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Les diffrents acides amins : (Mm moyenne = 110Da) Les acides amins hydrophobes : Glycine : Gly, G Alanine : Ala, A
O H2C NH2 O
O H3C NH2 O
Valine: Val, V
CH3 H3C NH2 O O
Leucine : Leu, L
O H3C CH3 NH2 O
Isoleucine : Ile, I
CH3 H3C NH2 O O
Thronine : Thr, T
OH H3C NH2 O O
Aspartate : Asp, D
O O O NH2 O
Glutamine : Gln, Q
O H2N O
Asparagine : Asn, N
O O O O NH2 NH2
NH2
Lysine : Lys, K
H2N O O
Histidine : His, H
O NH+ N H NH2 O
Tyrosine : Tyr, Y
O O N H NH2
Mthionine : Met, M
H3C S O O NH2
Cystine : Cys, C
O HS NH2 O
Dopamine
H2N
HO NH2
Ornithine
O O NH2
H2N
O N H
Citrulline
O O NN2
La strochimie : Chaque acide amin possde au moins un carbone asymtrique (sauf la thronine et lisoleucine qui en ont deux et la glycine qui nen possde pas). Chaque acide amin est class dans le systme R/S : tous les acides amins sont de la srie S, sauf la cystine qui est de la srie R. Cas particulier : 2S 3R T et 2S 3S I
coo-
H3N
C R
Isomre D :
C R
NH3
Chaque acide amin dvie le plan de polarisation : de faon lvogyre ( gauche) et de faon dextrogyre ( droite).
Les proprits ioniques : Chaque acide amin libre possde au moins deux groupements fonctionnels et peut possder dautres fonctions sur les chanes latrales (R).
R H3N+ CH COOH
R H3N+ CH COOH2N
R CH COO-
pK= 2-3
pK= 9-10
Les acides amins portant des groupements fonctionnels sur les chanes latrales possdent dautre pK : (ces pK varient si lacide amin se trouve lintrieur ou lextrieur de la protine). Glu et Asp : pK= 4 Lys : pK= 11 Arg : pK= 13 His : pK= 6 Tyr : pK= 10 Cys : pK= 9-10 Les proprits optiques : ABSORPTION : (UV, Visible) Tryptophane (eau, pH 7) : = 280 nm ; = 5600 M-1.cm-1 Tyrosine (eau, pH 7) : = 274 nm ; = 1400 M-1.cm-1 Phnylalanine (eau, pH 7) : = 257 nm ; = 200 M-1.cm-1 Globalement, les protines absorbent 280 nm (cest la longueur donde utilise pour les dosages de protines). Le coeff. dextinction molculaire () varie en fonction du nombre de tryptophane dans la molcule. Les protines absorbent trois diffrentes : = 200 nm les liaisons peptidiques = 280 nm les tryptophanes = 500 600 nm les groupements hminiques (protines pigmentes).
Tyrosine (eau, pH 7) : = 303 nm ; = 0.14 Phnylalanine (eau, pH 7) : = 282 nm ; = 0.04 Le rendement quantique () cest : lnergie mise par fluorescence / lnergie absorbe au cours de lexcitation. La fluorescence des protines dpend de leur composition en acides amins, de ce fait, on peut suivre la dnaturation des protines par mesure de fluorescence (gnralement la fluorescence augmente avec la dnaturation car les acides amins aromatiques qui se trouvaient lintrieur de la protine se retrouve lextrieure). Les proprits chimiques dues au groupements amins : Les ractions dalkylation : (RX) RX +
NH2 CH R COO-
R'
NH CH R
COO- + X
H+
R'
C O
NH2
CH R
COO-
R'
C O
NH
CH R
X- +
H+
Les ractions avec les aldhydes ou les ctones aromatiques : LES BASES DE SCHIFF : 4
O Ar C H
aldimine
+
H2N CH R COOOH2
Ar
CH
CH R
COO-
+ OH-
OH2
Ar
CH
C R R
COO-
Ar
CH-
C R
COO-
Ar
CH2
C R
COO-
+ OH2
Ar
CH2
NH2
COO-
ctimine
Les enzymes qui font des bases de Schiff utilise le phosphate de pyridoxal comme coenzyme. H O
O C O P O O H2C N H
+
OH CH3
Ce dernier se lie de faon covalente lenzyme par lintermdiaire dune base de Schiff. Cest le cas des ractions de transamination :
COO(CH2)2 CH H2N COOO COOCOO(CH2)2 O C COOCOO-
CH2 C COO-
+
H2N
CH2 CH COO-
LA REACTION A LA NINHYDRINE:
O OH OH O O O O NH2 O N COOOH2 CH R O COOCO2 O O N
H C R
CH
gemdiol aldimine
O OH2 R-CH=O O NH2
ctimine
O O N O
Ninhydrine
intermdiaire amin
pourpre de Ruheman
Les proprits chimiques dues aux groupements carboxyliques : La formation dester : (grce au diazomthane CH2=N+=N-)
CH2=N+=N-
OOCR
CH3OCOR
Les proprits chimiques dues aux groupements carboxyliques : LA REACTION AVEC LISOTHIOCYANATE DE PHENYL :
R CH COONH S H N N O H R
R C N S
H2N
CH
COONH
C S
Isothiocyanate de phenyl
Phenyl thiohydantone PTH + AA LA FORMATION DE CHELATE : (complexe avec des ions mtalliques)
O C O CH2 C CH2 NH2 O CH2 NH2 O C Cu++ NH C CH2 O O
NH
Cu++ H2O
Les proprits chimiques dues aux chanes latrales: AVEC LES FONCTIONS AMINES : (avec le N-hydroxy succinimide)
OH O N O O O N O R1 O OH N O O
P-NH2
R1
NH
Cette technique permet de marquer lextrmit N terminale des peptides, grce un marquage du groupement R1 : exemple de liodination : ractif de Bolton Hunter
SO3Na O O N O CH2 O I125 CH2 I125 OH
DCCD
R-COOH
NHR1 NR2
NHR1 NHR2
AVEC LES GROUPEMENTS THIOLS : ox RCH2SH + HSCH2R RCH2SSCH2R red Cas du glutathion ( glutamylcysteinylglycine) : le rapport GSH / GSSG dtermine la formation des pont dissulfure dans le milieu intracellulaire. GSH =
H3N+ CH (CH2)2 CONH CH CH2 SH
Glutathion rductase
CONH
CH2
COOH
COOH
GSSG GSSG
+ +
NADPH + H HSPSH
2 GSH 2 GSH +
S
+
P S
NADP+
En solution aqueuse, il ya oxydation spontane et formation de ponts dissulfures nexistant pas dans les protines natives. De ce fait on ajoute des agents rducteurs dans le tampon pour viter ce phnomne. Le mercaptothanol : HS(CH2)2OH (il faut deux molcules de mercaptothanol pour rduire un pont dissulfure). Le dithiothritol (DTT) :
HO HO SH SH
Le blocage des fonctions thiols est galement ncessaire pour que les ponts dissulfures ne se reforment pas, ce blocage est ralis de deux faons : La S Carboxylation : (avec liodoactate : ICH2COO- )
R CH2 S
ICH2COO-
CH2
CH2COO-
CH2CHCN
CH2
(CH2)2
CN
Hg
COO-
CH2
Hg
COO-
Paramercuribenzoate
Coloration rouge
N2O COO-
S S DTNB--
N2O COO-
R S
N2O COO-
H2O2
R I
OH
OH2
H2 C R
+O
N Br
O3
La liaison peptidique : structure et proprits ; principaux peptides dintrt biologique. Les acides amins sont relis entre eux par lintermdiaire de liaison peptidique :
R H2N C COOH R R H2N C H O
H2N C COOH
N C COOH H
OH2
Lenchanement des acides amins selon les liaisons peptidiques (sans tenir comptes des chanes latrales) sappelle la chane principale. Les acides amins se polymrisent, pour former des peptides : 2 acides amins = dipeptides 3 acides amins = tripeptides 30 acides amins = polypeptides 50 acides amins = protines (peut contenir jusqu 40000 acides amins) Les peptides dintrt biologiques sont trs nombreux, les principaux sont les enzymes, les transporteurs de mtabolites, les rcepteurs, les hormones et facteurs de croissance, les protines de structure, du cytosquelette, rgulatrice, de stockage,. Structure primaire des peptides et des protines ; squenage. La chane polypeptidique doit alors sorganiser pour tre fonctionnelle, elle doit se replier (Folding : Repliement). Il existe quatre niveaux de repliement : La structure primaire : la squence en acides amins. La structure secondaire : lorganisation de la chane principale en motifs structuraux. La structure tertiaire : position dans lespace de lensemble des atomes de la protine (il y a une seule chane polypeptidique). La structure quaternaire : il y a plusieurs chanes polypeptidiques associes entre elles par des liaisons non covalentes. Lenchanement des acides amins se fait de lextrmit N ter vers lextrmit C ter. Le squenage des protines doit toujours commencer par laction dagents rducteurs ( mercaptothanol ou DTT ) suivi de laction des agents bloquant les rsidus SH libres ( Cyanothylation ou S Carboxylation) ou de laction de lacide performique (O=CH-OOH) qui oxyde les SH libre en rsidus SO3-. Ces mesures permettent de linariser la ou les chanes polypeptidiques en coupant les ponts inter ou intra-chane, ainsi on peut isoler sil le faut chaque chane par lectrophorse et les squencer sparment. Par la suite on travaillera donc sur des chanes peptidiques ne possdant quune extrmit N ter et quune extrmit C ter. Les peptides ainsi linariss sont ensuite coup en plus petits peptides afin de suivre le squenage de faon plus simple. La chane polypeptidique peut tre coupe de deux faons :
La coupure chimique : (deux exemples) Avec le bromure de cyanogne au niveau des mthionines:
CH3 S (CH2)2 N C CO N H H H CH3 S
+
Br OH2
(CH2)2 N Br N C CO N H H H
H2 H2 C C
Br
N C H H
O O lactone
H2N C H
Avec lacide actique glacial entre les aspartates et les prolines. La coupure enzymatique : Il existe deux types denzymes (quelles soient naturelles ou synthtiques) : les endoprotases et les exoprotases. Les exoprotases coupent les acides amins terminaux, tandis que les endoprotases coupent lintrieure des chanes polypeptidiques. Ensuite on peut encore diviser les exoprotases en deux sortes de sous enzymes : les carboxypeptidases qui coupent du ct carboxy terminal (COO-) de lacide amin et les aminopeptidases qui coupent du ct amino terminal (NH2) de lacide amin. Voici quelques exemples denzymes : Les endoprotases : Nom Pepsine Trypsine Chymotrypsine Les exoprotases : Nom Carboxypeptidase A Carboxypeptidase B Provenance Suc pancratique Suc pancratique Acides amins K,R,P K,R Ct de la coupure carboxy terminal carboxy terminal Provenance Suc gastrique Suc pancratique Suc pancratique Acides amins L,M,F,Y,W K,R F,Y,W Ct de la coupure amino carboxy carboxy
Il existe galement des protases synthtiques (AspC, LysC,), cependant, ces enzymes cotent trs chres. Si lon veut modifier laction des endoprotases, on doit modifier les acides amins de part et dautre de la liaison peptidique : exemple de la lysine :
R (CH2)4 NH2
CH3 COO-
anhydride cytraconique
Ainsi, la lysine nest plus reconnu par la trypsine. Analyse des mlanges de peptides : On fait une sparation par chromatographie en phase inverse (RP-HPLC) : Phase stationnaire : hydrophobe ( silice + chane aliphatique : bras mobile) Phase mobile : solvant de polarit dcroissante : (eau ; 0 90% dactonytrile :CH3CN). La solution contenant les peptides se fixe la phase stationnaire par interaction hydrophobe. On peut galement faire une lectrophorse suivie dun transfert sur papier PVDF ou sur nitrocellulose. Les taches obtenues sont dposes dans lanalyseur dEDMAN, afin de connatre le nom du ou des acides amins correspondants.
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La raction dEDMAN : (raction rcurrente jusqu 50 acides amins) 1) Couplage en milieu alcalin :
N C S
H H H2N C CO N C H R1 R2
S N H H H N C CO N C H H R1 R2
2) Clivage :
N H S O N C H H R1 H N C H R2 H+ (milieu anhydre) S N H O
N C H H R1
H H2N C CO R2
3) Conversion :
S N H O N C H H R1
anilinothiazolinone S N H H N C COOH H R1
(milieu acide) S N O NH H R1
OH2
OH2
Ensuite chaque phnyl thiohydantone est analys puis identifi par chromatographie, phnyl thiohydantoine car chacun dentre eux possde son propre pic. Analyse des extrmits C ter et N ter : N ter : chimique (mthode de SANGER)
R-X
H H2N C R1
ractif color
H2N NH2
H H2N C CO N NH2 H R1
enzymatique (avec les carboxypeptidase) Le squenage peut galement tre ralis par spectromtrie de masse : MALDI : Maldi Assisted Laser Desorption Ionisation Permet de dterminer la masse molaire et la squence, directement sur la protine entire. ESMS : (lectrospray) Permet de dterminer la masse molaire et la squence, directement sur la protine native.
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