Introduction

• Méthode analytique largement utilisée pour séparer,

identifier et doser des constituants chimiques même
dans des mélanges complexes

• Découverte par un russe, Mikhail Tswett (1906),

Chromatographie botaniste

• Dans des colonnes en verre remplies de carbonate de

calcium très fin, il a déposé des des solutions de
pigments végétaux (chlorophylles,...)

1 2
 Introduction
• En ajoutant du solvant pur au dessus de la colonne, les
pigments se sont déplacés
• Il constata une vitesse d’entrainement différente entre
les pigments --> une séparation
• Bandes colorées le long de la colonne
• Prix Nobel de chimie en 1952
3 4
Introduction
• Difficile de donner une définition à la chromatographie
tellement la diversité des systèmes et des techniques est
nombreuse
• Chromatographie = technique dans laquelle les
constituants d’un mélange se séparent en fonction des
vitesses auxquelles ils sont entraînés à travers une phase
stationnaire par une phase mobile gazeuse ou liquide
• Toutes les méthodes utilisent une phase stationnaire et
une phase mobile
 Introduction
• Phase stationnaire = phase qui reste en place dans une
colonne ou sur une surface plane
• Phase mobile = phase qui se déplace à travers la phase
stationnaire en entrainant l’analyte avec elle
• 2 grands types de méthodes chromatographiques: en
colonne ou planaire
5 6
Introduction
• En chromatographie sur colonne, la phase stationnaire
est maintenue dans un tube étroit et la phase mobile y
progresse par gravité ou sous l’action d’une différence de
pression
• En chromatographie planaire, la phase stationnaire est
présente à la surface d’un support plat (chromatographie
sur couche mince) ou immobilisée à l’intérieur des pores
d’une feuille de cellulose (chromatographie sur papier)
• La phase mobile se déplace à travers la phase
stationnaire par capillarité ou sous l’effet de la gravité
 Introduction Introduction
• Les différentes méthodes se classent en 3 catégories
selon la nature de la phase mobile: liquide, gaz ou fluide
supercritique

• Dans la chromatographie en phase en phase liquide, on a

5 types de chromato

• 3 types de chromato en phase gazeuse

• Les différents types varient par la nature de la phase

stationnaire

7 8
 Elution
• 2 espèces A et B se séparent dans une colonne par le
processus d’élution

• Elution = entraînement d’un soluté à travers une

colonne par addition continue d’un solvant frais

Elution • On prépare un volume connu d’échantillon contenant A

et B que l’on dissout dans la phase mobile

• On introduit au sommet de la colonne (t0) et les

constituant A et B se distribuent entre les 2 phases

9 10
 Elution
• L’ajout de phase mobile neuve (= éluant) entraîne
l’échantillon le long de la colonne
• De nouveaux équilibres se forment entre la phase
mobile et la phase stationnaire
• L’avancée du solvant entraîne les molécules de soluté
vers le bas de la colonne en une série continue de
transfert entre les 2 phases
• La vitesse moyenne de progression d’un composé
dépend du temps qu’il passe en phase stationnaire
11
Elution
• Le temps est long pour des solutés fortement retenus
par la phase stationnaire (B) et plus court lorsque la
rétention est plus faible (A)
• = temps de rétention
• La différence des vitesses amène la séparation des
constituants sous forme de bandes dans la colonne
• La séparation est complète lorsque l’on ajoute
suffisamment d’éluant pour que les bandes individuelles
sortent de la colonne individuellement pour être
recueillies
12
 Elution

Chromatogramme

13 14
 Chromatogrammes Chromatogrammes
• On place un détecteur en sortie de colonne qui répond
à la concentration en analyte

• On enregistre son signal en fonction du temps (ou du

volume d’éluant)

• On obtient une série de pics = chromatogramme

• On utilise ce graphique aussi bien en analyse qualitative

(position des pics sur l’axe du temps) qu’en analyse
quantitative (aires sous les pics)

15 16
 Chromatogrammes Elution
• Comme B est plus retenu que A, au fur et à mesure du
temps, les pics s’éloignent les uns des autres

• Par contre, les pic s’élargissent au cours du temps -->

diminue l’efficacité de la séparation

• On peut travailler dans des conditions opératoires telles

que la vitesse d’élargissement est très faible par rapport
à la vitesse de séparation

17 18
 Chromatogrammes Chromatogrammes
• Les vitesses d’élargissement des pics et de séparation
sont influencées par différents paramètres chimiques ou
physiques

• Pour améliorer la séparation, on peut soit augmenter la

vitesse de séparation ou diminuer la vitesse
d’élargissement

• a: problème

• b: augmente la séparation

• c: diminue la largeur
19 20
 Chromatographie
• Le pouvoir de séparation dépend des vitesses d’élution
• Ces vitesses sont déterminées par les coefficients de
distribution des solutés entre les 2 phases
• Les séparations sont basées sur les différences de
répartitions (affinités) des solutés entre la phase mobile
et la phase stationnaire
• K = coeff distribution = rapport entre la C soluté ds
phase stat et la C soluté ds phase mobile
21
Chromatographie
• On a déjà vu que le temps de rétention correspond au
temps entre l’injection de l’échantillon et l’apparition
d’un pic de soluté sur le détecteur d’un colonne
chromato
• Il existe aussi le temps mort
• C’est le temps mis par une espèce non retenue par la
phase stationnaire pour arriver au détecteur
• Paramètre important pour l’identification des pics
22
 Chromatographie Chromatographie
• Souvent, l’échantillon contient déjà une telle espèce (non
retenue)

• Si pas, on en ajoute une

• vitesse soluté = L / tR

• vitesse de la phase mobile = L / tM

23 24
 Chromatographie Chromatographie
• v = u * (1 / (1 + K Vs /Vm)) • Permet de décrire la vitesse de progression d’un soluté
dans la colonne
• vitesse du soluté est fonction de la vitesse de la phase
• Si ce facteur est plus petit que 1, il est très difficile de
mobile, du coefficient de distribution et des volumes de
déterminer le temps de rétention d’un soluté car
phase mobile et de phase stationnaire
l’élution est trop rapide
• On peut connaître ces volumes en connaissant la
géométrie interne de la colonne • Si ce facteur est supérieur à 20, les temps d’élution sont
trop longs
• Facteur de capacité: k’A = tR - tM / tM
• Idéal: entre 1 et 5

25 26
 Chromatographie
• Le facteur de sélectivité α d’une colonne pour 2 espèces
A et B = tRB - tM / tRA - tM

• On peut donc déterminer ce facteur de sélectivité

expérimentalement à partir d’un chromatogramme
Elargissement des bandes et
• Pour modifier ces différents facteurs donc les vitesses
donc les tR donc la séparation, on peut jouer sur la
efficacité des colonnes
composition de la phase mobile, de la phase stationnaire,
de la température d’injection,...

27 28
 Chromatographie Chromatographie
• N = L / H avec L = longueur de la colonne
• L’efficacité d’une colonne dépend du degré
d’élargissement du pic
• L’efficacité augmente si le nombre de plateaux
théoriques augmente ou si H diminue (pour un L donné)
• Afin d’expliquer la forme et la largeur des pics, on se
base sur la théorie cinétique et le mouvement brownien
• L’efficacité peut fortement varier en fonction du type de
colonne et de la nature des 2 phases
• On observe que les pics d’élution ressemblent à des
courbes de Gauss
• Le nombre de plateaux théoriques peut varier de qques
centaines à plusieurs centaines de milliers
• L’efficacité d’une colonne s’évalue à partir de 2 termes: la
hauteur équivalente à un plateau théorique (H) et le
nombre de plateaux théoriques (N) • La hauteur d’un plateau est de l’ordre de grandeur du
millimètres maximum

29 30
 Chromatographie Chromatographie
• On considère la colonne comme si elle était constituée
d’une série de plateaux

• A chaque plateau, l’équilibre est atteint

• Alors, on devrait avoir un pic unique, sans largeur

• Mais en pratique, l’équilibre n’est jamais atteint ce qui

explique (très simplement) la forme Gaussienne des pics
• N = 16 *(tR/W)2
• On considère alors ces termes uniquement comme des
indicateurs d’efficacité d’une colonne H = LW2 / 16tR2
•
• Prix Nobel 1952
31 32
 Chromatographie Chromatographie
• L’élargissement des pics et donc la perte d’efficacité
provient de la vitesse des processus de transfert pendant
la progression du soluté

• Certains paramètres peuvent affecter ces vitesses de

transfert afin d’améliorer les séparations

• L’un des plus important est la vitesse d’écoulement de la

phase mobile

33 34
 Chromatographie Chromatographie
• L’importance de la cinétique sur l'efficacité d’une
colonne dépend principalement du temps de contact
entre la phase mobile et la phase stationnaire

• Pour étudier l’efficacité d’une colonne, on détermine

généralement H (équation) en fonction de la vitesse de la
phase mobile

35 36
 Chromatographie Chromatographie
• A cause des pertes de charge, la longueur d’une colonne
• On remarque que l’on a toujours un minimum dans la
en phase liquide est de max 50 cm
courbe --> une efficacité maximale

• On remarque aussi que les vitesses d’écoulement en • Alors qu’en phase gazeuse, on peut aller jusqu’à 50 m...
phase liquide doivent être beaucoup plus faibles que les
vitesses en phase gazeuse • Donc, le nombres de plateaux théoriques en phase
gazeuse et beaucoup plus grand qu’en phase liquide
• On remarque aussi que la hauteur théorique d’un
plateau est beaucoup plus petite en phase liquide --> • L’efficacité est donc meilleure
meilleure efficacité

• Mais...

37 38
 Chromatographie
• Cela fait 40 ans que l’on essaie de relier H (donc
l’efficacité d’une colonne) aux paramètres vu dans le
tableau
• Au moins 12 formules ont été publiées pour établir cette
relation avec plus ou moins de succès
• Aucune relation parfaite n’a été trouvée mais certaines
peuvent être utilisées pour améliorer l’efficacité d’une
colonne
39
Chromatographie
• H = B/u + Cs*u + Cm*u
• B coefficient de diffusion longitudinal = terme
proportionnel à Dm = coefficient de diffusion dans la
phase mobile
• En effet, on a vu que l’analyte avance sous forme de
bande dans la colonne (et pas un un bloc)
• L’analyte a donc tendance à migrer du centre de la bande
(+ concentré) vers le haut ou le bas de ce centre (+
diluée) --> étalement des pics
40
 Chromatographie Chromatographie
• Cm*u = transfert de masse dans la phase mobile
• Cause majeure de l’élargissement des pics en phase
gazeuse
• L’élargissement du pic dans la phase mobile est dû à la
multitude de trajets que peut prendre une molécule
• Plus limité en phase liquide (car vitesse de diffusion plus
pour traverser une colonne remplie
faible)

• Cs*u = coefficient de transfert de masse de la phase
stationnaire = fct de Ds et df
• Les longueurs des trajets peuvent donc varier de
manière importante
• Le temps de séjour des molécules peut donc aussi varier
fortement

41 42
Chromatographie Chromatographie
• Les molécules arrivent donc au détecteur à des temps
différents ce qui provoque l’élargissement des pics

• = phénomène de diffusion turbulente

• Un autre phénomène diminue l’efficacité d’une colonne

• La présence de zone stagnante de phase mobile piégée

dans les pores d’une phase stationnaire

• Le soluté doit alors d’abord diffuser à travers ce liquide

avant d’entrer en contact avec la phase stationnaire et
effectuer un transfert

43 44
Chromatographie Chromatographie
• On remarque l’effet de chaque terme sur l’efficacité
d’une colonne

• Il existe donc une vitesse d’écoulement optimale qui

minimise H et qui donne une efficacité de séparation
maximale

45 46
 Chromatographie Chromatographie
• Le diamètres des particules qui remplissent la colonne et le
diamètre de la colonnes sont des paramètres très
importants

• Une diminution de la granulométrie permet de diminuer la

hauteur équivalente d’un plateau théorique (graphique)

• On tend aussi à diminuer le diamètre des colonnes

• En phase gazeuse, on peut diminuer la vitesse de diffusion

linaire en diminuant la température

• En phase liquide, on diminue l’épaisseur du film liquide

47 48
 Chromatographie
• La résolution d’une colonne (Rs) est une mesure de son
aptitude à séparer deux analytes

• Rs = 2*delta Z / Wa + Wb

• Delta Z = différence des tR des composés

Résolution d’une colonne
• Wa (et Wb) largeur des pics au niveau des tangentes

• Une résolution de 1,5 permet une séparation complète

• On peut augmenter la résolution en allongeant la

colonne (plus de plateaux théoriques) mais alors on
augmente les temps de rétention
49 50
Chromatographie Chromatographie

• α le facteur de sélectivité

• k’b le facteur de capacité de l’espèce la plus lente

51 52
 Chromatographie
• Le but de la chromatographie est d’obtenir la meilleure
résolution possible en un minimum de temps
• Il faut faire un compris entre les 2
53
Chromatographie
• Ces formules vont guider le choix des conditions
opératoires pour obtenir la résolution souhaitée en un
minimum de temps
• On voit 3 parties dans ces formules:
• La 1ère partie correspond à l’efficacité de la colonne (N
ou H)
• La 2ème partie contient le facteur de sélectivité qui
dépend des propriétés des 2 solutés
• Le 3ème terme contient le facteur de capacité qui
dépend du soluté et de la colonne
54
 Chromatographie Chromatographie
• Les données suivantes se rapportent à une colonne • Calculer:
chromatographique: - le nombre de plateaux théoriques pour chaque composés
- Longueur de la colonne: 24,7 cm - le nombre de plateaux théoriques moyen
- Vitesse d’écoulement: 0,313 ml/min - la hauteur équivalente à un plateau théorique
Un chromatogramme d’un mélange de A, B,C et D a fourni
les données suivantes: • Pour A, B, C et D, calculer:
- le facteur de capacité
tR (min) W (min)

Non retenu 3,1 / • Pour les composés A et B, B et C et C et D, calculer:

- la résolution
A 5,4 0,41 - le facteur de sélectivité
B 13,3 1,07
Pour B et C,
- la longueur de la colonne nécessaire pour séparer les 2
C 14,1 1,16 composés avec une résolution de 1,5
D 21,6 1,72 - le temps d’élution du composé C avec cette nouvelle
colonne
55 56
 Chromatographie Chromatographie
• Pour optimiser, on peut jouer sur le terme d’efficacité en
• On peut modifier le facteur de capacité pour améliorer
augmentant N (nombre de plateaux théoriques) la sélectivité
• Mais alors on doit augmenter la longueur de la colonne
• Une augmentation de k’b améliore la résolution mais
et donc les temps de rétention
augmente le temps de rétention (fct cubique)
• Donc, on peut diminuer H
• On travaille généralement entre 1 et 5
• Pour cela, on a déjà vu que l’on pouvait diminuer la
• Au dessus de 5, la résolution augmente peu mais le
granulométrie, diminuer le diamètre de la colonne, temps d’élution augmente fortement
diminuer la T° de la colonne (phase gazeuse), diminuer
l’épaisseur du film liquide (phase liquide) et optimiser la
vitesse d’écoulement de la phase mobile

57 58
Chromatographie Chromatographie
• On peut modifier le k’ en phase gazeuse en modifiant la
température

• En phase liquide, on peut changer la composition du

solvant pour améliorer la séparation

59 60
Chromatographie Chromatographie
• Si on a un α proche de 1, on ne sépare pas
correctement 2 composés

• Mais augmenter α entraine une augmentation de k’ et il

faut rester en dessous de 10 max

• Pour augmenter α, on peut modifier la composition de la

phase mobile (phase liquide), modifier la température de
la colonne, modifier la composition de la phase
stationnaire ou utiliser des effets chimiques spéciaux

• Ceux si vont réagir spécifiquement avec l’un des

composés à séparer

61 62
 Chromatographie Chromatographie
• Lorsque l’on est en présence de mélanges complexes, il
est souvent compliqué de trouver les bons paramètres
pour tous les composés

• Exemple d’un mélange de 6 composants groupés 2 par 2

63 64
 Chromatographie
• Dans ce cas, on va modifier les conditions qui
déterminent k’ au cours de la chromato
• Au début de la séparation, on va se placer dans les
conditions du graphique a jusqu’au moment ou on
sortira correctement 1 et 2
Chromatographie
• En phase liquide, on fait cela en modifiant la composition
de la phase mobile pendant l’élution = gradient de
composition ou programmation de solvant
• En phase gazeuse, on joue sur la température =
programmation de température

• Ensuite, on modifie les conditions pour sortir

correctement 3 et 4 (graphique c)

• Ensuite, on poursuit l’élution avec les conditions qui

permettent de séparer 5 et 6

65 66
 Chromatographie
• Outil puissant et polyvalent pour séparer des substances
chimiques très semblables

• Utilisée aussi bien en qualitatif qu’en quantitatif

• En qualitatif, on l’utilise pour mettre en évidence la

Applications présence ou l’absence de substances dans des mélanges
plus ou moins complexes

• Par contre, la chromato ne fournit qu’1 seule information

sur chaque espèce (le temps de rétention)

67 68
 Chromatographie Chromatographie
• La technique montre donc ses limites en présence d’un • Souvent, on ne sait pas identifier tous les composants
mélange complexe et inconnu d’un mélange mais on s’assure de l’absence d’une espèce

• On remédie à cela en couplant la sortie des colonnes • Si on a pas de pic au même temps de rétention qu’un
des spectromètres UV, IR ou de masse étalon que l’on a injecté, on peut affirmer que le
composé n’est pas présent
• Ex: GC-MS à l’école, HPLC+voltampéro

• La chromato va donc séparer les composés et le

spectromètre les identifier

69 70
 Chromatographie Chromatographie
• La chromatographie est aussi répandue et utilisée car • La hauteur des pics (entre le sommet et la ligne de base)
elle est rapide, simple et son coût est relativement peu est une mesure fiable si on contrôle précisément la
élevé température, la vitesse de l’éluant et l’injection

• Son domaine d’application est extrêmement large • La vitesse d’injection est critique et des erreurs de 5 à
10% sont possibles si on injecte avec une seringue
• Le plus important, c’est la possibilité de doser les
substances

• Pour cela, on se base sur l’aire des pics ou la hauteur des

pics par rapport à des étalons

• Ces 2 paramètres varient linéairement avec la

concentration (conditions identiques)
71 72
 Chromatographie Chromatographie
• L’air des pics est indépendante de l’élargissement des • On utilise des séries d’étalons dont la composition est
pics proche de la solution inconnue

• On travaille de préférence avec ces aires • A partir des chromatogrammes des solutions étalons, on
établit un graphique de l’aire des pics en fonction de la
• Les appareils possèdent un intégrateur électronique concentration

• Si pas, on multiplie la hauteur par la largeur à mi-hauteur • La source d’erreur principale est le volume injecté
du pic
• Généralement très faible (10 micro litre) --> grandes
erreurs possibles surtout avec microseringue

73 74
 Chromatographie Chromatographie
• En chromato gaz, on injecte à haute température -->
possibilité de pertes par évaporation

• Les appareils modernes utilisent une boucle

d’échantillonnage

• On remplit d’abord la boucle de liquide puis on tourne la

vanne pour entraîner le contenu dans la colonne

• Le volume injecté est alors reproductible

75 76
 Chromatographie
• Pour obtenir une meilleur précision, on utilise des
étalons internes
• Dans chaque étalon, on ajoute une quantité exactement
connue d’un composé non présent dans le mélange de
base
• Le rapport entre l’air du pic de l’inconnu et l’air du pic
de l’étalon est notre paramètre analytique
• Si la méthode est bien mise en oeuvre, on obtient des
erreurs de moins d’1 %
77
Etalon interne
• Dans un vial contenant des quantités connues des nos
composés, on ajoute une quantité connue d’un étalon
interne
• Une telle substance doit avoir un temps de rétention
proche des composés à doser mais son élution ne doit
pas interférer
• Le rapport de la masse sur l’aire du pic d’un composé
est proportionnel avec le rapport de la masse sur l’aire
du pic du sdt interne
• Ce facteur de proportion s’appelle le facteur de
réponse
78
 Etalon interne Etalon interne
• Pour vérifier, on peut recommencer l’opération avec un
• Une autre possibilité est d’établir une droite
2ème vial étalon contenant des autres masses —> des
d’étalonnage Aire analyte / Aire sdt en fonction de la C
autres aires —> même facteur de réponse en analyte
• On analyse alors notre vial inconnu auquel on ajoute une
• Plusieurs étalons de concentrations différentes en
quantité connue de sdt interne l’analyte et la même concentration en étalon interne
• Etant donné qu’on connait les facteurs de réponse de
• Plus long car droite d’étalonnage complète
chaque composé, on peut calculer la masse des différents
composés
• Voir fichier excel
• Facile et rapide car on a besoin que d’1 seul étalon (2
pour être sur) • Exercice

• Le plus compliqué est de 79trouver un bon sdt interne 80