Université de Boumerdès

Département de Biologie

Licence Biologie moléculaire

Module: Techniques d’Analyse Biologique (TAB)

Chapitre II: La centrifugation

Préparé par

Dr LAHIANI S.

Révisé par: Prof. Moreno Galleni (CIP de l’université de Liège)

Année académique 2022-2023

vidéo
• PARTIE I: CONNAISSANCES DE BASE
Les étapes de base d’une analyse biochimique
 I- DÉFINITIONS

- Beaucoup d'expériences en biochimie exigent une ou

plusieurs étapes de centrifugation. Cette technique
permet d'exposer des échantillons à de fortes
accélérations qui permettent la séparation des
constituants. On peut ainsi fractionner une
préparation en un sédiment (ou "culot"), constitué
de matériel plus ou moins solidement entassé dans
le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant
qui sera le liquide résiduel au dessus du sédiment.
 II. PRINCIPES DE BASE

• Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer

dans ce champ jusqu'à ce qu'elle rencontre une résistance capable
de l'arrêter complètement. Ce principe fondamental de physique
est très utilisé en biochimie pour séparer des précipités, des
cellules, des organites et même des macromolécules. En mettant
une préparation biochimique dans le rotor d'une centrifugeuse et
en faisant tourner celui-ci, on génère une accélération qui va
pousser les particules qui la composent vers l'extérieur du rotor,
c'est-à-dire le fond du tube à centrifuger. La vitesse avec laquelle se
déplaceront ces particules est proportionnelle à
• la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise
• la masse de la particule
• la différence entre la densité de la particule et celle du solvant,

et inversement proportionnelle à la friction avec le milieu, en fonction

de la taille et à la géométrie des particules.
 II. PRINCIPES DE BASE

• La principale limite qui détermine la vitesse de rotation du rotor est

évidemment la force du moteur qui le fait tourner. Plus le rotor est
lourd et volumineux, plus l'effort que doit fournir le moteur est
grand.
• une gamme d'appareils en fonction des besoins expérimentaux a
été développé , particulièrement au niveau des accélérations
requises, des volumes de matériel à centrifuger, de la température
de travail, etc.
• Centrifugeuses de table: Les modèles les plus simples, souvent
appelées centrifugeuses cliniques, permettent d'atteindre de faibles
accélérations (1000 à 3000 xg) à des vitesses de rotation
relativement basses (moins de 3000 RPM). Certains modèles sont
réfrigérés, certains autres non.
 II. PRINCIPES DE BASE

• Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes.

Elles permettent d'obtenir des vitesses de rotation de l'ordre de 30
000 RPM, donnant pour les plus petits rotors des accélérations
d'environ 20 000 xg. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces
centrifugeuses permettent de centrifuger des relativement gros
volumes. Certains rotors peuvent même contenir quatre ou six
bouteilles de 250 mL.
 II. PRINCIPES DE BASE

• Ultracentrifugeuses: Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent

d'atteindre des accélérations très élevées (jusqu'à 300 000 xg) en faisant tourner

des rotors très rapidement (50-85 000 RPM). De telles vitesses de rotation ne

peuvent s'obtenir que sous pression très réduite. Les faibles pressions permettent

aussi d'éviter la surchauffe du rotor et de l'échantillon. Tous les modèles sont

réfrigérés. Ces appareils doivent donc être munis de pompe à vide et de systèmes

de réfrigération. Les volumes sont quelques peu limités, généralement on ne

trouve pas de rotors pouvant contenir plus d'une dizaine de tubes de 40 mL.

Récemment, la compagnie Beckman a fabriqué un modèle d'ultracentrifugeuse

tournant à 130,000 rpm générant des accélérations de plus d'un million de g!

Un diagramme et une description du fonctionnement d'une ultracentrifugeuse ont

été publiés récemment (JM Perkel, 2004).

 II. PRINCIPES DE BASE

• Microcentrifugeuses: On a aussi développé des centrifugeuses

spécialement conçues pour les micro-volumes très souvent
employés en biochimie moderne. Les microtubes à centrifuger sont
des petits tubes coniques généralement de 1.5 mL fait de
polypropylène et assez peu dispendieux. Les centrifugeuses de ce
type peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de
l'ordre de 12-15 000 x g. Les modèles les moins couteux n'ont pas
de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés
 III. Eliment de base: ROTOR
• Rotors
• La fabrication et la conception des rotors doivent tenir compte de nombreuses
contraintes. Ils doivent être évidemment suffisamment résistants pour supporter
les accélérations voulues mais suffisamment légers pour que le moteur de la
centrfugeuse puisse les faire tourner à la vitesse requise.
• Pour les centrifugations à faible vitesse peuvent se faire avec des rotors en acier.
Cependant, pour les fortes accélérations, on utilise des alliages à base de métaux à
la fois légers et résistants comme l'aluminium et le titane. Les rotors faits de
matériaux composites (à base de fibres de carbone), extrêmement résistants et
légers, ont même fait leur apparition depuis quelques années.
• C'est pourquoi chaque rotor a une vitesse maximale à laquelle on peut les faire
tourner. Il est esentiel de respecter scrupuleusement cette limite pour éviter le bris
du rotor ou celui du moteur.
• Une autre contrainte est la dimension du rotor. Pour maximiser la vitesse de
rotation il faut minimiser le rayon du rotor, donc sa taille. Pour centrifuger de gros
volumes, il faut évidemment de plus gros rotors, ce qui explique que les rotors de
grande capacité ne peuvent tourner qu'à des vitesses réduites.
• Il existe trois grands types de rotor: à angle fixe, à godets mobiles et verticaux.
IV. Type de Rotor
 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes préparatives et/ou séparatives

CENTRIFUGATION

Centrifugation
Augmentation de la sédimentation proportionnelle au carré de
la vitesse et au rayon de l’axe de centrifugation

Remarques
Centrifugation horizontale ou oblique
Vérifier la vitesse (surtout faible)
Eviter la décélération brutale
Récipients variables, volumes variables
Possibilité  20000 g
Réfrigération possible
 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes préparatives et/ou séparatives

ULTRACENTRIFUGATION

Principe
Accélération élevée (> 100000g), température réfrigérée

Ultracentrifugation préparative
 1/ Différentielle : mélange homogène  2 fractions (culot et
surnageant)
 2/ En gradients de densité
a) Zonale : gradient de saccharose, séparation selon les
coefficients de sédimentation
b) Isopycnique : chlorure de césium, séparation selon la densité
 MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes préparatives et/ou séparatives

ULTRACENTRIFUGATION
Remarques :
 la forme du gradient est importante
Gradient linéaire  macromolécules, Gradient concave  lipoprotéines
(flottation)
Gradient discontinu ou par paliers  cellules, organites subcellulaires,
homogénats,
purification de virus, Gradient à paliers multiples
 la préparation est manuelle ou informatisée
 le remplissage est variable selon la nature du gradient
 la récolte des fractions se fait à la pipette ou par pompe
 l’analyse des fractions est discontinue ou en continu
V. I/ Ultracentrifugation différentielle
 V. 2/ Ultracentrifugation en gradients de densité
Centrifugation en gradient de saccharose (de zone )
Principe : séparer des macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur
forme dans une solution de centrifugation sous l'effet d'un champ gravitationnel
intense ( lors de rotations dans une centrifugeuse).
En effet la distance de migration en un temps donné est fonction du PM et de la
forme de la macromolécule.
La solution de centrifugation est souvent un gradient de concentration de
saccharose. Il permet de stabiliser la séparation des molécules au cours puis à la fin
de l'ultracentrifugation. Ici, la mesure de la vitesse de migration d'une particule
donnée permet de déterminer sa constante de sédimentation (S) qui est liée à la
forme et au PM de la particule étudiée.
Ce type de centrifugation est utilisée pour séparer grossièrement des fragments
dont les tailles se répartissent sur qq kb.

Utilisations majeures :
purification des bras (court et long) des phages.
sélection des fragments d'ADN de tailles correctes compte tenu du vecteur utilisé
lors de la constitution des banques génomiques.
isolement des polysomes
fractionner des ARN (séparer des ARN 28S, 18S,5S,ARNt et ARNm)
la centrifugation isopycnique (gradient
continu) : Une solution de chlorure de
césium (CsCl) de densité donnée soumise à
une force de gravité intense forme
spontanément un gradient de densité
continu.La résolution de tels gradients
atteint le centième d'unité de densité. Les
molécules ajoutées à la solution de ClCs
vont se placer, au cours de la migration,
dans la zone du gradient dont la densité est
la même que la leur. Ce type
d'ultracentrifugation est très résolutif mais
d'un maniement délicat.
Centrifugation sur coussin (gradient discontinu)
Le gradient est préformé par des dépôts
successifs (appelés coussins) de solution de ClCs
de densité croissante. Les différentes molécules et
les particules virales ou phagiques vont se placer au
cours de la centrifugation au dessus de la couche de
ClCs qu'elles ne pourront pas traverser. En effet
seules les molécules dont la densité est supérieure à
celle du coussin de chlorure de césium pourront le
traverser. La fraction est récupérée à l'interface de
deux coussins.
Ce type de centrifugation permet de séparer
rapidement et facilement des mélanges d'acides
nucléiques dont les densités sont différentes,
homogènes et connues.
Utilisation majeure : préparation rapide et à grande
échelle des phages ou des virus de densité connu

Un exemple d'utilisation de la centrifugation

sur coussin : la purification des phages