CONTRÔLES MICROBIOLOGIQUES

DES PRODUITS PHARMACEUTIQUES

ET COSMÉTIQUES
COSMÉTIQUES
 Législation
Règlement (CE) n°1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013)
 d’utilisation normales ou raisonnablement prévisibles
Les produits cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions

• Elaboration d’un dossier d’information

– Rapport sur la sécurité du produit cosmétique, personne responsable = pharmacien/médecin

• Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008)

• Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-

organismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie
cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus
peu résistants.
• De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en
eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des
conservateurs afin de limiter cette prolifération.
• Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les
produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir
leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
 Législation
Règlement (CE) n°1223/2009, (entré en application dans sa totalité le 11 Juillet 2013)

• Elaboration d’un dossier d’information
– Rapport sur la sécurité du produit cosmétique

• Obligation de respecter les BPF : norme NF EN ISO 22 716 (publiée en janvier 2008)

• Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant des micro-

organismes pathogènes peut avoir des conséquences graves sur l’écologie
cutanée de l’utilisateur, surtout sur une peau lésée ou chez des individus
peu résistants.
• De nombreux produits cosmétiques ont une composition et une teneur en
eau permettant la multiplication microbienne. Ils contiennent des
conservateurs afin de limiter cette prolifération.
• Différents contrôles et recherches microbiologiques sont réalisés sur les
produits cosmétiques afin d’évaluer leur niveau d’hygiène et de prévoir
leur comportement vis-à-vis d’éventuelles contaminations.
 Exemples de produits à faible risque

Risque microbiologique
2) Risque microbiologique
• La norme ISO 29621:2010. Appréciation du risque microbiologique
Les produits finis évalués à faible risque par cette norme ne nécessiteront pas la mise
en œuvre des normes microbiologiques relatives aux cosmétiques
Facteur physicochimique Limite Exemple

pH ≤ 3,0 Soins peeling (acide glycolique)

pH
Éthanol ou autre alcool
Température de remplissage
Activité de l'eau, aw
Produits à base de solvants
≥ 10,0 Produits défrisants
≥ 20 % Laques, toniques, parfums
≥ 65,0 °C Pommades pour les lèvres, rouges
à lèvres, fards à joues
≤ 0,75a Pommades pour les lèvres, rouges
à lèvres, fards à joues
Vernis à ongles

Oxydants Colorants capillaires

Chlorhydrate d'aluminium ≥ 25 % Anti-transpirants
 Risque microbioogique
• L'analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels
que :
– l'altération potentielle des produits cosmétiques;
– le caractère pathogène des micro-organismes;
– le site d'application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses, etc.);
– la catégorie d'utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans, etc.).
• recherche d'agents pathogènes pour la peau
– Staphylococcus aureus,
– Pseudomonas aeruginosa
– Candida albicans
• recherche des indicateurs de contamination fécale pour détecter une
défaillance de l'hygiène au cours du processus de fabrication.
– Escherichia coli
 Analyses microbiologiques
Laboratoire de microbiologie
Principe actifs
Recherche conservateurs
Effet inhibiteur des conservateurs
R
& Sensibilité microbiologique (ISO 9621:2010)
D Challenge test (ISO 11930)
Fabrication en Validation du neutralisant pour le
Formulation pilote dénombrement

Contrôle d’atmosphère
Echelle
Fabrication industrielle
Contrôle des surfaces
Contrôle de l’hygiène du personnel
Contrôle microbiologique du produit vrac

Contrôle du produit fini

conditionnement - dénombrement et détection de la FMA
- dénombrement des levures /moisissures
- détection des pathogènes
 Contrôle des produits finis
Référentiels pour le contrôle
• Pharmacopée EU 8.0 (janvier 2014): (harmonisée)
Cosmétique = médicament à usage cutané
– paragraphe 2 .6.12 : Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement microbien
– paragraphe 2.6.13 : Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de microorganismes spécifies

• Normes ISO
– NF EN ISO 21 148 : généralités(2009)
– NF EN ISO 21 149 : dénombrement et détection de la flore mésophile aérobie (2009)
– NF EN ISO 16 212: dénombrement des levures moisissures (2011)
– NF EN ISO 22 718: détection Staphylococcus aureus (2009)
– NF EN ISO 21 717 : détection Pseudomonas aeruginosa (2009)
– NF EN ISO 21 148 : détection Escherichia coli (2009
– NF EN ISO18 416 : détection Candida albicans (2009)
– NF EN ISO18 415 : détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés (2011)
 Contrôle des produits finis
Préparation de la suspension mère :
• le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum
entre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min
• La suspension mère est préparée à partir d’un échantillon d’au moins 1 g ou 1 ml
du produit d’essai mélangé avec soin.

Produit miscible à l’eau Produit non miscible à l’eau

V mL de diluant neutralisant + polysorbate 80

V mL de diluant-neutralisant

Dilution d= 1/10
Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit
S (g ou mL) de produit

S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 Contrôle des produits finis
Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit
Conservateur
Produits phénoliques:
parabens, phénoxyéthanol,
phényléthanol, etc.
Anilides
Ammoniums quaternaires
Tensioactifs cationiques
Aldéhydes
Agents générateurs de formaldéhyde
Oxydants
Isothiazolinones, imidazoles
Biguanides
Sels métalliques (Cu, Zn, Hg)
Organo-mercuriels
Composés chimiques pouvant neutraliser
l'activité antimicrobienne des conservateurs
Lécithine
Polysorbate 80
Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras
Tensioactifs non ioniques
Lécithine, saponine, polysorbate 80, dodécylsulfate de
sodium
Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras
Glycine, histidine
Thiosulfate de sodium
Lécithine, saponine
Amines, sulfates, mercaptans, bisulfite de sodium,
thioglycolate de sodium
Lécithine, saponine, polysorbate 80
Bisulfite de sodium, L-cystéine
Composés sulfurés, acide thioglycollique
Exemples de neutralisants adéquats et de liquides de rinçage [6] [7] (pour les
méthodes de filtration sur membrane)
Polysorbate 80, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras, 7 g/l + lécithine, 20 g/l + polysorbate 80,
4 g/l.
Bouillon neutralisant D/Ea.
Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Polysorbate 80, 30 g/l + dodécylsulfate de sodium, 4 g/l + lécithine, 3 g/l.
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Bouillon neutralisant D/Ea.
Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Lécithine, 3 g/l + polysorbate 80, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l.
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l + L-cystéine, 1 g/l.
Bouillon neutralisant D/Ea.
Liquide de rinçage: polysorbate 80, 3 g/l + L-histidine, 0,5 g/l.
Thiosulfate de sodium, 5 g/l.
Liquide de rinçage: thiosulfate de sodium, 3 g/l.
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Thioglycolate de sodium, 0,5 g/l ou 5 g/l.
L-cystéine, 0,8 g/l ou 1,5 g/l.
Bouillon neutralisant D/Ea.
Liquide de rinçage: thioglycolate de sodium, 0,5 g/l.
 Contrôle des produits finis
Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit
• la neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit
doit être vérifiée et validée
• La validation est réalisée en contaminant le produit avec des
souches de référence et en effectuant le dénombrement
contre un témoin sans produit.
– Staphylococcus aureus ATCC 6538
– Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ou E.coli ATCC 8739
– Candida albicans ATCC 10231

• L’écart entre le témoin et l’essai ne doit pas excéder 50% (0,3

log)
 Bouillon pour enrichissement : Bouillon Eugon LT 100

Contrôle des produits finis

Dénombrement et détection
• En plus du dénombrement , un détection est également
réalisée dans un bouillon « d’enrichissement » incubé
pendant 20H.
• Bouillon Eugon LT 100
Peptone pancréatique de caséine 15 g
Peptonepapaïque de soja 5,0 g
L-cystéine 0,7 g
Chlorure de sodium 4,0 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’oeuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
 DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILES
Norme ISO 21 149
Dénombrement Validation du Dénombrement
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus 1 mL
V mL de diluant neutralisant
à 103 UFC/mL(masse) V mL de diluant neutralisant
à 104 UFC/mL ( surface)
Dilution d= 1/10 à 102 UFC/mL (filtration) Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit
S (g ou mL) de produit Témoin sans produit

1 mL en masse
1 mL en masse
0,1 ml en surface
0,1 ml en surface
10 mL filtration
10 mL filtration Si inefficacité du neutralisant

Géloses TSA

Réfrigérateur N T
(détection des particules)

72 H ± 6H
72 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C
32,5 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILES
Norme ISO 21 149
Détection Validation de la Détection
Pseudomonas aeruginosa
1 mL
V mL de bouillon Eugon + Staphylococcus aureus
V mL de bouillon Eugon
à 102UFC/mL
Dilution d= 1/10 Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit Témoin sans produit
S (g ou mL) de produit
1 ml en masse

20 H minimum
20 H minimum
32,5 °C ± 2,5°C
32,5 °C ± 2,5°C

0,1 ml en surface
0,1 ml en surface

Gélose TSA
20 à 24 H
32,5 °C ± 2,5°C
Validation si 100 à 500 UFC/mL

48H ± 6H
48 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C
32,5 °C ± 2,5°C
Validation si présence de colonies caractéristiques
S = 1g produit de catégorie2 Jaunes pour St.aureus
S= 5g produit de catégorie 1 Verdâtres pour Ps aeruginosa
Et absence de colonie sur le témoin
 DÉNOMBREMENT des levures et moisissures
Norme ISO 16 212
Dénombrement Validation du Dénombrement

Candida albicans 1 mL
V mL de diluant neutralisant
à 103 UFC/mL(masse) V mL de diluant neutralisant
à 104 UFC/mL ( surface)
Dilution d= 1/10 à 102 UFC/mL (filtration) Dilution d= 1/10
S (g ou mL) de produit
S (g ou mL) de produit Témoin sans produit

1 mL en masse
1 mL en masse
0,1 ml en surface
0,1 ml en surface
10 mL filtration
10 mL filtration

Géloses SDA
Sabouraud dextrose agar

Réfrigérateur N T
(détection des particules)

3 à 5 jours
3 à 5 jours
25 °C ± 2,5°C
25 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES

Validation de la Détection
Détection Pseudomonas aeruginosa
1 mL
Staphylococcus aureus
V mL de bouillon Eugon
E.coli V mL de bouillon Eugon

Candida albicans Dilution d= 1/10

Dilution d= 1/10
à 10 UFC/mL
2

S (g ou mL) de produit Témoin sans produit

1 ml en masse S (g ou mL) de produit

20 H minimum 20 H minimum
32,5 °C ± 2,5°C 32,5 °C ± 2,5°C
0,1 ml en surface

Gélose Cétrimide (ISO 21 150) 0,1 ml en surface

Gélose Baird parker (ISO 21 718) 20 à 24 H

Gélose Mac Conkey (ISO 21 148) 32,5 °C ± 2,5°C
Gélose SDA (ISO 18 416) Validation si 100 à 500 UFC/mL

48H ± 6H 48 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C 32,5 °C ± 2,5°C
Validation si présence de colonie caractéristiques
Et absence de colonie sur le témoin
S = 1g produit de catégorie2
Identification S= 5g produit de catégorie 1
 DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES
Souche et Ps. aeruginosa St aureus E.Coli C.Albicans
norme (ISO 21 150) (ISO 21 718) (ISO 21 148) (ISO 18 416)
Milieu Cétrimide Baird parker Mac Conkey SDA

Colonies Pigment jaune-vert Colonies noires et Colonie rouge Colonies convexes et

caractéristiques (pyocyanine), brillantes, entourées brique; peut être crémeuses, de
fluorescent sous d'un halo clair (de 2 entourée d'une zone couleur blanche à
rayonnement UV mm à 5 mm) de bile précipitée. beige
Méthode Gram Gram Gram Gram
d’identification* Test enzymatique Test enzymatique Test enzymatique Test de filamentation
Isolement sur Test coagulase Isolement sur EMB Test de
« Pseudomonas P » (24 à 48 H à 32,5°C) chlamydosporulation
(24 à 48 H à 32,5°C)
Résultat Bacille Gram – Coque Gram+ Bacille Gram – Cellules ovoïdes
Oxydase + Catalase + Oxydase – violettes
Colonies entourées Coagulase + Colonies bleu noir Filaments
d’une zone bleu- à reflet métallique Chlamydospore
verte (pyocyanine) sur EMB Blastospore
ou rouge marron
(pyorubine)

* Minimale : galerie biochimique ou autre méthode validée possible

 Détection de micro-organismes spécifiés et non spécifiés
Enrichissement (Eugon)

Isolement (TSA)

Gram

Coque Bacille G- autre Levure

gram +

Non oxydase +
Catalase + oxydase -

Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification

adapté adapté adapté adapté

Escherichia Non Non

Staphylococcus Non Non Pseudomonas Candida
aureus ? aeruginosa ? coli? albicans?

Présence de Présence de
Présence de Présence de
Escherichia Candida
Staphylococcus Pseudomonas
coli albicans
aureus aeruginosa

Présence d’un micro-organisme non spécifié

 Contrôle du produit fini
Critères microbiologiques
• Règlement (CE) n°1223/2009,
Spécifications microbiologiques de la substance ou du mélange et du produit cosmétique.
Une attention particulière est accordée aux produits cosmétiques utilisés sur le contour des yeux, sur les
muqueuses en général, sur une peau lésée, chez les enfants de moins de trois ans, chez les personnes âgées et chez
les personnes au système immunitaire fragilisé.

• BPF (ISO 22 716)

Il convient que les critères d'acceptation soient établis pour spécifier les exigences auxquelles
doivent répondre les matières premières, les articles de conditionnement, les produits vrac et les
produits finis.

• Lignes directrices du Comité Scientifique des Produits de Consommation

Catégorie de produit FMAT Germes pathogènes

catégorie 1* ≤102UFC/ g (ou mL) Absence dans 0,5 g ou mL
catégorie 2 : ≤103UFC/ g (ou mL) Absence dans 0,1g ou mL
* destinés aux enfants < 3 ans ou en contact avec les yeux et les muqueuses recommandation du SCCP

PR NF EN ISO 17516 (août 2013) Cosmétiques – Microbiologie – Limites microbiologiques

 A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des
CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8.0 2014)
substances pour usage pharmaceutique non stériles (5.8.)

Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi :

– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20
– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc….

DGAT DMLT Micro-organismes spécifiés

Voie d’administration UFC/g ou /mL UFC/g ou /mL Absence dans ( )

Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)

Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1g ou 1 mL)

Rectale 103 102

Buccale, Gingivale 102 101 Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Cutanée, Nasale, Auriculaire Pseudomonas aeruginosa(1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Vaginale 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Candida albicans (1g ou 1 mL)

Transdermique 102 101 Staphylococcus aureus(1 dispositif)

Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Inhalation 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Préparation à base de MP naturelle ne pouvant 10 4
10 2 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
subir de prétraitement antimicrobien Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL

Aliments médicamenteux vétérinaire ne Escherichia coli (1g ou 1 mL)

pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104 Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
 Contrôle du produit fini
Interprétation des résultats
BPF (ISO 22 716)

Dossier de lot ANALYSES

Produit finis, vrac, MP, article de

Résultats conformes conditionnement
hors spécification

Enquête
Retraitement

Libération de lot Destruction du lot

Challenge test
Risque microbiologique
Règlement (CE) n°1223/2009
• Concernant la sensibilité microbiologique, on distingue trois catégories de
produits:
– 1) les produits à faible risque microbiologique (par exemple, les produits dont la teneur
en alcool est > 20 %, les produits à base de solvants organiques, les produits à pH
élevé/faible), pour lesquels il n’est pas nécessaire de soumettre le produit fini à un
challenge test pour la conservation, ni à des contrôles microbiologiques. Une
justification scientifique est toutefois requise;
– 2) les produits à usage unique et les produits qui ne peuvent être ouverts (par exemple,
dont le conditionnement permet de doser le produit sans que celui-ci n’entre en contact
avec l’air), pour lesquels seuls des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont
nécessaires. Une justification scientifique est toutefois requise;
– 3) tous les autres produits, pour lesquels un challenge test pour la conservation et des
contrôles microbiologiques sur le produit fini sont nécessaires.
C) Challenge test
ou test d’efficacité de la conservation antimicrobienne

• Etabli par la pharmacopée européenne ou pharmacopée US pour les médicaments

et les produits cosmétiques
• NORME ISO 11930 : 2012

• Ce test consiste en la contamination artificielle du produit cosmétique avec

différents micro-organismes en nombre connu et au suivi de l’évolution de ce
nombre en fonction du temps.
• Les souches utilisées sont celles habituellement trouvées dans les produits
cosmétiques et au niveau de l’épiderme :
Aspergillus brasiliensis ATCC 16 404
– Candida albicans
– Aspergillus niger
– Escherichia coli 7, 14 et 28 jours
– Staphylococcus aureus
– Pseudomonas aeruginosa
• La population microbienne pour chaque souche est évaluée après 2, 7, 14, 21 et
28 jours.
 Challenge test
Pseudomonas aeruginosa 0,2 mL de N
Staphylococcus aureus
N0 =N/100
E.coli
Candida albicans T0 20 g de produit
10 3
10 UFC/mL
2
Aspergillus brasiliensis
7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
1 ml en masse
N
10 à 10 bactéries/mL
7 8

106 à 107 mycètes/mL

Calcul de N
T7
1 ml
Validation du en masse 48 à
neutralisant Gélose TSA ou SDA 72 H à
Nx
32,5 °C
± 2,5°C
10ml de diluant neutralisant 10ml de diluant

T14
1 g de produit
Essai Témoin Témoin inoculum 1 ml
1 ml en masse en masse 48 à
Nx 72 H à
32,5 °C
± 2,5°C

T28
48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C 1 ml
en masse 48 à
Nvf Nvn Nv
Nx 72 H à
Validation si Nv  100 , Nvn proche de Nv et Nvf  0,5 Nvn 32,5 °C
± 2,5°C
 Taux de réduction logarithmique (Rx = lg N0– lg Nx) requis
Micro-organismes Bactéries C. albicans A. brasiliensis

Temps de
T7 T14 T28 T7 T14 T28 T14 T28
prélèvement

Critères A ≥3 ≥3 et PA ≥3 et PA ≥1 ≥1 et PA ≥1 et PA ≥0 ≥1 et PA

Non Non
Critères B ≥3 ≥3 et PA ≥1 ≥1 et PA ≥0 ≥0 et PA
réalisé réalisé

•critères A:
la formulation est protégée contre la prolifération microbienne pouvant présenter un risque potentiel pour l’utilisateur et aucun autre
facteur n’est pris en compte.
•critères B:
le niveau de protection est acceptable si l’analyse du risque démontre l’existence de facteurs de maîtrise non liés à la formulation indiquant que le
risque microbiologique est acceptable pour le produit cosmétique.

Exemple1 crème de soin + Staphylococcus aureus Exemple2 shampoing+ Candida albicans

Jour résultat Réduction Red log attendue interprétation
logarithmique

J0 2,3.10
1,6.1055
J14
J2 5.10
<1 4 <1
5 2 
J28
J7 3.10
<1 2 3
5 NI
3 
Conclusion
J28 <Conservateur
1 non efficace
5 sur les mycètesNI 
Conclusion Conservateur efficace sur Staphylococcus aureus
 Liens internet
Règlement 1223 : 2009
http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2009:342:0059:0209:fr:PDF

DÉCISION D’EXÉCUTION DE LA COMMISSION du 25 novembre 2013 concernant les lignes directrices pour
l’application de l’annexe I du règlement (CE) n°1223/2009 du Parlement européen et du Conseil relatif aux
produits cosmétiques
• http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2013:315:0082:0105:FR:PDF
Critères de qualité microbiologique d’un produit cosmétique
http://mon.univ-montp2.fr/claroline/backends/download.php?url=L0NyaXTocmVzX21pY3JvYmlvb
G9naXF1ZXMucGRm&cidReset=true&cidReq=XLCH404
Stabilité microbiologique Le contexte réglementaire et sociétal
• http://www.cosmetic-valley.com/images/1-Contexte%20r%C3%A9glementaire%20et%20soci
%C3%A9tal%20-%20S%20Guyomard_1.pdf
Intertek
http://www.intertek-france.com/cosmetique/analyses/microbiologie/
Normes ISO
PHARMACEUTIQUE
• Les produits pharmaceutiques sont analysés selon les
directives
– de la pharmacopée française et européenne pour les produits
destinés à l’exploitation dans la CE
– des pays de vente comme les USA (USP) ou le Japon (JP) qui disposent
de leur propre pharmacopée.
• Les pharmacopées distinguent deux types de produits :
– Les produits qui doivent être stériles :
- Les préparations pour usage parentéral (introduction d’une substance dans
l’organisme par une autre voie que la voie digestive, exemple : Injection sous-
cutanée, intraveineuse ou intra musculaire).
- Les préparations ophtalmiques.
- Les pansements chirurgicaux et le matériel chirurgical.
- Les autres préparations devant être stérile…
– Les produits non obligatoirement stériles :
- Les matières premières
- Les médicaments à usage non parentéral
 A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
1 MICROORGANISMES RECHERCHÉS.

• La présence de micro-organismes peut

 Réduire l’efficacité des principes actifs
 Induire des problèmes de santé
• produits à faible risque de contamination :
– Dénombrement de germe indicateur de la qualité globale :
– les germes totaux (DGAT : dénombrement des germes aérobies totaux)
– les levures et moisissures (DMLT : dénombrement des moisissures et levures totales)
– Recherche des microorganismes spécifiques,pour quelques produits particuliers :
E.coli , Salmonella , Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus.

• Leur recherche va dépendre :

– la voie et le mode d’administration
– La nature du produit et son aptitude à favoriser la croissance microbienne
– Catégorie de patients visée (YOPI)
– Etat du patient : Existence de blessures, lésions organiques, utilisation d’immunosuppresseurs.
– Des traitements ultérieurs de fabrication pour les matières premières
 CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.

2 TECHNIQUES
• Préparation de l’échantillon avec
– un diluant avec neutralisant tamponné pour arrêter l’action des
antimicrobiens présents (PA ou conservateur)
– un tensio-actif pour mélanger les produits de nature lipidique
• Méthode de dénombrement
• Filtration
• Dénombrement en milieu solide (produit non filtrable)
• Les milieux de culture recommandés par la
pharmacopée sont :
– Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja pour la
FMAT
– Milieu Sabouraud glucosé gélosé + ATB pour les levures
moisissures

2.6.12. Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement microbien ....................
2.6.13. Contrôle microbiologique des produits non stériles :recherche de microorganismes spécifies..............
 CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
ANCIENS CRITÈRES.
La limite prescrite dans la contamination microbienne dans des produits non
obligatoirement stériles est
102 micro-organismes par ml ou par gramme.
Limite maximale d'acceptation 5.102 micro-organismes par mL ou par gramme.
• Si absence totale de développement, rendre < à 1 micro-organisme par ml ou par
gramme.
• Si développement, choisir le résultat le plus défavorable.
– Si le résultat est > 102 micro-organismes par ml ou par gramme, réaliser une coloration
de Gram.
• si bacilles Gram +, faire une recherche de spores et pas d'identification.
• si bacilles Gram-, faire une identification.
• si coques Gram +, faire une identification.
La conformité ou la non conformité du produit dépend du micro-organisme identifié et du traitement appliqué
au produit.
– Si le résultat est > 5.102 micro-organismes par ml ou par gramme, effectuer un deuxième
essai sur le même échantillon et éventuellement un troisième essai sur un échantillon
différent du même lot.
• Si le deuxième essai est bon, rendre comme résultat: produit conforme; de même pour le troisième essai.
• Si un des deux essais terminaux est non conforme, le produit est rejeté.
 A)CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE.
5.1.4. Qualité microbiologique des préparations pharmaceutiques et des
3 CRITÈRES D’ACCEPTATION. (PH Eu 8.0 2014)
substances pour usage pharmaceutique non stériles (5.8.)

Les critères d’acceptation de la qualité microbiologique sont interprétés ainsi :

– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20
– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 etc….

DGAT DMLT Micro-organismes spécifiés

Voie d’administration UFC/g ou /mL UFC/g ou /mL Absence dans ( )

Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL)

Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1g ou 1 mL)

Rectale 103 102

Buccale, Gingivale 102 101 Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Cutanée, Nasale, Auriculaire Pseudomonas aeruginosa(1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Vaginale 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Candida albicans (1g ou 1 mL)

Transdermique 102 101 Staphylococcus aureus(1 dispositif)

Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Inhalation 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1g ou 1 mL)

Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)

Préparation à base de MP naturelle ne pouvant 10 4
10 2 Escherichia coli (1g ou 1 mL)
subir de prétraitement antimicrobien Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL

Aliments médicamenteux vétérinaire ne Escherichia coli (1g ou 1 mL)

pouvant subir de prétraitement antimicrobien 105 104 Salmonella (10 g ou 10 mL)
Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires /g ou mL
 B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
Médicament à analyser Incubation
1 RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES 30° C en
– Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais deAérobiose
Bouillon TSA
vérifier
– l’absence de tout microorganisme (FMAT, Bouillon
levures Schaedler
moisissures,Anaérobiose
bactéries anaérobies en bouillon thyoglycolate)
Germes retenus sur les filtres
– L’absence de particules
– mais aussi d’endotoxine.
– Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de
grand volume d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de
filtration.
 B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
1 RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES
– Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais de
vérifier l’absence de tout microorganisme (FMAT, levures moisissures,
bactéries anaérobies en bouillon thyoglycolate) mais aussi
d’endotoxine.
– Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de
grand volume d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de
filtration.
– Afin de limiter encore le risque de contamination par
l’environnement, l’appareil de filtration est manipulé sous des
isolateurs : PSM de type III ou équipés d’un hémi scaphandre.
 B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
2) RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE.
Les normes de la pharmacopée imposent l'absence de substances
pyrogènes (susceptible de provoquer une augmentation de la température)
dans les produits pharmaceutiques qui entrent en contact avec la
circulation sanguine ou le système nerveux central.
Les pyrogènes sont soit
- des micro-organismes responsables d’infections
- des substances sécrétées par des micro-organismes persistant
après la destruction de celui-ci ex : endotoxine
 B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
2 RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE .
• L'essai permettant la détection des endotoxines
bactériennes est un essai in vitro réalisé à l'aide
d'un réactif, le lysat d'amoebocytes de Limule
(LAL), obtenu à partir des cellules circulantes de
cet animal : le limule.

http://www.eprofeel.tv/v
/102,charles-river-le-dos
age-des-endotoxines.htm
l
 B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
2- RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE.
• Lors de la mise en présence du LAL et
d’endotoxines, la formation de coaguline
s’accompagne de l’apparition
– d’un trouble (base de la méthode turbidimétrique)
• Leur agrégation conduit à la formation
– d’un gel (technique par gélification)
• La protéine coagulogène peut être éliminée du
réactif LAL et remplacée
– par un substrat chromogène spécifique
de la coagulase (méthodes chromogéniques)
– Par un substrat fluorogene spécifique
de la coagulase (méthode par fluorimétrie)
 B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
2- RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE.
Un petit volume de l'échantillon (10 pi) est combiné avec le Limulus Amebocyte
Lysate, et les endotoxines de l'échantillon déclenchent l'activité protéolytique du
facteur C.
Lorsque le substrat chromogène est ajoutée, il est catalysé par la protéase activée.
le clivage produit de la p-nitroalinine (pNA), de couleur jaune qui peut être
quantifiée en mesurant l'absorbance à 405 nm (A405) et par l'extrapolation à
l'encontre d'une courbe d’étalonnage.
 B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES
2 DOSAGE DES PYROGÈNES « TOTAUX ».
C) CONTRÔLES QUALITÉ.
• Afin de valider les contrôles sur les lots de fabrication, il est nécessaire de
vérifier la conformité :
- des milieux
- des diluants
- des produits à examiner.
• Les tests réalisés sont :
- des tests de stérilité des milieux et diluants:
ils permettent de contrôler leur non contamination lors de leur préparation et de leur
conservation en les plaçant (milieu prêt à l’emploi donc conditionné en boite et non ensemencé) à
l’étuve pendant le temps et à la température d’incubation utilisés habituellement.(voir TP)
- des tests de fertilité des milieux :
- ils permettent de déterminer si le milieu a conservé les qualités nutritionnelles attendues au
cours de sa préparation ou de sa conservation.
- On ensemence le milieu avec une suspension bactérienne de référence (ATCC) de concentration
connue de façon à retrouver environ 100 colonies sur le milieu.(voir TP)
- L’absence de culture ou un résultat < 30 colonies traduit un problème de fertilité.
- des tests permettant de vérifier l’absence d’antimicrobien dans le produit
examiné.
- Il consiste à mettre en contact le produit avec les souches de référence et de comparer les
résultats obtenus avec un témoin réalisé sans produit.(voir TP)
• Nouveau règlement européen no 1907/2006 sur
l’enregistrement, l’évaluation, l’autorisation et la restriction
des produits chimiques
• Entré en vigueur au 1er juin 2007
• Tout producteur d’une substance chimique doit fournir un
dossier contenant les informations physicochimiques,
toxicologiques et écotoxicologiques la concernant
 Liens internet
• Pyrogènes
• http://
www.merckmillipore.fr/chemicals/pyrodetect-system/c_loysHfET05QAAAE
yqpQqgLUh