La chromatographie

Chromatographie en
Phase Gazeuse
CPG
 1- Introduction générale sur la chromatographie

La chromatographie est une technique de séparation des constituants d‟un

mélange, dans le but d‟identifier ou de doser certains constituants du mélange.

Le principe est basé sur les différences d'affinité (lien) des composés du mélange

avec la phase stationnaire et la phase mobile

 Soluté: toute substance, constituant d‟un mélange, séparée par chromatographie.

 Phase mobile: le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté

 Phase stationnaire: (une phase immobile) c‟est un produit par ses affinités avec les

solutés, va permettre leur séparation quand la phase mobile les déplace,

1906: La découverte de la chromatographie (Michel TSWETT) a séparé des pigments
végétaux colorés

Russe, Tswett, en 1906 a séparé

des pigments végétaux colorés (Un
pigment est une molécule et non une
couleur c‟est un produit chimique qui
permet de créer une couleur sur
une colonne remplie de carbonate de
calcium, les pigments étaient
entraînés avec de l'éther de
pétrole (Phase mobile). Il a observé
sur la colonne la formation d‟une
bande de différente couleurs (vert,
orange, jaune..). Il a donné à
cette technique le nom de
chromatographie (écriture des
couleurs).

Séparation des substances absorbées par lavage progressif. Le solvant qui sert à réaliser une
élution est appelé éluant.
 2- Historique de la chromatographie

Le mot chromatographie vient du grec: Khroma= couleur; Graphein= écrire

Il existe peu d‟exemple de développement d‟une méthode aussi extraordinaire que

celui de la chromatographie.

Quelques dates importantes de la chromatographie

 Vers 1940, Martin et James développent la pratique et la théorie de la

chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952,

 En 1952, mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse, 1955–1960:

Age d‟or de la chromatographie en phase gazeuse

Fin des années 60: Naissance de la chromatographie liquide haute performance

(CLHP ou HPLC) par Huber et Huzsman

 Actuellement: Amélioration instrumentale (informatisation) et innovation dans le

domaine de la miniaturisation (nanotechnologie)

Quelques avantages de la HPLC (CL)
Possibilité de chromatographié :
 Produits thermolabiles (substance qui changer de propriétés lorsqu'elle subit une
élévation de température comme Médicaments, vaccins. La zymase des catalyseurs de

fermentation alcoolique, en transformant le glucose (ou d‟autres sucres) en éthanol+ CO2 )., enzyme
hétérogène
 Produits de haute masse molaire.
 Mode préparatif facile à mettre en œuvre

Quelques avantages de la C.G:

 Détecteurs spécifiques et sensibles
 Couplage avec spectrométrie
 Possibilité d‟analyser les produits de très faibles masses molaires.
 Avantage de la chromatographie

 Chromatographie de très petites dimensions (Miniaturisation) et

Automatisation des systèmes d‟ injections

 Injection de petit volume

 Répétabilité des injections

 Grande variété de la phase stationnaire

 Variation des types d‟interactions

 Augmentation de la sensibilité des détecteurs

 Etudes de traces
 Théorie de la chromatographie
a- Principe:
Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents
entre deux phases en contact: la phase stationnaire et la phase mobile .
• La séparation est basée sur l'entraînement des constituants du mélange par PM
• Ces derniers parcourent (traverser ) la phase stationnaire avec des temps
proportionnels leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur
affinité avec la phase stationnaire (polarité… )
La polarité est due à  d'électronégativité entre les atomes qui la composent, ( = q x d )
Une molécule est polaire si les positions des charges partielles positives et négatives ne sont pas
confondues ( 0) . Une molécule est apolaire (non polaire) dans le cas contraire  =0.

A phase mobile ⇌ A phase stationnaire

K : Coefficient de distribution

K = CS / C M
CS : Concentration de l‟analyte A ( espèce chimique) dans la phase stationnaire
CM : Concentration de l‟analyte A (espèce chimique) dans la phase mobile,
Un analyte est la substance ou la quantité à déterminer d'une espèce chimique dans une analyse chimique.
 Théorie de la chromatographie

b- Chromatogramme.

 Diagramme montrant l‟évolution du signal du détecteur en fonction du temps d‟élution

Définition: L'élution est un procédé permettant de mettre en solution (dite éluée) un composé

adsorbé à l'aide d'un solvant nommé l'éluant ( PM). (Elution en chromatographie: entraînement

d‟un soluté à travers la phase stationnaire par le mouvement de la phase mobile).

 la phase mobile peut être appelée éluant

L‟analyse du chromatogramme permet:

 Qualitative: identification/ position du pic

 Quantitative: aire des pics

c- Analyse qualitative

 Affinité forte du produit pour la phase stationnaire:

 Le produit progresse lentement dans la phase stationnaire

 Le temps de rétention du produit est long

 Affinité forte du produit pour la phase mobile:

 Le produit progresse rapidement dans la phase stationnaire

 Le temps de rétention du produit est plus court

Le temps de rétention du composé permet son identification

 Théorie de la chromatographie

d- Paramètres caractérisant la rétention

o Temps et volume morts
o Temps et volume de rétention
o Temps et volume de rétention réduits
o Le facteur de rétention

tM ou t0: Temps mort c‟est le temps écoulé pour un composé non retenu par la colonne

tR :Temps de rétention: c‟est le temps écoulé entre l‟instant de l‟injection et le max du

pic du composé

t‟R Temps de rétention réduit: temps de rétention affranchit des phénomènes hors

phase stationnaire

t‟R = tR – tM
 t0 ou tM t’R tR : temps de rétention
tR
tM = t0 temps mort ( diffèrent du temps début de
l'injection)
tR' : temps de rétention réduit (tR = tR' + tM)
VM : volume mort de la colonne
VR : volume de rétention d'un composé
VR = D(débit) x t (temps)
VR' : volume de rétention réduit (VR = VR' + VM)

t0 ou tM tR

Définitions:
La définition du débit: la quantité d'une grandeur, ici le volume, par unité de temps.

 v = L / tR = vitesse moyenne de déplacement du soluté (L=longueur de la colonne)

 u = L / tM = vitesse moyenne des molécules de la phase mobile (cm.s-1).La

relation entre v et u v = u. f

f:fraction de temps passé par le soluté dans la phase mobile)

 V M = V0 = volume de la PM dans la colonne (volume mort). VM = tM . D
 D est le débit de la phase mobile c'est un volume par unité de temps:
Unité du débit: (cm3.s-1 ou mL.s-1)
 u = D /S (S= section de la colonne) ( cm3.s1/cm2)= cm/s

VS = volume de la PS = V (colonne vide) - VM

Vs= Vtot - VM

VR = volume de rétention du soluté = volume de la PM nécessaire pour entraîner le

soluté jusqu'à la sortie de la colonne = V (Phase mobile) qui s'est écoulé entre le

moment de l'injection et celui correspondant au sommet du pic. V R = tR . D

V'R = VR - V0 (VM) = volume de rétention réduit du soluté

t’R = tR – tM

Temps de rétention réduit

e- Application
Le chromatogramme du Prozac (antidépresseur) a
été enregistré dans les conditions suivantes
Colonne C18: 15 cm x 4.6 mm
Phase mobile: acetonitrile / 25mM KH2PO4 pH
7.0 (40:60)
Débit: 2mL/min. Température: 30°C
Chromatogramme du Prozac
Injection: 1µL
1-Le temps de rétention?. Le temps de rétention tR d'un produit S est le temps écoulé entre le

début de l'injection et la sortie du produit. (D‟après le chromatogramme : tR = 3mn)

Remarque: tR dépend du produit S et des conditions expérimentales (colonne, température, débit de
phase mobile... etc.)

2- Le volume de rétention? Le volume de rétention VR correspond au volume de phase mobile

nécessaire pour éluer le produit S. Si D est le débit de la phase mobile (D supposé constant) :

• VR = tR x D. (pour le chromatogramme, VR = 3x2 = 6 ml

3- Le temps mort? Le temps mort tM est le temps que met la phase mobile pour traverser la colonne.

(dans la figure, tM = 1mn

4- La vitesse u: la vitesse moyenne de S dans la phase mobile (u) est caractérisée par sa vitesse
linéaire u de déplacement dans la colonne de longueur L,

on a : u = L /tM (pour le chromatogramme, u = 15 cm/mn)

5- Le volume mort.
On appelle volume mort VM le volume de phase mobile qui passe à travers la colonne pour aller d'une
extrémité à l'autre de la colonne (pendant le temps tM). Autrement dit, VM est le volume occupé par la
phase mobile dans une colonne.
VM = tM x D. (pour le chromatogramme , VM = 1x 2 = 2 ml)

VM ne dépend que de la géométrie et du remplissage de la colonne.

6- Volume et temps de rétention réduits

On appelle volume de rétention réduit V„ , la différence entre les termes VR et VM .
V'R = VR - VM (pour le chromatogramme, V'R = 4 ml
Le volume de rétention réduit correspondant au produit S est le volume de phase mobile qui doit passer
à travers la colonne pour éluer le composé S.
De la même façon, on définit un temps de rétention réduit t„R.
t„ R = tR - t M (pour le chromatogramme, t„R = 2 mn
Les volumes et temps de rétention réduits sont indépendantes des volumes et temps morts, elles
dépendent donc moins de l'instrumentation (de la colonne).
 7- Le facteur de rétention (ou de capacité).
Le facteur de rétention k' pour un produit donné est défini comme suit :

𝐕 𝐕𝐑−𝐕 𝐌 𝐕′𝐑 𝐭𝐑−𝐭𝐌 𝐭′𝐑

K‟= 𝐑 -1= = ou également K‟ = =
𝐕𝐌 𝐕𝐌 𝐕𝐌 𝐭𝐌 𝐭𝐌

Ce qui donne : VR = VM (1 + k‟) et tR = tM (1 + k‟)

Les facteurs de rétention sont des grandeurs sans dimension donc plus générales
d'un produit donné que les temps ou les volumes de rétention réduits.
pour le chromatogramme k' = 2
D'où une définition du facteur de rétention d'après: c'est le rapport du temps
passé par le soluté dans la phase stationnaire sur le temps passé par ce même
soluté dans la phase mobile.
f- Interprétation thermodynamique des paramètres de rétention

 La constante d'équilibre (constante de partition, ou de distribution) K

Le problème est le suivant:

trouver les relations entre les paramètres de rétention (VR, k', tR' et tR)
et la constante d'équilibre K caractérisant l'équilibre suivant:

* Ss : concentration de la substance (ou matière) dans la phase stationnaire

* SM : concentration de la substance dans la phase mobile.
La soluté S est caractérisé par la constante d'équilibre K, appelée aussi constante de
partition ou distribution
K = [Ss]/[SM] où [Ss] = mS/Vs et [SM] = mM/VM
Avec:
o mM = masse du soluté S dissous dans la phase mobile
o mS = masse du soluté S dissous dans la phase stationnaire
o VM = volume de la phase mobile (équivalent au volume mort)
o VS = volume de la phase stationnaire
VM et VS sont constants pour une colonne donnée avec une phase stationnaire donnée ( = VM/VS).
Le paramètre , appelé rapport de phases est une constante qui caractérise une colonne de
chromatographie.  (sera calculé par la suite pour une colonne capillaire en chromatographie en
phase gazeuse).
[Ss] 𝒎𝑺 𝑽𝑴 𝒎𝑺
K= = . = 
[SM] 𝒎𝑴 𝑽𝑺 𝒎𝑴

Le facteur de rétention K‟ (ou de capacité) pour un produit donné est défini comme suit:

𝐕𝐑
K‟= -1
𝐕𝐌
Si on suppose que VR est proportionnel à la masse totale de soluté dissous dans la phase
stationnaire et dans la phase mobile. On a donc VR ~à (mS + mM)
De la même façon, si on suppose que VM est proportionnel à la masse de soluté dissous dans
la phase mobile. On a donc VM proportionnel à mM VM ~à (mM). On déduit que

mS + mM m mS [Ss] 𝑽𝑺 𝑽𝑺 𝑲
K’= -1 = S K‘ = = x = K’ =
mM mM mM [SM] 𝑽𝑴 𝑽𝑴 

Relation entre facteur de rétention K‟ et le facteur de de partition ou équilibre K

C‟est une relation fondamentale de la chromatographie
 g- conclusion

(tR − t M ) t′R
k' = = tR = tM(k’+ 1)
tM tM
𝐊 𝐊
t‟R = tM x tR = tM (1+ )
 

Règle générale : Facteur de rétention k‟

 Si k‟ = 0 → tR = tM ou VS = VM
Composé non retenu par la phase stationnaire (le soluté migre aussi vite que le solvant)

 Si K‟  ∞ le soluté reste dans la colonne

 Le facteur de rétention k‟ est:

• Indépendant du débit
• Indépendant de la longueur de la colonne
• Définit le comportement des colonne
 (k'A < 1) k‟ faible: Composé peu retenu par la phase stationnaire tR rapide

 k‟ très grand k'A > 20

Composé très retenu par la phase stationnaire tR très grand

 k‟ trop grand: Composé trop retenu par la phase stationnaire: on a un

Phénomène de diffusion, le pic chromatographie s‟élargit

 Ordre de grandeur de k‟ : En HPLC, la séparation est optimale pour 2 < k' < 10
afin que le temps de passage des constituants ne soit pas trop long
 Le facteur de rétention k‟ exprime mathématiquement la capacité plus ou moins
grande de la colonne à retenir chaque constituant

Le meilleur compromis : k'=5 valeur "idéale

 Analyse courte
 Bonne séparation
h- Influence de la température sur les temps de rétention réduits t‟R

K varie avec la température T suivant l'équation classique

où G° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases.
K est >>1 donc G° est négative
𝐊
En combinant cette expression avec l'équation t’R = tM (1+ ) on trouve la relation entre

le temps de rétention réduit et la température:

G°
Ln t‟R = - – Ln  + Ln tM
RT
G° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté entre les phases mobile et stationnaire.

Plus rG°(dissol PM→ PS) est petit (grand en valeur

absolue), plus la constante d'équilibre K est grande,
plus le produit est retenu sur la colonne, plus le tR
est grand.
D‟après la figure, il apparaît que pour avoir une
séparation chromatographique,

il faut que : G°(dissol PM→ PS) <0

soit G°(dissol PS) <G°(dissol PM) ou en valeur
absolue ‌G°(dissol PS) >‌G°(dissol PM)
Représentation graphique du terme rG°(dissol PM→ PS)
 G°(dissol PM→ PS) est fonction de la température, en effet G° = H°- TS°

H° S°
Ln tR'= - + - Ln + Ln tM
RT R
Ln t’R = 𝐀
𝐓
+ 𝐁 où A et B sont des constantes pour un produit donné et une colonne donnée.

Considérons deux températures T1 et T2 où T2>T1 avec les facteurs de rétention

correspondants k'1 et k'2, la formule devient

comme t„R1>t„R2, on voit que H° est toujours <0.

Le temps mort tM, peut être supposé indépendant de la température pour une colonne
donnée et une pression donnée.
En réalité, lorsque la température augmente, le mouvement augmente, la viscosité de la
phase mobile (gaz) augmente et sa vitesse diminue légèrement dans de la colonne. On
observe expérimentalement une faible augmentation du temps mort avec la température
Le chromatogramme de la nicotine a été obtenu dans les conditions suivante :
lConditions CPG. Colonne remplie 10% Carbowax 20M/2% KOH sur 80/100
Chromosorb WAW 6 (183 cm) x 2mm ID. Débit de la phase mobile: 20mL/min.
Inj.:1µL Four: 200 °C. Temps de rétention de la nicotine=3,20 mn. Four: 180 °C.
Temps de rétention de la nicotine = 6,60 mn
Questions :
1 - Calculer la vitesse linéaire (cm/sec) de la phase mobile dans la colonne.
2- En déduire le temps mort de cette analyse.
3-Calculer le temps de rétention de la nicotine à 160°C.
4- On suppose que rH est constant dans l‟intervalle  180-200°C°, calculer rH
5- Peut-on éluer la nicotine en 1 mn, sachant que la température limite
d‟utilisation de la colonne et de 250° C ?
6-Le pic de la nicotine a une largeur à mi hauteur de 10 sec.
Calculez N et H
 Solution
1- le débit D = V/t = r2 L/t or la vitesse u = L/t d‟où u = D/ r2

20 636
Application numérique : u = = 636 cm/min ou u= = 10,6 cm/sec
 (0,1) 2 60

2- tM = L/u soit tM = 183/10,6 = 17,26 sec = 0,29 mn.

3- a- Pour la nicotine et à T= 200°C: t’R = tR - tM = 3,20- 0,29 = 2,91 mn à 200°C

b- Pour la nicotine et à T= 180°C: t’R = tR - tM = 6,60- 0,29 = 6,31 mn à 180°C

Ln (2,91) = A/473 + B et Ln (6,31) = A/453 + B.

On a 2 équations avec 2 inconnues. La résolution de cette équation donne:

A= 8408 et B= - 16,7, On cherche tR =? à T = 433°K soit 160°C

Ln(tR) = 8408/433 -16,7 = 15,44mn

4- à 250°C soit T= 523°K on obtient t’R = 0,53 mn soit tR = 0,82 mn.

3,2x60 2
5- N = 5,54 ( ) = 2042 plateaux théoriques et
10
H = 1830/2521 = 0,90 mm
 On détermine les temps de rétention (tR) au cours d'une chromatographie
sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (M)
(Le débit de la colonne est de 5 ml/min):

Substance M tR (min)
Aldolase 145000 10,4

Lactate déshydrogénase 135000 11,4

Phosphatase alcaline 80000 18,4

Ovalbumine 45000 26,2

Lactoglobuline 37100 28,6

1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de M en fonction de Ve. Que
remarquez-vous ?
2 - Pour la glucokinase, tR= 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique
précédent.
 Cet exercice met en jeu une chromatographie colonne Sephadex
(tamisage moléculaire, gel filtration).
La connaissance du débit de la colonne (5 ml /min) et des différents temps de
rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir
tableau), selon la relation

Ve (volume d'élution) = D (débit) x tR (temps de rétention)

Élution M Log M tR (min) Ve (ml)

Aldolase 145000 5,16 10,4 52
Lactate déshydrogénase 135000 5,13 11,4 57
Phosphatase alcaline 80000 4,9 18,4 92
Ovalbumine 45000 4,65 26,2 131
Lactoglobuline 37100 4,57 28,6 143

La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log M) qu'il faut

calculer préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne
une droite
 Pour la glucokinase: Ve = D x t = 21 x 5= 105ml

log M= 4,82 donc M= 𝟏𝟎𝟒,𝟖𝟐 = 𝟔𝟔𝟎𝟔𝟗

 5- Facteur de sélectivité α ou de séparation
 Il mesure la capacité de la colonne à séparer les pics.
 Plus   1, plus les temps de rétention sont éloignés.
 Ce facteur de sélectivité ou de séparation, sans dimension, est égal au rapport des
facteurs de capacité de deux solutés noté A et B dont on veut séparer.
 Le facteur de sélectivité α décrit la position l‟un par rapport à l‟autre, de 2 pics adjacents

Facteur de sélectivité α est le rapport de distribution du constituant B le plus retenu

2ème pic (le pic B sur le rapport de distribution du constituant A le moins retenu 1er pic le pic A.

K′B 𝐭 (𝐁)−𝐭𝐌 t′ R (𝐁)

α = K′ = 𝐭 (𝐀)−𝐭𝐌 = t′
𝐑

A 𝐑 R ( 𝐀)

t‘R (B)> t‘R(A) → α > 1

Ce facteur (α) rend compte de la proximité des pics sans tenir compte de leur forme
5-1 Le facteur  en fonction de K’
KA = [A]S / [A]M KA Ou KB: est le coefficient de partition ou distribution

KB = [B]S / [B]M
k‟: Facteur de rétention ou de capacité

k'A = KA . VS / VM k'B = KB . VS / VM donc: KB / KA = k'B / k'A k′

α = k′ B
A

5-2 le facteurα en fonction des volumes

VR(B)– VM
α=
VR (B) = VM + KBVS , VR (A) = VM + K1VS VR (A) – VM

5-3 le facteur α en fonction des les temps de rétention

α = [(tR(B) - tM) / tM ] .[tM / (tR (A) - tM ) ]

t′R(B)
α=
t′R(A)
 5-4 Influence de la température sur le facteur α
Enthalpie libre de dissolution du soluté A dans la phase stationnaire

pour le soluté A: K = [A] s / [A] M et ∆GA ° = - RT. ln K A

A

pour le soluté B: K B = [B] / [B] et ∆G ° = -RT. ln K

B
B S M B

α= KB / KA = k'B / k'A

∆G°B- ∆GA° = - RT . (lnKB - ln K A ) = - RT . ln KB /KA

∆G°B- ∆GA° = - RT . ln α
facteur de sélectivité α = exp (∆GA° - ∆GB° ) / RT
5-4 Exemple
1- Calculer le facteur de rétention de k'A de A et k‘B de B
2- Calculer Facteur de sélectivité α ou de séparation

1- Facteur de rétention : k'A =(tR (A) - tM) /tM = t'R (A)/tM=10/4 = 2,5

k'A = 10/4 = 2,5

k'B = 15/4 = 3,75

2- Facteur de sélectivité  ou de séparation = t'R (B)/t'R(A)=3,75/2,5 = 1,5

 = 1,5
6-1- Facteur de résolution (R) entre deux pics:
La résolution donne des renseignement sur la qualité d‟une séparation, elle dépend de
deux facteurs:
a) la distance séparant les sommets de deux pics mesurée par tR2 - tR1;

b) la largeur des pics à la base 1 + 2 .

Le facteur de résolution R est un paramètre important de la chromatographie car il
définit la plus ou moins bonne séparation de 2 solutés :

R est exprimée en termes de temps de

R exprimée en termes de volume de
rétention par la relation:
rétention par la relation

VR2−VR1
R= 2
1+2

On remarque aussi que la résolution R est proportionnelle à la racine carré de la

longueur de la colonne: ( R √𝐋)
Pic 1
tR1 temps de rétention du pic 1
Pic 2
tR2 temps de rétention du pic2
ω1 largeur à la base du pic 1
ω2 largeur à la base du pic 2

𝐊′𝟐 𝐭 ′ 𝐑𝟐
= =
𝐊′𝟏 𝐭 ′ 𝐑𝟏

Facteur de sélectivité)

Pour des valeurs de R supérieures à 1,5, les pics sont correctement séparés.
On note aussi que la résolution R est proportionnelle à √𝐋
 Exercice
Un mélange de six iodures d‟alkyle est séparé par chromatographie gazeuse
à l‟aide d‟une colonne remplie de poudre de brique réfractaire enrobée d‟huile de
silicone (longueur L = 365 cm). La colonne est chauffée de telle sorte que sa
température croisse linéairement durant toute l‟opération.
Le tableau donne les résultats relevés.

Température
Pic Identité tR (min) ω (min) Surface (cm2)
(°C)
1 Air tM = 0,5 Petite 55 Petite
2 CH3I 6,60 0,55 100 13,0
3 C2 H 5 I 9,82 1,00 127 12,0
4 Iso-C3H7I 11,90 1,04 139 10,0
5 n-C3H7I 13,04 1,08 148 7,2
6 CH2I2 19,10 1,60 193 2,0

(a) Calculer la résolution entre les pics 2-3, 3-4, 4-5, 5-6 ?
(b) la séparation vous convient elle ?
(c) Quelle longueur de colonne aurait il fallu pour que la résolution des pics 4 et 5 ait été
de R‟ = 1,5 ?
 Correction 2
(a) Formule R = 2 (tB – tA)/(ωB+ωA)
N° du solutés t R la largeur
- des pics
pics
2 CH3I 6,60 0,55 R2-3 = 2 (9,82-6,6)/(0,55+1) = 4,15
3 C2H5I 9,82 1,00

Pic 3 C 2 H5 I 9,82 1,00

R3-4 = 2 (11,9-9,82)/(1+1,04) = 2,04
Pic 4 Iso-C3H7I 11,90 1,04

R4-5 = 2 (13,04-11,9)/(1,04+1,08) = 1,08

D‟après les valeur du tableau précèdent
R5-6 = 2 (19,1-13,04)/(1,6+1,08) = 4,52
(b) Pour le pics 5 la résolution R=1,08 est mal résolus.
C- Quelle longueur de colonne aurait il fallu pour que la résolution des pics 4 et 5 ait été de R‟= 1,5?

Définition: Résolution R est proportionnel à la racine carré de L(longueur de la colonne); R  𝐋

Pour R’ = 1,5 on a L’
R = 1,08 on a L =365 cm R‟/R = 𝐋′ /𝐋 R‟ =1,5 R =1,08 L= 365cm L‟

𝐋′
Application: (1,5/1,08) = 𝟑𝟔𝟓
L‟ = 365.(1,5/1,08)2 = 704 cm
 6-1 Facteurs influençant la résolution R et le facteur de la séparation :

tR1 tR2
Figure a
Chromatogramme de référence fig (a)

tR1 tR2
Figure b
- Si ωA et ωB sont constantes
- ∆t = tR2 - tR1 ) augmente
Donc R et  augmentent w1 w1

Figure c
 ω1 et ω2 diminuent
 ∆t = tR2 - tR1 constant
Donc R augmente et α reste constant
w1 w2
En conclusion, deux paramètres : R et  s'avèrent donc importants en chromatographie,
la rétention et la forme du pic.
On peut conclure que:
 Pour R = 1,5 on obtient une bonne séparation :
 Pour des valeurs de R beaucoup plus grande que 1,5, la séparation des pics
n‟est pas meilleure mais le temps de la séparation devient long
 Si R = 1, les 2 pics se chevauche

R= 2.𝟒𝟐𝟎−𝟒𝟎𝟎
𝟏𝟗,𝟓+𝟐𝟎,𝟓
=𝟐 .
𝟐𝟎
𝟒𝟎
=𝟏

Conclusion: mauvaise séparation parce que R  1,5

 7- Courbe de Gauss
Forme des pics en chromatographie
On assimile les pics en chromatographie à une courbe de Gauss

Les pics chromatographiques ont une allure gaussienne. L'aire des pics est
calculée en assimilant le pic à un triangle
Une courbe de Gauss est caractérisée par les paramètres suivants:
 Une courbe de Gauss est caractérisée par les paramètres suivants:

 Écart-type =  correspond à la moitié de la largeur du pic mesuré à 60,6% (points d'inflexion I)

de sa hauteur

 Variance = 2

 Largeur à mi-hauteur =  mesurée à h/2. La relation entre  et σ est = 2,35 

 la "base" du pic =  est mesurer à 13,5% de la hauteur
On a la relation: ω = 4σ =1,7δ

-1 1
0

Figure Caractéristiques d‟un pic chromatographique idéal.

Signification des trois paramètres classiques et résumé des caractéristiques d‟une courbe de Gauss.
Sur une colonne (phase stationnaire: C18), 15 cm x 4,6mm,
remplie de particules de 5mm, avec l‟acétonitrile (CH3CN) comme
phase mobile et à une température de 30°C, on mesure un temps
mort de 1,07mn.
Dans ces conditions, on obtient la séparation 2 produits:
Amphétamine (A) et Methamphétamine (M) on donne pour les 2 pics:
* pic (A) : temps de rétention = 2,40 min, 1= 5 sec.
* Pic (M) : temps de rétention = 2,85 min, 2= 6 sec.

1- Calculez le facteur de séparation 

2- Calculez le facteur de résolution R
3- Évaluez le nombre de plateau théorique de la colonne N
4- Calculez ∆G (d‟énergie libre de dissolution) entre ces 2 produits dans la phase stationnaire (R
= 8,31 J K-1 mol-1)
Solutions:
1- k'(A) = k'A = (tA - t0) / t0 = (2,40-1,07) /1,07= 1,243 et k'(M) = (tM - t0)/t0 = 1,664 d'où = 1,338.
2- R= 1,118
3- N= 5390 plateaux théoriques d'après Purnell
4- ∆G = -RTln() = -733 J /mol
 7- Efficacité d‟une colonne

7-1 Module du Théorie des plateaux

H L

Pour exprimer l'efficacité d'une colonne de longueur L et de N plateaux

théoriques,
On définit la hauteur H équivalent à un plateau théorique (HEPT):
Une colonne est constituée de N plateaux théoriques (de même hauteur)
Le paramètre H est intéressant car il est indépendant de la longueur de la colonne.

Paramètre H: Hauteur des plateaux théoriques H = L/N N: Plateaux théoriques

 8-1 Modèle des plateaux théoriques
Vers 1950, MARTIN et SYNGE ont tenté de justifier la forme des pics de
chromatographie, en assimilant une colonne de chromatographie à une colonne à distiller.

8-1Notion de plateaux théoriques

• Une colonne de N plateaux théoriques est une colonne

divisée en N petits disques cylindriques successifs.

• On admet que la phase mobile progresse d‟un cylindre

à l‟autre (d‟une façon discontinue)

• On observe une rétention du soluté S, du fait de

l'équilibre de ce produit entre la phase mobile
• (S phase M) et la phase stationnaire (S phase
Stationnaire).

• H équivalent à un plateau théorique (HEPT) Pour

exprimer l'efficacité d'une colonne de longueur L et
de N plateaux théoriques, on définit la hauteur H):

Le paramètre H est intéressant car il est indépendant de la longueur de la colonne.

H ( Hauteur des plateaux théoriques) est donnée l équation suivante : H = L/N

 7-2 Exemple

Le tableau suivant montre le pouvoir de séparation des chromatographies les plus utilisées

L
Nombre de plateaux N H=
Type de chromatographies N
théoriques N mètre de colonne (HETP) en mm

1000
CPG (colonne remplie de 2m ) 2000
𝟐𝟎𝟎𝟎
𝟐𝟎𝟎𝟎
= 1
𝟐𝟓𝟎𝟎𝟎
CPG 100000 = 0,25
(colonne capillaire de 25m )
4000 𝟏𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎

100 500
CPL classique de 50 cm 200 =5
𝟏𝟎𝟎

HPLC de 10 cm 5000 50000 0,02

 7-3 Relation entre N, σ, tR,w et 

 Écart-type = σ

 Variance = σ2
• Largeur à mi-hauteur= 
 la "base" du pic= ω

Le nombre de plateaux théoriques N de la colonne mesure son efficacité,

La relation entre N et tR est: Nσ2=(tR)2

L‟efficacité d‟une colonne est son aptitude à donner des pics fins ( petit) donc N élevé.
Les fabriquant donnent toujours dans les spécifications le nombre de plateaux théoriques

7-3 Autres expressions de N:

H = σ2/L
σ = Lω/4tR
H= Lω2/16t2R
Nσ2=(tR)2
N augmente donc avec le temps de rétention et diminue si la largeur des pics (σ) augmente
 Formule utilisant la base extrapolée  du pic N = 16 (tR/ω)2

Formule utilisant la largeur à mi hauteur du pic δ N = 5,545 (tR/δ)2

7-4 Conclusion

 Une « bonne » colonne de chromatographie qui conduit à des pics fins ( petit) pour
des temps de rétention (tR) élevés, est donc caractérisée par N élevé.

 plus N grand, plus la colonne est efficace et plus le pic est fin ( petit),

 N est une grandeur caractéristique d'un système chromatographique. Il peut être

augmenter en réduisant le débit de la PM, mais tR est aussi augmente.

 Les fabriquant de colonnes donnent toujours dans les spécifications le nombre de

plateaux théoriques N pour caractériser l'efficacité de leur colonne.
 En CPG, N est donné pour un produit donné, souvent le tridécane (C13H28)
 Rappel
Module du Théorie des plateaux

Pour exprimer l'efficacité d'une colonne * H équivalent à un plateau théorique (HEPT)

H = L/N * longueur L et de la colonne
On définie
* N plateaux théoriques

La relation entre N et tR est: Nσ2=(tR)2

H = σ2/L : σ = Lω/4tR ; N = 16 (tR/ω)2

 Une « bonne » colonne de chromatographie qui conduit à des pics fins ( petit) pour
des temps de rétention (tR) élevés, est donc caractérisée par N élevé.

 plus N grand, plus la colonne est efficace et plus le pic est fin ( petit),

 N est une grandeur caractéristique d'un système chromatographique.

Il peut être augmenter en réduisant le débit de la PM, mais tR est aussi augmente.
 Les fabriquant de colonnes donnent toujours dans les spécifications le nombre
de plateaux théoriques N pour caractériser l'efficacité de leur colonne.
 9- Mécanisme d‟élargissement d‟un pic chromatographique
9-1 Equation de VAN DDEMTER (VD)

L‟équation de VAN DDEMTER. (1956) pour la chromatographie CPG relie les

différentes causes d‟élargissement des pics à:
*nla vitesse de la phase mobile
* hauteur H équivalent à un plateau théorique (HEPT):

Propose une équation suivante : H =A+B/u+Cu.

où u est la vitesse moyenne de la phase mobile (cm/s),
Trois facteurs (A, B et C) qui contribuent à l'élargissement des pics

9-2 Le terme A Coefficient de diffusion turbulente ou terme de

remplissage
Suivant la taille et la forme des particules, ils existent pour la phase
mobile, plusieurs trajets possibles, cette particularité contribue à l'élargissement
des pics
Le chemin 2 est supérieur à celui de chemin 1, donc la molécule du trajet 1 arrive
avant de celle du trajet 2.
 Le chemin 2 est supérieur à celui du chemin 1, donc la molécule du trajet 1 arrive avant de
celle du trajet 2.
 Le trajet dépend du diamètre des particules qui remplissent la colonne. A = 2l dp.
(facteur de diffusion d'Eddy) l 1, dp est le diamètre moyen des particules.
 Donc, plus les particules sont petites et plus le remplissage est homogène, plus A
est petit et plus l'efficacité de la colonne augmente
(dp petit A petit colonne est efficace

 A est donc lié au diamètre des particules du support

 A est nulle pour une colonne capillaire de CPG

trajets élargissement des pics

diamètre des particules

 Soit l équation de VAN DDEMTER : H =A+ B/u +Cu
9-3: (Terme B) Diffusion longitudinale.
Le terme B traduit la dispersion du soluté à cause de la diffusion du soluté dans la
colonne.

Par exemple, dans un flux liquide, les molécules au centre du flux progressent
plus vite que celles qui sont sur les bords au contact des particules; on a B = 2g Dm où
g est une constante (g<1).
Dm est le coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile

molécule

Le terme B est inversement proportionnel à u. L'efficacité d'une colonne

augmente avec la vitesse de la phase mobile. Ceci peut expliquer les bonnes
séparations obtenues en HPLC; de plus, comme le terme Dm est environ 5 fois plus
grand en CPG qu'en CPL, il en résulte que la contribution de la diffusion longitudinale
est presque négligeable en HPLC.
9-4 - .(Terme C) Résistance au transfert de masse

Ce terme C.u représente la résistance au transfert du soluté entre les phases

mobiles et stationnaires, qui empêche l'équilibre entre S(pM) et S(pS).
Ce phénomène est du que certaines molécules reste dans les pores de la phase stationnaire donc .

Plus la vitesse (u) de la phase mobile diminue, plus les molécules de soluté peuvent mesurer dans
la phase stationnaire, plus l'équilibre entre les 2 phases est favorisé et plus la colonne est
performante.

Le terme C est proportionnel à (dp2/Dm), les colonnes les plus efficaces seront
celles le diamètre dp des particules est le plus faible possible.
Il faut utiliser des solvants de faible viscosité pour minimiser ce terme (C)

dp = diamètre des particules de remplissage.

Dm = coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile
 9-4: Courbe de Van Deemter

La représentation graphique de l'équation H = A+B/u+C.u est appelée courbe de Van Deemter

Soit une courbe de V.D. expérimentale, obtenue en HPLC, en ordonnée est reportée la
hauteur de plateau réduite h = H/dp (où dp = 5 m est le diamètre des particules.
On considère deux points particuliers A et B sur cette courbe.
1- Au point A (débit=1ml/mn, U= 0,65 mm/s et h = 2), Calculer le temps mort et le
temps d'analyse ( tR rétention).
2- Même question au point B (débit = 2,75 ml/mn, U=1,7 mm/s et h=2,5
3- Calculer la hauteur des plateaux théoriques H
4- Calculer la perte d'efficacité de la colonne entre A et B (NB/NA ).
5- Conclusion
Solution:
1- tM = L/U ; L (voir la courbe) soit 230 s = 3,83 mn; tA = tM (1+k') = 708 s = 11,80 mn

k‟ : Facteur de rétention: Le facteur de rétention k„ pour un produit donné est défini comme suit) :
tA = tM (1+k') : K‟ = tA/tM K‟ = (tA- tM)/t M K‟ = 2,08

2- tM = L/U tM = 88,23 s = 1,47 mn; tB = 271,76 s = 4,5 mn

3-Calculer la hauteur des plateaux théoriques cas

Au point A H = h x dp = 2x5 =10
Au point B H = h x dp = 2,5x5 =12

4- on a hA= 2 hB= 2,5 NB/NA = hA/hB = 0,8

En conclusion,
N diminue un peu car il est multiplié par 0,8 mais le temps d'analyse diminue
énormément car il est divisé par 2,6 ( tA/tB = 2,66)
Il peut donc plus "rentable" de faire l'analyse au point B qu'au point A.
 Analyse quantitative par chromatographie

Quantification en chromatographie :
La chromatographie est aussi une technique analytique quantitative
Relation fondamentale: la quantité massique du soluté injecté est proportionnelle à l‟aire

du pic donnée par le détecteur mi = Ki x Ai

mi = masse (en gramme) du soluté i injecté au niveau de l‟injecteur et qui traverse la

colonne chromatographique. Elle est déterminée par la connaissance du volume de solution
introduit et sa concentration. C = n/V= m/MV
Ki = coefficient de réponse absolue du détecteur pour le soluté i (Attention  du
coefficient de partition), dépend du réglage du chromatographe et des conditions expérimentâtes
Ai = aire du pic du soluté i, mesurée par la détecteur ou déterminée sur le chromatogramme.

L‟analyse qualitative :
 les séparations (~temps de rétention (tR)) déterminées et reproductibles
Pour déterminer la concentration massique d‟un soluté i donné, il faut:
 Disposer d‟une référence (étalon) du soluté, de concentration donnée, qui permet
de tester la sensibilité du détecteur
 Connaître les aires ou hauteurs des pics
Dans des conditions expérimentales définies Aire du pic pour un soluté i donné
Ai= 2,507.h.σ = 1,06.h ω
h = hauteur du pic
σ = demi-largeur du pic au point d‟inflexion (60,6% haut)
ω = la base du pic à 11%h

Analyse quantitative est basée sur des méthodes comparatives

A- Méthode de l‟étalonnage externe
B- Méthode de l‟étalonnage interne
 A- Méthode de l‟étalonnage externe
Cette méthode permet de calculer la teneur (% massique) d‟un ou plusieurs
solutés par comparaison de 2 chromatogrammes grâce au coefficient de réponse absolu Ki
du détecteur

Mode opératoire:
1- Préparation d‟une solution de référence (solution étalon) de concentration Créf connue
2- Injection d‟un volume V donné et détermination de l‟aire Aréf sur le chromatogramme étalon
3- Injection du même volume V de l‟échantillon contenant le soluté à doser à la concentration Céchant
inconnue.
4- Détermination de A éch obtenue sur le chromatogramme dans les mêmes conduction
expérimentales
 Référence A- Méthode de l‟étalonnage externe Echantillon

Puisque les volumes V sont égaux, les aires sont proportionnelles.

Solution étalon (réf): mi réf= Ki .Ai réf =Ciréf .V

Céch = Créf A éch/A réf

Solution à doser: mi éch= Ki .Ai éch=Ci éch .V

La méthode de l‟étalonnage externe on considère que Ki = coefficient de réponse absolue du

détecteur pour le soluté i est constant
 A- Méthode de l‟étalonnage externe :
Pour minimiser les erreurs sur la concentration du soluté à doser et vérifier la linéarité
de la réponse du détecteur : détermination d‟une courbe de calibration (Ai = f ([Ci ])
avec plusieurs solutions étalons, puis déterminer la concentration du soluté i de la solution
à doser (Ai éch qui donne Ci éch) sur la courbe étalon

Ai , Aire pic Domaine linéaire

C Soluté

[Soluté]min [Soluté]max

Remarques
Les injections se font dans les mêmes conditions expérimentales de:
 Température,
 Débit et composition de la ΦMob,
 Même colonne et ΦStat .
 B- Méthode de l‟étalonnage interne :

Cette méthode est basée sur la détermination du coefficient de réponse Ki

relatif de chaque soluté à doser vis-à-vis d‟un soluté supplémentaire introduit pour
servir de référence (étalon interne).
Les aires des pics des solutés à quantifier 1 et 2 sont comparées à celle du
soluté de référence
E = étalon interne) introduit à une concentration connue.

Mode opératoire: Première étape

 Préparation d‟une solution de référence contenant les solutés 1 , 2 et E (étalon) en
concentration connue pour chaque soluté,
 Injection d‟un volume V et mesuré les aires de pic de chaque soluté de réf sur le
chromatogramme ; A1, A2 et AE
 Chacune des aires des pics étant proportionnelles aux quantités réellement injectées
m1, m2 et mE en soluté 1, 2 et E
Soluté 1 m1 = K1 .A1 𝑚1 K1. A1
=
𝑚𝐸 KE . A E
Soluté 2 m2 = K2 .A2 𝑚2 K2. A 2
=
Etalon interne mE = KE .AE 𝑚𝐸 KE . A E

Mode opératoire : Première étape

Les coefficients de réponse relatifs du soluté 1 par rapport au soluté E (noté K1/E)
et du soluté 2 par rapport au soluté E noté K2/E) sont tels que :

K1 m1.AE
K1/E= =
KE mE . A1

K2 m2.AE
K2/E= =
KE mE . A2

Les coefficients de réponse relatifs Ki/E sont caractéristique de chacun des solutés i
vis-à-vis de l‟étalon E et sont indépendant du volume injecté
 Mode opératoire : Seconde étape
 Injection d‟un volume V quelconque de l‟échantillon à analyser, contenant une
concentration connue de l‟étalon interne E ([Étalon ]) mais de concentration
inconnue pour les solutés 1‟ et 2‟
 Détermination de l‟aire de chacune des pics relatifs aux solutés 1‟, 2‟ et E sur
le chromatogramme de l‟échantillon A‟1, A‟2 et A‟E sont déterminées

• les coefficients de réponse relatifs K1/E, K2/E sont déterminer dans 1ere étape
• Chaque aire correspondant à une masse donnée m‟1, m‟2 et m‟E de chaque soluté 1‟, 2‟ et E

Mode opératoire: les coefficients de réponse relatifs K1/E, K2/E et [Étalon] étant connus :

m’1 /m’E = K1/E . A’1/A’E C’1 = C’E . K1/E . A’1/A’E

m’2 /m’E =K2/E . A’2/A’E C’2= C’E . K2/E . A’2/A’E

 Référence Échantillon

Méthode de l‟étalonnage interne :

Pour limiter les erreurs :
 Si on dispose de plusieurs solutions de concentrations connues en soluté 1 (masse mi )
il est préférable d‟ajouter une masse mE constante de soluté étalon E interne à
chacune de ces solutions puis de faire leur injection successive dans les mêmes
conditions expérimentales
 On tracera ensuite une droite d‟étalonnage mi = f(Ai /AE) de la pente de la droite
sera mE x K1/E
 Puis l‟injection de la solution contenant le soluté 1 de concentration inconnue (masse
m1‟) et le soluté étalon E de même masse mE
 Le rapport Ai‟/AE permettra de déterminer directement la masse m1‟ du soluté 1
contenue dans la solution à analyser grâce à la droite d‟étalonnage.
 * Plusieurs solutions de concentrations connues en soluté 1
* Ajouter une masse mE constante de soluté étalon E interne à chacune de ces solutions puis de faire
leur injection successive

C1 C2 C3 C4 C5
A1/AE A2/AE A3/AE A4/AE A5/AE

Ai/AE
On trace une droite d‟étalonnage
mi = f(Ai /AE) et la pente de la droite P =mE x K1/E

 Puis l‟injection de la solution C inconnue (masse m1‟)

et le soluté étalon E de même masse mE
 Le rapport Ai‟/AE d détermine directement la masse
m1‟ du soluté 1 contenue dans la solution à analyser
grâce à la droite d‟étalonnage.

mi
Remarques sur l‟étalonnage interne :
 Les analyses se font dans les mêmes conditions expérimentales de la température,
débit et composition de la Φ Mobile, même colonne et Φ Stationnaire

 Avantage: Cette méthode permet de s‟affranchir de l‟imprécision et la reproductibilité du volume

injecté V.
Choix de l‟étalon interne ajouté :
 il doit être pur
 il ne doit pas exister initialement dans l‟échantillon
 son pic doit être bien résolu, pas de chevauchement des pics d‟élution pour déterminer l‟aire
de chaque pic avec précision
 son temps de rétention doit être proche de celui des solutés à doser
 sa concentration doit être proche à celle des autres solutés pour obtenir une réponse linéaire du
détecteur
 il doit être inerte vis à vis des autres constituants de l‟échantillon
 RESUME
Analyse quantitative par chromatographie
Dans cette partie on va étudier, les analyses quantitative par chromatographie selon les
méthodes ci-dessous :
• La méthode d‟étalonnage externe
• La méthode d‟étalonnage interne
• Normalisation

1- La méthode d‟étalonnage externe

Mesurer les propriétés de l'analyte (cours de chimie analytique)

les résultats analytiques dépendent de la mesure finale X d'une propriété
physique de l'analyte. Idéalement, la grandeur physique mesurée est directement

proportionnelle à la concentration ou la masse: cA = k.X ou mA = K . X

Ces méthodes analytiques nécessitent la détermination empirique de k à l'aide

d'étalons chimiques pour lesquels CA ou mA est connu. La détermination de k qui

est une étape importante s'appelle un étalonnage
 A- Méthode de l‟étalonnage externe
Pic A de l‟échantillon dans CA echa ???
Pic A dans étalon de concentration CA réf

tM

Chromatogramme de échantillon
Chromatogramme Etalon

On applique le relation: mi = K . Ai= Ci.V (K Constante de réponse dépend de l‟appareil)

m réf = K. A réf = C réf .V méchan = K. A échan = C échan .V

Le rapport : méchan /m réf = K. A échan / K. A réf = C échan .V/C réf .V

A échan /A réf = C échan /C réf

C échan = C réf . A échan /A réf

 2- La méthode d‟étalonnage interne
On ajoute un composé qui va jouer le rôle d’un témoigne et ne doit pas figurer dans l’échantillon

T 1 T 2
2
1

Temps
Temps
Chromatogramme Etalon Chromatogramme de échantillon
m etalon1 = K1A1
mT = K T AT K1/T =(m1/mT).(AT/A1) m1échan= K1.Aéchan = C1échan .V
m T = K T A T = CT V

méchan Aéchan C(1)échan

= K =
mT 1/T AT Cetalon
Aéchan
C(1)échan = K1/T Cetalon
AT
% échantillon= (C(1)échan / m injecté ) x100

On peut faire la même chose pour le pic 2

 4
3- Normalisation
2
1
Un chromatogramme TM 3
contient quatre produits

temps
Pic 3 est le plus petit

k1/3 A 1
% (1)=
k1/3 A1 + k2/3 A2 + k3/3 A3

m 1= K1A1 K1/3 =(m1/m3 ).(A3/A1) = C1A3/C3A1

m3 = K 3 A3

 % = % (1)+ % (2)+ % (3)=100 %

 11- Chromatographie en phase gazeuse

L’échantillon est vaporisé et injecté au sommet de la colonne. L’élution est assurée par un
flux de gaz inerte appelé gaz vecteur (phase mobile). Il n’y a pas d’interaction entre l’analyte et la
phase mobile en CPG.
Schéma de principe
 1- Alimentation en gaz vecteur
1- Gaz inerte: He, N2, H2, Ar … le choix du gaz dépend du détecteur utilisé).
Eviter la présence de traces: H2O et O2 : gaz purs et desséchés (tamis moléculaire
En général : 25 à 100 ml/mn pour les colonnes remplies
0,5 à 5 ml/mn pour les colonnes capillaires
2- Injection de l‟échantillon Microseringue (1µl à 10µL).
Injection à travers un septum (élastomère) dans une chambre à vaporisation instantanée
(injecteur) située à une extrémité de la colonne.

3- Température de l‟injecteur doit permettre la vaporisation mais éviter la décomposition

(≈ 50°C au dessus du point d‟ébullition du constituant le moins volatil)

Injecteur : permet d‟introduire et de vaporiser

l‟échantillon en tête de colonne la température
de l‟injecteur est maintenue à 200 °C

Injecteur
4 - Les caractéristiques de l‟injecteur dépendent du type de colonne utilisé

Colonnes remplies : injection de 0,1 à 0,5 µl de solution de l‟échantillon, injecteur

“classique”, à vaporisation directe.

Colonnes capillaires (faibles débits) : quantités très faibles, difficiles à mesurer :

injecteur avec ou sans division (split/splitless)
 Colonne remplie : Colonne capillaire :
 Tube en acier  Tube en fibre de verre
o Diamètre interne = 3 à 6 mm o Diamètre interne = 0,1 à 0,35 mm
o Longueur = 1 à 10m o Longueur = 10 à 100 m
 Débit gaz vecteur : 10 à 40 ml/min  Débit gaz vecteur : 0,5 à 2 ml/min
 la phase stationnaire = molécules
ou macromolécules directement
greffées sur la paroi interne de la
fibre de verre
 5 Four et Colonne
Four : contient la colonne chromatographique et régule la température d‟analyse
Colonne dans enceinte thermostatée (40 à 400 °C) de programmable.

Colonnes remplies Tube en acier inox, verre, ou téflon de 1/8 ou 1/4 de pouce de
ø (3,18 ou 6,35 mm) et 1 à 10 m de long, rempli d‟un support poreux, inerte et stable,

finement et divisé, La phase stationnaire est donc imprégnée (taux de 3 à 25%) dans
les pores (pb de lessivage).
Support le plus utilisé : (silicates fossiles) : chromosorb® Faible
granulométrie
 10-6 Colonnes capillaires

développées dans les années 70.

Colonnes tubulaires ouvertes : la phase stationnaire tapisse les parois internes, sous
forme d‟un film (épaisseur 0,05 à 5 µm) :
1ères colonnes en acier, puis en silice fondue (très pure) ø intérieur = 0,1 à 0,35 mm,
L = 10 à 100 m enroulée en spirales de ø ≈ 15 cm : Grande efficacité N= 200000
plateaux (H≈ 1000 pour une colonne remplie).
A noter que le terme de remplissage A =0 de l‟eqt de Van Deemter.
: coût, fragilité (casse, oxydation), faible capacité injecteur split-splitless.
 La phase stationnaire

 Faible tension de vapeur

 stabilité thermique; inertie chimique;
 propriétés telles que les valeurs k et α soient correctes.

Colonnes remplies :
 Grand choix de phases stationnaires, facile à mettre en œuvre car simple imprégnation dans les pores du
support.

Colonnes capillaires :
Choix beaucoup plus limité (phases pouvant conduire à la formation d’un film greffé)

R = Me : polydiméthylsiloxane apolaire.

Possibilité de substituer des groupes Me par R = Ph (5%, 50%,…), C3H6CF3, C3H6CN : polarité

Phase stationnaire solide (chromatographie gaz/solide) :

Matériau adsorbant (silice ou alumine) déposé sous forme de fines particules très fines sur la paroi interne des
colonnes capillaires : Pour séparation de gaz (N2, CO, CO2) et hydrocarbures très légers.
 11-6 Principaux détecteurs
Les performances du détecteur:
 sensibilité (10-8 à 10-15 g/s)
 réponse linéaire (simple, linéarité 105, universel, non destructif, colonnes remplies ou capillaires)
 sélectivité : détecteurs universels ou sélectifs

* Détecteur à conductibilité thermique (TCD) ou catharomètre

 Mesure des variations de la conductivité thermique du gaz vecteur (H2 ou He) 6 à
10 x > à la plupart des produits organiques
 Détecteur pont de Wheatstone (filament Pt, Au ou W) système différentiel
* Détecteur à ionisation de flamme (FID) (le plus utilisé).

La phase mobile pénètre dans un brûleur alimenté par un mélange H2 + air

combustion, production d’ions et d’électrons faible courant électrique amplifié par un
électromètre.
L’aire du pic est ici proportionnelle à la masse et non à la [ ], donc non dépendante des
variations de débit de la phase mobile .
 forte sensibilité (10-13 g/s), linéarité (107-108), quasi-universel
 destructif (pyrolyse)
* Autres détecteurs

Détecteur thermoionique: Semblable au FID + céramique en silicate de Rb ou Cs à l‟extrémité de

la flamme : formation d‟un plasma dans lequel se forme un nombre élevé d‟ions en présence de
molécules phosphorées ou azotées. Sélectif aux composés contenant P et N (applications :
pesticides,…)

Détecteur à photomètrie de flamme : excitation des éléments par de la lumière à des

caractéristiques (526 nm pour P, 394 pour S)
Détecteur à capture d’électrons (composés halogénés) Méthodes couplées : information
structurales
-Détecteur IR
-Détecteur de masse : GC-MS : spectromètre de basse résolution (souvent quadripôle)
 12- Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC
C’est un procédé de séparation de solutés présents dans un mélange à l’état liquide.

12-1 Phases mises en jeu :

phase mobile (ΦMob): liquide inerte (solvant faiblement polaire ou polaire) qui entraîne les
solutés au travers de la phase stationnaire Φstat
phase stationnaire (ΦStat): particules solides finement divisées (polaires ou faiblement
polaires) contenues dans la colonne
La chromatographie liquide fait intervenir simultanément des interactions
soluté / phase stationnaire solide
soluté / phase mobile liquide
phase mobile liquide / phase stationnaire solide

Solutés analysables : la chromatographie liquide permet d’analyser

• de petites molécules ou des macromolécules
• des molécules apolaires, peu polaires, polaires ou ioniques

Contrainte : utiliser une phase mobile qui solubilise les solutés à analyser
 Chromatographie Liquide de Haute Performance (HPLC)

Principe de la CLHP
Séparation de constituants dans un mélange complexe
Mise en solution dans un solvant ou un mélange de solvant (éluant)
Analyse qualitative
Analyse quantitative
Appareils de Chromatographie en phase Liquide à Haute Performance (HPLC) :
 Instrumentation en chromatographie liquide :
Réservoirs de solvants :
contient un ou plusieurs solvants (faiblement polaires ou polaires) les solvants sont
dégazés pour enlever les gaz dissous (solvants très purs)
 Verre ou inox (V = 0,5 à 2L)
 Filtre (poussières), dégazage (barbotage de gaz inerte
Mode isocratique (éluant unique)
Mode gradient d’élution (mélange de solvants)

Système de pompage :
 passage en continu de la phase mobile au travers de la phase stationnaire
 contrôle le débit et la composition de la phase mobile
o P  420 bars
o pas de pulsation : pompes à piston alternatif
o 0,1 < débit < 10 ml/min
o résistance à la corrosion
Injecteurs :
Introduction de l’échantillon liquide dans une boucle d’injection (5µL < V < 500µL) (volume calibré)
Colonne chromatographique :

Tube en acier contenant la phase stationnaire solide

Tube en inox (5 cm < L < 30 cm, 4 mm < Øint.< 10 mm)
Efficacité ≈ 50 000 plateaux / m Micro-colonnes
Matériau de remplissage : gel de silice préparé par procédé sol-gel
•Phase stationnaire :
particules solides de silice
sphériques et calibrées en taille
surface‌spécifique‌d’échange‌élevée
activées ou désactivées en surface (non polaire ou polaire)

la phase stationnaire et la phase mobile sont de polarité opposée

a- Chromatographie en phase normale :
 la phase stationnaire est polaire tandis que la phase mobile est apolaire (ou très faiblement polaire)
Phase stationnaire polaire -R comporte des groupements polaires de type : phényle = -(CH2)n-C6H5 ; amine
= -(CH2)n-NH2 ou -(CH2)n-N(CH3)2 diamine = -(CH2)n-NH-(CH2)2-NH2
nitrile = -(CH2)n-C≡N diol = -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2-O

b- Chromatographie en phase inverse :

 la phase mobile est polaire tandis que la phase stationnaire est apolaire
-R = chaînes hydrocarbonées apolaires de type hydrocarbure linéaire
-R = -(CH2)n-CH3
n = 2 (propyle, phase C3 ) ; n = 7 (octyle, phase C8) ; n = 17 (octadécyle, phase C18)
la phase stationnaire et la phase mobile sont de polarité opposée

a- Chromatographie en phase normale : phase mobile peu polaire

solvants usuels : hexane (C6H14), toluène (C6H5-CH3), chloroforme (CHCl3), dichlorométhane (CH2Cl2)

b- Chromatographie en phase inverse : phase mobile très polaire

solvants usuels : méthanol (CH3-OH), acétonitrile (CH3-C≡N), eau (H2O)
Détecteurs
 Placé en sortie de colonne, il enregistre un signal optique en fonction du temps
donne une acquisition du chrommatogramme,
 Propriétés : sensible, rapide à la détection, réponse linéaire sur une large gamme de
concentration
 Détecteur spectrophotométrique : détecteur UV-Vis mesure en continu de l’absorbance de
la phase mobile en fonction du temps. Analyse à une longueur d’onde λ donnée dans l’UV-Vis

Asoluté = εsoluté,λ * l * [soluté]

l = trajet optique
ε= coefficient d’extinction molaire
[soluté] = concentration du soluté
Exemple de chromatogramme de dérivés aromatiques benzéniques
Le temps de rétention augmente lorsque la masse molaire du soluté augment

Le temps de rétention augmente lorsque la masse molaire du soluté augmente

Phase stat. apolaire Chromato en

Phase mobile polaire phase inverse