Méthodes de Séparation 2010-2011 Nathalie Younan

Série 6: Chromatographie d’exclusion stérique

Exercice 1 : Indices de Kovats

Au cours de la séparation d’un mélange d’hydrocarbures, les temps de rétention
mesurés sont :
Propane 2.23 min
Isobutane 5.71 min
Butane 6.67 min

Quel est l’indice de Kovats pour chaque composé ?

Exercice 2 : Perte de charge dans une colonne

1) Citer l’équation de Darcy en présentant les différents paramètres qu’elle contient.
2) Lorsqu’on compare une colonne de longueur L et une colonne de longueur 2L (de
même diamètre intérieur, avec des grains de phase stationnaire identiques et une
même qualité de remplissage), comment la perte en charge (pression en tête de
colonne) évolue-t-elle :
- à débit identique ?
- à débit divisé par deux ?

RAPPEL

Le volume total VM de la phase mobile dans la colonne peut être décomposé en deux
parties :
- le volume interstitiel Vi (extérieur des pores)
- le volume des pores Vp

Pour une molécule de taille intermédiaire, le volume d’élution est :

Ve =Vi +KVp

K, coefficient de diffusion, représente le degré de pénétration d’une espèce présente

dans le volume Vp (0<K<1).

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Exercice 3 :
Une colonne de filtration sur gel a un rayon r de 0.80 cm et une longueur l de 20 cm.
a) Calculer le volume de la colonne.
b) Le volume Vi de la phase mobile en dehors des particules du gel est de 18.1 ml et le
volume total de la phase mobile est de 35.8 ml. Déterminer le coefficient K pour un
soluté élué à 27.4 mL.
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Exercice 4 :
Une colonne HPLC d’exclusion moléculaire avec résine polystyrène a un diamètre de
7.8 mm et une longueur de 30 cm. La proportion solide des particules du gel occupe
20% du volume, les pores occupent 40% et le volume entre les particules 40%.
a) A quel volume les molécules totalement exclues sortiraient de la colonne ?
b) A quel volume sortiraient les plus petites molécules ?
c) Un mélange de polyethylène glycols de masses moléculaires différentes est
élué entre 23 et 27 mL. Qu’est-ce que cela implique concernant les
mécanismes de rétention de ces solutés dans la colonne ?

Exercice 5 :
On chromatographie une solution dans le tetrahydrofuranne (THF) d’un mélange de
polystyrènes de masses moléculaires connues sur une colonne (I.D=7.5mm, L=
300mm) dont le domaine de perméation s’étend de 400 à 30 000 daltons. La phase
éluante est du THF. Son débit est 1mL/min. La détection UV est effectuée à 254nm.

A partir du chromatogramme obtenu reproduit ci-après :

a) Calculer le volume d’exclusion total (volume interstitiel) et le volume des pores de
la colonne utilisée.
b) Calculer le coefficient de diffusion K pour le composé de masse 3250 Da.
c) On observe quelquefois en chromatographie d’exclusion stérique des valeurs de K
supérieures à 1. Interpréter ce phénomène.

Exercice 6 :
Les composés suivants sont séparés par chromatographie d’exclusion stérique.
a) Par quelle méthode peut-on évaluer la masse moléculaire de composés inconnus ?
b) Estimer la masse moléculaire du soluté inconnu.

Composés Vr (mL) Masse moléculaire (Da)

Blue Dextran 2000 17.7 2.106
Aldolase 35.6 158000
Catalase 32.3 210000
Ferritin 28.6 440000
Thyroglobulin 25.1 669000
Inconnu 30.3 ?