CMbiochana IV Et V - 2023-2024

La biochimie, une approche moléculaire du vivant
Techniques de biochimie analytique

pour la production et l’analyse de protéines recombinantes
appliquées à l’hormone de croissance

Introduction
L’hormone de croissance ou somatropine
Structure avec résolution = 2.5 Å,

Obtenue par cristallographie aux rayons X
https://www.rcsb.org/structure/1HGU
Protéine : 191 résidus d’acides aminés (4 hélices α et 2 pontsdisulfure)

22 kDa
pI = 5.4
La biochimie, une approche moléculaire du vivantLa biochimie, une approche moléculaire du vivant
Introduction
Rôle physiologique de l’hormone de croissance
Site Inserm (2018)

Introduction
Le déficit en hormone de croissance à l’origine de troubles de croissance
Site Inserm (2018)

Introduction
Traitement par des hormones de croissance naturelles
Introduction
Production d’hormones de croissance recombinantes
Production d’hormones de croissance recombinante dès 1981 par la

société GENTECH grâce au clonage de son gène
Introduction
Production et purification de la protéine hGH
tag
Expression de la protéine
Transformation recombinante
Construction du plasmide Multiplication cellulaire

Escherichia coli Production hGH recombinante
d’expression
Lyse
bactérienne
Purification Dépôt sur colonne
Protéine pure Chromatographie Contenu cytoplasmique libéré

1- Purification de biomolécules
• But : extraction et isolement d’une molécule, la plus pure possible, pour son
étude ou utilisation ultérieure.
• Extraits biologiques : ensembles complexes (des dizaines de milliers de

biomolécules différentes, proportions extrêmement variables, allant de 109 à
1023 exemplaires).
• La purification d’une biomolécule s’effectue toujours en 3 phases :
1. Préparation d’un extrait brut

2. Purification > séparation de la biomolécule d’intérêt des autres
> biomolécule pure
3. Analyse et caractérisation
Qu’est ce qu’une biomolécule?

Protéine, oses, lipides, acides nucléiques, hétéromolécules
(glycoprotéines, lipoprotéines,
glycolipide….)
Sur un plan qualitatif, les biomolécules présentent des

propriétés physico-chimiques et biologiques différentes :
Solubilité
Polarité (hydrophobicité/hydrophilie)
Charge électrique
Taille
Capacité à lier un ligand
A- Etape 1 : Préparation extrait brut
Les biomolécules sont généralement obtenues :
Protéines Protéines
• à partir d’un liquide physiologique (sérum, sécrétées membranaires
lait, …) pour les protéines sécrétées ;
• après lyse des cellules pour les protéines
intracellulaires et membranaires.
Pour lyser les cellules, les membranes biologiques sont
habituellement déstructurées grâce à des techniques :
• mécanique (broyage) Protéines
• physique (par sonication avec des ultrasons ou par cytoplasmiques
application de pression élevée)

• physico-chimique (détergents)
Cas particulier des protéines membranaires, nécessité de les solubiliser avec un détergent
pour éviter la perte de la structure 3D et empêcher l’agrégation.
La présence de détergent doit être maintenue pendant toutes les étapes de la purification.
A- Etape 1 : Préparation extrait brut de l’hGH
Tampon de lyse : 50 mM TrisHCl pH 8, NaCL 0,5 M, inhibiteur de protéase

Sonication dans la glace 10 à 15 cycles de 15s (45s d’attente)
Centrifugation 30 min 9000 rpm > on se débarrasse des débris (membranes
bactérienne et agrégats)
Après solubilisation, on obtient un extrait brut.

B- La chromatographie
Propriétés utilisées pour la

Type de chromatographie
séparation
Chromatographie en phase directe
Hydrophobicité ou hydrophilicité
ou inverse
Taille Chromatographie d'exclusion de taille
Charges Chromatographie d'échange d'ion
Affinité spécifique Chromatographie d'affinité
Chromatographie
sur couche mince Chromatographie
CCM en phase liquide
Chromatographie
en phase gazeuse
a- CCM
La migration se fait en fonction de la différence dans la capacité de la biomolécule à interagir
avec le solvant et la phase stationnaire.
Plus elle interagit avec le solvant plus elle va migrer haut
D Front de migration
Papier du solvant
d1
Phase stationnaire Séparation
d2
d3
d4
Dépôt Dépôt
Solvant Solvant
Phase mobile Phase mobile
Pour chaque molécule, on va calculer un rapport frontal

distance migration molécule (d)
Rf =
distance de migration du solvant (D)
b- Chromatographie liquide Chromatogramme
Enregistreur
b- Chromatographie liquide
Enregistreur Chromatogramme
Absorbance
Temps
Un chromatogramme est la représentation graphique de la réponse du détecteur en fonction du temps ou

du volume de phase mobile
La phase mobile qui traverse la colonne entraîne (élue) les molécules (solutés) de l’échantillon qui ont été
introduites en tête de colonne
En sortie de colonne la phase mobile traverse un détecteur qui mesure un paramètre physique (Absorbance
par exemple) proportionnel à la concentration des solutés contenus dans la phase mobile
Fractions d’élution : En sortie de colonne la phase mobile est collectée par unité de temps ou de volume
dans des tubes.
La chromatographie sur couche mince et la chromatographie en phase gazeuse ne sont pas utilisées pour la
purification et l’analyse des protéines mais pour des petites molécules (MW < 2000 Da).
La chromatographie sur couche mince sera évoquée en TD et en TP (sucres du lait)

MDV 2
Chromatographie
La biochimie, une approche moléculaire du vivant d’affinité
b- étape 2 : chromatographie d’affinité
Met à profit l’affinité de la molécule à purifier pour un ligand, fixé sur la phase stationnaire :
• Enzyme / cofacteur
• Antigène / anticorps
• Glycoprotéine / lectine
• Récepteur /hormone
• Etiquettes
Il faut fixer de façon

covalente le ligand sur
la phase stationnaire,
par l’intermédiaire d’un
groupe chimique réactif.
L’élution (le « décrochage ») se fait grâce à un excès de ligand, une
variation de pH ou de la force ionique de la phase mobile.
MDV 2
Chromatographie
La fixation du ligand sur la résine

se fait via un bras chimique
appelé espaceur.
La molécule qui a de l’affinité

pour le ligand se fixe alors que les
autres molécules du mélange
traversent la colonne.
MDV 2
Chromatographie
CHARGE : l’extrait brut, filtré, est déposé sur la colonne.

MDV 2
Chromatographie
LAVAGE : passage de tampon pour entrainer les molécules non fixées.

MDV 2
Chromatographie
LAVAGE : passage de tampon pour entrainer les molécules non fixées.

MDV 2
Chromatographie
ELUTION : un excès de ligand libre entraine l’élution de la protéine.
ligand libre
MDV 2
Chromatographie
ELUTION : un excès de ligand libre entraine l’élution de la protéine.
ligand libre
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme
Concentration en ligand libre

Dépôt échantillon
Absorbance 280 nm
Flux de tampon
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme

Lavage avec tampon
Absorbance 280 nm
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme

F
L Lavage avec tampon
U
X
D
E
Absorbance 280 nm
T
A
M
P
O
N
Tampon avec
ligand libre
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme

Lavage avec tampon
Absorbance 280 nm
Tampon avec
ligand libre
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme

Lavage avec tampon
Absorbance 280 nm Tampon avec

ligand libre
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
La biochimie, une approche moléculaire du vivantLa biochimie,d’affinité
une approche moléculaire du vivant
https://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y
b- étape 2 : chromatographie d’affinité IMAC
IMAC= Immobilized metal-affinity chromatography

affinité avec des ions métalliques immobilisés (ici
Ni2+)
Étiquette (his)6
hGH -his-his-his-his-his-his
Ligand libre
NTA (acide nitrilotriacetique)
chélatant des ions métalliques Ni2+

MDV 2
Chromatographie
La biochimie, une approche moléculaire du vivant échangeuse d’ions
c- étape 3 : chromatographie échangeuse d’ions
Met à profit l’interaction ionique entre la molécule à purifier et une molécule de

charge opposée, fixée sur la phase stationnaire :
Résines échangeuse d’anions - Résines échangeuse de cations +
+ -
+ + - -
+ - -
+
+ - -
+
+ -
L’élution se fait grâce à une variation de pH et/ou de la force ionique de la phase

mobile.
MDV 2
Chromatographie
La biochimie, une approche moléculaire du vivant échangeuse d’ions
c- étape 3 : chromatographie échangeuse d’ions
Met à profit l’interaction ionique entre la molécule à purifier et une molécule de

charge opposée, fixée sur la phase stationnaire :
Résines échangeuse d’anions - Résines échangeuse de cations +
+ -
+ + - -
+ + - -
+ + - -
+ -
Résine SP Sepharose Fast Flow
Résine Q / DEAE
-CH2-CH2-CH2SO32-
MDV 2
Chromatographie
La biochimie, une approche moléculaire du vivant échangeuse d’anions
c- étape 3 : chromatographie échangeuse d’anions
LAVAGE : passage de tampon pour entrainer les molécules non fixées car
chargées + ou neutres.
- -
+ +
+ + + +
+ + + +
+ + + + +
+ + +
+
+
+
-
MDV 2
Chromatographie
LAVAGE : passage de tampon pour entrainer les molécules non fixées car
chargées + ou neutres.
- -
+ +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ +
-
Sur une colonne échangeuse d’anions, les molécules anioniques,

chargées –, sont retenues sur la résine chargée +.
MDV 2
Chromatographie
ELUTION : une augmentation de la force ionique entraîne l’élution de la protéine.
+ +
+ + + +
+ + + +
+ + + + -
+ +
- -
MDV 2
Chromatographie
La biochimie, une approche moléculaire du vivant échangeuse de cations
chromatogramme
Concentration en sels
Lavage avec tampon
Absorbance 280 nm
Tampon
de salinité
croissante
+ + + Volume élution
+
+ - - - -
+ +
+ + + -- - - -
-
Interaction ionique entre
Résine chargée + (mono Q)
et protéine chargée -
+
-
hGH -(his)6
à pH 7,4, protéine chargée – Interaction ionique diminue

car pI=5,14 quand la concentration saline
du milieu augmente
MDV 2
Chromatographie
La biochimie, une approche moléculaire du vivant d’exclusion-diffusion
d- étape 4 : chromatographie d’exclusion de taille
La dernière étape de purification peut être une

étape de chromatographie d’exclusion de taille (ou
exclusion diffusion) :
Séparation des molécules en fonction de leur
taille et donc en fonction de leur masse
moléculaire.
50 µm
La filtration s’effectue sur gel de dextrane

(polymère d’oses) de haut poids moléculaire
(Sephadex, Sepharose…) :
après traitement chimique, ces macromolécules
forment des réseaux poreux à 3 dimensions.
MDV 2
Chromatographie
chromatographie d’exclusion diffusion

=
chromatographie de gel filtration
=
chromatographie de perméation sur gel
MDV 2
Chromatographie
X
Les substances dont la masse moléculaire (donc la taille) dépasse le diamètre des
pores (« limite du gel ») sont exclues du réseau :
 elles n’ont accès qu’au volume de solvant extérieur aux billes du gel et sont
éluées les premières de la colonne.
MDV 2
Chromatographie
Les molécules de taille plus petite pénètrent aussi dans le réseau 3D des billes de Sephadex :
 elles ont accès à un plus grand volume dans la colonne et nécessitent
un volume d’élution plus important.
MDV 2
Chromatographie
Flux de tampon
MDV 2
Biomolécules 2 Chromatographie
Chromatographie
d’exclusion-diffusion
chromatogramme
Flux de
tampon
Absorbance 280 nm
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme
Flux de
tampon
Absorbance 280 nm
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme
Flux de
tampon
Absorbance 280 nm
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
chromatogramme
Flux de
tampon
Absorbance 280 nm
Volume élution
MDV 2
Chromatographie
Vt = Σ volume des billes + volume extérieur aux billes
Vt = volume d’élution d’une molécule de très faible
masse molaire (100 Da)
𝐷 2
Vt = 𝐻 × 𝜋 ×
2
V0 = volume d’élution d’une molécule exclue

H
D = volume extérieur aux billes
V0 = Vt – volume des billes
Ve= volume d’élution d’une molécule X = V0 + KAVVi

= V0 + volume des billes traversées
Ve - V0
+ Ve tendra vers Vt
Kav = + Kav tendra vers 1
Vt - V0
+ la molécule est petite
Kav = constante de volume accessible
+ le volume des billes traversées augmente
MDV 2
Chromatographie
Kav = constante de
estimer la MM d’une protéine inconnue
volume accessible
(fraction des billes accessible aux molécules)
Kav 1
Mélange injecté (témoins)
NOM kDa aprotinine
ribonucléase
Aprotinine 6,5 anhydrase carbonique
0,5
Ribonucléase 13,7 ovalbumine
Anhydrase carbonique 29
conalbumine
Ovalbumine 43
Conalbumine 75
Chlorure de cobalt 0,238
0
• MM connue 2 3 4 5 6 logMM
• Kav calculée
Bleu dextran 2000 2000
MDV 2
Chromatographie
https://www.youtube.com/watch?v=E3z1wIImvHI
https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ
Résine de particules de
dextran et sepharose
réticulé (taille = 8,6 µm
(Superdex)
-
hGH -(his)6
La protéine de petite taille est

Protéine de MM= 22 kDa éluée de la colonne après ajout
d’un grand volume d’éluant
2- Caractérisation de biomolécules
Chromatogramme
Flux de
tampon
Absorbance 280 nm
Fractions d’élution
Dans quelle fraction d’élution se trouve la hGH ? Est-elle pure ?

Electrophorèse en conditions dénaturantes : SDS PAGE
Western blot
Dosage spectroscopique
MDV 2
La biochimie, une approche moléculaireTechniques
du vivant électrophorétiques
A- SDS PAGE
Après une étape dénaturation, la pureté de la

protéine est évaluée par SDS PAGE.
Gel d’électrophorèse coloré

au bleu de Coomassie
SDS-PAGE : Sodium DodecylSulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium
MDV 2
La biochimie, une approche moléculaireTechniques
du vivant électrophorétiques
A- SDS PAGE
• Un mélange de molécules est soumis à un champ électrique entrainant la migration des

molécules chargées.
• En fonction de différents paramètres physico-chimiques des molécules et du support

d’électrophorèse, la vitesse de migration des molécules va être variable permettant leur
séparation.
• Le support de migration peut être un gel d’agarose (acides nucléiques), de polyacrylamide

(protéines) ou une simple feuille de papier (acides aminés, peptides).
• Le support permet de faire circuler les molécules de tampon entre les compartiments de
l’anode et de la cathode (la cellulose du papier est traitée pour être moins sensible à l’action
de l’eau des tampons).
MDV 2
Electrophorèse PAGE
A- SDS PAGE
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
L’acrylamide est une petite molécule
Acrylamide
A- SDS PAGE
L’acrylamide est une petite molécule qui peut former un polymère qui sera réticulé en
présence de méthylène bisacrylamide.
Acrylamide
Méthylène bisacrylamide
A- SDS PAGE
L’acrylamide est une petite molécule qui peut former un polymère réticulé en présence de
méthylène bisacrylamide et de 2 catalyseurs (TEMED et APS)
acrylamide
méthylène
bisacrylamide
Polyacrylamide (Gel)
APS : Ammonium persulfate ou Persulfate d’ammonium
TEMED : Tétraméthyléthylènediamine
A- SDS PAGE
Systèmes de migration utilisés au TP4

A- SDS PAGE
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
Le gel d’acrylamide
est coulé entre
Composition du gel : 2 plaques de verre
Acrylamide/bisacrylamide où il va polymériser
Tampon Tris pH6,8 ou 8,8
SDS
Persulfate d’ammonium
TEMED
A- SDS PAGE
« peigne à 10 dents »
Gel de concentration
pH 6,8
Espaceurs
Gel de résolution
pH 8,8 Plaques de verre
A- SDS PAGE
échantillon protéique
dans un milieu dense
(exemple : glycérol)
+
MDV 2
Electrophorèse
La biochimie, une approche moléculaire du vivant SDS - PAGE
A- SDS PAGE
+
A- SDS PAGE
Matériel pour une électrophorèse sur gel

A- SDS PAGE
Préparation des échantillons protéiques
Les protéines sont incubées en présence de :

- détergent anionique (SDS : sodium dodécyl sulfate)
Partie chargée négativement
O
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-S-O- + Na
O
Partie hydrophobe
- agent réducteur (b mercaptoéthanol) : rompt les ponts disulfure

CH2-SH
b mercaptoéthanol |
CH2-OH
- tampon de haute densité (glycérol) / colorant bleu

- 5 minutes à 100°C.
A- SDS PAGE
Protéines et SDS
Les protéines sont alors « nappées », recouvertes de SDS (dénaturation) et elles ont un
masse
rapport constant.
charge négative
protéine
SDS
Partie chargée négativement
O
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-S-O- + Na
O
Partie hydrophobe
A- SDS PAGE
masse
Avec SDS  dénaturation et rapport constant
charge négative
-
30 kDa
30 kDa
30 kda -
30 kDa
+
A- SDS PAGE
Coloration du gel
- Bleu de Coomassie
Limite de détection: 0,1 μg
Bain colorant
- Nitrate d’argent
Limite de détection: 10 ng
A- SDS PAGE
Coloration du gel
- Bleu de Coomassie
Bain colorant
A- SDS PAGE
Décoloration du gel et apparition des protéines
- Bleu de Coomassie
Estimation de la masse moléculaire des protéines : précision 5-10%

A- SDS PAGE
Exemple de gel SDS-PAGE
électrophorèse SDS-PAGE
-
30 kda -
+
Marqueurs
(masses connues)
T : Total S : Soluble P : Pellet, culot insoluble

A- SDS PAGE
PAGE SDS-PAGE
Sans SDS  Avec SDS 
Protéines structures masse
Rapport constant
tertiaires/quaternaires natives charge négative
-
-
30 kDa 30 kDa
30 kDa 30 kDa
30 kda -
30 kDa 30 kDa
+
+
A- SDS PAGE
https://www.youtube.com/watch?v=toPpdoBYPWo
Western blot
B – Western Blot
Le western blot permet de

répondre à 2 questions :
- La protéine d’intérêt est-elle
dans l’échantillon ?
- Quantification
B – Western Blot
Source biologique human

expressed in HEK 293
Recombinant
cells
Essai/Dosage ≥95% (SDS-PAGE)
Forme lyophilized
22 kDa (monomer, non-
Poids mol.
glycosylated)
Conditionnement pkg of 10 μg
Prix 350 €
Utilisation culture cellulaire
Expédié(e)(s) dans neige carbonique
Température de conservation −70°C
Western blot
Licence 1 Sciences de la Vie
C – Dosage spectroscopique
Spectrophotométrie – Loi de Beer Lambert
Solution absorbante de
concentration C (mol.L-1)
Intensité de lumière incidente à une Intensité de lumière transmise à
longueur d’onde donnée cette longueur d’onde
I0 I avec I < I0
A= 0.431
détecteur
Monochromateur l
Trajet optique
(1cm)
La fraction de la lumière incidente absorbée par une solution à une l donnée dépend :
1- de l’épaisseur de solution que la lumière doit traverser (trajet optique)
2- de la concentration de la solution en espèces absorbantes
I = I0 . 10 –
exlxC
D.O.= A = e x l x C
• D.O. : densité optique ou A : Absorbance (sans unité) ;
• e : coefficient d’absorption molaire (ou coefficient d’extinction molaire)
caractéristique du composé pour une longueur d’onde l donnée (unité :
L.mol-1.cm-1 ou M-1.cm-1) ;
• l : trajet optique, distance parcourue par la lumière dans la solution
absorbante, qui correspond à la largeur de la cuve de mesure (unité : cm, en
général, l = 1 cm) ;
• C : concentration molaire de la substance absorbante (unité : mol.L-1 ou M)
Absorbance
D.O.= A = e x l x C 3
si trajet optique l = cste
2
La loi de Beer-Lambert est-elle toujours valable
quelle que soit la valeur d’absorbance ? 1 e
Il y a des limitations réelles à la loi de Beer-Lambert : 0

[soluté absorbant]
 la loi de Beer-Lambert ne décrit correctement les propriétés d’absorption
que pour des solutions DILUEES.
Aux concentrations supérieures à 10 mmol.L-1, la distance moyenne entre molécules

absorbantes est suffisamment faible pour que chaque molécule puisse perturber la
distribution des charges de ses voisines, pouvant ainsi modifier significativement la
capacité d’absorption (e) à la longueur d’onde utilisée.
 Le photomultiplicateur du spectrophotomètre peut également avoir des

difficultés à détecter un nombre faible de photons.
C – Dosage spectroscopique https://www3.nd.edu/~aseria
nn/CHAP9B.html/sld013.htm
• L’hormone de croissance contient des résidus d’acides aminés
aromatiques qui absorbent à 280 nm
Coefficient d’absorption molaire

de l’hormone de croissance humaine à 280nm:
εhGH(280 nm)= 17 500 m-1.cm-1
• Mesure de Abs(280 nm) au spectrophotomètre (solution assez diluée)
• Calcul de la concentration à partir de la loi de Beer Lambert:

𝐴𝑏𝑠(280 𝑛𝑚)
[hGH]=
εℎ𝐺𝐻(280 𝑛𝑚) Pour échantillon purifié: 𝐴𝑏𝑠(280 𝑛𝑚)= 0,032
Concentration molaire : [hGH]=1,8 µM
 Concentration massique = [hGH]* MMhGH = 0,040 g/L
D – Bilan de la purification
Lysat cellulaire
Centrifugation
tag
Expression de la protéine
Transformation recombinante
Débris Surnageant
cellulaires
Chromatographie d’affinité
Construction du plasmide Multiplication cellulaire
Escherichia coli
d’expression Production hGH recombinante
Autres fractions Fractions
Lyse
bactérienne = Contaminants contenant la hGH
Chromatographie
Dépôt sur colonne échangeuses d’anions
Purification

contenant la hGH
Protéine pure Chromatographie Contenu cytoplasmique libéré = Contaminants
Chromatographie d’exclusion

= Contaminants contenant la hGH
Lysat cellulaire
Centrifugation Objectif : Obtenir une protéine la plus pure et
active avec un rendement le plus élevé possible
Débris Surnageant
cellulaires
Fractions Rendement Facteur d’enrichissement

Autres fractions
contenant la hGH (de purification)
= Contaminants
Chromatographie
échangeuses d’anions


Lysat cellulaire Quantité de hGH en fin de purification

Rendement de purification = X 100
Centrifugation
Quantité de hGH dans le lysat cellulaire
Débris Surnageant
cellulaires
La quantité de protéine d’intérêt est très souvent déterminée
Chromatographie d’affinité grâce à son activité biologique ou par l’utilisation d’anticorps car
elle est mélangée à d’autres protéines
Autres fractions Fractions elle n’a pas de caractéristique physico-chimique la
= Contaminants contenant la hGH différenciant des autres protéines
Chromatographie


Lysat cellulaire Proportion de hGH en fin de purification

Degré d’enrichissement =
Centrifugation
Proportion de hGH dans le lysat cellulaire
Débris Surnageant
cellulaires
Quantité de hGH
Fractions Proportion de hGH =
Autres fractions Quantité de protéines totales
Chromatographie
Plus on purifie et plus la proportion de protéine d’intérêt
contenant la hGH
augmente. C’est ce que mesure le degré d’enrichissement.
= Contaminants

Volume Concentration en Quantité de Activité hGH Quantité de Rendement Taux
Etape (ml) protéines (mg/ml) protéines (mg) (U/mL) hGH (U) % d'enrichissement
Lysat cellulaire Lysat cellulaire (extrait brut) 100 5 500 10 1000
Centrifugation Surnageant après centrifugation 90 1,7 153 9,8 882 88,2 2,9
Chromatographie d'affinité 10 10 100 74,6 746 74,6 3,7
Chromatographie d'échange d'ions 5 5 25 105,4 527 52,7 10,5
Chromatographie d'exclusion 7 1,3 9 50,3 352 35,2 19,3
Débris Surnageant
cellulaires

Chromatographie


Débris Surnageant
cellulaires
Quantité de hGH en fin de purification
Fractions Rendement de purification = X 100
Autres fractions
contenant la hGH Quantité de hGH dans le lysat cellulaire
= Contaminants
Chromatographie

= Contaminants contenant la hGH 352
Rendement de purification = X 100
Chromatographie d’exclusion 1000

= Contaminants contenant la hGH En fin de purification, 35% de hGH se trouvant dans le lysat a été conservé
65% a été perdu
Débris Surnageant
cellulaires
Proportion de hGH en fin de purification
Fractions Degré d’enrichissement =
Autres fractions Proportion de hGH dans le lysat cellulaire
Chromatographie
Autres fractions Fractions 352/9

contenant la hGH Degré d’enrichissement =
= Contaminants 1000/500
En fin de purification, la proportion (et non la quantité) de hGH se trouvant dans la
Autres fractions Fractions fraction est 20 fois supérieure à la proportion de hGH dans le lysat.
= Contaminants contenant la hGH Des protéines contaminantes ont bien été éliminées.
La hGH est-elle pure ?
3- L’hormone de croissance commercialisée pour la recherche

20 µg / 61,00 €
SDS PAGE (test pureté)
https://www.novusbio.com/products/
growth-hormone-protein_nbp2-34890
Bilan :
Produire et purifier une protéine = Utilisation des techniques de biochimie analytique à adapter à chaque cas
Il y a d’autres chromatographies et d’autres méthodes d’analyse qui seront vu en L2 L3 et M et notamment pour

des molécules non protéiques

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Techniques de biochimie analytique

appliquées à l’hormone de croissance

Structure avec résolution = 2.5 Å,

Protéine : 191 résidus d’acides aminés (4 hélices α et 2 pontsdisulfure)

Site Inserm (2018)

Site Inserm (2018)

Production d’hormones de croissance recombinante dès 1981 par la

Construction du plasmide Multiplication cellulaire

Purification Dépôt sur colonne

Protéine pure Chromatographie Contenu cytoplasmique libéré

• Extraits biologiques : ensembles complexes (des dizaines de milliers de

• La purification d’une biomolécule s’effectue toujours en 3 phases :

1. Préparation d’un extrait brut

Qu’est ce qu’une biomolécule?

Sur un plan qualitatif, les biomolécules présentent des

application de pression élevée)

A- Etape 1 : Préparation extrait brut de l’hGH

Tampon de lyse : 50 mM TrisHCl pH 8, NaCL 0,5 M, inhibiteur de protéase

Après solubilisation, on obtient un extrait brut.

Propriétés utilisées pour la

Pour chaque molécule, on va calculer un rapport frontal

Un chromatogramme est la représentation graphique de la réponse du détecteur en fonction du temps ou

La chromatographie sur couche mince sera évoquée en TD et en TP (sucres du lait)

Il faut fixer de façon

La fixation du ligand sur la résine

La molécule qui a de l’affinité

CHARGE : l’extrait brut, filtré, est déposé sur la colonne.

LAVAGE : passage de tampon pour entrainer les molécules non fixées.

LAVAGE : passage de tampon pour entrainer les molécules non fixées.

ELUTION : un excès de ligand libre entraine l’élution de la protéine.

ELUTION : un excès de ligand libre entraine l’élution de la protéine.

Concentration en ligand libre

Concentration en ligand libre

Lavage avec tampon

Concentration en ligand libre

Concentration en ligand libre

Lavage avec tampon

Concentration en ligand libre

Lavage avec tampon

Absorbance 280 nm Tampon avec

IMAC= Immobilized metal-affinity chromatography

chélatant des ions métalliques Ni2+

Met à profit l’interaction ionique entre la molécule à purifier et une molécule de

L’élution se fait grâce à une variation de pH et/ou de la force ionique de la phase

Met à profit l’interaction ionique entre la molécule à purifier et une molécule de

Sur une colonne échangeuse d’anions, les molécules anioniques,

ELUTION : une augmentation de la force ionique entraîne l’élution de la protéine.

à pH 7,4, protéine chargée – Interaction ionique diminue

La dernière étape de purification peut être une

La filtration s’effectue sur gel de dextrane

chromatographie d’exclusion diffusion

V0 = volume d’élution d’une molécule exclue

Ve= volume d’élution d’une molécule X = V0 + KAVVi

La protéine de petite taille est

Dans quelle fraction d’élution se trouve la hGH ? Est-elle pure ?

Electrophorèse en conditions dénaturantes : SDS PAGE

Après une étape dénaturation, la pureté de la

Gel d’électrophorèse coloré

SDS-PAGE : Sodium DodecylSulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

• Un mélange de molécules est soumis à un champ électrique entrainant la migration des

• En fonction de différents paramètres physico-chimiques des molécules et du support

• Le support de migration peut être un gel d’agarose (acides nucléiques), de polyacrylamide