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5.14 P---------- -- R------ M---- --- R------- U--- -- A------- -----

ST------

5.14.1 Normes McFarland

I.PRINCIPE
Les étalons de turbidité McFarland sont utilisés pour
standardiser le nombre approximatif de bactéries
dans une suspension liquide en comparant
visuellement la turbidité d'une suspension test avec
la turbidité d'un étalon McFarland. Les étalons
McFarland sont préparés en ajoutant du chlorure de
baryum à de l'acide sulfurique pour obtenir un pré-
sulfate de baryum.
précipité. En ajustant les volumes de ces deux
réactifs, des standards de différents degrés de
turbidité peuvent être préparés pour représenter
plusieurs concentrations différentes de bactéries. La
norme la plus couramment utilisée dans le
laboratoire de microbiologie clinique pour les tests
de routine de sensibilité aux antimicrobiens (1, 2) est
de 0,5, ce qui représente 1,5 108
(généralement, la plage est de 1,0 dix8à 2.0
dix8) bactéries/ml. Les normes McFarland sont
disponibles dans le commerce auprès de plusieurs
sources. En tant qu'alternative aux étalons traditionnels
de sulfate de baryum, les étalons McFarland préparés à
partir de particules de latex sont récemment devenus
disponibles dans le commerce.

II. MATÉRIAUX A. Réactifs 3.Eau déminéralisée stérile de qualité réactif

1.Acide sulfurique, 1 % (vol/vol) (H2ALORS4)
un.Ajouter environ 90 ml d'eau
Inclure les informations de CQ sur le déminéralisée dans une fiole
conteneur de réactif et dans les jaugée de 100 ml.
enregistrements de CQ. b.A l'aide d'une pipette volumétrique
de 1,0 ml, ajouter 1,0 ml d'H
concentré2ALORS4au flacon.
c.Porter à 100 ml avec de l'eau
déminéralisée et mélanger.
ré.Conserver dans un flacon en verre à
bouchon à vis jusqu'à 1 an à 25°C.
2.Chlorure de baryum, 1,175 % (p/vol)
(BaCl2•2H2O)
un.Peser 1,175 g de BaCl2• 2H2O
et placer dans une fiole jaugée
de 100 ml.
b.Ajouter environ 50 ml d'eau
déminéralisée et bien mélanger
pour dissoudre.
Conserver dans un flacon en verre à bouchon à
vis jusqu'à 1 an à 25°C.
B. Fournitures
1.Pipettes sérologiques stériles de 1,0
litre et 10,0 ml et poire de pipette
2.Tubes à bouchon à vis en verre lavé à l'acide
d'un diamètre comparable à celui utilisé
pour la préparation de l'inoculum (par
exemple, 13 x 100 mm)
3.Parafilm ou paraffine
C. Équipement
1.Fioles jaugées de 100 ml
2.Pipettes jaugées de 0,5 et 1,0 ml
pour 0,5 étalons
Voir l'annexe 5.14.1–1 pour les tailles
de pipettes jaugées nécessaires à la
préparation d'autres étalons. BaCl2•2H
2O doit être dispensé avec une pipette

c.Porter à 100 ml avec de l'eau volumétrique.

déminéralisée et mélanger. 3.Agitateur magnétique et agitateur
ré.Conserver dans un flacon en verre à 4.Vortex
bouchon à vis jusqu'à 1 an à 25°C. 5.Spectrophotomètre

III. CONTRÔLE DE QUALITÉ A. Au moment de la préparation des normes

Vérifier la densité optique de l'étalon McFarland à une longueur d'onde de 625 nm et enregistrer
les résultats. La plage acceptable pour une norme McFarland 0,5 est de 0,08 à 0,10. Pour les
normes autres que 0,5, établissez des plages acceptables en interne.

5.14.1.1
Normes McFarland 5.14.1.2

III. CONTRÔLE DE QUALITÉ B. Contrôles supplémentaires

(a continué) 1.Vérifiez les étalons en cours d'utilisation à chaque utilisation pour des signes visibles d'agglutination
et comparez périodiquement les étalons en cours d'utilisation avec un étalon qui n'a pas été utilisé.
Si l'agglutination est apparente, jetez le standard.
2.Vérifier les normes pour toute preuve d'évaporation. Cela peut être accompli en traçant une
ligne sur le tube au niveau du ménisque lorsque les tubes sont remplis. Une baisse du
niveau de liquide en dessous de cette ligne indique qu'une évaporation s'est produite.
Si l'évaporation est évidente, jetez l'étalon.
3.Vérifier la densité optique d'un standard représentatif (qui n'a pas été utilisé) à 3 mois
pour s'assurer que la densité optique du lot est toujours dans les limites de contrôle.
S'il est sous contrôle, la durée de conservation du lot peut être prolongée d'un mois
supplémentaire.
4.Répétez la vérification de la densité optique tous les mois. En cas de contrôle, la durée de conservation peut être

prolongée d'un mois supplémentaire jusqu'à 12 mois.

IV. PROCÉDURE UN.Reportez-vous à l'annexe 5.14.1–1 pour les volumes de 1 % H2ALORS4et 1,175 % BaCl2• 2H2
O nécessaire pour préparer différentes qualités d'étalons McFarland (représentant
diverses concentrations de bactéries) et substituer ces volumes dans la procédure ci-
dessous lors de la préparation d'étalons autres que 0,5.
BPour préparer les normes McFarland 0.5
1.Ajouter environ 85 ml de 1% H2ALORS4dans une fiole jaugée de 100 ml.
2.A l'aide d'une pipette volumétrique de 0,5 ml, ajouter 0,5 ml de BaCl 1,175%2•2H2O goutte à
goutte vers le H2ALORS4tout en agitant constamment le flacon.
3.Porter à 100 ml avec 1% H2ALORS4.
4.Placer la barre d'agitation magnétique dans la fiole et placer sur l'agitateur magnétique
pendant environ 3 à 5 min.
5.Examiner visuellement la solution pour s'assurer qu'elle semble homogène et exempte de
grumeaux visibles ; vérifier la densité optique et l'enregistrer sur la feuille QC.
6.Si le CQ est acceptable, distribuer un volume de 2 à 7 ml (selon le volume couramment
utilisé dans la préparation de la suspension d'inoculum) dans chaque tube.
sept.Bouchez les tubes hermétiquement.

8.Sceller avec Parafilm ou paraffine.

9.Conserver dans l'obscurité à température ambiante pendant 3 mois ou plus (voirpoint III ci-
dessus).

V. UTILISATION DE MC UN.Bien mélanger l'étalon McFarland et tester la suspension sur un agitateur vortex avant
NORMES FARLAND l'examen.
BEn présence d'un bon éclairage, comparer visuellement la turbidité de la suspension d'essai
à la norme McFarland.
1.Tenez les deux tubes devant une carte Wickerham (Annexe 5.14.1–2).
2.S'il est plus difficile de voir les lignes sur la carte Wickerham avec la suspension
d'essai qu'avec la norme McFarland, la suspension est trop dense et doit être
diluée.
3.Si une dilution est nécessaire, utilisez une pipette stérile pour ajouter du bouillon stérile
supplémentaire ou une solution saline dans le tube pour obtenir une turbidité comparable à celle
de la norme McFarland.
4.Avant les examens ultérieurs, tester la suspension au vortex et le puits étalon
McFarland.
5.Si la suspension à tester est trop légère, ensemencer avec des organismes supplémentaires ou
réincuber la suspension (selon le protocole de préparation de l'inoculum) jusqu'à ce que la
turbidité atteigne celle de l'étalon.
5.14.1.3 Tests de sensibilité aux antimicrobiens

VI. REMARQUES SUR LA PROCÉDURE
UN.La suspension d'essai et l'étalon McFarland doivent être contenus dans des tubes de
même diamètre.
BLes normes McFarland sont plus susceptibles de s'agglutiner et de s'évaporer si elles sont exposées à l'air. Ainsi, il
est impératif que les bouchons soient hermétiquement scellés avec du Parafilm ou de la paraffine.
CLes étalons utilisés s'agglutinent et s'évaporent plus rapidement que ceux stockés, et les étalons utilisés
doivent être examinés régulièrement. Jeter les étalons présentant des signes d'agglutination ou
d'évaporation, quelle que soit la durée de conservation indiquée.
RÉ.Lorsque des tubes en verre sont utilisés, le lavage à l'acide aide à minimiser l'agglutination.
E.Un conteneur de stockage pratique pour les normes McFarland est un conteneur d'expédition de tubes à essai.
Vous pouvez également envelopper le tube dans du papier d'aluminium.
F.Une alternative à l'utilisation d'un spectrophotomètre selon les normes QC McFarland consiste à
effectuer des comptages de colonies sur des suspensions bactériennes (par exemple,Escherichia
coliATCC 25922) qui ont été normalisés par rapport à un lot particulier de normes.
1.Préparer 6 dilutions successives au 1/10 de la suspension à tester dans du NaCl 0,85 %
(le premier tube de dilution est étiqueté 10-2; l'étalement de 0,1 ml de la suspension
standardisée au McFarland 0,5 donnerait les 10-1dilution). (TNTC, trop nombreux pour
être comptés.)

Attendu non. des colonies

Dilution (avec aliquotes de 0,1 ml)

dix-1 TNTC
dix-2 TNTC
dix-3 TNTC
dix-4 TNTC
dix-5 TNTC
dix-6 150
dix-sept 15

2.Plaquez des aliquotes de 0,1 ml de dilutions censées donner environ 30 à 300 colonies
(dans cet exemple, la plaque 10-6et 10-sept) au BAP (en double) et étaler uniformément
pour répartir à l'aide d'une anse ou d'un « bâton de hockey » stérile.
3.Le nombre de colonies doit se situer à moins de 10 % des nombres attendus.
G.Le nombre réel de bactéries viables présentes dans les suspensions standardisées McFarland peut
varier en fonction de la taille, de la viabilité et de l'agglutination des bactéries particulières
testées.
HLorsque vous utilisez des standards McFarland disponibles dans le commerce préparés à partir de
particules de latex, suivez les instructions du fabricant pour l'utilisation et le stockage.
JE.D'autres dispositifs donnent satisfaction pour standardiser les suspensions bactériennes. Il s'agit notamment des
éléments suivants :
1.Dispositifs d'inoculum de type baguette qui prélèvent un volume standardisé de pâte cellulaire
(à partir de colonies cultivées pendant la nuit sur une plaque de gélose) qui est ensuite mis
en suspension dans un volume standardisé de liquide (système d'inoculation BBL Prompt,
[Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, Md. , ou Dade MicroScan, West
Sacramento, Californie).
2.Photomètres ou colorimètres tels que les suivants
un.Colorimètre Vitek (bioMérieux Vitek, Inc., Durham, NC)
b.Turbidimètre MicroScan (Dade MicroScan)

VII. LIMITES Les suspensions normalisées selon les normes McFarland ne contiendront le nombre estimé de
bactéries que si des normes McFarland de haute qualité sont utilisées. Les étalons qui se sont
agglutinés ou évaporés donneront des résultats insatisfaisants.
Normes McFarland 5.14.1.4

RÉFÉRENCES 1.NCCLS.2003.Normes de performance pour les 2.NCCLS.2003.Méthodes de dilution des tests de

tests de sensibilité aux disques antimicrobiens, sensibilité aux antimicrobiens pour les bactéries qui
8e éd. Norme approuvée M2-A8. NCCLS, Wayne, se développent de manière aérobie,6e éd. Norme
Pa. approuvée M7-A6. NCCLS, Wayne, Pa.

LECTURE SUPPLÉMENTAIRE Barry, AL1976.Le test de sensibilité aux Washington, JA, E. Warren et AG Karlson.1972.
antimicrobiens : principes et pratiques,p. 72–74. Lea Stabilité des normes de turbidité du sulfate de
et Febiger, Philadelphie, Pennsylvanie. baryum.Appl. Microbiol.24:1013.
Mc Farland, J.1907. Néphélomètre : instrument
d'estimation du nombre de bactéries dans les
suspensions utilisé pour le calcul de l'indice
opsonique et pour les vaccins.JAMA14:1176–1178.

ANNEXE 5.14.1–1 Préparation des normes McFarland

Adapté deKC Chapin et T. Lauderdale.2003. Réactifs, colorants et milieux :
bactériologie, p. 358.DansPR Murray, EJ Baron, JH Jorgensen, MA Pfaller et RH
Yolken (éd.),Manuel de microbiologie clinique,8e éd. Presse ASM, Washington, DC

Volume (ml)
Nb de bactéries/ml
Norme non. (dix8) représentée
BaCl2•2H2O (1,175 %) H2ALORS4(1%)

0,5 0,5 99,5 1.5

1 1.0 99,0 3
2 2.0 98,0 6
3 3.0 97,0 9
4 4.0 96,0 12
5 5.0 95,0 15
6 6.0 94,0 18
sept 7.0 93,0 21
8 8.0 92,0 24
9 9.0 91,0 27
dix 10.0 90,0 30

ANNEXE 5.14.1–2 Carte Wickerham

LJ Wickerham.1951. Taxonomie des levures, p. 11.DansBulletin technique n°. 1029. Département

américain de l'agriculture, Washington, DC