Technique biochimique

chromatographi
e
Plan:
*Définition
*Différents types de chromatographies
*Terminologie générale de la chromatographie
*Chromatographie liquide
*Principales grandeurs de chromatographie
Définition:
Étymologiquement, la chromatographie signifie l'image en
couleur et c’est une technique qui permet la purification et la
caractérisation des molécules C’est une technique qui met en
jeu deux phases: une phase mobile et une phase stationnaire.
C’est une méthode de séparation des constituants d un
mélange par entraînement de la phase mobile (liquide ou gaz)
le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide fixé).
Chaque molécule à séparer est soumise à deux forces:
Force de rétention: qui correspond à l affinité du soluté pour la
phase fixe .
Force de mobilité ou d’entraînement de soluté par la phase
mobile:
La résultante des deux forces est différente, ce qui permet une
Différents types de chromatographie:
Selon la nature de la phase mobile, nous distinguons la phase
mobile liquide ou gazeuses.
Si la phase mobile est liquide: chromatographie en phase liquide
Si la phase mobile est un gaz: chromatographie en phase gazeuse.
1) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE:
Selon la nature de la phase stationnaire, nous distinguons
différents types 1.1) La phase stationnaire est un liquide c’est
une chromatographie liquide-liquide
1.2) La phase stationnaire est un solide c’est une
chromatographie liquide-solide: 5 possibilités
*CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITÉ:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est un solide sur le quel est greffé des
effecteurs qui présentent une affinité Ac-Ag, enzyme –substrat,
hormerecepteur.
*Chromatographie adsorption phase inversée:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est solide poreux portant des groupements
non polaires.
*Chromatographie adsorption phase normale :
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est solide poreux portant des groupements
polaires.
*CHROMATOGRAPHIE GEL FILTRATION,EXCLUSION DIFFUSION,
TAMISAGE MOLÉCULAIRE, PERMÉATION SUR GEL:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est solide poreux La séparation s’effectue en
fonction de la taille des particules. Les grosses seront exclues et
sortiront en premier Les plus petites diffusent dans le pores du gel
et sortiront les dernières . *CHROMATOGRAPHIE SUR ÉCHANGEURS
D IONS:
LIQUIDE –SOLIDE
La phase stationnaire est une résine porteuse de groupement
ionisé (-) ou (+). Les interactions sont du type électrostatiques .
2) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG)
La phase mobile est un gaz vecteur Si la phase stationnaire est
solide c’est la CHROMATOGRAPHIE GAZ –SOLIDE .
Si la phase stationnaire est liquide c’est la CHROMATOGRAPHIE
GAZ –LIQUIDE.
TERMINOLOGIE GÉNÉRALE DE LA CHROMATOGRAPHIE.

Chromatographie d’élution:
la phase mobile parcourt en permanence la phase stationnaire afin que
les solutés introduits à une extrémité de celle-ci sortent à l’extrémité
opposée. Dans cette méthode, la phase mobile est inerte vis-à-vis de la
phase stationnaire.
1) Colonne chromatographique :
C’est un tube cylindrique vertical de diamètre et longueur variable,
en
verre, métal, ou autre substance. Rempli de la phase stationnaire à
l’intérieur duquel s’opèrent les séparations chromatographiques.
2) Phase stationnaire:
C’est le produit qui, par ses affinités avec les solutés, va permettre
leur
séparation quand la phase mobile les déplacera .
3) Phase mobile ou éluant :
une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui déplace les solutés dans
la
phase stationnaire, jusqu’à ce qu’ils sortent de celle-ci .
4) Eluat :
5) Elution :
C est l’opération de récupération de soluté sous l’effet d’ un
solvant , éluant ou phase mobile .
6) Chromatogramme liquide:
Ensemble de fractions récupérées après élution .
7)Courbe d’élution:
C’est la représentation graphique de la concentration du soluté
dans l’éluat en fonction du temps de rétention ou volume de
rétention .
Procédure de chromatographie liquide:
Elle peut se faire soit: SUR UNE SURFACE PLANAIRE comme
couche mince ou papier (DEUST) SUR UNE COLONNE.
Phase mobile coule par gravité ou pression ambiante Phase
mobile coule sous pression imposée.
Grandeurs chromatographiques:
*le rapport de distribution K :
Représente la constante d'équilibre de la réaction ou de constante
de distribution, coefficient de distribution et coefficient de partage.
K est égal au rapport des concentrations du soluté A dans les deux
phases K = CS / CM
•CS : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase
stationnaire.
•CM : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase
VOLUME D'ÉLUTION D'UN COMPOSÉ :
(Ve ) : Ve = Vm + K.Vs
• Vm : volume mort de la colonne
• VS : volume de la phase stationnaire
• K : Rapport de distribution du composé entre la phase
stationnaire et la phase mobile
Volume d'élution d'un composé (Ve ) :
Ve= Vm + K.Vs
avec K = Ve -Vm/Vs et on sait que K = CS / CM
D’ou
K = CS / CM = (Ve - Vm) / Vs
•CS : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase
stationnaire.
•CM : concentration en mol/l à l'équilibre, du soluté dans la phase
mobile.
Chromatogramme ou courbe d’élution:
c’est la représentation graphique de la concentration des solutés
en fonction de des valeurs de rétentions (temps ou volume ) C est
un trace sur un papier enregistreur des réponses successives du
détecteur, au cours de l’élution des solutés hors des colonnes.
Valeurs de rétention:
Sont le temps ou volume de rétention, qui permettent de chiffrer
l’action d’une phase stationnaire donnée sur un soluté donné Si un
composé n'est pas du tout retenu: Il sort dans le volume de la phase
mobile contenu dans la colonne, Vm (appelé encore volume mort de
la colonne). Lorsque un composé est retenu, Le volume de rétention,
Vr, correspondant au maximum (au sommet) du pic d'élution.
Le volume ou le temps de rétention :
Le volume et le temps sont reliée par la formule du débit.
Vm(ml)= Tm(sec)D(ml/sec)
Avec V: volume mort
t:temps de rétention
D:débit de la phase mobile
Vr(ml)=Tr(sec) D(ml/sec)
Temps de rétention réduit:
tr’= tr –tm
tr: temps de rétention du soluté.
tm : temps mort.
Le facteur de capacité ou facteur de rétention K ou K’
c’est un facteur sans dimension Ne dépend pas du débit ni de la
longueur de la colonne
Donne une idée sur la distance entre les sommets de deux pics
consécutifs .
Le coefficient de sélectivité ou de rétention relative :
Ce facteur de sélectivité ou de séparation, sans dimension,

Le facteur de sélectivité exprime la position relative de 2 pics sur

le chromatogramme Donne idée sur l’efficacité de séparation entre
deux pics voisins
Coefficient de résolution de 2 pics (R) :
La résolution est la capacité de séparer des composés qui ont des
volumes (temps) de rétention proches. R Exprimée en termes de
volume de rétention ou temps de rétention, la résolution est définie
selon la formule suivante :
Conclusion:
Chromatographie liquide à haute performance (hplc):

La chromatographie HPLC est une technique d’analyse

qualitative et quantitative qui permet l'identification, la
séparation et le dosage de composés chimiques dans un
mélange liquide, même à l’état de traces. L’échantillon à
analyser contenant une ou plusieurs espèces est entraîné
par un courant de phase mobile au contact d'une phase
stationnaire. Chaque espèce présente migre à une vitesse
qui dépend de ses caractéristiques et de celles des deux
phases en présence. La technique chromatographique est
très utilisée dans plusieurs domaines de la science; en
particulier: - Industrie des produits pharmaceutique et
vétérinaires - Domaine environnementale (Pesticides,
Hydrocarbures…) - Dans la biologie -Analyse des
Chaine HPLC comprend: - Une
pompe quaternaire - Un
injecteur manuel - Trois
détecteurs: Fluorescence, UV,
Réfractomètre- Une colonne C18
phase inverse - Un logiciel
VARIAN Wspermet l’acquisition,
l’analyse et le traitement des
résultats.