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Journal égyptien de la recherche aquatique (2015)41,257–264

HÉBERGÉ PAR
Institut national d'océanographie et des pêches

Journal égyptien de recherche aquatique

http://ees.elsevier.com/ejar
www.sciencedirect.com

ARTICLE PLEINE LONGUEUR

AquatiqueBacille cereusJD0404 isolé des

sédiments boueux des mangroves de Thaïlande et
caractérisation de son activité cellulolytique

Aiya Chantarasiri*

Faculté des sciences, de l'énergie et de l'environnement, King Mongkut's University of Technology North Bangkok,
Rayong Campus, Bankhai, Rayong 21120, Thaïlande

Reçu le 11 août 2015 ; révisé le 31 août 2015 ; accepté le 31 août 2015

Disponible en ligne le 26 septembre 2015

MOTS CLÉS RésuméCette étude visait à effectuer l'isolement, le criblage et l'identification de bactéries à haut niveau
Bacillus cereus; d'activité cellulolytique dans les sédiments boueux des mangroves en Thaïlande. Cent quatre-vingt-dix isolats
Activité cellulolytique ; de bactéries aquatiques ont été isolés de différents sédiments boueux et quatre-vingt-un isolats ont été
Mangrove; déterminés comme étant des bactéries cellulolytiques. La bactérie cellulolytique identifiée commeBacille
Sédiment boueux cereusJD0404 a montré une activité d'hydrolyse maximale sur des plaques de gélose à la
carboxyméthylcellulose. Ses performances cellulolytiques pour l'activité CMCase, l'activité Avicelase etb-
l'activité de la glucosidase était de 1,778 ± 0,003 U/mL, 0,079 ± 0,001 U/mL et 0,048 ± 0,002 U/mL,
respectivement. La température et le pH optimaux pour l'activité enzymatique ont été déterminés comme
étant respectivement de 50 °C et 7,0. L'activité cellulolytique a été grandement améliorée par Mn2+et
considérablement inhibée par l'EDTA et le toluène. L'application préliminaire de bioconversion a montré que
leB. cereusJD0404 pourrait être utilisé pour l'hydrolyse de la biomasse à base de cellulose. Cette étude a
démontré une bactérie faisable pour les industries respectueuses de l'environnement et la biotechnologie.
- 2015 Institut National d'Océanographie et des Pêches. Hébergement par Elsevier BV Il s'agit d'un accès libre
article sous licence CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduction Sandilyan et Kathiresan, 2014), y compris la protection côtière contre les

catastrophes naturelles, le stockage de matières organiques, les habitats pour

Les marécages de mangroves ou les forêts de mangroves sont les les organismes estuariens et l'atténuation du phénomène de réchauffement

écosystèmes de zones humides côtières uniques que l'on trouve le climatique. Les écosystèmes de mangrove peuvent stocker de grandes

long des côtes tropicales et subtropicales dominées par des plantes quantités de carbone organique et sont riches en carbone organique dans les

halophiles du genreRhizophoreetAvicenne (Mitsch et Gosselink, sédiments qui proviennent principalement des chutes de litière et des racines

2015). Les mangroves et les milieux côtiers voisins offrent de souterraines des plantes de mangrove (Yong et al., 2011). Les communautés

nombreux avantages écologiques (Ghosh et al., 2010 ; microbiennes de la mangrove jouent un rôle vital dans le cycle du carbone
organique. Les micro-organismes cellulolytiques peuvent effectuer la
dégradation de la litière végétale à base de cellulose, entraînant la production
* Tél./fax : +66 (0)38 627012.
Adresse e-mail:aiya.c@sciee.kmutnb.ac.th de dérivés de sucre simple dans les sédiments (Soares-Júnior et al., 2013). Les

Examen par les pairs sous la responsabilité de l'Institut national de l'océanographie

enzymes cellulolytiques microbiennes, appelées cellulase, sont les enzymes

et des pêches. complexes constituées d'endoglucanases

http://dx.doi.org/10.1016/j.ejar.2015.08.003
1687-4285 - 2015 Institut National d'Océanographie et des Pêches. Hébergement par Elsevier BV
Ceci est un article en libre accès sous licence CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
258
(EC 3.2.1.4), les exoglucanases (EC 3.2.1.91 et EC 3.2.1.176) etb-
glucosidases (EC 3.2.1.21) qui agissent en synergie pour hydrolyserb-1, 4
liaisons glycosidiques de la cellulose. La cellulase est devenue un
biocatalyseur central dans diverses industries de technologies vertes,
telles que la production textile, la composition de détergents, la
transformation des aliments, la production d'aliments pour animaux,
l'élimination du biofilm bactérien et la bioconversion pour la production
de biocarburants (Juturu et Wu, 2014). La plupart des enzymes
cellulolytiques isolées des mangroves et des milieux aquatiques
apparentés sont produites à partir de champignons appartenant aux
genresCladosporium, Alternariaet Byssochlamys. (Alsheikh-Hussain et
al., 2014 ; Matondkar et al., 1980 ; Thatoi et al., 2013), et des bactéries
appartenant aux genresMicrococcus, Bacillus, Pseudomonas,
Xanthomonas etBrucelle (Behera et al., 2014). Fait intéressant, la
Thaïlande est l'un des pays asiatiques qui contiennent de vastes
étendues de mangroves (Sandilyan et Kathiresan, 2014), mais la
connaissance des microbes cellulolytiques isolés des mangroves est
limitée (Behera et al., 2014). Pour cette étude, les bactéries aquatiques
démontrant des performances cellulolytiques ont été isolées à partir de
sédiments boueux de mangroves en Thaïlande et identifiées. L'objectif
était de déterminer une bactérie cellulolytique aquatique compétente
pour une utilisation possible dans les industries des technologies vertes
et les applications biotechnologiques connexes.
matériaux et méthodes
Description des sites d'échantillonnage
Des échantillons de sédiments boueux ont été prélevés dans les
mangroves de la rivière Rayong (12-39057.4000N, 101-14030,7900
E), Province de Rayong, Thaïlande (Fig. 1). Des échantillons ont été
prélevés deux fois pendant la saison des pluies, une fois en juillet 2014 et
une autre en septembre 2014. Des sédiments boueux près des racines
des plantes de mangrove ou sous la litière végétale décomposée à une
profondeur de 0 à 15 cm ont été prélevés sur les sites d'échantillonnage.
Figure 1 Carte des mangroves de la rivière Rayong. Le site d'échantillonnage couvrait une superficie de 75 400 m2. La figure a été générée à l'aide de
le service Google Maps.
A. Chantarasiri
à différents endroits, placés dans des sacs en plastique stériles à fermeture à
glissière et conservés à 4 °C.
Isolement et purification des bactéries de la mangrove
L'isolement des bactéries et des milieux de mangrove a été modifié de
Dias et al. (2009). Les échantillons ont été dilués en série avec une
solution saline normale stérile (NaCl à 0,85 %) dans les 24 h suivant le
prélèvement pour obtenir des dilutions au 1/10 000. Cent microlitres de
chaque échantillon dilué ont été étalés sur Tryptone Soya Agar (Himedia,
Inde) additionné de 1,8 % de NaCl et incubés à 28 °C, la température
moyenne des sédiments des sites d'échantillonnage, pendant 48 h. Les
plaques de gélose ont été étudiées en termes de morphologie des
colonies, y compris la forme, la marge, l'élévation et la pigmentation. Des
colonies morphologiquement dissemblables ont été sélectionnées et
ensemencées en stries sur Tryptone Soya Agar pour obtenir des colonies
pures.
Criblage de bactéries cellulolytiques
Le criblage des bactéries cellulolytiques a été réalisé à partir de celui
précédemment décrit (Kasana et al., 2008) en utilisant des plaques de
gélose à la carboxyméthylcellulose (CMC) et la méthode de coloration à
l'iode de Gram. Cinq microlitres de culture de croissance pendant la nuit
dans le Tryptone Soya Broth (Himedia, Inde) de chaque isolat bactérien
ont été étalés sur de la gélose CMC (0,2 % de NaNO3, 0,1 % K2HPO4, 0,05
% MgSO4, 0,05 % KCl, 0,2 % sel de sodium CMC, 0,02 % peptone et 1,7 %
agar). Les plaques de gélose ont été incubées à 28 °C pendant 48 h puis
inondées avec une solution d'iode de Gram pendant 10 min. Les isolats
cellulolytiques ont été détectés par la zone cellulolytique autour des
colonies après coloration à l'iode de Gram. La valeur de la capacité
d'hydrolyse (HC) qui détermine l'activité cellulolytique a été calculée à
partir du rapport entre le diamètre de la zone cellulolytique et le
diamètre de la colonie bactérienne. Le témoin négatif pour le dépistage
était le
Caractérisation de l'activité cellulolytique desBacille cereus
bactérie non cellulolytique,Escherichia coliTISTR073
(Thailand Institute of Scientific and Technological Research,
Thailand) et le contrôle positif était la bactérie cellulolytique
isolée des fèces bovines,Bacillus methylotrophicus
RYC01101 (Chantarasiri, 2014).
Identification des bactéries cellulolytiques
L'isolat cellulolytique sélectionné a été identifié par examen
morphologique, caractérisation biochimique et analyse génétique
moléculaire. L'examen morphologique a été réalisé par coloration
de Gram, coloration des endospores et test de motilité. La
croissance à différents paramètres, y compris le pH, la température,
les conditions de salinité et l'environnement anaérobie, a été
étudiée à 28 - C pendant 24 h aprèsChantarasiri (2014). La
caractérisation biochimique a été examinée par des tests de
catalase (Gagnon et coll., 1959) et test d'oxydase (Gordon et Mc
Leod, 1928). La fermentation du dextrose, du lactose et du
saccharose et la production de sulfure d'hydrogène ont été
analysées à l'aide de Triple Sugar Iron Agar (Himedia, Inde).
L'amplification par PCR et l'analyse de la séquence d'ADNr 16S ont
été décrites parYukphan et al. (2004)en utilisant un jeu d'amorces
comme suit : amorce sens 27F : GAGTTTGATCATGGCTCAG et amorce
antisens 1492R : CGGTTACCTTGTTACGACTT. Toutes les analyses
génétiques moléculaires, y compris l'amplification par PCR, l'analyse
de séquence d'ADNr 16S et l'analyse de similarité d'homologie, ont
été effectuées par l'Institut thaïlandais de recherche scientifique et
technologique (Thaïlande).
Préparation de la solution d'enzyme cellulolytique
L'isolat sélectionné a été cultivé dans un bouillon CMC à 28 °C pendant
48 h dans des conditions d'aération. Les cellules bactériennes ont été
retirées du bouillon de culture par centrifugation à 4500-gpendant 30
min à 4-C. Le surnageant acellulaire obtenu après centrifugation a servi
de solution enzymatique brute. La solution enzymatique brute a été
partiellement purifiée par des dispositifs de filtre centrifuge Amicon
Ultra-15 (10 kDa) (Millipore, Irlande).
Test d'activité cellulolytique
Les tests d'activité cellulolytique ont été modifiés par rapport à
l'étude décrite précédemment en incubant la solution enzymatique
avec le substrat et en déterminant la quantité de produits libérés (
Kim et al., 2012). L'activité endoglucanase (activité CMCase) a été
mesurée en incubant 0,5 ml de solution enzymatique avec 0,5 ml de
sel de sodium CMC à 2 % dans un tampon phosphate de sodium 0,1
M (pH 7,0) à 50 °C pendant 30 min. Les sucres réducteurs libérés ont
été dosés par la méthode à l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS) (
Meunier, 1959). La réaction enzymatique a été terminée en ajoutant
3,0 ml de réactif DNS puis bouillie pendant 5 min. La solution a été
complètement refroidie et la densité optique du mélange
réactionnel a été mesurée à 540 nm. L'activité exoglucanase (activité
Avicelase) a été mesurée en utilisant 2% d'Avicel PH-101 (Sigma –
Aldrich, Allemagne) en suspension dans un tampon phosphate de
sodium 0,1 M (pH 7,0) comme substrat et en l'incubant avec 0,5 ml
de solution enzymatique à 50 -C pendant 1h. Le surnageant du
mélange réactionnel a été recueilli afin de déterminer la quantité de
sucres réducteurs par la méthode DNS. L'activité enzymatique a été
calculée à l'aide d'une courbe standard de glucose. Une unité (U) de
CMCase et d'Avicelase
259
activités est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour
libérer 1jemol de sucres réducteurs en équivalents glucose par
minute dans des conditions de dosage standard.b-l'activité de la
glucosidase a été mesurée en incubant 0,5 mL de solution
enzymatique avec 1 mL de 0,1 %p-nitrophényl-b-ré-glucopyranoside
(pNPG) dans du tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,0) à 50 °C
pendant 1 h. La réaction enzymatique a été terminée en ajoutant
2,0 mL de Na 1 M2CO3solution et la densité optique du mélange
réactionnel a été mesurée à 400 nm. L'activité enzymatique a été
calculée à l'aide d'unp-courbe standard du nitrophénol. Une unité
(U) deb-l'activité glucosidase est définie comme la quantité
d'enzyme nécessaire pour libérer 1jemole dep-nitrophénol par
minute dans des conditions de dosage standard.
Effet de la température sur l'activité cellulolytique et la stabilité
thermique
L'effet de la température sur l'activité enzymatique a été examiné
en incubant 0,5 ml de solution enzymatique avec 0,5 ml de sel de
sodium CMC à 2 % dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH
7,0) à différentes températures allant de 20 -C à 85 -C pendant 30
min. . La stabilité thermique a été examinée en incubant la solution
enzymatique dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,0) à
des températures allant de 20 °C à 85 °C pendant 24 h et l'activité
résiduelle a été contrôlée en utilisant 2 % de sel de sodium CMC
comme substrat. L'activité cellulolytique des enzymes a été dosée
selon la méthode décrite ci-dessus.
Effet du pH sur l'activité cellulolytique et la stabilité du pH
L'effet du pH sur l'activité enzymatique a été mesuré en incubant 0,5 ml
de solution enzymatique avec 0,5 ml de sel de sodium CMC à 2 % dans
différents tampons de pH à 50 °C pendant 30 min. L'activité enzymatique
a été mesurée à une gamme de valeurs de pH comprises entre 3,0 et
11,0 en utilisant 0,1 M des tampons suivants : tampon citrate de sodium
(pH 3,0–6,0), tampon phosphate de sodium (pH 6,0–8,0), tampon Tris–HCl
(pH 8,0– 9,0) et tampon glycine-NaOH (pH 9,0–11,0). La stabilité du pH a
été déterminée en incubant la solution enzymatique dans les tampons
mentionnés ci-dessus à 50 °C pendant 24 h et l'activité résiduelle a été
contrôlée en utilisant du sel de sodium CMC à 2 % comme substrat.
L'activité cellulolytique de l'enzyme a été dosée en utilisant la méthode
décrite ci-dessus.
Effet des additifs sur l'activité cellulolytique
L'effet des additifs sur l'activité enzymatique a été étudié en incubant 0,5
ml de solution enzymatique avec des ions métalliques, un détergent, un
agent chélateur et des solvants organiques. Il y avait douze ions
métalliques différents utilisés, y compris Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Hg2+, K+,
mg2+, Mn2+, Ni2+, Pb2+, Sr2+, et Zn2+, avec la concentration finale de la
solution d'ions métalliques à 5 mM suite à l'étude deSeo et al. (2013).
L'effet du détergent sur l'activité enzymatique a été étudié en utilisant du
TWEEN 80 à 1 % (Sigma–Aldrich, Allemagne). Le résultat d'un agent
chélatant sur l'activité enzymatique en utilisant 5 mM d'EDTA a été
déterminé. L'activité résiduelle des enzymes a été contrôlée en utilisant
2% de sel de sodium CMC comme substrat après avoir été incubée avec
des solutions d'additifs à 50 -C pendant 60 min (Annamalai et al., 2013).
L'effet de huit solvants organiques sur l'activité enzymatique a été
examiné en incubant la solution enzymatique avec une concentration de
25 % de divers solvants organiques tels que le benzène, le cyclohexane,
le dichlorométhane,
260 A. Chantarasiri

Tableau 1Morphologie des colonies et valeurs de la capacité d'hydrolyse (HC) des bactéries cellulolytiques.

Souche bactérienne Forme Marge Élévation Pigmentation Valeur HC

JD0404 Circulaire Enroulé Soulevé Blanc 4,47 ± 0,30

JD0402 Circulaire Entier Soulevé Jaune 3,90 ± 0,23
JD1304 Circulaire Entier Convexe Blanc 3,89 ± 0,24
JD1701 Irrégulier Onduler Soulevé Blanc 3,85 ± 0,25
JD0803 Circulaire Entier Convexe Blanc 3,83 ± 0,31
JD1603 Circulaire Enroulé Convexe Blanc 3,67 ± 0,29
JD1803 Irrégulier Enroulé Soulevé Blanc 3,66 ± 0,32
JD1202 Circulaire Enroulé Convexe Blanc 3,64 ± 0,14
JD1703 Circulaire Enroulé Umboné Blanc 3,63 ± 0,17
JD1003 Irrégulier Onduler Soulevé Blanc 3,51 ± 0,10
JD1101 Irrégulier Onduler Soulevé Blanc 3,49 ± 0,13
JD2103 Circulaire Entier Convexe Blanc 3,48 ± 0,33
PS0102 Circulaire Entier Convexe Brun pâle 3,43 ± 0,17
JD1502 Circulaire Enroulé Convexe Blanc 3,39 ± 0,08
PS1504 Irrégulier Onduler Appartement Blanc 3,32 ± 0,13
PS1704 Irrégulier Enroulé Soulevé Blanc 3,27 ± 0,08
JD2102 Irrégulier Onduler Umboné Crème 3,24 ± 0,18
PS2006 Circulaire Entier Convexe Blanc 3,24 ± 0,46
JD0502 Circulaire Entier Convexe Crème 3,22 ± 0,11
JD0504 Circulaire Entier Convexe Jaune pâle 3,15 ± 0,64
PS1804 Irrégulier Enroulé Soulevé Blanc 3,10 ± 0,32
PS0902 Circulaire Enroulé Convexe Brun pâle 3,10 ± 0,15
Contrôle positif Circulaire Entier Convexe Blanc 3,09 ± 0,39
Le contrôle positif étaitB. méthylotrophicusRYC01101 et les valeurs HC de tous les isolats inférieurs au contrôle positif ne sont pas affichées.

Figure 2 Zone cellulolytique autour des colonies bactériennes sur plaques de gélose CMC après coloration à l'iode de Gram.

éthanol, éther éthylique, méthanol,n-hexane et toluène à 50 -C
pendant 4 h (Annamalai et al., 2013) et l'activité résiduelle des
enzymes a été mesurée en utilisant 2% de sel de sodium CMC
comme substrat. L'activité cellulolytique des enzymes a été dosée
selon la méthode décrite ci-dessus.
Application sur biomasse cellulosique par procédé de bioconversion
à 28-C dans des conditions d'aération pendant 48 h. Le milieu de culture
a été collecté pour la détermination des sucres réducteurs par la
méthode DNS.
résultats et discussion
Isolement, criblage et identification des bactéries cellulolytiques

L'application au procédé de bioconversion a été étudiée. Pour produire

les sucres réducteurs, la biomasse à base de cellulose a été hydrolysée
par une bactérie aquatique sélectionnée. Des tiges de manioc, du foin,
de la paille de riz et des coques d'arachide ont été utilisées comme
source de carbone de la culture bactérienne. La bactérie aquatique a été
cultivée dans un milieu de base additionné de 1% de poudre de
biomasse à base de cellulose (Chantarasiri et al., 2015)
Cent quatre-vingt-dix bactéries aquatiques avec des colonies de
morphologie dissemblable ont été isolées de quarante-deux sédiments
vaseux. La supplémentation du milieu Tryptone Soya Agar avec 1,8% de
NaCl a assuré la sélection de bactéries isolées principalement présentes
dans les écosystèmes de mangrove (Dias et al., 2009). Quatre-vingt-un
isolats bactériens ont été définis comme cellulolytiques
Caractérisation de l'activité cellulolytique desBacille cereus 261

Tableau 2 Performance cellulolytique deB. cereusJD0404 et bactéries apparentées dans leBacillegenre.

Bactéries Activité CM Case Activité avicelase b-Activité glucosidase Référence

(U/mL) (U/mL) (U/mL)
Bacillesp. SMIA-2 0,29 0,83 ND Ladeira et al. (2015)
B. cereusBR0302 0,12 ND ND Chantarasiri et al. (2015)
B. licheniformisJK7 0,75 ND 0,63 Seo et al. (2013)
B. méthylotrophicusRYC01101 0,23 ND ND Chantarasiri (2014)
B. pumilusEB3 0,08 ND 0,04 Arffin et al. (2006)
B. subtilisAS3 0,07 ND ND Deka et al. (2011)
B. subtilisSL9–9 0,90 0,32 Aucune activité Kim et al. (2012)
B. cereusJD0404 1,78 0,08 0,05 Cette étude

ND signifie 'non déterminé'.

bactéries car elles présentaient la zone cellulolytique autour de

leurs colonies sur gélose CMC après coloration à l'iode de Gram. Les
valeurs de HC ont été calculées et les résultats sont présentés dans
Tableau 1 etFigure 2. La souche bactérienne JD0404 a présenté une
capacité d'hydrolyse maximale de 4,47 ± 0,30, supérieure au témoin
positif (B. méthylotrophicusRYC01101) par un facteur de 1,45.
L'identification de la souche JD0404 a été déterminée à l'aide d'un
examen morphologique, d'une caractérisation biochimique et d'une
analyse génétique moléculaire. La souche JD0404 est une bactérie
anaérobie facultative avec une couleur blanche, une élévation
surélevée et une colonie à marge enroulée. Les cellules
bactériennes étaient 1 - 4jem, en forme de bâtonnet, à Gram positif,
formant des endospores et mobiles. Les tests de catalase et
d'oxydase étaient positifs. Les analyses de fermentation du sucre et
de production de sulfure d'hydrogène ont montré que la souche
JD0404 pouvait fermenter le glucose mais ne pouvait pas produire
de sulfure d'hydrogène cultivé sur Triple Sugar Iron Agar. Pour une
croissance à différents paramètres, il pourrait croître entre un pH de
5,0 et 11,0 à des températures comprises entre 20 -C et 45 -C et une
tolérance à la salinité à 6 % de NaCl. L'analyse de séquençage du
gène ADNr 16S a mis en évidence qu'il présentait la plus grande
homologie avecB. cereusATCC 14579 avec 99,81 % de similarité
(Certification of Thailand Institute of Scientific and Technological
Research, Request No. 2558/3-063). Sur la base des résultats, cette
bactérie aquatique a été désignée commeB. cereus JD0404.B. cereus
est une bactérie omniprésente présente dans la matière organique
en décomposition, le sol, les aliments, les eaux douces et marines et
le tractus intestinal des invertébrés (Botton, 2010). Il peut être utilisé
pour biosynthétiser de nombreuses enzymes d'hydrolyse et a été
utilisé pour des applications biotechnologiques (Łaba et al., 2015).
Selon d'autres études,B. cereuspeut être isolé des mangroves et des
environnements connexes (Dias et al., 2009 ; Tabao et Monsalud,
2010 ; Thatoi et al., 2013) car il joue un rôle important dans le flux de figure 3 Effet de la température sur l'activité CMCase (a) et
carbone et le processus de dégradation de la matière organique stabilité (b) deB. cereusJD0404. Les barres d'erreur représentent
dans les écosystèmes de mangrove (Gosh et al., 2010). l'écart type de trois répétitions.

Activité cellulolytique de B. cereus aquatique JD0404

B. cereusJD0404 a été examiné pour l'activité cellulolytique et cela a
montré qu'il pouvait produire 1,778 ± 0,003 U/mL d'activité CMCase,
0,079 ± 0,001 U/mL d'activité Avicelase et 0,048 ± 0,002 U/mL
d'activitéb-activité glucosidase. Son activité cellulolytique a été
comparée à d'autres bactéries dans leBacillegenre (Tableau 2). Les
comparaisons ont montré que lesB. cereusJD0404 est une bactérie
productive productrice d'endoglucanase, mais elle produit à peine
de l'exoglucanase etb-glucosidase. Ce cellulolytique
les performances étaient en accord avec l'absence du système
cellulolytique complet duBacillegenre (Kim et al., 2012). Plus Bacilleles
enzymes ont montré une activité primaire sur la CMC avec leur activité
endoglucanase, mais n'ont guère dégradé les formes cristallines de la
cellulose (Ladeira et al., 2015 ; Robson et Chambliss, 1984). On pourrait
affirmer que la CMC est la source de carbone expérimentalement
appropriée pour la production d'enzymes cellulolytiques de bactéries.
Cependant, au fil des ans, de nombreuses études ont tenté d'isoler le
cellulolytiqueBacillebactéries de
262 A. Chantarasiri

Tableau 3Effet de divers additifs sur l'activité CMCase de

B. cereusJD0404.
Activité résiduelle (%)

Ions métalliques

Californie2+ 124,15 ± 1,38

Co2+ 182,84 ± 1,37
Cu2+ 142,90 ± 0,85
Fe2+ 138,72 ± 2,55
Hg2+ 96,22 ± 1,15
K+ 95,41 ± 1,14
mg2+ 136,15 ± 2,98
Mn2+ 302,92 ± 3,82
Ni2+ 161,79 ± 1,79
Pb2+ 121,59 ± 0,42
Sr2+ 103,91 ± 0,18
Zn2+ 97,57 ± 0,00

Détergent
ENTRE 80 95,28 ± 0,56

Agent chélatant
EDTA 78,41 ± 1,49

Solvants organiques
Benzène 91,64 ± 0,02
Cyclohexane 91,91 ± 1,51
Dichlorométhane 95,01 ± 0,58
Éthanol 95,96 ± 6,10
Éther éthylique 96,23 ± 3,05
Méthanol 90,83 ± 7,61
n-Hexane 98,92 ± 1,14
Toluène 72,21 ± 0,43

Figure 4 Effet du pH sur l'activité CMCase (a) et la stabilité (b)
à partir deB. cereusJD0404. L'activité enzymatique a été mesurée dans un tampon
citrate de sodium (-), un tampon phosphate de sodium (4),Tampon Tris-HCl
(h)et tampon glycine-NaOH (ré).Les barres d'erreur
représentent l'écart type de trois répétitions.
environnements et ont rapporté leurs enzymes résultantes
ayant une activité cellulolytique complète (Balasubramanian et
Simões, 2014 ; Kim et al., 2012 ; Ladeira et al., 2015).
Caractérisation de l'enzyme cellulolytique de B. cereus aquatique
JD0404
La température optimale pour l'activité cellulolytique (activité
CMCase) s'est avérée être de 50 -C (Figure 3a) et celle-ci est restée
stable jusqu'à 60 -C (Figure 3b). Pour un pH optimal, leB. cereus
JD0404 a montré une activité optimale à pH 7,0 (Figure 4a) et était
stable à pH 5,0–8,0 (Figure 4b). Ces caractéristiques de pH et de
température étaient liées à d'autresBacilleenzymes isolées de
différents environnements. Il a été découvert que l'endoglucanase
de Bacillesp. sont actifs à une température de 50 à 60 °C et à un pH
de 4,8 à 11,0 (Sâdhu et Maiti, 2013). L'effet de divers additifs sur
l'activité enzymatique est montré dansTableau 3. Le résultat des
ions métalliques a révélé que l'activité cellulolytique deB. cereus
JD0404 a été grandement amélioré par Mn2+et légèrement inhibé
par Hg2+, K+et Zn2+. De même, l'endoglucanase bactérienne de
nombreuses études a également été activée par Mn2+
et gêné par Hg2+(Annamalai et al., 2013 ; Balasubramanian
et Simões, 2014 ; Irfan et al., 2012 ; Kim
et al., 2009 ; Lin et al., 2012 ; Trivedi et al., 2011 ; Yin et al., 2010). Ces
ions métalliques ont un effet majeur sur les performances
enzymatiques en agissant comme cofacteur (Irfan et al., 2012). Basé
sur l'augmentation de l'activité catalytique par Mn2+, on pourrait
supposer que cet ion métallique répond à certains résidus d'acides
aminés dans le site actif et favorise la conformation favorable à
l'activité enzymatique (Azzeddine et al., 2013). Le phénomène inactif
des enzymes provoqué par Hg2+pourrait éventuellement indiquer
que le site actif de l'enzyme contenait le groupe thiol (Irfan et al.,
2012 ; Yin et al., 2010). L'activité cellulolytique a été légèrement
réduite par le TWEEN 80 indiquant queB. cereus JD0404 pourrait
être utilisé pour les industries traitant des détergents. La réduction
des performances catalytiques de l'enzyme cellulolytique par un
agent chélateur a révélé que l'endoglucanase de
B. cereusJD0404 pourrait être identifié comme une métalloenzyme (
Annamalai et al., 2013). Pour postuler plus loinB. cereusJD0404 à la
bioremédiation des eaux usées contaminées par des solvants
organiques ou des industries travaillant avec des solvants organiques,
l'effet des solvants organiques sur la stabilité enzymatique deB. cereus
JD0404 a fait l'objet d'une enquête. Les résultats ont montré que seul le
toluène avait des performances enzymatiques inactivées de manière
critique, ce qui était en accord avec de nombreuses études (Annamalai et
al., 2013 ; Trivedi et al., 2011).
Application sur biomasse cellulosique par procédé de bioconversion
La production de sucres réducteurs à partir d'agro-résidus et de déchets
lignocellulosiques par un procédé de bioconversion est aujourd'hui une
préoccupation mondiale car ils sont le substrat indispensable des biocarburants et
des produits biosourcés. Dans cette étude, la population locale
Caractérisation de l'activité cellulolytique desBacille cereus
les agro-résidus ont été bioconvertis en sucres réducteurs par la
potentielle bactérie cellulolytique,B. cereusJD0404. Après 48 h
d'incubation bactérienne, les tiges de manioc, le foin, la paille de riz et les
coques d'arachide ont été convertis en sucres réducteurs de 9,42 ± 0,04,
8,78 ± 0,13, 7,88 ± 0,09 et 7,76 ± 0,00 mg/mL respectivement. Pour la
paille de riz, la quantité de sucres réducteurs de cette expérience était
supérieure à celle de l'étude précédente utilisant l'enzyme cellulolytique
deB. cereusBR0302 isolé du sol des zones humides côtières (Chantarasiri
et al., 2015) par 58 fois. L'intérêt pour les bactéries cellulolytiques et leurs
enzymes s'est considérablement accru ces dernières années (Wang et al.,
2009), car le procédé de bioconversion de la biomasse lignocellulosique
est respectueux de l'environnement et offre plusieurs avantages.
conclusion
Les bactéries cellulolytiques de la mangrove jouent un rôle important
dans le flux de carbone et le cycle de la matière cellulosique dans les
milieux aquatiques associés. Ces bactéries cellulolytiques ont récemment
été appliquées à divers processus industriels et minimisent également
les dommages causés par la pollution. Cette étude est le premier rapport
de bactéries cellulolytiques isolées de mangroves dans la province de
Rayong, en Thaïlande. La souche de bactérie aquatique JD0404 a été
isolée, identifiée et finalement désignée commeB. cereusJD0404. Les
caractéristiques cellulolytiques deB. cereus JD0404 qui ont été trouvés en
feront un candidat compétent pour les procédés industriels et les
applications biotechnologiques.
Remerciements
Cette recherche a été financée par l'Université de technologie
du nord de Bangkok du roi Mongkut. Contrat n° KMUTNB-
GEN-57-53. Je suis reconnaissant au Dr Narumon Boonman,
Université Suan Sunandha Rajabhat pour ses conseils sur cette
recherche.
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