Introduction

• Les 1ères chromato en phase liquide ont été réalisées

sur des colonnes en verre de 1 à 5 cm de diamètre et
remplie sur une longueur de 50 cm à 5 m

• Les dimensions des particules étaient de 200 microns

Chromatographie en phase mais les débits d’élution étaient très faibles
liquide - HPLC (0,5 ml/min...)

• On alors essayé d’accélérer le processus en travailler

sous pression mais l’augmentation du débit provoquait
une augmentation de H --> une diminution de l’efficacité

1 2
 Introduction Introduction
• On a vite compris que pour améliorer les performances
il fallait diminuer la granulométrie du support • A la fin des années 60, on a commencé à utiliser des
supports d’une granulométrie de 5 a 10 microns

• On parle alors de chromatographie liquide à haute

performance (HPLC) car on va utiliser des appareils
beaucoup plus sophistiqués qu’au début

• 5 applications principales de la chromato en phase

liquide sont: chromato de partage (liquide/liquide),
chromato d’adsorption (liquide/solide), la chromato par
échange d’ions, la chromato sur gel de perméation
(exclusion) et la chromato par gel de filtration
(exclusion)

3 4
 Introduction Introduction

• Pour les grosses molécules, on utilise le chromato

d’exclusion

• En raison de sa polyvalence et du vaste domaine de ses

applications, l’HPLC est la technique la plus utilisée des
techniques de séparation

• Soit sur colonne, soit sur surface plane = chromato

planaire

• On va d’abord parler de la chromato en phase liquide

sur colonne

5 6
 Appareillage
• On doit utiliser des pressions de plusieurs centaines de
bar pour assurer des débits corrects avec des supports
de très faible granulométrie

• L’appareillage est donc plus élaboré et plus couteux que

les autres types de chromatographie
Appareillage

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 Appareillage Appareillage

• On utilise des réservoirs contenant du solvant

• On élimine les poussières et le gaz dissous

• Si on travaille avec un gradient d’élution, on a besoin de

plusieurs réservoirs et d’une vanne proportionnelle

• Cette programmation de solvant (solvants à polarité

différente) permet d’améliorer la séparation (comme la
programmation de T° en GC)

• Loi d’Everett: ln k’ = m * ln %organique + p

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 Appareillage Appareillage

• Pouvoir d’élution par ordre croissant des solvants • Il faut aussi faire attention à la viscosité de la phase
classiques en HPLC phase inverse: mobile —> grand influence sur la pression de travail

• Eau - Méthanol - Acétonitrile - Acétate d’éthyle - • La pression de travail avec l’acétonitrile est plus basse
Dichlorométhane - Hexane qu’avec le méthanol

• Il faut toujours essayer de mettre en solution • Attention également au seuil de coupure (voir UV/
l’échantillon dans le même solvant que la phase mobile Visible)
que l’on va utiliser
• ACN = 190 nanomètre
• Quand on fait des mélanges de solvants, attention à la
miscibilité des solvants entre eux • MeOH = 210 nanomètre

11 12
 Appareillage Appareillage

• Le système de pompage doit permettre de monter à 420 • On injecte généralement l’échantillon à l’aide d’une
bars, sans pulsations, avec un débit suffisant (0,1-10 ml/ seringue à travers un septum
min), en contrôlant ce débit (5%) et résister à la
corrosion des solvants • Procédure peu reproductible et limitée à 100 bars

• On utilise une pompe alternative --> pulsations que l’on • On utilise plus régulièrement des boucles d’injection
élimine ensuite
• Elles peuvent délivrer entre 5 et 500 microlitres de
manière beaucoup plus reproductible

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Appareillage Chromatographie

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 Appareillage Appareillage
• Les colonnes de HPLC sous souvent en inox
• En effet, les solvants que l’on utilise doivent être de
grande pureté et donc cher
• Longueur entre 10 et 30 cm, diamètre colonne entre 4
et 10 mm et diamètre des particules entre 5 et 10
microns (limite de pression) • Voilà ce que l’on peut obtenir avec ce genre de colonne
en 15 s
• Entre 40 000 et 60 000 plateaux théoriques par m

• On commercialise maintenant des microcolonnes (plus

petites, plus fines) qui permettent de réduire la
consommation de solvant

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 Appareillage
• Le remplissage des colonne HPLC se fait généralement
avec des grains de silice
• Ces grains sont recouverts d’un fin film organique
• Utilise aussi de l’alumine, des polymères poreux,...
• Grains de silice greffée NH2, CN, Alcool,... --> polaire -->
phase mobile apolaire (hexane, + ACN, CHCl3,...)
Appareillage
• Grains de silice greffée avec des chaines carbonées (C8 -
C18) --> phase stat apolaire
• Phase mobile ACN, Méthanol, eau --> polaire
• Les composés apolaires sont retenus
• Appelé chromato en phase inverse

• Les composés polaires sont retenus

• Appelé chromato en phase normale

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 Appareillage Appareillage
• On place souvent un colonne de protection avant la
• Dans de nombreux cas, une régulation stricte de la
colonne analytique = colonne de garde
colonne est nécessaire
• Permet augmenter la durée de vie de la colonne car on
• Mais on peut aussi très bien travailler à la T° ambiante
enlève les poussières et contaminants dans le solvant
• Soit via des résistances et des ventilos, soit via un circuit
• Ces colonnes de garde ont les mêmes dimensions que la
d’eau thermostatisé
colonne analytique si ce n’est une taille de particule plus
grande afin de minimiser les pertes de charge

21 22
 Appareillage Appareillage
• Il n’y a pas de détecteurs universels en HPLC aussi
sensibles qu’en GC

• Le détecteur utilisé est donc fonction de l’échantillon

que l’on analyse

• Les détecteurs les plus répandus sont basés sur

l’absorption d’un rayonnement UV ou visible

• Il s’agit de spectromètres conçus pour être intégrés à un

dispositif d’HPLC

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 Appareillage Appareillage
http://chemistry4all-zaki48.blogspot.com/
• On travaille parfois avec des sources continues (D2, W2)
+ filtres interférentiels pour isoler une longueur d’onde
à laquelle le composé absorbe

• Les appareils les plus sophistiqués possèdent un disque

formé de plusieurs filtre afin de pouvoir travailler à la
longueur d’onde voulue

25 26
 Appareillage Appareillage
• Un autre type de détecteur mesure la variation de
l’indice de réfraction du solvant due à la présence des
molécules d’analyte

• Ce détecteur est n’est pas sélectif

• Mais sa sensibilité est un peu limitée

• On peut utiliser des détecteurs électrochimiques qui

effectuent des mesures potentiométriques,
conductométrique, voltampérométrique,...

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 Appareillage `UPLC
• UPLC = évolution de l’HPLC « classique »

• Comme on travaille en phase liquide, les coeff de

diffusion sont plus faibles qu’en gaz

• Pour améliorer l’efficacité (diminuer H), on peut alors

diminuer la granulométrie

• Mais alors on augmente les pertes de charge —>

augmentation de la pression de travail

• On est donc limité à des diamètres de 3 microns et des

pressions de 400 bars

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 UPLC
• 2 possibilités:

• Augmenter la température —> diminue la visco —>

améliore les coef de diffusion —> améliore l’efficacité
MAIS attention aux composés thermosensibles

• Diminuer la granulométrie = UPLC

Chromatographie de partage
• Travaille avec des particules de 2 microns ou moins

• Gamme de débit plus large pour une même efficacité

(Van Deemter) —> augmentation de la vitesse d’analyse

• Pression entre 550 et 1000 bars

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 Chromato de partage Chromato de partage
• Cette chromatographie de partage peut être divisée en 2
• Actuellement, la grande majorité des applications se fait
techniques: la chromato liquide - liquide et liquide -
avec une phase stationnaire greffée
phase greffée

• En liquide - liquide, la phase stationnaire est un solvant

immobilisé par adsorption physique à la surface des
particules du support

• En liquide - phase greffée, la phase stationnaire est une • Les supports à phase greffée sont préparés par la
réaction d’organochlorosilane avec des groupements OH
espèce organique attachée par des liaisons chimiques à la
surface des particules du support préalablement formés à la surface de particules de silice

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 Chromato de partage Chromato de partage

• Les supports à phase greffée sont beaucoup plus stables

que les liquides immobilisés car on forme des liaisons
chimiques

• L’inconvénient des phase greffée est leur capacité faible

--> volume d’échantillon doit être faible
• R est généralement C8 ou C18
• Avec les liquides immobilisés, on doit traiter
• Beaucoup d’autres groupements ont été greffés sur la régulièrement la colonne car au fil des analyses, un peu
sicilice --> gamme large de polarité pour la phase de phase stationnaire est décrochée
stationnaire

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 Chromato de partage Chromato de partage

• Lors d’une chromatographie de partage, on peut • Le constituant le moins polaire est donc élué en 1er
travailler en phase normale ou en phase inversée
• L’augmentation de la polarité de la phase mobile réduit
• Pour cela, on joue sur la polarité des différentes phases son temps d’élution

• La chromatographie normale est la 1ère qui a été

développée
• En chromato inverse, la phase stationnaire est apolaire
• On utilise une phase stationnaire polaire et une phase alors que l’on utilise un solvant polaire pour la phase
mobile apolaire mobile

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 Chromato de partage
• Ici, le composé le plus polaire est élué en 1er
• Une augmentation de la polarité de la phase mobile
augmente donc son temps de rétention
• Actuellement, on travaille majoritairement avec des
supports greffés C8 ou C18 et en mode inversé
• Chaînes hydrocarbonées sont perpendiculaires et la
phase mobile est souvent constituée d’eau et d’un autre
solvant (méthanol, acétonitrile,THF,...) dans des
proportions définies
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Chromato de partage
• Pour que la chromato de partage soit efficace, il faut un
équilibre correctement choisi entre la polarité de la
phase mobile, de la phase stationnaire et de l’analyte
• Il existe des classements de polarité des différents
groupements ou solvants utilisés
• Généralement, on adapte la polarité de la phase
stationnaire à celle de l’analyte (pour qu’il soit retenu) et
on travaille avec une phase mobile de polarité
complètement différente
• Mais attention aux temps de rétention...
40
 Chromato de partage

• Les applications de cette technique sont nombreuses:

Chromatographie d’adsorption

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 Chromato d’adsorption Chromato d’adsorption

• C’est la méthode originale de la chromatographie • La silice et l’alumine finement divisés sont les phases
stationnaires utilisées
• Adsorption d’un analyte à la surface de la phase
stationnaire qui est un solide finement divisé • Majoritairement la silice

• L’analyte est en compétition avec la phase mobile pour • Plus l’analyte est polaire, est plus les temps de rétention
occuper les sites de la surface solide augmentent

• La rétention résulte de l’importance relative des forces • Si on veut modifier les coefficients d’adsorption, on ne
d’adsorption peut modifier que la polarité que de la phase mobile
(contrairement à avant car on modifiait les groupements
greffés à la phase stationnaire)

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 Chromato d’adsorption
• Le changement de solvant entraine des variations
importante des temps de rétention

• Souvent, on utilise un mélange de solvant et/ou un

gradient de solvant
Chromatographie par échange
• L’HPLC liquide-solide permet de séparer des composés
organiques relativement non polaires, insolubles dans
d’ions
l’eau et de masses molaires inférieures à 5000

• Permet (contrairement aux autres techniques) de

fractionner des isomères comme des dérivés du benzène
substitués en méta et en para

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 Chromato d’échange d’ions
• Dans cette technique, on utilise des résines échangeuses
d’ions comme phase stationnaire
• Des ions de même signe sont séparés par élution dans
une colonne remplie d’une résine finement divisée
• Ces résines échangeuses d’ions sont des polymères de
masse moléculaire élevée
• Elles contiennent de nombreux groupements
fonctionnels ionique
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Chromato d’échange d’ions
• Les résines échangeuses de cations peuvent être soit
de type acide fort (acide sulfonique RSO3-H+) soit de
type acide faible (acide carboxylique RCOOH)
• Les résines échangeuses d’anions contiennent des
groupements amine basiques (RN(CH3)3+OH-)
• Les cations ou les anions échangent avec les sites
actifs de la résine --> ils sont retenus
48
Chromato d’échange d’ions Chromato d’échange d’ions
• Lors d’une chromato par échange d’ions, les ions
d’analytes sont introduits au sommet d’une colonne
remplie d’une résine correctement choisie

• L’élution se fait par une solution qui contient un ion qui a

une plus grande affinité que l’ion de l’analyte vis à vis des
sites réactionnels de la résine

• Par exemple, on vient fixer un analyte contenant un

mélange de chlorure, de thiocyanate, de sulfate et de
phosphate sur une résines qui possède des sites OH-

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 Chromato d’échange d’ions Chromato d’échange d’ions
• On effectue l’élution avec une solution basique diluée ce • = Chromatographie ionique (1975)
qui libère les anions
• Utilisée pour séparer et doser des espèces chargées
• La différence des coefficients de distribution des anions (organique ou non)
provoque la séparation
• Ces détecteurs de conductivité sont sensibles, universels,
simple, peu couteux, utilisable longtemps,...

• On peut facilement coupler cette technique avec une • Le seul inconvénient est que la conductivité de la phase
mesure de conductivité afin de détecter les substances mobile masque celle de l’analyte --> diminution de la
et en déterminer la concentration sensibilité

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 Chromato d’échange d’ions Chromato d’échange d’ions
• Il existe actuellement des systèmes de micromembranes
• Pour contrer cela, on a ajouté une colonne de qui travaillent en continu
neutralisation de l’éluant placée en sortie de la colonne
échangeuse d’ions
• Cette technique est la plus efficace et la plus rapide pour
séparer et doser des anions
• Cette colonne est remplie d’une autre résine qui
transforme les ions de l’éluant en une espèce
moléculaire sans modifier la conductivité due aux ions
de l’analyte
• Il y a peu, on a commercialisé des appareils de chromato
ionique à colonne unique grâce à l’amélioration des
• Pour les anciennes colonnes de neutralisation, il fallait
détecteurs
régénérer la résine régulièrement (8-10h d’utilisation)
afin de recréer les sites acides ou basiques originels

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Chromato d’échange d’ions

Chromatographie d’exclusion

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 Chromato d’exclusion
• = chromato sur gel
• Plus récente des méthodes chromatographiques
• Utilisée pour des espèces de masse moléculaire élevée
• Le support est constitué de petites particules de
polymère ou de silice contenant un réseaux de pores et
de canaux dans lesquels les molécules de soluté peuvent
être piégées
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Chromato d’exclusion
• Le temps de séjour des molécules dépend de leur taille
• Les grosses molécules ne sont quasi pas retenues dans
les pores et sortent en 1er
• Les petites molécules sont facilement piégées dans les
labyrinthes et donc restent longtemps dans la colonne
• Le taux de pénétration dans les pores dépend du
diamètre des particules
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 Chromato d’exclusion
• Le fractionnement d’une même espèce dépend
directement de la diversité des tailles
• La grosse différence par rapport aux autres méthodes
chromatographiques est que cette technique ne fait
intervenir aucune interaction physique ou chimique
• On essaye même d’annuler au maximum ces interactions
• La séparation ne se fait que via la taille des particules =
exclusion stérique
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Chromato d’exclusion
• Divers matériaux possibles dans les colonnes d’exclusion
• Si la phase mobile est aqueuse, on utilise des matériaux
hydrophiles --> filtration de gel pour séparer les
composés polaires
• Si la phase mobile est un solvant organique non polaire
on utilise des matériaux hydrophobes --> perméation de
gel pour séparer les composés apolaires
• Large gamme de diamètre des pores
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 Chromato d’exclusion Chromato d’exclusion
• On peut alors passer cet échantillon dans une chromato
• Dans une même colonne, on peut séparer des composés d’exclusion
de masse molaire moyenne = qques centaines à plusieurs
millions
• On obtiendra une distribution Gaussienne de la masse
moléculaire en fonction du nombre
• Une autre application de la chromatographie d’exclusion
est la détermination de la masse moléculaire ou de la
distribution de masses moléculaires d’un polymère

• Lors de la synthèse d’un polymère, on n’obtient pas un

composé qui a 1 seule masse moléculaire mais des
milliers de chaines de longueur (et donc de masse
moléculaire) différente

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