POPULATION D ’ADN COMPLEXE

- ADN génomique
ou
- copie d ’ARNm = CDNA

Amplification spécifique Détection spécifique

Clonage dans Amplification in vitro

Hybridation moléculaire
des vecteurs PCR

- vecteur - polymérase - Sonde ADN ou ARN

- lier le fragment thermostable marquée
d ’ADN au vecteur -information sur la
- transfert dans séquence permettant
l’hôte de générer des amorces
d’amplification
LE CLONAGE
 I - Propriétés des vecteurs de clonage
•capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée
(origine de réplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)

•possèdent un polylinker ou site multiple de clonage

Molecular Cell Biology

Molecular Cell Biology

•Possèdent des propriétés permettant la sélection de la cellule hôte (résistance ATB)

•supportent l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand
II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur

- Préparation du vecteur

- Préparation de l’ADN à insérer

- Réalisation d’un recombinant

- Incorporation à l’hôte
 Obtention de l’ADN recombinant

+ traitement
PAL

An Introduction to Genetic Analysis  

 La ligation (ligature...)

Une enzyme, la ligase,

est capable
de lier de façon
covalente
deux molécules d’ADN
en une.
Molecular Cell Biology
 Différents vecteurs de clonage
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut
être cloné dans chaque vecteur

Type de vect eur ADN cloné en kb

Pl asmid e 10
Ph age lambd a 25
Cosm ide 45
Ph age P1 100
BAC(bacteria l ar tific ial chromosome) 300
YAC (yeas tar tific ial chromosome) 1000
 Les plasmides comme vecteurs de clonage (1)
Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne
Molécule d’ADN circulaire – taille 2kb à 5kb
Peut accepter jusqu’à 10kb d’ADN exogène
Peut être considérée comme un minichromosome capable de
réplication autonome
Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques=
sélection

Molecular Cell Biology

Les plasmides comme vecteur de clonage (2)
 II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur

Définition
- Préparation du vecteur
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides
- Préparation delel’ADN
composant.
à insérer
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
- Réalisation d’un recombinant
laboratoires de biologie.
Cette -technique utilise les connaissances
Incorporation à l’hôte qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes
De type procaryotique
(bactéries):
Cas d’un vecteur plasmidique:
l’ADN est introduit dans les
bactéries traitées spécialement
le plus souvent par choc
thermique ou par choc électroporateur
électrique.
 Identification des clones intéressants
Dans ce cas les bactéries transformées avec le vecteur ne
possédant pas ou possédant l’insert sont sélectionnées --> un
criblage est nécessaire

Molecular Cell Biology

 pBR322

Criblage des clones

intéressants (3)

AmpR AmpR
TetR TetS
Clone intéressant
Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
 Criblage -screening- des clones intéressants (2)
Test blanc-bleu (complémentation)

An Introduction to Genetic Analysis  

 III - Différents vecteurs de
clonage
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut
être cloné dans chaque vecteur

Type de vect eur ADN cloné en kb

Pl asmid e 10
Ph age lambd a 25
Cosm ide 45
Ph age P1 100
BAC(bacteria l ar tific ial chromosome) 300
YAC (yeas tar tific ial chromosome) 1000
 Les phages comme vecteurs de clonage

Phage = virus de bactéries

Molecular Cell Biology

Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes

De type procaryotique:
Cas d’un vecteur phagique
Les cosmides comme vecteurs de clonage

Molecular Cell Biology

Les YACs comme vecteurs de clonage
YAC : Yeast Artificial
chromosome
Criblage d’une banque phagique

Hybridation
avec uns sonde
spécifique...
Prochain cours!

An Introduction to Genetic Analysis  

 IV - APPLICATIONS DES VECTEURS

- Clonage et amplification d’une séquence d’ADN

- Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc

- Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou

des organismes(animaux transgéniques)

- Production d’ARN

- Production de protéines codées par les gènes insérés

 Banques d’ADN

-Banques d’ADN génomique

- Banques de cDNA
Banque (librairie) d’ADN génomique

Molecular Cell Biology

 Comment définir si une banque est
suffisamment grande pour espérer trouver un
fragment d’intérêt?
Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnée
dans une banque.
N=ln(1-P)/ln(1-f)
N: nombre de recombinants
P: probabilité désirée
f: proportion de génome dans un seul recombinant
Ex: 99% de probabilité d’avoir une séquence représentée dans une
banque de fragments de 17kb d’un génome eucaryote (3.109pb)
N= ln(1-0.99)/ln(1-(1,7.104/ 3.109))=8,1.105 colonies
Banque d’ADNc

Le problème ici est

l’obtention de clone dit
« full length ».
 Obtention de l’ADN de l’organisme donneur

A partir de l’ARN:
Principe de la "reverse
transcription":

An Introduction to Genetic Analysis  

 APPLICATIONS DES VECTEURS

Définition
- Clonage et amplification d’une séquence d’ADN
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
- Création des des
succession banques d’ADN
nucléotides génomiques et d’ADNc
le composant.
C’est aujourd'hui
- Production une technique
de protéines codéesde routine
par pour les
les gènes insérés
laboratoires de biologie.
-Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou
Cette technique utilise transgéniques)
des organismes(animaux les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
 Production de protéines
Utilisation de vecteur d’expression

Molecular Cell Biology

Production de protéines humaines à but thérapeutique

- Facteur VIII de la coagulation dans l’hémophilie A

- Hormone de croissance

- Insuline
Exemple de
l’insuline
 CELLULES HÔTES

-Bactéries : E. Coli
premier hôte utilisé
nombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisables
Définition
culture en masse dans les fermenteurs
taux d’expression
Le séquençage élevés
de l’ADN, est (plusieurs de
la détermination g de
la protéine/litre)
succession
MAIS des nucléotides
secrètent mal les le composant.
protéines : éclatement des bactéries
pas de modifications
C’est aujourd'hui une techniquepost-traductionnelles
de routine pour les
laboratoiressaccharomyces
-Levure de biologie. cerevisiae
modifications post traductionnelles
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
MAIS pas de secrétion, moins bon rendement
acquises depuis une trentaine d'années sur les
-Cellules CHO
mécanismes de la(chinese hamster
réplication ovary)
de l'ADN.
culture de masse en bioréacteurs, protéines complexes
MAIS cher et rendement plus faible
 Autres exemples
Levures et bactéries utilisées comme usines:
production d'antibiotiques -pénicilline, tétracycline-,
d'enzymes comme lipases -lessives-...

Vaccins : fraction de protéines virales

nécessaire à la production d’AC

Bioréactifs – Enzymes de restriction

diminution du coût
Création de plantes transgéniques

An Introduction to Genetic Analysis  

Création d’animaux transgéniques