Méthodes de Séparation 2010-2011 Nathalie Younan

Série 7: Méthodes de Séparation

Exercice 1 : HPLC
Dans cette expérience, un mélange de 5 peptides est analysé en chromatographie
liquide. L’échantillon (1
l) est injecté dans une capHPLC avec une colonne capillaire
de phase inverse C18.

Le gradient d’élution est composé de deux solvants A et B:

A: H2O / Acetonitrile (98:2) B: Acetonitrile / H2O (80:20)

Le gradient appliqué durant la chromatographie est représenté en pointillés sur le

chromatogramme suivant.
Les espèces non retenues sortent à 3 min après l’injection.

50 100%B
5
40

1 3
Absorbance 214nm / mAU

30 Gradient LC
4
20 50%B
2

10

0
0%B

-10

-20
0 10 20 30 40
Temps / min

Les temps de rétention et largeur de pic pour chaque peptide, déterminés à partir du
chromatogramme précédent sont indiqués dans le tableau suivant:

Peptide Temps de retention (min) Largeur de pic (min)

1 15.242 0.273
2 17.084 -
3 17.300 -
4 19.434 0.296
5 22.167 0.249

1) Déterminer le facteur de rétention k’ de chaque peptide ainsi que le facteur de

séparation
pour les couples de peptides 1/2, 2/3, 3/4 et 4/5.

2) À partir des facteurs de rétention et de séparation des peptides 4 et 5, déterminer la

résolution de la colonne.
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3) Calculer le nombre de plateaux théoriques et la hauteur équivalente de plateaux

théoriques de la colonne HPLC utilisée.
À votre avis, est-ce suffisant pour avoir une séparation convenable ?

4) Pourquoi les peptides 2 et 3 sont-ils élués quasiment en même temps ?

Exercice 2 : Paramètres adimensionnels en chromatographie (Knox)

1) Expliquer l’intérêt d’utiliser des paramètres adimensionnels pour l’évaluation

de performances chromatographiques.

2) Définir les paramètres suivants : longueur réduite de colonne, hauteur réduite

de plateaux théoriques et vitesse réduite d’écoulement.

3) Quel doit-être le débit linéaire de la colonne, u, pour chromatographier le

phenetol (coefficient de diffusion : Dm= 0,49.10-9 m2s-1) et une hypothétique
macromolécule (coefficient de diffusion : Dm= 6,2.10-11 m2s-1) avec une
vitesse d’écoulement réduite optimale de vopt=3 ? Le diamètre des particules
dp de la phase stationnaire est de 5 μm.

Exercice 3 : Chromatographie liquide-liquide

Le tableau suivant donne les paramètres solvatochromiques pour trois composés :

Composés Vw * 

Benzène 0.491 0.59 0.10 0
Nitrobenzène 0.631 1.01 0.30 0
Phénol 0.536 0.72 0.33 0.61

1) Expliquer les différences observées entre ces composés.

2) Un temps de rétention de 16 min a été mesuré pour le phénol. Le temps mort

pour cette colonne est de 2.5 min, la longueur de colonne est de 20 cm, et le
diamètre interne 5 mm. Déterminer le coefficient de distribution et les
volumes des phases mobile et stationnaire. On donne les paramètres
solvatochromiques suivant pour l’éluant :

constante  p b a
0.355 3.664 0.0115 -0.4987 -2.841