Chromatographie Liquide Haute

Performance
-HPLC-
Plan
Introduction
I. Principe et notions fondamentales
II. Appareillage en HPLC
III. Applications
IV. Analyse quantitative
Conclusion
Introduction

Le développement des chromatographies sur colonne réalisées initialement par simple

gravité à conduit à la diminution de la taille des particules support ( 5 à 10 m ) et par
conséquent à la nécessité d’exercer de fortes pressions pour permettre l’élution

Les systèmes de détection des composés à la sortie de la colonne, en constant

développement et la diversité des phases stationnaires actuellement disponibles ont
fait de l’HPLC une méthode analytique incontournable et la méthode
chromatographique la plus connue
I. Principe et notions fondamentales

Les méthodes chromatographiques sur colonne sont des méthodes analytiques de

séparation et de quantification basées sur les différences de distribution des
espèces analysées entre deux phases non miscibles : une phase stationnaires et
une phase mobile

La classification des méthodes chromatographiques est :

- Selon la nature de la phase mobile

- Selon la nature des phénomènes responsables de la séparation

I. Principe et notions fondamentales

Phénomènes mis en jeu

- Adsorption : lorsque la PS est solide, les phénomènes d’adsorption des solutés transportés par

un liquide résultent d’un double effet physique ( physisorption ) et chimique ( chimisorption )

- Partage : résulte de la différence de solubilité lorsque les deux phases sont liquides

- Échange d’ions : PS contenant en surface des sites ioniques : la séparation met en jeu des

échanges entre les ions de l’échantillon et ceux de la phase stationnaire

- Exclusion-diffusion : séparation uniquement selon la taille des molécules , sur un gel poreux
 I. Principe et notions fondamentales
Phénomènes mis en jeu
I. Principe et notions fondamentales
1. Grandeurs chromatographiques

Temps de rétention d’un composé :

Temps entre l’injection et l’apparition du signal correspondant
au composé considérée. Il permet d’identifier ce composé
☞ C’est la principale donnée qualitative

Aire du pic :
La surface du pic ou AUC est proportionnelle à la quantité du
composé
☞ C’est la principale donnée quantitative

Temps mort ( tm ou t0)

Temps de rétention des substances non retenues
I. Principe et notions fondamentales

1. Chromatogramme :
- Un diagramme montrant l’évolution du signal de détecteur en fonction du temps d’élution

- Ce graphique est utilisé à la fois en analyse qualitative et quantitative

I. Principe et notions fondamentales

2. Grandeurs chromatographiques
2.1 coefficient de distribution

Traduit l’importance relative des forces intermoléculaires qui excitent entre le

composé et les deux phases
Plus K est grand  plus le composé est retenu
I. Principe et notions fondamentales
2.2. Forme des pics :

(1) Dans le cas idéal , le composé se partage également entre la phase S et la phase M, le pic est symétrique
Dans la pratique ;
(2) Trainée en queue : le composé a une grande affinité vis-à-vis à la Phase S
(3) Trainée en tête : le composé a une grande affinité vis-à-vis à la Phase M
I. Principe et notions fondamentales

2.3. Paramètres de rétention :

• Tr : temps de rétention

Temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui qui

correspond sur le chromatogramme au max du pic qui lui
est lié
• Tm ou T0: temps mort

Temps nécessaire pour qu’un composé non retenu traverse

la colonne
• Tr’ : = Tr – Tm = temps de rétention réduit ( corrigé)
I. Principe et notions fondamentales

2.3 Paramètres de rétention :

• Vr : Volume de rétention : Volume de la phase mobile nécessaire pour
faire migrer un composé d’un bout à l’autre de la colonne

Vr = Tr . D ( D : débit de la Phase M : ml/min )

• Facteur de capacité : K’ : Rapport des quantités de substances qui
trouvent dans les 2 phases :
I. Principe et notions fondamentales
2.4. Paramètres de séparation :
• Facteur de sélectivité :

Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics on

utilise le facteur de sélectivité

: est toujours > 1 : valeurs optimales 2 à 10

I. Principe et notions fondamentales
2.4. Paramètres de séparation :
• Facteur de résolution :

La résolution de deux pics voisins est définie par le rapport de la distance entre le
max des deux pics et la moyenne arithmétique de la largeur à la base de deux pics

: largeur du pic à la base

I. Principe et notions fondamentales
3. Efficacité d’une colonne
• Nombre de plateaux théoriques

L’efficacité de la colonne se traduit par l’aptitude de la colonne à donner

des pics fins, la largeur d’un pic est caractéristique de l’efficacité de la
séparation

L’efficacité est mesurée par le nombre de plateaux théoriques N

ou
I. Principe et notions fondamentales
3. Efficacité d’une colonne
• Nombre de plateaux théoriques effectifs

Il est plus judicieux d’utiliser le nombre de plateaux théoriques effectifs

puisqu’il dépend vraiment de temps passé dans la phase stationnaire

ou
II. Appareillage en HPLC
conception modulaire ou les différentes composantes sont liées entre elles par
des canalisations de très faible diamètre interne ( 0.1 mm) en acier inoxydable.
II. Appareillage en HPLC
1. Réservoir de la phase mobile

Réservoir en verre ou en acier inoxydable

1. Il renferme la phase mobile

2. Il doit être étanche pour éviter :

- évaporation préférentielle

- Dissolution des gazes de l’atmosphère

3. On filtre la PM pour éliminer toute particule en suspension car dans les tubes de l’appareil ont
un diamètre extrêmement fin et risquent de se boucher
II. Appareillage en HPLC

2. Dégazeur :

Son rôle est d’enlever le gaz dissous qui peuvent former les bulles et interférer dans la
séparation et la détection

Plusieurs techniques :

1. Barbotage d’un gaz inerte N2 4. Chauffage

2. Pompage sous vide 5. Agitation

3. Distillation 6. Bain ultrasons

II. Appareillage en HPLC

3. Pompe

Son rôle d’assurer l’écoulement de la phase mobile dans la colonne

- Débit : 0.01 à 10 µl/ml

- Pression maximale : 400 bars

- Stabilité du débit < 0.5%

- Résistance à la corrosion

- Chambre de mélange efficace et de faible volume

II. Appareillage en HPLC

4. Systèmes d’injection :

4.1 injection à seringue :

On apporte l’échantillon par une seringue dont l’aiguille traverse un

septum en caoutchouc pour déposer l’ échantillon au sommet de la
colonne qui est placée dans le septum
II. Appareillage en HPLC
4.2 Vannes à boucles d’injection :

Le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d’échantillonnage d’une

capacité fixe

Cette boucle permet d’introduire l’échantillon sans modifier la pression dans la colonne

Possède deux positions :

Chargement : permet le remplissage de la boucle d’injection

Injection : mise en circulation de l’échantillon dans le système chromatographique

II. Appareillage en HPLC
5. Colonne

La colonne se présente comme un tube , en acier , dont la longueur et le diamètre présentent

des différences selon les modèles

La phase stationnaire est déposée à l’intérieur de la colonne ou elle est retenue par une pastille
en acier inoxydable fritté

- Longueur de 10 – 30 cm

- Diamètre interne : 3,9 à 20 nm

- Granulométrie : 3 à 10 µm
II. Appareillage en HPLC

6. Four pour colonne

- Les écarts de la T° modifiant les temps de rétention, les appareils actuels

permettent de thermostater la colonne et l’éluant, à la fois pour assurer la
répétabilité des analyses et pour faire intervenir éventuellement la T° comme
paramètre de séparation

- En effet l’ augmentation de la T° diminuera la valeur K, K’ et le temps de

rétention
II. Appareillage en HPLC

7. Détecteur

Rôle : suit en continu l’apparition des solutés pour détecter on utilise différentes phénomènes
physico-chimiques le signal obtenu est enregistré en fonction de temps

Ils doivent répondre à certains exigences :

- Signal proportionnel à la concentration , Sensibilité , Réponse stable dans le temps, Faible

temps de réponse , Bruit de fond faible

Il n’existe pas un détecteur universel mais il faut le choisir en fonction des substances analysées
II. Appareillage en HPLC
7.1. Les détecteurs UV-Visible

La détection est basée sur la loi de Beer- Lambert, l’absorbance est mesurée à la longueur d’onde ou plusieurs longueurs
d’onde dans l’UV- Visible
- Très forte sensibilité 10-8 M

- Grande sélectivité

- S’assurer de la pureté d’un pic

- Renseignements spectraux sur les analytes

- Peu sensible aux variations de débit et de température

- Utilisation et entretien facile

- Peut être utiliser en mode gradient

II. Appareillage en HPLC

7.2. Détecteurs de fluorescence :

Détecteurs très sensibles et très sélectifs, mais ils sont destinés uniquement
aux solutés fluorescents ( c.-à-d. qu’elle réémettent sous forme de lumière
une partie de l’énergie qu’elle reçoivent d’une source lumineuse excitatrice )
ou après formation post colonne de composés fluorescents ( dérivatisation )

F = k ( 1 – 10-
II. Appareillage en HPLC
7.3. Réfractomètre différentiel
Il mesure en continu la différence de l’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de la colonne. Il
est peu sensible et nécessite une T° parfaitement réglée à 0.01°C près

- Il est inutilisable en mode gradient sauf si les solvants utilisés ont des indices de réfraction très proche

- Les pics obtenus peuvent être positifs ou négatifs selon que l’indice de réfraction augmente ou diminue
II. Appareillage en HPLC
II. Appareillage en HPLC

8. Intégrateur-enregistreur

- Il s’agit en fait d’un petit ordinateur qui récupère toutes les données issues des
détecteurs, trace les chromatogrammes et intègre la surface des pics.

- Il imprime un rapport d’analyse donnant les temps de rétentions et les surfaces de

chaque pic

- On peut le programmer pour qu’il fasse seul les divers calculs conduisant aux cc à
partir de chromatogrammes étalon et chromatogrammes des mélanges analysés
III. Applications

Le domaine d’application de la technique (HPLC) est très vaste.

- Industrie pharmaceutique

- Industries chimiques

- Agro-alimentaires

- Environnement

- Biochimie
VI. Analyse chromatographique

1. Analyse qualitative :

- Identifier les analytes par leurs Tr qui pour des conditions données
( PM, débit, colonne , …) est caractéristique du composé
VI. Analyse chromatographique

2. Analyse quantitative :

Toutes les méthodes de quantification en chromatographie sont des

méthodes comparatives et non pas absolues
VI. Analyse chromatographique

1. Étalonnage externe :

L’étalonnage externe consiste à préparer à partir d’une substance pure

une gamme d’étalonnage qui va couvrir la plage de travail
VI. Analyse chromatographique
2. Étalonnage interne
Le principe général est d’ajouter au cours de la préparation des échantillons une substance dont la
structure et le comportement est proche de la substance à doser

La courbe d’étalonnage sera établie entre le rapport de la

réponse ( réponse de détection de la substance à doser /
réponse de détection de l’EI ) et le rapport de la
concentration entre la substance à doser et l’EI

Calcul : A éch /AEI = a C éch /CEI + b

VI. Analyse chromatographique

3. Ajouts dosés :
On ajoute à une concentration inconnue mais constante, de notre composé des ajouts successifs de
substance à analyser
VI. Analyse chromatographique
4. Normalisation interne :
On compare les aires des pics d ’élution au cours d’une même injection

Cette méthode permet de donner le pourcentage d’un composé dans un mélange, elle ne donne
pas la concentration ou la masse du composé analysé
Idem pour y et z.
F : facteurs de réponse déterminés par rapport à un composé de référence f R : 1
conclusion

L’HPLC est devenue une méthode analytique de référence pour pratiquement tous
les domaines

La possibilité d’agir de manière très précise sur la sélectivité et la résolution pour

le choix de la colonne, phase stationnaire et phase mobile fait que le champ
d’application devient très large

Le développement actuel de procédés de couplage notamment à la spectroscopie

de masse augmente la puissance des analyses chromatographiques