Cours (Techniques D'analyse Biologiques)

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université « Dr. Moulay Tahar » de Saida
Faculté des sciences
Département de biologie
Techniques d’analyse biologiques

(Partie II)
- Méthodes spectrales –
3ème année Biochimie
Préparé par : Mr. Halla Noureddine
Année Universitaire
2019 -2020
Généralités sur les méthodes
spectrales
ème
Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA Techniques d’analyse biologiques (3 année Biochimie)
Généralités sur les méthodes spectrales
1. Introduction :
La spectrophotométrie est l’étude des interactions entre la matière et les radiations

électromagnétiques.
Plusieurs théories ont été développées pour expliquer ce qu’est la lumière :
• La théorie électromagnétique (Maxwell): elle attribue à la lumière les

propriétés d’un rayonnement électromagnétique constituée d’un champ
magnétique B→ et d’un champ électrique E→ qui lui est perpendiculaire. Ces
champs, en un point donné, varient de façon sinusoïdale, en phase.
• La théorie corpuscules associée à la lumière des corpuscules appelés photons,
dont l’énergie est proportionnelle à la fréquence des ondes lumineuses.
2. Ensemble des radiations électromagnétiques :
On caractérise une radiation par sa fréquence ‘ν’ (exprimé en hertz ‘Hz’) qui définit
l’énergie transportée par les photons : ∆E = h ν (où h est la constante de Planck ; h =
6,63 . 10-34 J.s). on utilise également d’autre grandeurs liées directement à la
fréquence des radiations : la période ‘T’ (T = 1/ν), la longueur d’onde ‘λ’ (par
mètre), distance parcourue par l’onde pendant une période (λ = cT = c/ν, où c
représente la célérité de la lumière dans le vide ; le nombre d’onde ‘σ’, σ = 1/λ
(exprimé en cm -1).
3. Interaction des radiations électromagnétiques avec la matière :
Toutes les interactions se font par échange d’énergie entre le rayonnement et la

matière et tout processus favorable d'interaction résulte d'une transition énergétique
entre un niveau fondamental et un niveau excité. La répartition de l’énergie dans la
matière est :
- Energie propre des noyaux (quantifiée).

- Energie due aux électrons des atomes ou des molécules (quantifiée).
- Energie de vibration des atomes dans une liaison (quantifiée).
- Energie de rotation de l’ensemble d’une molécule (quantifiée).
- Energie de translation des atomes ou des molécules.
Dans l’état stable, à basse température, seule les basses énergies sont possibles. On
peut augmenter l’énergie de la matière par différents processus : thermiques,
électriques, ou électromagnétiques ; c’est l’excitation.
Le rayonnement incident peut interagir de plusieurs manières avec la matière :
2 Généralités sur les méthodes spectrales | Mr.HALLA N.

ème
1. Réflexion : phénomène de retour d’une onde lorsqu’elle rencontre une

surface, transparente ou non, sans la traverser.
2. Réfraction : La réfraction est la déviation de la lumière lorsqu'elle traverse
l'interface entre deux milieux transparents de densités optiques différentes.
Cependant, la dispersion est la séparation des diverses composantes d'une
lumière polychromatique par réfraction.
3. Diffraction : La diffraction est la déviation de la lumière qui traverse une
fente étroite ou qui rencontre un obstacle très petit.
4. Diffusion : La diffusion est la dissémination dans toutes les directions de la
lumière lorsqu'elle rencontre un milieu constitué de fines particules ou une
surface irrégulière. C'est le phénomène de diffusion qui est responsable de la
couleur bleue du ciel et de la couleur rouge des couchers de soleil.
5. Fluorescence : La fluorescence est l'émission instantanée, de lumière par un
corps soumis à un rayonnement. L'émission de lumière se fait donc pendant
l'excitation.
6. Absorption : L'absorption est le retrait, partiel ou complet, de lumière dans
un faisceau lumineux. L'absorption peut se faire lors de la réflexion de la
lumière par une surface colorée ou par la transmission à travers un filtre.
4. Analyse des spectres :
Dans la plupart des cas, le rayonnement qui interagit avec la matière est complexe : il
est formé d’un ensemble de radiations de longueurs d’onde différentes ; on dit qu’il
est « polychromatique ».
2 Généralités sur les méthodes spectrales | Mr.HALLA N.

Spectroscopie d’absorption dans l’UV-
visible
ème
Spectroscopie d’absorption dans l’UV-visible
La spectrophotométrie UV / Visible est une méthode très commune dans les laboratoires. Elle
repose sur l'interaction du rayonnement électromagnétique et de la matière dans le domaine
s'étendant du proche UV au très proche IR soit entre 180 et 1100 nm. L'absorbance des
composés dans le proche UV et le visible est exploitée en analyse quantitative par application
de la loi de Beer-Lambert.
Domaine spectral : Le domaine spectral concerné est subdivisé en trois plages appelées
proche UV, visible et très proche IR (185-400 ; 400-800 ; 800-1100 nm). La plupart des
spectrophotomètres commerciaux recouvrent la gamme allant de 190 à 950 nm.
Principe : L'absorption des rayonnements par les molécules dans cette gamme de longueur
d'onde est due au passage du niveau fondamental à un niveau excité sous l’effet du
rayonnement ; plus précisément au passage d’un électron d’un niveau électronique à un autre
niveau électronique d’énergie supérieure.
Les spectres dans l'UV / visible : Le document de base fourni par les spectrophotomètres,
appelé spectre, correspond au tracé des variations de l’absorbance en fonction de la longueur
d'onde des photons incidents. Les spectres dans l’UV / visible donnent la transmittance ou
l’absorbance de l’échantillon analysé en fonction de la longueur d’onde du rayonnement ou
parfois du nombre d’onde, son inverse. La transmittance, notée T, est donnée par :
T = I/I0
où I0 est l’intensité incidente et I, l’intensité transmise. L’absorbance est définie par :
A = -logT
Origine des absorptions : L’absorption dans le domaine UV / visible est due au passage d'un
niveau électronique à un autre d’énergie supérieure avec changement des niveaux de vibration
et de rotation ; au cours de ce processus, un électron passe d’une orbitale moléculaire à une
autre d’énergie supérieure.
Les transitions électroniques rencontrées en chimie organique sont :
Transitions σ- σ* : sont situées dans le lointain UV vers 130 nm.
Transitions n - σ* : Elles correspondent à des longueurs d’onde comprises entre 150 et 250
nm.
Transitions n - π* : exemple : carbonyle; elle se situe entre 270 et 290 nm.
Transitions π - π*.
Instrumentation dans l’UV/visible : Les spectromètres UV-visible comportent une source

de lumière suivie d’un monochromateur, d’un compartiment pour placer les échantillons, puis
d’un dispositif de réception associé à un dispositif de traitement des données permettant au
final le tracé d’un spectre
4 Spectroscopie d’absorption dans l’UV-visible | Mr. HALLA N.

ème
4.2- Les sources lumineuses : Deux sources sont d'utilisation courante dans ce domaine :
• Solides chauffés, Tungstène (visible-infrarouge) ou lampe à arc xénon (visible)

• Décharges des gaz raréfiés, lampe à arc au deutérium sous moyenne pression (UV <
350 nm) ou vapeur de mercure (UV, discontinu)
4.3- Les monochromateurs : Le monochromateur est utilisé pour extraire du rayonnement

émis par les sources une bande spectrale très étroite dont on peut faire varier la longueur
d'onde.
4.4- Les détecteurs : Les détecteurs sont soit des barrettes de photodiode lorsqu’on utilise un
système dispersif soit des photomultiplicateurs.
X – Applications :
X.1 - Analyse qualitative : Les spectres UV fournissent généralement peu de renseignements

sur la structure moléculaire des composés comparés aux spectres IR. Néanmoins, on les utilise
soit pour une confirmation soit pour une identification grâce aux règles empiriques. La
spectrométrie UV / Visible s'applique principalement aux molécules contenant :
- un ou plusieurs noyaux aromatiques ;
- des groupements C=O (aldéhydes ; cétones) ;
- des groupements N=O ;
- des groupements N=N.
X.2 - Analyse quantitative : L’analyse quantitative par la spectrométrie UV-visible est très
employée (beaucoup plus que l’analyse qualitative) grâce à l’utilisation de la loi de Beer-
Lambert.
Loi d’absorption de la lumière - loi de Beer-Lambert : Soit une lumière monochromatique

traversant une solution absorbante de concentration C contenue dans une cuve d’épaisseur l.
Une partie de ce rayonnement sera absorbée par l’échantillon et une partie sera transmise.
I = I0e-klC
ème
• I0 est l'intensité de la lumière incidente

• I est l'intensité après passage à travers la cuve contenant la solution (intensité
transmise)
• l est la distance traversée par la lumière (épaisseur de la cuve) (en cm)
• C est la concentration des espèces absorbantes
• k est une constante caractéristique de l’échantillon.
Cette équation peut se réécrire log(Io/I) = klC/2.3 = ε l C.
* log(I0/I) est appelé absorbance (A)
* I/I0 = T est la Transmittance
ε est le coefficient d'extinction molaire ; c’est une caractéristique de la substance étudiée à

une longueur d'onde donnée. Si C est la molarité, ε est en L.mol-1.cm-1.
On obtient alors la relation connue sous le nom de loi de Beer-Lambert :
A = - log T = ε C l
La bande d'absorption, observée dans le domaine de l’UV-visible, est caractérisée par sa

position en longueur d'onde λmax, nm (ou en nombre d’onde, cm-1) et par son intensité reliée
au coefficient d’extinction molaire εmax.
La loi de Beer-Lambert est vérifiée dans les conditions suivantes :
• la lumière utilisée doit être monochromatique ;

• les concentrations doivent être faibles ;
• la solution ne doit être ni fluorescente ni hétérogène ;
• le soluté ne doit pas donner lieu à des transformations photochimiques ;
• le soluté ne doit pas donner des associations variables avec le solvant.
X.3 - Autres applications
D’autres applications sont connues pour le Contrôle Qualité ou le suivi de la cinétique d’une
réaction, la détermination des constantes de dissociation des acides ou des constantes de
complexation, la détermination des masses molaires…

Spectroscopie d’absorption dans l’Infra
Rouge
ème
Spectroscopie d’absorption dans l’Infra Rouge
1. Domaine spectral :
Le rayonnement infrarouge (IR) est localisé au-delà des longueurs d’ondedans le rouge, sont
situées entre la région du spectre visible et des ondeshertziennes. Le domaine infrarouge
s’étend de 0,8µm à 1000 µm. Il estarbitrairement divisé en 3 catégories, le proche infrarouge
(0,8 à 2,5µm) soit12500-4000 cm-1), le moyen infrarouge (2,5 à 25µm soit 4000-400 cm-1)
etle lointain infrarouge (25 à 1000µm soit 400-10 cm-1).
2. Principe :
La spectroscopie IR est basée sur l’interaction de la lumière IR avec lenuage électronique des
liaisons chimiques. Dans le cas de la spectroscopied’absorption IR, le rayonnement émis par
la source polychromatique induit des transitions entre les niveaux d’énergievibrationnelle.
Lors de cette interaction il y a émission de radiations à deslongueurs d’onde différentes de
celle de la radiation incidente.
3. Molécules polyatomiques
Seules les liaisons qui présentent un momentélectrique dipolaire oscillant sont actives dans
l'infrarouge. La figure 01 montredes exemples de quelques modes vibratoires typiques. A
chaque modecorrespond une fréquence propre fondamentale et plusieurs autresfréquences
associées aux harmoniques.
Figure 01 : Exemple de vibrations atomiques : la chaîne hydrocarbonée
8 Spectroscopie d’absorption dans l’IR | Mr. HALLA N.

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4. Appareillage
Il existe deux sortes de spectromètre IR: le spectromètre à balayage et lespectromètre à

transformée de Fourier.
1. Un spectromètre IR à balayage s'agit du modèle le plus classique,semblable aux

spectrophotomètres utilisés en spectroscopie UV-visible.
2. Un spectromètre IR à transformée de Fourier (IRTF) est identique àun spectromètre à

balayage le système dispersif est remplacé par uninterféromètre (de Michelon) dont la
position est ajustée par laser.Ils sont composés des éléments suivants :
• Source :Le choix de la source dépend de la région infrarouge où l’on veut travailler.
Cependant, dans la plupart des cas on travaille dans la région appelée infrarouge
moyen c’est à dire entre 4000 et 400 cm-1.
• Echantillon:Le rayonnement IR provenant de la source est polychromatique, tout
d'abord séparé en deux faisceaux équivalents dont l'un est focalisé sur une cellule de
référence et l'autre sur une cellule contenant l'échantillon, ce dernier traverse alors le
compartiment échantillon et grâce à un miroir à secteur tournant est recombiné au
faisceau de référence. Ce faisceau recombiné passe ensuite par la fente du
monochromateur à réseau.
• Système dispersif :Le monochromateur consiste le plus souvent en un réseau capable
de disperser le rayonnement incident en ses diverses longueurs d'onde. Ce réseau est
de plus en rotation constante afin de pouvoir focaliser chaque longueur d'onde l'une
après l'autre sur un détecteur.
• Détecteur : le détecteur détecte les variations de température et les transforme en
variationd’intensité. Cette différence d'intensité permet alors facilement d'obtenir
latransmittance (T), qui s'exprime généralement en %.
L'intensité du faisceau qui arrive au détecteur est traduite sous formed'interférogramme. Cet
interférogramme est ensuite traité par Transforméede FOURIER. C'est un processus
mathématique permettant de décomposerun signal complexe, fonction du temps, en une
somme de signaux simplesde fréquences.

ème
Figure 02 : L’interféromètre de Michelson et chemin optique dans le spectromètreFT-IR
5. Application de l’IR à la détermination des fonctions organiques.
Les spectres IR sont donc tracés dans l’intervalle maximal [400, 4000] (cm-1), la grandeur
portée en ordonnée étant la transmittance T =I/I0 oul’absorbance (ou densité optique) A =
logI0/I, I étant l’intensité transmise par l’échantillon et I0 l’intensité transmisepar la
référence.Comme pour toutes les techniques de spectroscopie, elle peut être employée pour
l'identification de composés ou pour déterminer la composition d'un échantillon.

Spectrométrie d'absorption atomique
Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA Techniques d’analyse biologiques (3ème année Biochimie)
Spectrométrie d'absorption atomique
1. Introduction :
La spectrométrie d’absorption atomique (SAA) étudie les émissions ou absorptions de lumière

par l'atome libre.La SAA permet de doser dans pratiquement toute sorte d’échantillon,un ou
plusieurs éléments pré-définis (métaux ou non-métaux) choisis dans une listeen contenant
environ 70. La sensibilité permet d’atteindre pour certains éléments desconcentrations
inférieures au µg/L (ppb). Les applications sont très nombreuses.
2. Principe :
La spectroscopie d’absorption atomique (SAA) est basée sur le principe que les atomes libres
peuvent absorber la lumière d’une certaine longueur d’ondes. L'absorption des radiations
électromagnétiques des régions visibles et UV du spectre par les atomes libres résulte d'un
changement dans la structure électronique. L’absorption de chaque élément est spécifique,
aucun autre élément n’absorbe sa longueur d’ondes. L'intensité de l'absorption dépend
directement du nombre de particules absorbant la lumière selon la loi de Beer
Lambert.Cependant en pratique, cette relation n'est pas toujours vérifiée. On n'obtient pas
toujours une droite d'étalonnage. C'est le cas si la concentration devient trop élevée.
La SAA est une méthode basée sur un élément unique, utilisée pour reconstituer l’analyse des
métaux d’échantillons biologiques, métallurgiques, pharmaceutiques et atmosphériques par
exemple. La détermination spectroscopique d’espèces atomiques peut seulement être réalisée
à partir d’un échantillon à l’état gazeux, dans lequel les atomes individuels comme l’Ag, l’Al,
l’Au, le Fe et le Mg sont nettement séparés les uns des autres.
3. Appareillage :
Le dispositif expérimental utilisé en absorption atomique se compose d'une source, d’un

atomiseur, d'un monochromateur et d'un détecteur relié à un amplificateur et un dispositif
d'acquisition.
12 Spectroscopie d’absorption atomique | Mr. HALLA N.

Schéma représente dispositif expérimental utilisé en absorption atomique
3.1. Source de lumière :
Le rôle de la source primaire est de produire une radiation lumineuse à la longueur d’onde
caractéristique de l’élément à doser (raie d’émission). Les photons émis à cette longueur
d’onde caractéristique pourront être absorbés dans l’atomiseur par la raie d’absorption. Un
très grand nombre de sources primaires ont été essayées mais, en fin de compte, seulement
quelques types de lampes sont d’usage courant en absorption atomique.
3.1.1. Lampes à cathode creuse (HCL) : Les lampes à cathode creuse (Hollow Cathode
Lamps, HCL) sont certainement les lampes les plus répandues, sauf pour certains éléments
pour lesquels elles ne donnent pas satisfaction.
3.1.2.Lampes à décharge sans électrode (EDL) : Il s’est rapidement avéré que les lampes à
cathode creuse avaient des performances réduites pour toute une série d’éléments volatils.
Bien qu’il existe des lampes à décharge sans électrode (ElectrodelessDischargeLamps, EDL)
pour une cinquantaine d’éléments. Les lampes HCL et EDL sont parfaitement
complémentaires, les premières donnant d’excellents résultats pour les métaux non volatils,
les secondes s’adressant particulièrement bien à l’étude des métaux volatils.
3.1.3.Super-lampes et ultra-lampes : Un des inconvénients des lampes à cathode creuse est

que, lors d’une augmentation de courant, non seulement la lampe s’échauffe trop, mais un
phénomène de renversement de raie apparaît. Un nouveau type de lampes, dérivées de
cathodes creuses, est apparu sur le marché il y a quelques années. Il s’agit des super-lampes et
des ultra-lampes.
3.1.4.Lampes à vapeur de mercure : Certains appareils d’absorption atomique sont

spécifiques au dosage du mercure. Ils utilisent une lampe à décharge de vapeur de mercure.
Ces lampes émettent des raies assez larges et il faut les alimenter par un très faible courant, ce
qui peut entraîner un manque de stabilité.
3.2. Atomisation :
Rôle de l’atomiseur : La lumière émise par la source primaire passe au travers de la cellule
d’absorption (l’atomiseur) où une partie de la lumière incidente est absorbée. Le rôle de
l’atomiseur est de produire des atomes, mais ceux-ci doivent se trouver à l’état fondamental
pour pouvoir absorber les photons provenant de la source. On distingue essentiellement deux
types d’atomiseurs : la flamme et le four en graphite (électrothermique).
3.2.1. Flamme :
La technique de spectroscopie d’émission atomique de flammeavait montré depuis longtemps

qu’une flamme produite par la combustiond’un gaz (le plus courant étant l’acétylène) avec de

l’air produisaitdes atomes dont une faible proportion est à l’état excité. La majorité des
atomes s’ytrouvent à l’état fondamental.Lesflammes d’absorption atomique ont une forme
laminaire, mince(1 mm) mais fort longue (5 à 15 cm).
Nébuliseur : La solution d'analyse est pulvérisée en un aérosol constitué de fines gouttelettes.

Cet aérosol pénètre dans la chambre de nébulisation dont le rôle est de faire éclater les
gouttelettes et d'éliminer les plus grosses. Ce brouillard homogène pénètre alors dans le
brûleur. Il existe deux principaux type de nébuliseurs, le nébuliseur pneumatique (le plus
souvent utilisé en SAA ) et le nébuliseur ultrasonique (rarement utilisé en SAA).
Gaz : Les gaz qui entretiennent la flamme sont un mélange de comburant et de combustible.
Le comburant est le plus souventl’air et, dans certains cas, le protoxyde d’azote N2O. Les
combustibles sont surtout l’acétylène, parfois le propane oul’hydrogène. La flamme la plus
couramment utilisée est donc la flamme airacétylène(2 500 °C).
3.2.2. Four en graphite et atomisation électrothermique
Nous savons que la nébulisation est peu efficace et que le temps de séjour des atomes dans la
zone d’observation d’une flamme est extrêmement court (1 ms). Il a donc fallu trouver un
système dans lequel on analyse la totalité de l’échantillon et permettant d’augmenter le temps
de séjour des atomes dans la zone d’observation, il s’agit de l’atomisation
électrothermiques.
L’étape d’atomisation permet de dissocier la matrice résiduelle etd’atomiser le plus

sélectivement possible l’élément dosé. La températureappliquée et la durée de l’étape doivent
être suffisantes pourentraîner l’atomisation complète de l’analyte en évitant les effets
demémoire pouvant apparaître ultérieurement.
Un atomiseur électrothermique fournit une grande sensibilité parce-qu’il atomise l’échantillon

rapidement. L’atomisation se produit dans un four de graphite cylindrique, ouvert aux deux
extrémités et qui contient un trou au centre pour la présentation des échantillons. Le gaz le
plus communément utilisé est l’argon.
3.3. Monochromateur :
La lumière qui quitte la source n’est pas monochromatique : c’estun spectre de raies contenant
les raies de l’élément à doser, les raiesdu gaz de remplissage, ainsi que les raies d’éventuelles
impuretés.Le rôle du monochromateur consiste à éliminer toute la lumière,quelle que soit son
origine, ayant une longueur d’onde différente decelle à laquelle on travaille.
3.4. Détecteur :
Le détecteur est situé à la sortie du monochromateur. Son rôle estde mesurer les intensités
lumineuses nécessaires au calcul desabsorbances. Pratiquement tous les appareils à l’heure
actuelle sontéquipés d’un tube photomultiplicateur. Ce système de détectionconvient
parfaitement pour tous les spectromètres permettant l’analysemonoélémentaire.
4. Applications analytiques :
La spectrométrie d’absorption atomique peut être appliquée audosage d’une trentaine

d’éléments, et cela tout aussi bien au niveaudes éléments majeurs (domaine analytique de la
SAAF : 0,1 à10 mg/dm3) que d’éléments traces ou ultratraces (domaine analytiquede la
SAAE : 0,0001 à 0,1 mg/dm3). La SAA couvre un vasteéventail d’applications : l’analyse des
eaux, des tissus végétaux etanimaux, des aliments et boissons, des sols, engrais et
sédiments,des liquides biologiques, des produits industriels (ciments, verres,métaux, produits
pétroliers...).
La spectrométrie d’absorption atomique est une méthode analytiquecomparative ; elle

implique un étalonnage, et la qualité desrésultats dépend de la représentativité des étalons par
rapport auxéchantillons. L’étalonnage le plus courant s’obtient en mesurant l’absorbancede
solutions synthétiques à concentrations progressives en analyte.La concentration de la
solution inconnue est alors directementdéduite en rapportant sa valeur d’absorbance sur une
droite d’étalonnagepréalablement établie.
4.1 Analyses des eaux douces : Dans cette catégorie d’échantillons, nous considérons les
eaux derivières et de lacs, mais aussi les eaux d’égouts, de rejetsménagers et industriels.
4.2 Analyses des eaux salées : Nous considérons ici les eaux de mer et d’estuaires ainsi que
lessaumures industrielles.
4.3 Analyses de solides : Une grande partie des échantillons analysés en SAA sont
solides.Les matrices de certains sont presque uniquement minérales (sols,roches, sédiments,
poussières, matières en suspension), d’autresont une dominante organique (certaines matières
en suspension,tissus animaux et végétaux, ces deux derniers provenant
d’échantillonsagroalimentaires).
4.4 Analyses des liquides biologiques : Dans le domaine de l’analyse médicale, le contrôle
des métauxdans les liquides biologiques est très important. Les deux typesd’échantillons les
plus analysés sont le sang et l’urine.
4.5 Analyses des liquidesagroalimentaires : Les liquides agroalimentaires comprennent

toutes les boissons(eaux, vin, lait, jus de fruits) mais aussi les vinaigres et les huilesliquides à
la température ambiante.

Résonance magnétique nucléaire
ème
Résonance magnétique nucléaire
I - Introduction
La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique fondée sur l’absorption
du rayonnement électromagnétique par la matière dans un champ magnétique intense,
mais la transition provoquée concerne le noyau de certains atomes présents dans la
molécule. Elle constitue l’une des plus puissantes méthodes de détermination de la
structure des espèces aussi bien organiques qu’inorganiques.
II - Théorie
II.1 Principe générale :
Certains noyaux (possèdent un spin) sont comparables à de petits aimants, qui soumis
à un champ magnétique intense peuvent sous l’action d’un champ de radio fréquence
(RF) convenable, absorber une certaine quantité d’énergie : c’est le phénomène de
résonance. Il se traduit par le passage des noyaux d’un état énergétique favorable à un
état énergétique défavorable.
II.2 Propriétés nucléaires :
Un noyau possédant un spin non nul se comporte magnétiquement comme un petit

aimant. Les noyaux sensibles qui possèdent un spin nucléaire I égal à ½ comme le
1 13 31 15 19
proton H, le carbone C, le phosphore P, l’azote N ou le fluor F. Les noyaux à
2 14 17
spin I supérieur à ½ : le deutérium H l’azote N, l’oxygène O ou encore le soufre
33
S.Les noyaux non sensibles (un spin I égal à 0) possèdent tous un nombre de masse
et un nombre atomique pairs.
Le noyau possède un moment magnétique qui peut être assimilé en première

approximation à un petit aimant.
17 Résonance magnétique nucléaire |Mr.HALLA N.

ème
II.3 Interaction spin nucléaire-champ magnétique :
En l'absence de champ magnétique externe, les moments magnétiques de spin sont

orientés au hasard. Par contre, sous l'action d'un champ magnétique statique B0,un
noyau de spin I non nul peut prendre 2I+1 orientations par rapport à la direction de ce
1
champ. Pour exemple, le proton ( H) qui possède un spin nucléaire I = ½ prend deux
orientations:
m = +½lorsque le spin nucléaire est dans la même direction que le champ appliqué, il
est alors dans un état énergétique favorable α.
m = -½lorsque le spin nucléaire à une orientation antiparallèle au champ appliqué. Il

est alors dans une position énergétique défavorable β.
La différence d’énergie, ∆E, entre les deux états (αet β) dépendra directement de la
force du champ magnétique H0 selon :
∆E = (hγB )/2π où h est la constante de Plank, γ le rapport gyromagnétique du noyau

0
excité et B l’intensité du champ magnétique.
0
Orientation des moments magnétiques nucléaires : a) en absence, b) en présence d’un

champ magnétique externe.

ème
II.4 Condition de résonance :
La transition entre deux états demande un apport d’énergie qui est fourni par une
radiofréquence. Le passage d’un état α à un état β est appelé "transition énergétique".
L’énergie nécessaire est selon l’équation de Bohr : ∆E = (hγB )/2π = hν . La
0 0
fréquence du mouvement du proton en rotation est appelée fréquence de Larmor ν .
0
La résonance consiste donc au passage du noyau d’un état énergétique favorable α

(suivant la direction B0) à un état énergétique défavorable β (antiparallèle à B0). Cette
transition est induite par l’application ponctuelle d’un champ magnétique et de
radiofréquence. L’arrêt de l’application de la radiofréquence va permettre le retour à
l’équilibre des noyaux, c’est le phénomène de relaxation.
Le principe de la RMN du proton (RMN1H) consiste a :
(1) utiliser un champ magnétique H0 pour orienter les "spins" nucléaires des atomes,
(2) exciter ces spins par une onde radio a la fréquence de résonance, ce qui
faitbasculer certains spins.
III. Principales caractéristiques du signal RMN :
Chaque signal RMN est caractérisé par plusieurs grandeurs qui sont caractéristiques
de :
• Le déplacement chimique exprimé en ppm (partie par millions)

• La constante de couplage dont la grandeur est exprimée en Hertz
• L’intensité du signal
III.1 Le déplacement chimique :
La position des différentes raies du spectre RMN est déterminée par rapport à une
référence. Dans le cas du proton, on utilise le tétraméthylsilane Si(CH3)4 (note TMS).
Par commodité, on utilise une échelle de notation : le déplacement chimique noté δ,
exprime en partie par million (ppm). Cette valeur définie (δ) la position du signal sur
l’axe des fréquences (axe x du spectre), la valeur sera mesurée par rapport au signal
référence par la relation suivante : δ =(ν-νréf / νréf)X106. ν correspond au
ref
déplacement chimique des protons du TMS.
δest caractéristique de l’environnement du proton. Les protons de même

environnement sont dits magnétiquementéquivalents et ont le mêmeδ. Les
noyauxayant des environnements différents sont dits magnétiquementdifférents.Si un
signal sort à un champ voisin de celui de la référence (TMS), on dit qu'il sort à champ
fort : il est blindé. Inversement, si un signal sort à un déplacementchimique élevé, on
dit qu’il sort à champ faible : le signal est déblindé.
ème
Le déplacement chimique d’un proton dépend :
- essentiellement de la nature de l'atome qui le porte (carbone, azote ou oxygène

leplus souvent)
- des substituants portés par cet atome
- de la nature des atomes adjacents et des substituants portés par ces derniers
(OH, Cl,NO2…)
Les effets attracteurs (inductif ou mésomère) s’exerçant sur un carbone portantH

induisent un déblindage. Un effet donneur induira au contraire un blindage.Un
deuxième effet important est la présence d’électronspiau voisinage du protonétudie
(cycle aromatique ou liaison multiple).Les déplacements chimiques nous donnent
donc des indications surl'environnement chimique du groupe auquel appartient le
proton considéré. Onpourra ainsi identifier des groupes de protons a partir de la valeur
de δ.
III.2 Intensité des signaux :
L’intensité du signal considéré sera directement proportionnelle au nombre de protons

impliqués dans ce signal. L’intégration du signal par rapport à un signal de référence
permet alors de déterminer le nombre de protons.
III.3 Couplage spin-spin :
Ce couplage est responsable de la subdivision de certaines raies de résonance en

multiplets. Dans une molécule, l’énergie de chaque noyau est affectée par l’état de
spin de ses voisins. L’influence des noyaux se transmet via les électrons de liaison. Ce
type de couplage peut intervenir à travers plusieurs liaisons.
IV. Appareillage :
Les éléments suivants sont indispensables pour constituer un spectromètre :
• Un aimant pour produire le champ statique H0.

• Une source de radiations électromagnétiques de fréquence appropriée
(générateur).
• Une unité de balayage de fréquence dans tout le domaine des absorptions.
• Une cellule contenant l'échantillon.
• Un détecteur (récepteur de radiofréquence) qui mesure la quantité de
radiation absorbée par la cellule.
• Un enregistreur qui trace l'énergie absorbée en fonction de la fréquence.

Spectrométrie de masse
ème
Spectrométrie de masse
1. Introduction :
La spectrométrie de masse (SM) désigne une méthode de caractérisation de la matière

qui repose sur la détermination des masses atomiques ou moléculaires des espèces
individuelles présentes dans l’échantillon. Elle est présente dans des secteurs très
divers : chimie organique et inorganique, biochimie, chimie clinique et
environnementale, géochimie. Elle sert à toutes sortes d’analyses dans le but de
déterminer la nature, la composition et même la structure éventuellement
d’échantillons divers pour le respect des réglementations et dans l’industrie en
général.
2.Principe de base :
La spectrométrie de masse est basée sur la détermination des masses des molécules ou
atomes présents dans l’échantillon étudié. Pour arriver à ce résultat, on commence par
transformer une très petite quantité du composé à analyser en ions par un moyen
adapté (bombardement avec des électrons, des atomes, des photons...). Ces ions sont
alors soumis, sous un très bon vide, à l’action d’un champ électrique et /ou
magnétique selon les cas. Les forces qui s’exercent sur ces ions permettent de
déterminer leur rapport masse /charge, donc éventuellement leur nature.Les résultats
sont présentés au moyen d’un graphe appelé spectre de masse sur lequel figurent les
abondances des ions formés classés par ordre croissant de leur rapport masse/charge.
Le concept de la méthode apparaît dans la succession d’étapes auxquelles

l’échantillon est soumis :
➤Ionisation : l’échantillon porté sous forme de gaz ou de vapeur est ionisé dans la
source de l’appareil. De nombreux procédés sont utilisables pour cette première étape.
À ce stade, tout composé formé de molécules conduit à un mélange statistique d’ions
de fragmentation.
➤Accélération : aussitôt formés, les ions sont extraits de cette partie de l’appareil,
focalisés et accélérés par des lentilles électroniques, pour accroître leur énergie
cinétique.
➤Séparation : les ions sont alors « filtrés » suivant leur rapport masse/charge par
l’analyseur, certains appareils combinant plusieurs types d’analyseurs en série.
➤Détection : après séparation, les ions terminent leur course en venant frapper le
capteur d’un détecteur dont le signal est proportionnel aux charges des ions reçus.
➤Affichage du spectre de masse issu du traitement du signal envoyé par le détecteur.
La spectrométrie de masse est devenue progressivement un moyen d’investigation

irremplaçable des composés structurés que l’on rencontre aussi bien en chimie
organique qu’en biochimie (notamment en protéomique). Elle s’applique également à
l’analyse de la composition élémentaire des milieux inorganiques (technique ICP
22 Spectrométrie de masse |Mr.HALLA N.

ème
/SM). Elle permet aussi l’étude des échantillons comportant des mélanges
moléculaires, à condition de séparer les composés en amont du spectromètre de masse
avec un chromatographe par exemple. Les couplages en ligne CPG /SM ou CLHP
/SM font partie des meilleures méthodes d’analyse des mélanges (infimes quantités
d’échantillons complexes).
3. Principes et appareillagesde la spectrométrie de masse
3.1. Les sources
La source est l’élément du spectromètre de masse quipermet l’évaporation et

l’ionisation des analytes contenusdans l’échantillon. Plusieurs méthodes d’ionisation
sont disponibles et leur choix d’utilisation dépend despropriétés physicochimiques des
molécules à étudier etdes renseignements désirés.
3.1.1.Ionisation et fragmentation par impact électronique :l’ionisation par impact

électronique est la plus ancienne etla mieux connue des méthodes d’ionisation (figure
1). Lasource comprend un filament chauffé qui émet des électronsqui sont accélérés
vers une anode, appelée piègeou trappe. Le faisceau d’électrons entre alors en
collisionavec les molécules sous forme gazeuse présentes dansla source et leur
arrache un électron pour former l’ionmoléculaire M+., lui-même expulsé vers
l’analyseur grâce àune plaque portée à un potentiel positif et appelée repousseur.Cette
méthode d’ionisation-fragmentation est particulièrementadaptée aux composés de
masse moléculaire faible(inférieure à 1 000 Da), facilement volatilisables et stablesà
température élevée.
3.1.2. Ionisation chimique positive : la source d’ionisationchimique est souvent

identique à celle utilisée en impactélectronique (source combinée) mais le
mécanismed’ionisation est indirect. Un gaz réactant R (ammoniac,méthane,
isobutane) introduit dans la source à lapression de 1 mbar entre en collision avec un
faisceaud’électrons générés par un filament et accélérés grâceà une différence de
potentiels. Trois types de réactions peuvent intervenir : le transfertde proton (M +
RH+ ➞ MH+ + R), la formation d’adduits(M + R+ ➞ MR+), et l’abstraction
d’hydrure (MH + R+ ➞ M++ RH)(cas des hydrocarbures).Cette méthode
d’ionisationest particulièrement adaptée aux composés demasse moléculaire faible
(inférieure à 1 000 Da), facilementvolatilisables et stables à température élevée.
3.1.3.Ionisation par électro-nébulisation (ESI) : l’électronébulisation («

electrospray ») peut être utilisée en aval d’un chromatographe en phase liquide. Elle
consiste à pulvériser une solution, à ioniser les espèces qui y sont présentes et à en
assurer l’évaporation, ceci en appliquant à pression atmosphérique un champ
électrique sur un liquide traversant un capillaire (nébuliseur). On applique une
différence de potentiel de quelques milliers de volts entre le nébuliseur et une contre-
électrode (figure 2). Par exemple, les ions chargés positivement ou négativement
présents dans l’électrolyte vont migrer et se séparer à l’extrémité du capillaire, les
ions positifs se plaçant à la surface du liquide et les ions négatifs s’accumulant au
niveau du capillaire. Les répulsions entre les charges positives tendent à former le
cône de Taylor qui se transforme alors en fines gouttelettes au fur et à mesure que le
champ augmente. L’échantillon est ainsi pulvérisé sous forme de fines gouttelettes à

ème
la sortie du nébuliseur. Le solvant contenu dans les gouttelettes est ensuite

progressivement évaporé à l’aide d’un gaz neutre à contre-courant (azote).
Figure 1 : Source d’ions par impact électronique
Figure 2 :Source d’ions ESI (électronébuliseur)

ème
3.1.4.Ionisation chimique à pression atmosphérique : ouAPCI (pour « atmospheric

pressure chemical ionization »)(figure 3)elle peut être utilisée en aval d’un
chromatographeen phase liquide. Elle consiste, dans un premiertemps, à nébuliser à
l’aide d’un gaz (azote), une solutioncontenant les analytes d’intérêt. Cet aérosol est
évaporéaprès son introduction dans un manchon chauffé. Lemélange des gaz de
nébulisation et ceux issus de l’évaporationest entraîné vers une électrode à décharge
couronne(ou «corona»). Celle-ci, source constante d’électrons, créeun plasma en
ionisant le gaz ambiant pour former des ionsréactifs (dits « réactants »).
Figure 3 :Source d’ions APCI (ionisation chimique à pression atmosphérique).
3.1.5. La désorption et ionisation par impulsion laser et assistées par une matrice
(MALDI)
La MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) est fréquemment couplée à

un spectromètre de masse à temps de vol (TOF pour « time of flight »). Elle permet
d’ioniser des molécules de grande taille, peu volatiles et sensibles à la chaleur sans les
dégrader. La méthode MALDI-TOF s’applique aux biomolécules plus fragiles comme
les peptides, les protéines, les glycoprotéines et les oligonucléotides. L’échantillon est
mélangé à la matrice et placé sur une lame. Le dépôt (ou spot) formé est appelé cible.
Une source laser est dirigée sur la cible afin d’ioniser les molécules de l’échantillon.
Les ions sont ensuite détectés en mesurant le temps que mettent les différentes
particules à atteindre le détecteur. La vitesse de chaque particule dépend du rapport
masse/charge. Les molécules plus grandes mettront plus de temps à atteindre le
détecteur, tandis que les molécules plus petites arriveront plus vite. Une fois l’ion
arrivé au détecteur, le signal est amplifié et envoyé à un ordinateur qui traite les
données et donne les résultats sous forme de spectre (figure 4).

ème
Figure 4 : Principe d'ionisation par la technique MALDI
3.2. Les analyseurs de masse :
L’analyseur de masse correspond à la partie du spectromètrede masse qui sépare les

ions formés dans la sourceen fonction de leur rapport m/z. Plusieurs types
d’analyseurssont disponibles. Leur mode de fonctionnement repose surl’utilisation de
champs électriques et/ou magnétiques.
3.2.1. Analyseurs utilisantun champ électrique oscillant :
Le fonctionnement de ce type d’analyseurs (filtre quadripolaire,piège à ions) est fondé

sur le mouvement d’ionsdans un champ électrique oscillant. En effet, si l’on
considèrele trajet d’un ion dans une dimension ; placé entredeux électrodes, celui-ci
se déplace et est accéléré versl’électrode de signe opposé. Si la polarité de l’électrode
est inversée, l’ion se trouvera être accéléré dans l’autredirection. Lorsque l’amplitude
et la fréquence auxquellesle champ électrique est modifié sont suffisantes, l’ion
resteconfiné entre les deux électrodes.
• Analyseur-filtre quadripolaire : il est constitué successivementd’une série de

lentilles électroniques permettantla convergence et l’accélération des ions sortant de
lasource, puis d’un quadripôle formé le plus communémentde quatre barres entre
lesquelles sont établies desdifférences de potentiels, l’ensemble débouchant sur
undétecteur (figure 4).
• Analyseur-piège à ions : le piège à ions (ou trapped’ions) est constitué de trois

électrodes, une électrodeannulaire et deux électrodes « chapeau », ces dernièresétant
quasiment identiques et de géométrie hyperbolique.L’électrode « chapeau »
supérieure possède enson centre une ouverture qui permet l’introduction desions issus
de la source. L’électrode « chapeau » inférieurepossède une série de trous permettant
l’éjection desions vers le détecteur. Les spectromètres de masse de type piègeà ions
sont dédiés aux études structurales.

ème
3.2.2. Analyseurs utilisant un champ électriqueconstant – Analyseurs à temps de

vol(« time of flight » TOF) :
Le principe de fonctionnement de ce spectromètre demasse est simple. Généralement

un TOF est associéà une source MALDI. Les ions y sont formés dansune région
relativement limitée en présence d’unchamp électrique qui accélère ces ions sur la
longueur de la source avant leur entrée dans l’analyseur proprementdit. Ce dernier est
constitué d’un tube devol, région sans champ et de longueur beaucoupplus élevée que
de la source. Les ions sont détectés à l’autreextrémité du tube.
3.2.3. Analyseurs utilisant un champ magnétique :
La propriété des champs magnétiques à dévier la trajectoiredes ions a été mise à profit
dès le début du vingtième siècle pour déterminer la masse des ions.Les champs
électriques accélèrent les ions et homogénéisentleur énergie cinétique, le champ
magnétiqueles dévie sur des trajectoires circulaires dont le rayondépend de leur
rapport m/z.

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République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université « Dr. Moulay Tahar » de Saida

Faculté des sciences

Techniques d’analyse biologiques

3ème année Biochimie

Préparé par : Mr. Halla Noureddine

Généralités sur les méthodes spectrales

La spectrophotométrie est l’étude des interactions entre la matière et les radiations

Plusieurs théories ont été développées pour expliquer ce qu’est la lumière :

• La théorie électromagnétique (Maxwell): elle attribue à la lumière les

2. Ensemble des radiations électromagnétiques :

3. Interaction des radiations électromagnétiques avec la matière :

Toutes les interactions se font par échange d’énergie entre le rayonnement et la

- Energie propre des noyaux (quantifiée).

Le rayonnement incident peut interagir de plusieurs manières avec la matière :

2 Généralités sur les méthodes spectrales | Mr.HALLA N.

1. Réflexion : phénomène de retour d’une onde lorsqu’elle rencontre une

4. Analyse des spectres :

2 Généralités sur les méthodes spectrales | Mr.HALLA N.

Spectroscopie d’absorption dans l’UV-visible

où I0 est l’intensité incidente et I, l’intensité transmise. L’absorbance est définie par :

Les transitions électroniques rencontrées en chimie organique sont :

Transitions σ- σ* : sont situées dans le lointain UV vers 130 nm.

Transitions n - π* : exemple : carbonyle; elle se situe entre 270 et 290 nm.

Instrumentation dans l’UV/visible : Les spectromètres UV-visible comportent une source

4 Spectroscopie d’absorption dans l’UV-visible | Mr. HALLA N.

• Solides chauffés, Tungstène (visible-infrarouge) ou lampe à arc xénon (visible)

4.3- Les monochromateurs : Le monochromateur est utilisé pour extraire du rayonnement

X.1 - Analyse qualitative : Les spectres UV fournissent généralement peu de renseignements

- un ou plusieurs noyaux aromatiques ;

- des groupements C=O (aldéhydes ; cétones) ;

- des groupements N=O ;

- des groupements N=N.

Loi d’absorption de la lumière - loi de Beer-Lambert : Soit une lumière monochromatique

• I0 est l'intensité de la lumière incidente

Cette équation peut se réécrire log(Io/I) = klC/2.3 = ε l C.

* log(I0/I) est appelé absorbance (A)

* I/I0 = T est la Transmittance

ε est le coefficient d'extinction molaire ; c’est une caractéristique de la substance étudiée à

On obtient alors la relation connue sous le nom de loi de Beer-Lambert :

La bande d'absorption, observée dans le domaine de l’UV-visible, est caractérisée par sa

La loi de Beer-Lambert est vérifiée dans les conditions suivantes :

• la lumière utilisée doit être monochromatique ;

X.3 - Autres applications

6 Spectroscopie d’absorption dans l’UV-visible | Mr. HALLA N.

Spectroscopie d’absorption dans l’Infra Rouge

Figure 01 : Exemple de vibrations atomiques : la chaîne hydrocarbonée

8 Spectroscopie d’absorption dans l’IR | Mr. HALLA N.

Il existe deux sortes de spectromètre IR: le spectromètre à balayage et lespectromètre à

1. Un spectromètre IR à balayage s'agit du modèle le plus classique,semblable aux

2. Un spectromètre IR à transformée de Fourier (IRTF) est identique àun spectromètre à

9 Spectroscopie d’absorption dans l’IR | Mr. HALLA N.

Figure 02 : L’interféromètre de Michelson et chemin optique dans le spectromètreFT-IR

5. Application de l’IR à la détermination des fonctions organiques.

10 Spectroscopie d’absorption dans l’IR | Mr. HALLA N.

Spectrométrie d'absorption atomique

La spectrométrie d’absorption atomique (SAA) étudie les émissions ou absorptions de lumière

Le dispositif expérimental utilisé en absorption atomique se compose d'une source, d’un

12 Spectroscopie d’absorption atomique | Mr. HALLA N.

Schéma représente dispositif expérimental utilisé en absorption atomique

3.1. Source de lumière :

3.1.3.Super-lampes et ultra-lampes : Un des inconvénients des lampes à cathode creuse est