalier [2]) mais de rappeler les

R ÉSU M É A B STR AC T

Objectif. Dans les milieux de l’agroalimentaire ou médi-
caux, les biofilms microbiens sont à l’origine de nombreuses
contaminations. Ils pourraient notamment être responsables
de 65 % des infections nosocomiales. Ce travail a cherché à
objectiver l’efficacité de deux nouvelles formules nettoyantes
enzymatiques sur la réduction de biofilms bactériens. Maté-
riel et méthodes. Un dispositif « biofilm modèle » a été réa-
lisé en microplaques 96-puits avec trois microorganismes
distincts (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmo-
nella livingstone) afin de mesurer la réduction de la biomasse
constituant les biofilms après incubation avec les formules
nettoyantes. Les paramètres d’incubation avec les biofilms
sont les suivants : (i) concentration (0,5 ou 1,0 % dans l’eau) ;
(ii) temps (5, 15 ou 60 min) ; et (iii) la température (4, 10, 20 ou
40 °C). Résultats. À la différence du détergent désinfectant,
seules les formulations supplémentées avec des enzymes
permettent une réduction significative des biofilms bacté-
riens (jusqu’à 100 % dans certains cas). Les effets « dose »
ou « durée du contact » des formulations sont peu marqués
alors que l’efficacité augmente avec la température d’incu-
bation. Conclusion. Les nouvelles formulations nettoyantes
qui associent des dérivés de pin et des enzymes ont mon-
tré de grandes capacités à réduire du biofilm mature. Aussi,
elles devraient trouver leur place dans de nouveaux plans
de nettoyage/désinfection pour limiter le développement de
biofilms sur les sols et surfaces hautes des industries de
l’agroalimentaire et des établissements médicalisés.
MOTS-CLÉS
Biofilm – Bionettoyage – Contamination – Dérivés de
Pin – Détergent – Enzymes – Établissements médicalisés –
Infections nosocomiales – Nettoyage-Désinfection –
Sols-Surfaces.
Evaluation of the reduction of microbial biofilms
by new cleaning formulations that combine pine
derivatives and enzymes
Purpose. In the food industry and in healthcare, microbial
biofilms can be a source of contamination. In particular, they
may be involved in 65% of healthcare associated infections.
This study evaluated the effectiveness of two new cleaning
formulations with enzymes at reducing bacterial biofilms.
Material and Methods. Biofilm models obtained with three
bacteria, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Sal-
monella livingstone, were prepared on 96-well microtiter
plates. These plates were used to assess biofilm reduction
by the two cleaning formulations with the following incuba-
tion parameters: (i) concentration (0.5 and 1.0% in water), (ii)
contact time (5, 15 and 60 min) and (iii) temperature (4, 10, 20
and 40°C). Results. The two formulations with enzymes sig-
nificantly reduced the bacterial biofilms (up to 100% in some
cases) unlike disinfectant detergents.The concentration and
contact time had only a slight effect but the effectiveness of
the treatment increased with the incubation temperature.
Conclusion. These new cleaning formulations associating
pine derivatives with enzymes proved to be very effective at
reducing mature biofilms.They could, therefore, be included
in new cleaning/disinfecting procedures to reduce biofilm
formation on floors and working surfaces in the food indus-
try and in healthcare facilities.
KEYWORDS
Biofilm – Sanitization – Contamination – Pine Derivatives –
Detergent – Enzymes – Healthcare facilities – Healthcare
Associated Infections – Cleaning-Disinfection – Floors-
working Surfaces.

HYGIÈNES - 2016 - Volume XXIV - n° 6 293

 ÉVALUATION DE L’IMPACT DE NOUVELLES FORMULATIONS NETTOYANTES QUI ASSOCIENT DES DÉRIVÉS DE PIN ET DES ENZYMES SUR LA RÉDUCTION DU BIOFILM MICROBIEN
différentes phases qui caractérisent la mise en place et le
développement du biofilm et de souligner l’importance
de ces structures dans les processus infectieux en milieu
médical comme en milieu industriel.
Les biofilms constituent des communautés de cellules
qui adhèrent aux surfaces, enrobées à l’intérieur d’une
matrice polymérique constituée pour partie de protéines,
d’acides nucléiques, de lipides et d’exopolysaccharides
(EPS) [3]. Le développement du biofilm comporte quatre
étapes principales : (i) l’adhérence des microorganismes
sur le support, réversible dans un premier temps puis
irréversible ; (ii) la croissance de la biomasse en micro­
colonies ; (iii) la maturation sous la forme d’une structure
tridimensionnelle complexe ; (iv) la dispersion au cours
de laquelle des microorganismes sont relargués dans
l’environnement pour coloniser d’autres surfaces et ainsi
pouvoir réamorcer un nouveau cycle (Figure 1) [4,5]. Le
développement du biofilm s’effectue en réponse à des
signaux extracellulaires présents dans l’environnement
ou produits par les cellules elles-mêmes. Celles-ci pos­
sèdent des caractéristiques phénotypiques différentes
de celles des formes planctoniques correspondantes en
termes de croissance, d’expression génique, de produc­
tion protéique ou de communication cellulaire [6]. Pour
les cellules microbiennes, la possibilité de s’intégrer dans
un biofilm constitue un avantage écologique majeur dans
la mesure où il s’agit d’une stratégie d’adaptation à un
environnement devenu hostile. À l’intérieur de la structure
tridimensionnelle, les microorganismes sont en effet pro­
tégés de la dessiccation mais également de l’action des
biocides (acides ; antibiotiques) [7]. Les cellules du biofilm
présentent des résistances aux agents antimicrobiens
beaucoup plus élevées (facteurs 10 à 1 000) que leurs
équivalents planctoniques [8]. Les raisons pour lesquelles
Figure 1 – Réprésentation schématique de (i) l’adhésion bactérienne
sur des surfaces, (ii) le développement et la maturation des biofilms
et (iii) l’impact des états bactériens (planctonique, adhéré ou bio-
film) sur l’efficacité des biocides (d’après [4]).
Bactéries planctoniques
Différence de sensibilité
(jusqu’à un facteur 1.000)
Différence de sensibilité
(jusqu’à un facteur 10)
Adhésion à la surface Biofilm mature
Développement et maturation du biofilm
294
la sensibilité aux biocides est réduite pour les micro­
organismes présents dans les biofilms sont multifacto­
rielles. La matrice extracellulaire empêche la diffusion des
biocides dans le biofilm par simple effet barrière et/ou par
interactions électrostatiques en séquestrant certaines
molécules à la surface de la structure. De même, le méta­
bolisme cellulaire est fortement réduit à l’intérieur du bio­
film en raison de la raréfaction en nutriments et la faible
teneur en oxygène. Dans cet état physiologique proche
de la dormance, les cellules deviennent réfractaires à de
nombreux agents antimicrobiens [9,10]. Par ailleurs, la
croissance du biofilm est corrélée avec l’adaptation phé­
notypique des cellules dont il a été montré qu’elle pouvait
conduire à une augmentation importante de la résistance
aux biocides (pour revue [11]). En particulier, le système
de communication intercellulaire (détection du quorum
ou quorum sensing) présent chez certaines bactéries est
impliqué, au moins partiellement, dans l’induction d’un
phénotype spécifique du biofilm et permet, entre autres,
l’activation de certains gènes qui codent des enzymes
protectrices de stress oxydants (ex. : catalase, superoxide
dismutase) [12]. En effet, la présence d’inhibiteurs du
quorum sensing (ex. : drimendiol) permet d’augmenter
la sensibilité à certains agents biocides [13].
L’objectif des plans de nettoyage/désinfection tant dans
le milieu industriel que dans les environnements médi­
caux est de réduire la présence de microorganismes et
leurs activités à des niveaux acceptables mais également,
de limiter la formation de dépôts biologiques, sources
de nutriments favorables au développement microbien,
sur les différents équipements. Les méthodes de net­
toyage/désinfection requièrent l’utilisation d’acides, de
détergents et de biocides adaptés aux équipements à
traiter et aux revêtements des sols et surfaces des éta­
blissements de santé. Les modes d’action des biocides
les plus couramment utilisés (ex. : peroxydes ; ammo­
niums quaternaires ; aldéhydes…) sont bien connus [14]
et les conditions d’application efficaces (température,
pH, concentration en molécules actives, durée d’ex­
position) sont les résultats d’essais réalisés à partir de
microorganismes planctoniques (normes européennes
– NF EN 1276, 2010 ; NF EN 13697 ; NF EN 13727+A2
[15-17]). Malheureusement, les coefficients de résis­
tance aux biocides calculés pour des bactéries dans les
biofilms peuvent varier jusqu’à un facteur 1 000 par rap­
port aux valeurs obtenues pour ces mêmes organismes
sous leur forme planctonique [11]. Aussi, les modalités
d’un plan de nettoyage/désinfection peuvent se révéler
hautement inefficaces pour se débarrasser de biofilms
de surface. Pire, l’utilisation de concentrations plus éle­
vées en produits antimicrobiens peut conduire à inacti­
ver certaines cellules sensibles mais également à sélec­
tionner d’autres microorganismes qui présentent ou ont
acquis (ex. : mutation ; échange de matériel génétique)
une résistance renforcée aux biocides. Cette approche
conforte l’installation durable de telle ou telle cellule dans
HYGIÈNES - 2016 - Volume XXIV - n° 6
 ÉVALUATION DE L’IMPACT DE NOUVELLES FORMULATIONS NETTOYANTES QUI ASSOCIENT DES DÉRIVÉS DE PIN ET DES ENZYMES SUR LA RÉDUCTION DU BIOFILM MICROBIEN
un environnement traité. Aussi, l’utilisation de solutions
détergentes supplémentées avec des enzymes est une
approche intéressante pour contourner la résistance des
biofilms aux biocides. En synergie avec des molécules
tensioactives, un cocktail enzymatique (protéases ; gluco­
sidases) permet une dégradation suffisamment efficace
de la matrice du biofilm aboutissant à l’élimination de
cellules libérées par simple lavage/rinçage.
Dans ce contexte, trois microorganismes « modèles »
(Escherichia coli, Salmonella livingstone, Staphylococcus
aureus) ont été choisis pour leur capacité à former des
biofilms afin de pouvoir objectiver l’action de nouvelles
formulations nettoyantes enzymatiques sur la réduction
de biofilms bactériens d’environnements médicaux.
Matériel et méthodes
Souches bactériennes, milieux
et conditions de croissance
Les bactéries utilisées au cours de cette étude ont été
les suivantes : Escherichia coli CIP 54.8, Staphylococcus
aureus CIP 20256 et Salmonella livingstone (souche de
terrain). Les bactéries ont été cultivées dans le milieu
liquide TS (Trypticase Soja ; 5 g/l de peptone papaïnique de
soja, 15 g/l de peptone trypsique de caséine, 5 g/l NaCl,
pH = 7,3) ou solide (+ 15 g/l d’agar) à 37 °C pour E. coli et
S. aureus ou à 30 °C pour S. livingstone. Les microorga­
nismes ont été incubés en conditions d’aérobiose (agi­
tation orbitale 150 rpm). La croissance des bactéries a
été suivie au cours du temps par des mesures régulières
d’absorbance à 600 nm (= A600). La pureté des suspen­
sions bactériennes a été vérifiée par des observations
au microscope photonique après coloration de Gram ou
après étalement sur boîte de Petri.
Préparations des solutions nettoyantes
Deux formulations détergentes certifiées Ecolabel euro­
péen™ et une formulation biocide ont été essayées
pour leur capacité à réduire des biofilms bactériens :
[A] = dégraissant alcalin enzymatique ; [B] = détergent
neutre, Détergent tous sols et multisurfaces Enzypin™ ;
et [C] = Détergent/désinfectant dépourvu d’enzymes.
Les formulations [A] et [B] contiennent un cocktail enzy­
matique. À partir de ces trois formulations, des solutions
à 0,5 ou à 1,0 % (v/v) ont été préparées avec de l’eau du
réseau et testées sur les biofilms (100 µl/puits ; voir ci-
dessous) en faisant varier la durée de contact (5, 15 ou 60
min) et la température d’incubation (4, 10, 20 ou 40 °C).
Évacuation de la réduction des biofilms
Les biofilms produits par les différentes bactéries ont
été quantifiés selon la méthode décrite par Stepanovic
et al. [18]. Dans un premier temps, les suspensions bac­
tériennes après 24 heures de croissance ont été ajustées
à une densité équivalente (= A600 ≈ 0,4) puis diluées au
1/100e dans le milieu de culture TS. Les puits d’une micro­
HYGIÈNES - 2016 - Volume XXIV - n° 6
plaque 96-puits à fond plat en polystyrène stérile ont été
remplis avec 100 µl de suspension bactérienne (= A600
≈ 0,004). Chacun des genres bactériens a été essayé en
replica (n = 4). Les microplaques ont été incubées dans
les conditions décrites précédemment (48 heures ; 30
ou 37 °C). Le contenu des microplaques a été ensuite
éliminé par renversement et les puits ont été lavés trois
fois avec de l’eau. Dans un deuxième temps, l’action des
formulations a été testée sur le biofilm produit comme
décrit ci-dessus. Des témoins « négatifs » (= absence
de biofilm) et « positifs » (= présence de biofilm) ont été
réalisés dans des puits qui ne contenaient que du milieu
de culture TS ou ensemencés mais non traités avec les
formulations, respectivement. Dans un troisième temps,
les bactéries constituant le biofilm intact ou résiduel au
fond des puits ont été fixées avec 100 µl/puits de métha­
nol pur à 99,9 %. Après 15 minutes, les puits ont été
vidés et séchés sous un courant d’air chaud. Les micro­
plaques ont été colorées pendant 10 minutes avec 100 µl/
puits d’une solution commerciale de Cristal Violet-C à
2 % (BioMérieux). L’excès de colorant a été éliminé par
un renversement de la microplaque suivi de trois bains
successifs dans de l’eau. Après séchage, le colorant lié
au biofilm bactérien a été solubilisé avec 100 µl d’un
mélange éthanol/eau (70/30). L’absorbance de chaque
puits a été mesurée à 590 nm (A590) en utilisant un lec­
teur de plaque automatisé (Multiskan™ FC Microplate
Photometer ; Thermo Scientific). Les résultats enregis­
trés sous la forme de valeur d’absorbance (A590) ont per­
mis le calcul d’un pourcentage de réduction du biofilm
pour chacune des conditions essayées par rapport aux
biofilms témoins.
Analyse statistique
GraphPad Prism® (logiciel GraphPad, USA) a été utilisé
pour analyser les valeurs d’absorbance (A590) collectées.
L’analyse statistique des résultats a été réalisée en utili­
sant une analyse des variances à un facteur (Anova). Les
moyennes ont été considérées comme significativement
différentes pour des valeurs de p < 0,05 (*), p < 0,01 (**)
ou p < 0,001 (***). Les comparaisons des différents trai­
tements vs témoins ont alors été réalisées à l’aide du test
de comparaison des variances de Dunnett.
Résultats
Obtention des biofilms
L’évaluation de la formation de biofilm sur une surface
modèle constituée par le fond d’une microplaque 96-puits
en polystyrène a confirmé la capacité des trois souches
bactériennes choisies à former des biofilms dans le milieu
de culture TS. Néanmoins, la mesure de l’épaisseur des
biofilms a mis en évidence l’utilisation de souches micro­
biennes faiblement (E. coli), moyennement (S. aureus)
ou fortement (S. livingstone) productrices de biofilm
(Tableau I). En effet, les valeurs d’A590 mesurées étaient
295
 ÉVALUATION DE L’IMPACT DE NOUVELLES FORMULATIONS NETTOYANTES QUI ASSOCIENT DES DÉRIVÉS DE PIN ET DES ENZYMES SUR LA RÉDUCTION DU BIOFILM MICROBIEN

comprises entre [0,100-0,146] et [0,161-0,192] pour E. coli Effets des solutions nettoyantes supplémentées
et S. aureus, respectivement. Les biofilms obtenus avec avec des enzymes sur le décrochage du biofilm
S. livingstone présentaient une valeur moyenne d’A590 de Dans les mêmes conditions que précédemment, les
0,661 ± 0,085 indiquant ainsi que les conditions expéri­ biofilms ont été traités avec les formulations [A] (= un
mentales retenues étaient particulièrement favorables dégraissant alcalin) ou [B] (= un détergent neutre) sup­
pour promouvoir la formation de biofilm par la salmonelle. plémentées avec un cocktail enzymatique. Les résultats
obtenus en testant ces deux produits sur le biofilm de
Effets d’une solution biocide sur le décrochage S. aureus, une souche moyennement productrice, sont
du biofilm présentés dans la Figure 3. On observe une réduction
Après 48 heures de croissance en microplaques, les bio­ importante du nombre de cellules constituant les bio­
films ont été quantifiés sans ou après traitement avec films comprise entre 40 et 90 %. Les effets dose (0,5 vs
le détergent-désinfectant [C] dépourvu d’enzymes. Les 1,0 %) et durée de contact (60, 15 ou 5 minutes) ont été
données enregistrées à partir des biofilms de S. aureus relativement peu marqués contrairement à l’effet tem­
sont consignées dans la Figure 2. Cette formulation pérature. En effet, la réduction de population dans le bio­
détergente/désinfectante aux conditions d’application film mature a atteint approximativement 90 % lorsque
(concentrations : 0,5 ou 1,0 % ; température d’incubation : les cellules ont été traitées avec les formulations [A] ou
20 °C) n’a pas altéré de manière significative les biofilms [B] à 40 °C. Cette efficacité a diminué avec la baisse de
du staphylocoque. Des traitements réalisés à d’autres la température de traitement, surtout pour les courtes
températures (4, 10 ou 40 °C) ou sur des biofilms obtenus durées de contact, jusqu’à 30 à 40 %. Néanmoins, il faut
avec E. coli ou S. livingstone (résultats non montrés) ont noter l’efficacité du produit [B] à la concentration de 1,0 %
révélé que les biofilms n’étaient pas plus affectés sou­ lors des essais réalisés à « basses » (4 et 10 °C) tempé­
lignant l’inefficacité de cette formulation dans la réduc­ ratures. Des réductions de biofilms comprises entre 40
tion du nombre de cellules bactériennes constituant les et 60 % ont été enregistrées.
différents biofilms. De très bons résultats ont également été observés en
testant les formulations dans les mêmes conditions sur la
souche d’E. coli faiblement productrice de biofilm (résul­
tats non montrés). Sur des biofilms peu épais, les pro­
Tableau I – Densité cellulaire des biofilms duits [A] et [B] ont montré des efficacités proches de
correspondant aux trois bactéries testées 100 % lorsqu’ils ont été appliqués à 40 °C, indépendam­
ment de la concentration et de la durée de contact. Pour
A590 les températures de traitement inférieures, les réductions
Bactéries
Moyenne (± SD) du nombre de colibacilles dans le biofilm ont été moins
Escherichia coli 0,116 (0,015) bonnes que celles enregistrées précédemment à 40 °C
Staphylococcus aureus 0,178 (0,009) mais restaient très satisfaisantes, largement supérieures
Salmonella livingstone 0,661 (0,085) à 50 %. Sur la souche fortement productrice de biofilm
S. livingstone, l’efficacité maximale des formulations
testées sur la réduction du biofilm n’a été que d’envi­
Figure 2 – Évaluation des biofilms de S. aureus observés
sans (T, témoins) ou après incubation avec la solution bio- ron 50 % (résultats non montrés). Sur ces biofilms très
cide C à 0,5 ou 1,0 % (C_0,5 ou C_1,0, respectivement) pen- épais, l’impact des paramètres (i) température et (ii) durée
dant 60, 15 ou 5 minutes. Aucune différence statistique n’a du traitement est resté assez marginal sauf à 40 °C. En
été enregistrée entre les traitements et les témoins. effet, on observe à cette température une augmentation
20 °C significative de l’efficacité des deux formulations entre
A 590 les traitements réalisés pendant 5, 15 ou 60 minutes.
0,25
Discussion
0,20
Les biofilms de surface préoccupent les acteurs de l’in­
dustrie agroalimentaire ou du milieu médical dans la
0,15
mesure où ils sont à l’origine de contaminations croisées
0,10 persistantes. En raison de résistances manifestes des
microorganismes inclus dans des biofilms aux biocides
0,05 classiques [11], il apparaît nécessaire de revisiter les pro­
cédures de nettoyage/désinfection afin d’augmenter leur
0,00 efficacité bien entendu, mais également, de limiter leur
T C_0,5 C_1,0 impact environnemental. Une approche qui répond à ces
critères consiste à altérer ou à dissoudre complètement
60' 15' 5'
la matrice d’EPS associée au biofilm à l’aide d’enzymes

296 HYGIÈNES - 2016 - Volume XXIV - n° 6

 ÉVALUATION DE L’IMPACT DE NOUVELLES FORMULATIONS NETTOYANTES QUI ASSOCIENT DES DÉRIVÉS DE PIN ET DES ENZYMES SUR LA RÉDUCTION DU BIOFILM MICROBIEN

afin de permettre l’accès du biocide aux cellules. Dans
cet objectif, nous avons montré que seules les deux for­
mulations nettoyantes supplémentées avec un cocktail
enzymatique permettaient de réduire significativement
le nombre de cellules (viables ou pas) et la matrice extra­
cellulaire qui constituent les biofilms observés pour les
trois souches bactériennes testées. En effet, la méthode
de coloration au cristal violet utilisée ne se limite pas à la
seule quantification du nombre de cellules viables mais
évalue la biomasse totale présente dans le biofilm. Les
bactéries présentant des capacités différentes à produire
modérément (= E. coli), moyennement (= S. aureus) ou
fortement (= S. livingstone) des biofilms, nous avons
enregistré des efficacités différentes. Pour les biofilms
faiblement ou moyennement épais, les taux de réduction
obtenus variaient de 80 à 100 %, des valeurs meilleures
que celles obtenues par Singh et al. [19]. Par d’autres
approches expérimentales que les nôtres, ces auteurs
ont montré la capacité d’un mélange d’enzymes (pro­
téase, amylase et pectinase) produites par la souche
MTCC1323 d’Aspergillus clavatus à réduire les biofilms
de Pseudomonas aeruginosa et Bacillus subtilis, 82 et

Figure 3 – Impact des formulations [A] (= dégraissant alcalin enzymatique) ou [B] (= détergent neutre, détergent tous sols
et multisurfaces Enzypin™) sur la réduction du biofim de S. aureus.

Les cellules ont été traitées pendant 5, 15 ou 60 minutes avec des formulations à 0,5 ou 1,0 % à des températures d’incu-
bation de 4, 10, 20 ou 40 °C. Les épaisseurs des biofilms résiduels ont été comparées à celles de biofilms témoins afin de
calculer les pourcentages de réduction du biofilm. Chaque colonne indique la moyenne ± la déviation standard de 4 expé-
riences indépendantes (n = 4). *, ** ou *** correspondent à des valeurs significativement différentes à p < 0,05, p < 0,01 ou
p < 0,001, respectivement.

Réduction du biofilm (%) 40 °C Réduction du biofilm (%) 20 °C

A_0,5 A_1,0 B_0,5 B_1,0 A_0,5 A_1,0 B_0,5 B_1,0

0 0

-20 -20

-40 -40

-60 -60 ** *
*** ** ** ** **
***
*** *** * ***
*** ***
*** ***
-80 -80
***
**
*** ***
*** ***
-100 *** -100

60' 15' 5' 60' 15' 5'

Réduction du biofilm (%) 10 °C Réduction du biofilm (%) 4 °C

A_0,5 A_1,0 B_0,5 B_1,0 A_0,5 A_1,0 B_0,5 B_1,0

0 0

-20 -20
**
**
-40 -40 **
* *
** * * *
-60 *** -60
** *
** *** ** * ***
*** ** *** **
-80 *** -80 * ***

-100 -100

60' 15' 5' 60' 15' 5'

HYGIÈNES - 2016 - Volume XXIV - n° 6 297

 ÉVALUATION DE L’IMPACT DE NOUVELLES FORMULATIONS NETTOYANTES QUI ASSOCIENT DES DÉRIVÉS DE PIN ET DES ENZYMES SUR LA RÉDUCTION DU BIOFILM MICROBIEN
75 %, respectivement, après une incubation d’une heure
à 27 °C. La meilleure efficacité des formulations testées
aux cours de ce travail provient très probablement de la
synergie détergents/enzymes mise en avant précédem­
ment par Parkar et al. [20] pour débarrasser des sur­
faces en acier inoxydable de biofilms formés par Bacillus
flavothermus. Alors que des formulations nettoyantes à
base de détergents uniquement ne sont pas en mesure
d’éliminer le biofilm, ces mêmes formulations supplé­
mentées avec des enzymes permettent de dissoudre
la matrice biofilm et ainsi concourent à l’élimination des
microorganismes [21]). Les effets « dose » (0,5 vs 1,0 %)
ainsi que « durée de contact » ont été assez peu mar­
qués contrairement à l’effet température. Un traitement
à 40 °C avec les formulations A ou B a permis, dans nos
conditions expérimentales, d’atteindre une réduction du
biofilm d’E. coli proche de 100 %. Dans le cas du biofilm
produit par S. livingstone, l’épaisseur de la structure est
très probablement la raison principale pour laquelle les
formulations dopées avec le cocktail enzymatique n’ont
pas montré les mêmes efficacités avec un taux de réduc­
tion maximal de 50 %. L’insertion de ce microorganisme
dans de futurs tests nécessitera une meilleure maîtrise
de la formation de biofilms afin que ceux-ci présentent
une épaisseur plus raisonnable, et probablement plus
représentative, de celles des biofilms susceptibles de
se former sur des équipements et surfaces industriels
ou médicaux entretenus régulièrement.
Différentes enzymes ont déjà été testées sur la réduction
du biofilm de différents microorganismes [22]. En particu­
lier, il a été montré que dans certains cas, les amylases
sont bien moins efficaces que des enzymes protéoly­
tiques pour assurer la dégradation de l’EPS produit par le
biofilm [23]. Aussi, il semble avoir été judicieux d’ajouter
un mélange de différentes enzymes dans les nouvelles
formulations proposées afin qu’elles puissent dégrader
un panel de différents biofilms le plus large possible en
raison de la grande hétérogénéité des EPS.
Les biofilms rencontrés en agroalimentaire ou en milieu
médical se développent rarement sur un plastique ana­
logue à celui d’une plaque 96-puits mais plus communé­
ment à la surface de matériaux en acier, en inox, en caout­
chouc… ou de plastiques spécifiques pour des usages
alimentaires ou médicaux. Il est rare également que les
processus de nettoyage/désinfection n’incluent pas des
étapes de traitements physiques, pendant ou après la
mise en contact du matériel traité avec le produit (ex. :
alternance de pression/dépression d’eau de rinçage ;
brossage manuel ou mécanique ; utilisation d’ultrasons…
[24,25]). Il sera intéressant de réévaluer l’efficacité des
formulations nettoyantes/désinfectantes supplémentées
avec les enzymes sur des biofilms « naturels » position­
nés sur des matériaux plus conventionnels et en y asso­
ciant des traitements physiques.
298
Conclusion
Au cours de travail, nous avons montré l’efficacité des
nouvelles formulations nettoyantes proposées, qui asso­
cient dérivés de pin et enzymes, pour réduire efficace­
ment les biofilms bactériens. Dans la mesure où ces for­
mulations sont (i) peu impactantes sur l’environnement,
elles sont en effet certifiées Ecolabel Européen™, (ii)
simples à préparer et (iii) facilement éliminées par des
rinçages à l’eau claire, elles devraient trouver leur place
dans les plans de nettoyage/désinfection des équipe­
ments et surfaces des milieux alimentaires ou médicaux.
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et des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine de
l’agroalimentaire, dans l’industrie, dans les domaines domestiques et
en collectivité. Méthode d’essai et prescriptions (phase 2, étape 1).
16- Norme européenne ; NF EN 13697. (Juin 2015). Antiseptiques
et désinfectants chimiques : Essai quantitatif de surface non
poreuse pour l’évaluation de l’activité bactéricide et/ou fongicide
des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine de l’agro-
alimentaire, dans l’industrie, dans les domaines domestiques et en
collectivité – Méthode d’essai sans action mécanique et prescriptions
(phase 2/étape 2).
17- Norme européenne ; NF EN 13727+A2. (Décembre 2015).
HYGIÈNES - 2016 - Volume XXIV - n° 6
 ÉVALUATION DE L’IMPACT DE NOUVELLES FORMULATIONS NETTOYANTES QUI ASSOCIENT DES DÉRIVÉS DE PIN ET DES ENZYMES SUR LA RÉDUCTION DU BIOFILM MICROBIEN
Antiseptiques et désinfectants chimiques : Essai quantitatif de
suspension pour l’évaluation de l’activité bactéricide en médecine –
Méthode d’essai et prescriptions (phase 2, étape 1).
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Conflit d’intérêts : Anne Le Galet est directrice marke­
ting de la société Action Pin
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