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Programme PREPA

Mastre Optique et Photonique, Lasers et Applications



Universidad de Antioquia

Medellin (Colombia)










Nouvelles microscopies










Jean-Pierre Galaup

Laboratoire Aim Cotton
Bt. 505, Centre dOrsay
91405 ORSAY cedex (France)

http://www.lac.u-psud.fr

e-mail : jean-pierre.galaup@lac.u-psud.fr





Mai 2006
2
Plan du cours

1- Introduction
1.1- Histoire de la microscopie
1.2- Principe de la formation des images
1.2.1 Optique gomtrique
1.2.2 Diffraction de Fraunhofer
1.2.3 Thorie dAbbe
1.3- Limite de rsolution dun microscope
1.3.1 Critre de Rayleigh
1.3.2 Ouverture numrique
1.3.3 Aberrations gomtriques et chromatiques
1.3.4 Rle du condenseur
1.4- Performances compares des microscopies optiques

2- Microscopies photoniques classiques
2.1- Microscopie fond clair
2.1.1 Conditions dune bonne observation
La contribution du condenseur
Eclairage de Khler
Quel grossissement?
2.2- Microscopie fond noir Ultramicroscopie
2.2.1 Microscopie fond noir
2.2.2 Ultramicroscopie
2.3- Microscopie contraste de phase
2.4- Microscopie en lumire polarise
2.5- Microscopie contraste interfrentiel diffrentiel Nomarski

3- Microscopies optiques confocales
3.1- Principe
3.2- Formation de l'image confocale
3.2.1 Amlioration de la rsolution en microscopie confocale
Rsolution axiale en x,y
Rsolution radiale en z
3.2.2 Traitement et dconvolution de limage confocale
3.3- Ralisation dun microscope confocal
3.3.1 Microscope confocal balayage laser
3.3.2 Microscope confocal disque de Nipkow
3.3.3 Description dun microscope confocal invers commercial
3.4- Exemples dapplications

4- Microscopies optiques en champ proche
4.1- Ondes vanescentes
4.1.1 Introduction
4.1.2 Les ondes vanescentes de Fresnel
Le vecteur donde de londe vanescente
3
La polarisation de l'onde vanescente
4.1.3 Quelques consquences de ces proprits inhabituelles
Retour sur le problme de la rsolution dun instrument doptique
Les limites de londe vanescente de Fresnel
4.1.4 La diffraction vanescente
La diffraction dune onde plane
La microscopie optique en champ proche
4.2- Principales configurations
4.2.1 Microscopes en transmission
4.2.2 Microscopes en rflexion
4.2.3 Microscopes effet tunnel photonique
Microscopes effet tunnel optique balayage STOM ou PSTM
Microscopes STOM/PSTM invers : le i-PSTM ou TNOM
4.2.4 Microscopes en champ proche plasmons de surface
4.2.5 Microscopes hybrides
Microscopes avec contrle de la force de cisaillement ( shear-force control )
Microscopes en champ proche avec contact
4.3- Structure de base dun microscope SNOM
4.3.1 Partie mcanique
Ltage de translation
Les tubes pizo-lectriques
4.4- Nano-collecteurs et nano-metteurs
4.4.1 Diffrents concepts de nano-collecteurs
4.4.2 Fabrication des pointes
4.4.3 Contrle de la distance la surface
Contrle optique
Technique shear-force
4.5- Traitement des images
4.5.1 Filtrage par transformation de Fourier

5- Dveloppements actuels
5.1- Microscopie de fluorescence multi-photonique
5.2- Microscopie dobjets individuels
5.3- Microscopie Raman
5.3.1 Raman de rsonance
5.3.2 Raman exacerb de surface (SERS Surface Enhanced Raman Scattering )

6- Annexe : Glossaire de microscopie photonique

Bibliographie
4
1- Introduction

Depuis son invention au XVII
me
sicle, le microscope optique est devenu un instrument
dusage courant indispensable dans beaucoup de domaines de la mtallurgie la biologie et
la mdecine.

Cest un instrument simple qui accrot considrablement les capacits de perception du monde
lchelle micromtrique par lil humain.

Les performances dun microscope dpendent des qualits de son optique (Fig. 1.1), des
conditions dobservations utilises (Fig. 1.2), mais jusqu prsent, elles ne se comparent pas
toutefois aux observations ralises en microscopie lectronique, seule technique permettant
datteindre des rsolutions sub-nanomtriques (Fig. 1.3)



Figure 1.1 : Performances compares dun microscope type jouet ( gauche) avec un microscope de laboratoire
( droite).



Figure 1.2 : Comparaison entre deux observations faites avec un mme microscope mais avec un clairage
incorrect ( gauche) et un clairage correct ( droite).

5


Figure 1.3 : Observation compare de Gyrosigma sinense en microscopie optique ( gauche) et en microscopie
lectronique ( droite). La barre reprsente une distance de 1 m.

Le problme de la finesse des dtails observables et de leur rsolution constitue le problme
majeur de la microscopie. A cause de la diffraction de la lumire par louverture limite de
lobjectif, un point source parfait ne peut donner une image galement ponctuelle, mais
seulement une tache de diffraction dautant plus grande que louverture sera limite et le
grandissement recherch lev.

Les dveloppements rcents ont conduit rechercher dautres moyens pour dpasser cette
limite impose par la diffraction de la lumire et amliorer les conditions dobservations
dobjets particuliers, do les dveloppements de la microscopie sur fond noir ou
ultramicroscopie, des microscopies contraste de phase ou interfrentielles. Le progrs le
plus notable dans le domaine e la microscopie photonique en champ lointain est celui de la
microscopie dite confocale qui, si elle naccrot pas considrablement la rsolution
instrumentale, permet une qualit dimage ingale et la possibilit de reconstituer en 3
dimensions limage dun objet.

La rvolution dans ce domaine est venue du dveloppement des techniques de microscopie en
champ proche o lutilisation des ondes vanescentes qui nexistent que trs prs de la surface
dun objet. En captant ces ondes vanescentes par une sonde optique place quelques
nanomtres de lobjet, on peut reconstituer une image de lobjet avec une rsolution
largement sub-longueur donde et seulement dpendante de la dimension de la sonde.


1.1- Histoire de la microscopie

Quelques dates...

II
me
sicle av. JC : Nron utilisait le chaton de sa bague comme loupe.
1608 : Z. Jansen construit un microscope deux lentilles convergentes.
1633 : Ren Descartes (1596-1650) tablit les lois de l'optique.
1665 : Robert Hooke (Freshwater 1635-Londres 1703) publie Micrographia, le
premier recueil de micrographies dcrivant des lames minces de bois et o apparat le
terme cellule (Fig. 1.4). Tout la fois biologiste, palontologue, mtorologiste,
mcanicien et astronome, Hooke fut un des plus brillants exprimentateurs de son
6
temps. Son nom est rest associ aux lois de dformations lastiques des corps (loi de
Hooke).



Figure 1.4 : Microscope de Hooke et micrographie dune lame de lige prise par Hooke.

1669 : Isaac Newton (1642-1727) dcouvre la dcomposition de la lumire blanche.
1695 : Antonie Van Leeuwenhoek (1632-Delft 1723) construisit prs de 500
microscopes qui lui permirent d'observer et de dcrire pour la premire fois des
microorganismes tels que : bactries, spermatozodes, protozoaires, cellules
sanguines... (Fig. 1.5).



Figure 1.5 : Leeuwenhoek et son fameux microscope une seule lentille.

Leeuwenhoek tait drapier et commena polir des lentilles aprs la lecture du
Micrographia de Hooke. Ami intime du peintre Vermeer dont il n'avait pas les dons, il
dt faire appel un illustrateur pour ses planches.

1746 : J. Adams adapte un barillet porte-objectifs.
1828 : W. Nicol dveloppe la microscopie en lumire polarise.
1849 : J. Quekett publie un trait pratique sur l'usage du microscope.
1890 : Ernst Abbe (Eisenach 1840 - Ina 1905), physicien, il tablit les bases de la
formation des images dans le microscope et labore la thorie de la rsolution des
instruments (Fig. 1.6). En 1866 il rejoint le mcanicien Carl Zeiss avec qui il conoit
des lentilles aux aberrations trs faibles (objectif apochromatique et immersion). En
1896, il rforme la socit Carl Zeiss, dont les profits sont ds lors rpartis entre la
direction, les travailleurs et l'universit d'Ina.

7


Figure 1.6 : Portrait dErnst Abbe.

1903 : R. Zsigmondy invente lultra-microscope (perfectionn par A. Cotton). Il
recevra le prix Nobel de Chimie en 1925 pour son travail sur les collodes.
1908 : Khler et Siedentopf ralisent le microscope fluorescence.
1928 : E. Synge suggre un nouveau concept pour vaincre la limite de diffraction et
introduit la notion de super-rsolution.
1942 : F. Zernike (1888-1966) obtient le prix Nobel en 1953 pour la microscopie
contraste de phase.
1952 : G. Nomarski imagine le microscope interfrentiel diffrentiel.
1982 : G. Binning et H. Rohrer dcrivent le premier microscope pointe utilisant le
courant tunnel lectronique, le Scanning Tunneling Microscope (STM).
1984 : Les premiers quivalents optiques du STM apparaissent ouvrant la voie la
microscopie optique en champ proche.
1985 : Mise au point de la microscopie confocale balayage laser.
1990 : M. Orrit et J. Bernard dtectent des molcules uniques par fluorescence.


1.2- Principe de la formation des images

1.2.1 Optique gomtrique

Dans un microscope l'image agrandie de l'objet est forme par la lentille de l'objectif.
Lobjectif est llment crucial du microscope qui conditionne gnralement les performances
globales de linstrument. L'objet observer est plac au voisinage du foyer objet Fo de la
lentille. L'image agrandie se construit dans un plan image situ bien au-del du foyer image Fi
de la lentille (Fig. 1.7).

Daprs les lois de loptique gomtrique, pour un objectif assimil une lentille mince, on a
la relation :

f
1
' p
1
p
1
= +
(1.1)

o p et p sont respectivement les distances de lobjet et de limage au centre de la lentille et f
est la distance focale de la lentille. On note que limage est inverse par rapport lobjet.

8
objectif
objet
axe optique
image agrandie
Fo
Fi
p p


Figure 1.7 : Agrandissement par un objectif de microscope. Fo est le foyer objet, Fi est le foyer image de
lobjectif. Le grandissement est la consquence directe de la courte focale de lobjectif.

Le grandissement linaire est valu par :

p
' p
=
(1.2)

Daprs lq. 1.1, si p f, alors p , ce qui signifie que si lobjet est au foyer de la
lentille, limage est envoye linfini. Compte tenu de lq. 1.2 du grandissement, on en
dduit que limage sera dautant plus grande que lobjet sera prs du foyer Fo et que la focale
de la lentille sera courte. Cependant, il n'est pas possible d'agrandir infiniment un objet en
rduisant la distance au foyer et la focale de lobjectif.

De plus, loptique gomtrique ne prend pas en compte le caractre ondulatoire de la lumire
et les phnomnes de diffraction vont limiter le grandissement linaire dun objectif des
valeurs qui ne dpasseront gure l00x. Dans un microscope compos, limage forme dans le
plan image de lobjectif est reprise par loculaire et le grandissement total sobtient en
multipliant celui de lobjectif par celui de loculaire.

1.2.2 Diffraction de Fraunhofer

Les phnomnes de diffraction sont normalement tudis dans un cours doptique ondulatoire.
La thorie la diffraction repose sur le principe de Huygens-Fresnel qui indique que la
perturbation lumineuse en un point P rsulte de la superposition dondes secondaires mises
par tous les points dune surface situe entre ce point et la source de lumire. La traduction
mathmatique de ce principe est lintgrale de Fresnel-Kirchhoff qui scrit :

| |dS ) s , n cos( ) r , n cos(
rs
e
2
A
) P ( U
) s r ( k

=

+ i
i
(1.3)

dans le cas o on considre le passage de la lumire travers une ouverture de forme
quelconque perce dans un cran (Fig. 1.8). k est le vecteur donde = 2/. Si (x
0
,y
0
,z
0
) et
9
(x,y,z) sont les coordonnes des poins P
0
et P respectivement et (,) les coordonnes du
point Q dans louverture, on peut montrer que lq. 1.3 peut scrire :

=

+
d d e
' s ' r
Ae A cos
) P ( U
) , ( kf
) ' s ' r ( k
i
i
i
(1.4)

o : ...
' s 2
) y x (
' r 2
) y x (
' s 2 ' r 2 ' s
y x
' r
y x
) , (
3
2
3
2
0 0
2 2 2 2
0 0
+

+
+
+
+
+

+
= f (1.5)

Lvaluation de lintgrale 1.4 est plus simple lorsque les termes quadratiques et ceux
dordres plus levs en et peuvent tre ngligs. Dans ce cas, on parle de la diffraction de
Fraunhofer. Quand les termes quadratiques ne peuvent pas tre ngligs, on parle alors de la
diffraction de Fresnel. Heureusement, le cas plus simple de la diffraction de Fraunhofer est
celui de plus grande importance en optique.

x
y z
P
0
P
O
Q
r
r
s
s


Figure 1.8 : Diffraction par une ouverture de forme quelconque dans un cran plan.

Strictement parlant, les termes quadratiques et ceux dordres plus levs disparaissent
seulement quand r et s tendent vers linfini, cest dire quand la fois le point source et le
point dobservation sont linfini. Cest pourquoi, on parle aussi de diffraction linfini (ou
en champ lointain) dans le cas de la diffraction de Fraunhofer. La diffraction de Fresnel est
observe lorsque la source et lcran sont trs proches. Du point de vue de la thorie, la
diffraction de Fresnel est plus gnrale et elle inclut la diffraction de Fraunhofer comme un
cas particulier.

Dans les conditions de la diffraction de Fraunhofer, nous pouvons valuer la tache de
diffraction produite par une ouverture circulaire interpose entre une source ponctuelle et un
cran renvoy linfini laide dune lentille.

En utilisant les coordonnes polaires (,) pour le point Q dans louverture circulaire :

cos = et sin =

et les coordonnes (w,) pour le point P dans le plan de diffraction :

wcos = p et wsin = q
10

De cette dfinition de p et q, il sensuit que w =
2 2
q p + est le sinus de langle que la
direction (p,q) fait avec la direction centrale p = q = 0. Lintgrale de Fresnel-Kirchhoff se
met alors sous la forme :

=



d d e C ) P ( U
a
0
2
0
) cos( w k i -
(1.6)

Cette forme fait apparatre la reprsentation intgrale des fonctions de Bessel J
n
(x) :

=



d e e
2
) x ( J
2
0
n cos x
n
i i
-n
i
(1.7)

Lintgrale 1.6 scrit alors :

=

d ) w k ( J C 2 ) P ( U
a
0
0
(1.8)

En utilisant la relation de rcurrence :

{ } ) x ( J x ) x ( J x
dx
d
n
1 n
1 n
1 n +
+
+
= qui donne par intgration pour n=0 :

=
x
0
1 0
) x ( xJ ' dx ) ' x ( J ' x

on obtient :

(

=
kaw
) kaw ( J 2
a C ) P ( U
1 2

(1.9)

do lon dduit lintensit de la tache de diffraction :

0
2
1
2
I
kaw
) kaw ( J 2
) P ( U ) P ( I
(

= = (1.10)

Cest la clbre formule dAiry, tablie pour une ouverture circulaire. On dit aussi que I(P) est
la fonction dtalement dun point, Point Spread Function en anglais ou PSF. I
0
est
lintensit au centre de la tache : I
0
= a
2
E/
2
, E tant lnergie totale incidente.

Les minima de la fonction de Bessel J
1
(x) avec x = kaw = 2aw/ sont obtenus pour x =
1.22, 2.233, 3.238 do lon dduit que le rayons des anneaux sombres sont :

a
610 , 0 q p w
2 2

= + =
a
116 , 1


a
619 , 1

(1.11)

Dans le cas dune fente de largeur 2a, lquation correspondante fait intervenir le sinus
cardinal
x
) x sin(
c
= sin et scrit :

11
) x ( sin I I
kpa
) kpa sin(
) P ( U ) P ( I
2
c 0 0
2
2
=
(

= = (1.12)

1.2.3 Thorie dAbbe

La thorie de la formation de l'image dans un microscope a t formule par Ernst Abbe la
fin du XIX
me
sicle. Abbe traita l'objet comme un fin rseau de diffraction et bien que ce ne
soit pas une description exacte de la section de plantes, c'est une trs bonne approximation de
la structure rgulire des diatomes par exemple.

Par passage au travers dun rseau, la lumire est diffracte. Au rayon non dvi dordre 0
sajoutent des rayons diffracts, de part et dautre et selon les ordres de diffraction successifs :
-1 et +1, -2 et +2, -3 et +3, Tous ces ordres contiennent une part dinformation sur lobjet
tudi. Louverture de lobjectif limite le nombre dordres de diffraction susceptibles dtre
collects travers lui (Fig. 1.9).

Les structures diffractant fortement la lumire, cest dire correspondant des frquences
spatiales leves quivalentes un rseau de diffraction avec un trs grand nombre de traits au
millimtre, donneront des rayons avec des angles de diffraction levs qui ne pourront tre
collects par lobjectif. Leur absence ne permettra pas la formation dune image,
reconstruction fidle de lobjet.



Figure 1.9 : Illustration de la thorie dAbbe. A gauche, lobjet est un rseau faible nombre de traits, tous les
ordres de diffraction passent par lobjectif et limage reconstitue lobjet. A droite, lobjet est fortement
diffractant et pas tous les ordres de diffraction sont collects par lobjectif. En consquence, limage ne
reconstitue que partiellement, voire pas du tout les structures fines de lobjet.

Nous allons dcrire ce processus de formation de limage plus en dtail. Dans cette
prsentation de la thorie de la formation des images dans un microscope, nous limiterons
notre attention aux deux cas extrmes dune illumination compltement incohrente dune
part et dune illumination parfaitement cohrente dautre part. Le cas dune illumination
seulement partiellement cohrente nest pas trait.

Illumination incohrente

Considrons un objet lumineux par lui-mme comme par exemple, le filament incandescent
dune lampe lectrique. Soit P le point de lobjet situ sur laxe optique et Q un point voisin
une distance y de P dans le plan objet . Appelons P et Q les images de ces points spares
de la distance y dans le plan image (Fig. 1.10). et sont des plans conjugus.
Appelons et les angles que font les rayons marginaux passant par le diaphragme avec
laxe optique.
12

F
D
a
P
Q
P
Q

y
y
Y
Y


Figure 1.10 : Schma illustrant la thorie du pouvoir de rsolution du microscope.

Soit a le rayon de la zone suppose circulaire dans laquelle le faisceau de lumire convergent
vers P coupe le plan focal arrire F et appelons D la distance entre la pupille de sortie et le
plan image, alors, puisque est petit :

' D
' a
' = (1.13)

Si w =
2 2
q p + est la sparation entre Q et P, cest dire le sinus de langle sous lequel les
deux points sont vus du centre de louverture, alors nous avons avec une bonne
approximation :

Y = wD (1.14)

Soient n et n les indices de rfraction, et les longueurs donde respectivement dans les
espaces objet et image et
0
la longueur donde dans le vide, alors, puisque daprs le rsultat
1.11, le premier minimum de la figure de diffraction de P est donn par w = 0,61/a, nous
avons la limite de rsolution :

' ' n
61 , 0
'
'
61 , 0
' a
' D
61 , 0 ' Y
0

= = (1.15)

En utilisant la relation des sinus : nYsin = nYsin, on substitue Y par Y dans lq. 1.15
et en assimilant sin , on dduit :

sin n
61 , 0 Y
0
(1.16)

Lquation 1.16 donne la distance entre deux points objets quun microscope peut juste
rsoudre lorsque lillumination est incohrente et que louverture est circulaire.

13
La quantit nsin qui intervient dans cette quation est louverture numrique. Elle doit tre
grande pour un meilleur pouvoir de rsolution.

Illumination cohrente (thorie dAbbe)

Considrons lautre cas extrme o la lumire mergeant de lobjet peut tre traite comme
strictement cohrente. Cette situation est approximativement ralise lorsquun objet mince
avec une structure relativement simple est illumin par de la lumire issue dune source
suffisamment petite travers un condenseur faible ouverture. La premire thorie
satisfaisante de la rsolution dun microscope sous illumination cohrente a t formule et
aussi illustre par de belles expriences par E. Abbe en 1873.

Selon Abbe, lobjet agit la manire dun rseau de diffraction, si bien que non seulement
chaque lment de louverture de lobjectif, mais aussi chaque lment de lobjet doit tre pris
en considration dans la dtermination de la perturbation complexe qui intervient en
nimporte quel point particulier du plan image. Sous forme mathmatique, la transition du
plan objet au plan image implique deux intgrations : lune est tendue sur le plan objet,
lautre est tendue sur louverture. Dans la thorie dAbbe, la diffraction par lobjet est
considre dabord et leffet de louverture est pris en compte dans un deuxime temps.

Pour illustrer la thorie dAbbe, considrons la formation de limage dun objet en forme de
rseau de diffraction illumin par une onde plane incident normalement sur le plan objet selon
le principe de lillumination centrale de Khler. Londe est diffracte par lobjet et donne
naissance une figure de diffraction de Fraunhofer du rseau dans le plan focal arrire F de
lobjectif (Fig. 1.11), aussi appel plan de Fourier. Les maxima correspondant aux spectres
dordre successif de cette figure de diffraction sont nots S
-3
, S
-2
, S
-1
, S
0
, S
1
, S
2
, S
3


F
D f
(,)
(x,y)
(x,y)
S
0
S
1
S
2
S
3
S
-1
S
-2
S
-3
(p
,q
)
(p
,q
)


Figure 1.11 : Schma illustrant la thorie dAbbe de la formation de limage dans un microscope sous
illumination cohrente.

Chaque point dans le plan focal peut alors tre considr comme le centre dune mission
cohrente secondaire dont la contribution sera proportionnelle lamplitude en chaque point.
Les ondes lumineuses issues de chacun de ces points sources secondaires interfreront entre-
elles et donneront naissance limage de lobjet dans le plan image de lobjectif. Pour
obtenir une image fidle, il est ncessaire que tous les spectres (tous les ordres de diffraction)
contribuent la formation de limage. Ceci nest jamais possible strictement cause de
louverture finie de lobjectif. Dun point de vue pratique cependant, il est suffisant que
14
louverture soit suffisamment grande pour admettre tous les ordres qui transportent une
quantit apprciable dnergie.

On remarquera que si lobjet possde des structures de grande finesse, quivalentes donc un
rseau grav trs fin, les angles de diffraction dus ces structures seront trs grands et seuls
un nombre trs limit dordres de diffraction, voire la limite un seul, pourra passer travers
lobjectif. Dans ces conditions, lobjet ne pourra pas tre reconstitu avec toute la finesse
ncessaire et on aura atteint la limite de rsolution de linstrument.

Ces considrations peuvent tre exprimes dune manire prcise sans se restreindre au cas
dobjets assimils des rseaux de diffraction. Soient (x,y) les coordonnes dun point
typique du plan objet et f la distance du plan focal F la lentille objectif, la perturbation au
point (=pf,=qf) du plan F est donne par la formule de Fraunhofer :

(

|
.
|

\
|
+

= dxdy y
f
x
f
k exp ) y , x ( F C ) , ( U
1
i
(1.17)

o F est la fonction dcrivant la transmission de lobjet, C
1
une constante et lintgration est
effectue sur laire du plan objet couverte par lobjet.

Considrons maintenant la transition du plan focal F au plan image . D tant la distance
entre ces deux plans, au point typique (x=pD,y=qD) du plan image, la perturbation due
la diffraction de Fraunhofer par une ouverture situe dans le plan F sera :

|
.
|

\
|
+ = d d
' D
' y
' D
' x
k exp ) , ( U C ) ' y , ' x ( V
2
i
(1.18)

La substitution de lq. 1.17 dans lq. 1.18 donne :



(

|
|
.
|

\
|

|
.
|

\
|
+ +
|
.
|

\
|
+ = d dxdyd ' y
' D
f
y ' x
' D
f
x
f
k
exp ) y , x ( F C C ) ' y , ' x ( V
2 1
i
(1.19)

Si on suppose que F(x,y) est dfinie comme nulle pour tous les points du plan objet qui se
trouvent lextrieur de lobjet lui mme, cest dire de , alors lintgration par rapport x
et y peut formellement tre tendue de +. De mme, si louverture est suffisamment
grande pour que ) , ( U soit ngligeable pour les points du plan focal F qui se trouvent en
dehors de , alors les intgrations par rapport et peuvent galement tre tendues de
+. Appelons M (<0) le grandissement entre les plans et , dfini par :

f
' D
M = ou
M
1
' D
f
= (1.20)

En utilisant le thorme de lintgrale de Fourier, on obtient :

) y , x ( CF )
M
' y
,
M
' x
( CF ) ' y , ' x ( V = = (1.21)

15
o (x,y) est le point objet dont limage est en (x,y) et la quantit dfinie par :

C=C
1
C
2

2
f
2
(1.22)

est constante. Ainsi, si louverture est suffisamment large, limage est strictement similaire
lobjet, aussi bien en amplitude quen phase, mais inverse.

Dans le cas dune illumination cohrente, on peut montrer que la limite de rsolution est :

sin n
77 , 0 Y
0
(1.23)

A part la valeur du facteur numrique qui est en ralit quelque peu arbitraire, cette limite est
pratiquement identique celle obtenue dans le cas dune illumination incohrente.

1.3- Limite de rsolution dun microscope

La notion de rsolution est certainement la notion la plus importante en imagerie. On parle
aussi de pouvoir de rsolution. Elle dcrit la capacit dun systme rsoudre les plus petits
dtails dun objet. Diffrents critres ont t proposs pour dfinir de faon simple la
rsolution dun systme dimagerie. Le plus connu et utilis est sans aucun doute le critre de
Rayleigh qui est une forme concise du principe dAbbe.

1.3.1 Critre de Rayleigh

Comme on vient de le voir, la rsolution confre par un objectif est limite par la diffraction.
Elle rsulte des interfrences au niveau du plan image, des ondes lumineuses diffractes le
long du trajet des rayons (Fig. 1.12).



16
Figure 1.12 : Formation de l'image dans un microscope. L'image d'un point est en fait une tache de diffraction
(disque d'Airy) ou fonction d'talement du point rsultant de l'interfrence entre les ondes diffractes ayant
parcouru des trajets distincts jusquau plan image.

La rsolution telle qu'elle a t dfinie par Rayleigh correspond la distance minimale d
min

entre deux points objets qui seront considrs comme spars (rsolus) si le maximum
d'intensit du disque d'Airy du premier point correspond au premier minimum d'intensit du
disque d'Airy du second point. Comme reprsent sur la figure 1.13, on note que dans ces
conditions idales, lintensit dans le creux situ entre les deux maxima est gale 81% de
lintensit du maximum de limage individuelle de chaque point.



Figure 1.13 : Dfinition de la rsolution ou pouvoir sparateur par le critre de Rayleigh qui prcise les
conditions pour permettre de discriminer deux disques d'Airy.

Selon ce critre de Rayleigh, la rsolution thorique est gale :

d
min
= 0,61.
NA

(1.24)

o NA est louverture numrique ( Numerical Aperture ), cest dire nsin.

Cette relation qui dfinit le pouvoir sparateur de linstrument nest en toute rigueur valable
que si l'objectif collecte de la lumire provenant d'un condenseur ayant la mme ouverture
numrique que celle de lobjectif. Fort heureusement, en pi-illumination, cest dire
lorsquon collecte la lumire de fluorescence ou de la lumire diffuse sur fond noir, cette
condition est parfaitement remplie puisque l'objectif lui-mme joue galement le rle de
condenseur.

En fait, dans la formation de limage dans un microscope, il faut tenir compte de deux
fonctions de rpartition de la lumire:

-la fonction d'talement du point dans le plan focal, cest dire la tache dAiry ou plus
gnralement, la PSF qui conditionne la rsolution latrale (en X et en Y).

-la fonction de dfocalisation qui conditionne le rsolution axiale (profondeur de
champ) le long de laxe optique (en Z).

1.3.2 Ouverture numrique

17
Exprimentalement, la fonction d'talement du point (PSF pour Point Spread Function )
sobtient en observant un point lumineux idal (infiniment petit) au travers d'un objectif. Sous
limage familire du disque dAiry, la PSF apparat sous la forme dun maximum d'intensit
entour d'anneaux de plus en plus sombres. Elle rsulte de l'incapacit de la lentille collecter
la lumire disperse au-del d'un angle donn (demi angle d'ouverture du cne de lumire
entre le foyer et la lentille).

Le cne de lumire entre le foyer et la lentille de demi-angle au sommet dfinit l'ouverture
numrique NA = nsin de l'objectif. L'ouverture numrique NA est une caractristique
essentielle d'un objectif. C'est elle qui est directement responsable de la luminosit et de la
rsolution d'un objectif.

Deux autres caractristiques de l'objectif dpendent de l'ouverture numrique: ce sont la
distance de travail D et la profondeur de champ z. La figure 1.14 illustre les changements
provoqus sur la fonction dtalement du point PSF et sur la profondeur de champ. Plus
louverture numrique est grande, plus la PSF est fine et la profondeur de champ z petite.

D D D
iris iris

z z z
PSF PSF PSF


Figure 1.14 : Louverture numrique est caractrise par l'angle et elle dtermine la distance de travail D et
la profondeur de champ z. Un iris plac devant la lentille permet de faire varier l'ouverture numrique sans
changer le grandissement et d'augmenter ainsi la profondeur de champ.

Un objectif de haute qualit sera caractris par une grande ouverture numrique
(1,0<NA<1,45) ce qui a comme consquence une distance de travail limite (90 180 m) et
une profondeur de champ rduite (effet de sectionnement optique).

On peut tablir la relation suivante entre la profondeur de champ z et louverture
numrique :

(
(

|
|
.
|

\
|

=
2
2
1 1 4
z
n
NA
n

(1.25)

18
De manire gnrale, les objectifs de faible grossissement (5x 20x) ont une faible ouverture
numrique NA (0,5 0,75) mais offrent une grande distance de travail et une grande
profondeur de champ. Les objectifs de grandissement suprieur (40x l00x) ont une NA
suprieure 0,75 et procurent une excellente rsolution mais une faible profondeur de champ.
Pour obtenir une ouverture numrique effective suprieure 0,75 les objectifs doivent tre
immersion, cest dire que lon interpose entre lobjet et lobjectif un liquide adaptateur
dindice (Fig. 1.15). Louverture numrique est alors augmente. Par exemple, pour un
objectif immersion dans 1'huile (n = 1,515) ayant un demi-angle de 67,5 on obtient une
ouverture numrique de 1,40 au lieu de 0,9 pour le mme objectif sec, cest dire dans lair
(n = 1).

n
2
n
3
n
1
n
1
A B C A B C
Objectif sec
n
1
n
2
Objectif immersion
n
1
n
3


Figure 1.15 : Ouverture numrique et immersion de lobjectif. A gauche la diffrence entre les indices de
rfraction n
2
et n
1
est grande, les rayons lumineux A, B et C sont dvis vers l'extrieur lors du passage du
milieu de lobjet dans l'air. Les rayons les plus externes seront perdus. A droite, on utilise un liquide
d'immersion d'indice n
3
trs proche de n
1
. Les rayons ne sont plus dvis et sont tous collects par la lentille.

Les avantages d'un objectif immersion sont triples :

Augmentation de louverture numrique de lobjectif,
Elimination de laberration sphrique due au couvre-objet,
Elimination de la rflexion totale la surface suprieure du couvre-objet.

On peut de mme utiliser des condenseurs immersion, cependant, on peut calculer que le
gain en rsolution que lon obtient par immersion du condenseur n'est que marginal, NA
cond

ne passant que de 0,95 1,2.

Certains objectifs disposent d'un diaphragme iris qui permet de rgler l'ouverture numrique
de lobjectif. Ceci permet d'augmenter la profondeur de champ en rduisant l'ouverture de
l'iris. Bien entendu, cela entrane une dgradation de la finesse de l'image, cependant on
constatera quune diminution du diamtre de liris environ 80% de son ouverture complte
ne diminue que lgrement le pouvoir de rsolution mais amliore beaucoup le contraste. La
formule permet de dterminer que pour une lumire 500 nm, NA
obj
= 1,3 et NA
cond
= 0,95
(cest dire un condenseur "sec"), la rsolution maximale du microscope peut atteindre
environ 260 nm. C'est une limite que l'on peut atteindre en routine.

1.3.3 Aberrations gomtriques et chromatiques

19
La ralisation d'un objectif de microscope est extrmement complexe et doit prendre en
compte toutes sortes de dfauts.

Une correction importante de l'objectif concerne l'aberration sphrique. Avec les systmes de
lentilles qui ne sont pas corrigs, l'image subit une dformation sphrique telle que les dtails
situs au pourtour de l'image deviennent flous si la mise au point est faite sur le centre, et
inversement. Les objectifs aplantiques corrigent totalement l'aberration sphrique. Une
correction partielle peut souvent tre suffisante et donc plus conomique.

Par construction, une lentille est un dioptre courbure variable qui doit assurer la
convergence des rayons lumineux par rfraction. Cependant, cause de la dispersion de
lindice, l'angle de rfraction varie en fonction de la longueur d'onde. Autrement dit, pour un
objet clair par de la lumire blanche, on obtient une mise au point diffrente suivant que les
parties observes sont rouges, vertes ou bleues comme reprsent sur la figure 1.16.

Fo
Fo
rayon blanc
Bleu Rouge
Sans correction
Avec correction
axe optique


Figure 1.16 : Aberration chromatique. Sur la moiti suprieure, lobjectif est non corrig, la lumire blanche est
dcompose et les rayons rouges, verts et bleus convergent en des points diffrents le long de l'axe optique. Sur
la moiti infrieure, lobjectif est corrig par l'adjonction d'une lentille divergente pour compenser la dispersion
des rayons de longueur d'onde diffrente. Tous sont maintenant focaliss au mme point.

Ce dfaut s'appelle l'aberration chromatique. Dans les objectifs de microscope, on corrige ce
dfaut en fabriquant des objectifs composs constitus de plusieurs lentilles avec des lois de
dispersions dindice diffrentes afin de se corriger mutuellement, mais cette aberration
chromatique des objectifs est corrige de faon trs diffrente selon les fabricants. Selon la
correction effectue, on distingue des objectifs achromatiques, semi-apochromatiques et
apochromatiques.

En outre, si la correction de l'aberration sphrique est aussi ralise, l'objectif comporte la
mention "aplantique" (par exemple, un objectif sera aplantique-apochromatique). Les
objectifs apochromatiques sont ceux qui offrent la meilleure correction chromatique et un
contraste d'image particulirement bon. Ils sont employs pour examiner les structures fines et
colores. Les aberrations chromatiques des objectifs achromatiques bon march ne sont
gnralement pas perceptibles. Associs un filtre vert, les objectifs achromatiques peuvent
parfaitement tre employs pour la photographie noir et blanc. Pour la photographie couleur,
il est prfrable d'utiliser des objectifs semi-apochromatiques ou apochromatiques afin de
garantir la fidlit des couleurs et un bon contraste.

1.3.4 Rle du condenseur

Le rle du condenseur dans un microscope est essentiel en permettant d'clairer de faon
homogne le champ du microscope. Le dispositif le plus courant est le condenseur de Khler.
Il est constitu d'une source lumineuse, suivie d'un diaphragme de champ (limitant
20
l'illumination au champ microscopique visible). Une lentille collectrice rcupre la lumire de
la source, un diaphragme d'ouverture permet d'ajuster l'ouverture numrique du condenseur en
fonction de celle de l'objectif utilis, et enfin la lentille condenseur proprement dite focalise
l'illumination sur le spcimen. Le rglage des diffrents constituants du dispositif condenseur
est capital pour l'obtention d'une image rsolue et dun bon contraste (Fig. 1.17). En
particulier, le centrage et la focalisation du condenseur doivent tre ajusts chaque fois que
l'on change d'objectif. De mme l'ouverture des deux diaphragmes doit toujours tre ajuste
la dimension du champ du microscope.





Figure 1.17 : Influence du diaphragme du condenseur sur la rsolution au sein de l'image microscopique dune
diatome: gauche, le diaphragme du condenseur est rgl correctement; droite, le diaphragme du
condenseur est trop ferm. L'image de droite mme si elle parat plus contraste, est nanmoins mauvaise au
plan de la rsolution. Les structures fines de la diatome ne sont visibles que sur l'image de gauche obtenue avec
un rglage correct du diaphragme du condenseur.

La profondeur de nettet est dtermine par le grossissement global et l'ouverture du
condenseur. Plus le grossissement global est lev, plus la profondeur de nettet est rduite.
La diminution de l'ouverture du condenseur permet d'augmenter quelque peu la profondeur de
nettet mais aux dpens du pouvoir sparateur.


1.4- Performances compares des microscopies optiques

On compare les performances entre les trois principales familles de microscopies optiques.
Les microscopies classique et confocale sont dites en champ lointain. La lumire transmise,
rflchie ou mise par lobjet est collecte par un objectif situ une relativement grande
distance de lchantillon. Les nouvelles microscopies en champ proche utilisent une sonde
locale, gnralement une fibre optique de forme trs affine qui vient collecter linformation
au voisinage immdiat, cest dire quelques nanomtres de la surface de lchantillon.

Dans le tableau 1.1 comparatif, on prend en compte :

1) le type de dtection : la premire condition pour former une image dun objet dpend
de la capacit de linstrument dtecter la prsence de cet objet et donc collecter
suffisamment de photons portant une information pertinente sur lobjet. Un critre de
21
dtection peut tre dfini comme la capacit dtecter un nombre minimal de photons
tel que le rapport signal/bruit soit plus grand que 1. Si
det
est le seuil de dtection, il
doit vrifier lingalit :

det p
n s > = h avec
det
>n (1.26)

o n
p
est le nombre de photons, s le signal et n le niveau moyen de bruit en nergie.

Dans le tableau, on prcise aussi le type de dtection. Dans un microscope classique,
limage est collecte directement par lil, une plaque photographique ou une camra
CCD : il sagit dune dtection en parallle de tous les lments de limage. Ce nest
pas le cas pour les autres techniques qui ncessitent le balayage dun lment, par
exemple du faisceau laser, dune sonde locale ou de lobjet lui-mme : il sagit alors
dune dtection squentielle. Limage est acquise point par point. Ceci peut tre un
inconvnient majeur pour lobservation de cellules vivantes ou dobjets mobiles.

2) la localisation : aprs avoir extrait le signal du bruit, la prochaine tape est de localiser
llment metteur ou diffractant de lobjet. Mme si la tache de diffraction est plus
grande que /2, llment peut tre localis avec une prcision bien plus grande que la
longueur donde. Par exemple, le mouvement erratique dune bactrie dun diamtre
de 1 m peut tre suivi avec une prcision de quelques nanomtres ou moins bien que
le diamtre de limage puisse tre denviron 2 m. Bien sr, cela est possible si
limage de lobjet conserve toujours la mme forme dans son dplacement.

3) Rsolution : nous avons examin ce point en dtail prcdemment. Elle est mesure en
comparant les fonctions dtalement du point (PSF) de chaque instrument. Dans le cas
des microscopes en champ proche, cest la dimension de la sonde qui est dterminante.
Remarquons que le contraste est parfois confondu avec la rsolution parce quune
image bien contraste est souvent considre comme une bonne image selon les
critres de la perception visuelle humaine.

4) Enfin, on considre le problme de artfacts. Cest la critique la plus forte concernant
les techniques de champ proche qui travaillent en aveugle . Selon les modes
dinteractions de la sonde avec la surface de lchantillon, elles sont susceptibles de
gnrer des signaux qui, mal interprts, peuvent conduire une reprsentation
errone de lobjet.
22



Type de microscopie Classique Confocale Champ proche
Type de dtection
Parallle
(formation dune image)
Squentielle
( balayage)
Squentielle
( balayage)
Niveau de signal
(converti en courant)
Quelques mA quelques
A
Quelques mA quelques
A
Quelques A quelques
nA
Rapport signal/bruit Bon Bon Faible
Dtection Facile Facile Difficile
Localisation Facile Facile difficile Dlicate difficile
Fonction dtalement du
point (PSF)
2
1
) ( J 2
(

=
4
1
) ( J 2
(

=
Eleve, au-del de /2
Dpendante du diamtre
de la pointe
Cohrence de la lumire
Cohrente, partiellement
cohrente ou incohrente
cohrente Toujours cohrente
Risque dartfacts
Faible
(optique)
Faible
(optique ou lectronique)
Important
(optique, lectronique ou
mcanique)

Tableau 1.1 : Comparaison des trois microscopies optiques de base.

Si chaque instrument possde ses avantages et inconvnients en fonction de ce quoi on le
destine, on notera que les microscopies champ proche sont des instruments dlicats qui
ncessitent de lexprience la fois en lectronique, optique et traitement dimages.
23
24
2- Microscopies photoniques classiques

Nous traitons dabord brivement de ce qu'il est convenu d'appeler la microscopie fond
clair, o l'image forme par la lumire dvie est vue sur un fond de lumire non dvie. C'est
la forme la plus courante de la microscopie, pour laquelle nous rappelons les conditions
remplir pour une bonne observation.

Dans la suite du chapitre, nous discutons de techniques d'observation plus sophistiques
complmentaires ou alternatives : la microscopie fond noir et 3 mthodes permettant
laccroissement du contraste des images. La microscopie contraste de phase est dtaille et
nous mentionnons brivement deux autres techniques : l'observation en lumire polarise et la
microscopie interfrentielle DIC Nomarski.


2.1- Microscopie fond clair

C'est le procd le plus classique et commun qui convient particulirement l'examen d'objets
colors ou contrasts. Il peut s'agir d'objets dj colors ou qui le deviennent la suite d'un
traitement appropri ou encore d'objets incolores qui possdent un indice de rfraction trs
diffrent de celui de l'eau comme des gouttes d'huile, les parois cellulaires, des cristaux, les
grains d'amidon, les bulles d'air, etc.

2.1.1 Conditions dune bonne observation

La contribution du condenseur

En exposant la thorie de la formation des images, nous avons admis que l'chantillon tait
clair par un faisceau troit de lumire parallle. A partir de la thorie d'Abbe, on a dduit
qu'une image se forme lorsque les deux maxima de premier ordre de diffraction peuvent
interfrer avec la lumire non dvie. En fait, un seul maximum de premier ordre suffit. Il est
reprsentatif du rseau et porte juste suffisamment d'information pour crer une image
lorsqu'il interfre seul avec le rayon non dvi.

Cela veut dire que si on claire l'chantillon avec un faisceau oblique, la fois un maximum
de premier ordre et le faisceau non dvi peuvent tre collects par l'objectif. On a donc
avantage utiliser un clairage conique, cest dire par un cne de lumire ayant un angle
gal l'angle d'admission de l'objectif. C'est exactement ce que le condenseur fait.

Notons que pour collecter compltement la lumire avec un objectif immersion, le
condenseur doit aussi lui aussi tre huil la lame. Ce fait est trs contraignant, augmente la
diffusion et peut tellement rduire le contraste que le bnfice d'augmentation de la rsolution
peut tre perdu.

Notons aussi que le diaphragme du condenseur n'est presque jamais ouvert compltement quel
que soit l'objectif et son ouverture numrique car cela rduit le contraste. Seuls les objectifs
apochromatiques les plus rcents permettent l'clairage complet de leur ouverture, mais mme
avec ces objectifs, on obtient un meilleur contraste lorsque le diaphragme du condenseur est
lgrement ferm.

Eclairage de Khler
25

Cette mthode de rglage due Khler s'applique toutes les techniques microscopiques par
transparence, c'est--dire au fond clair, au contraste de phase et la polarisation. La procdure
suivre pour raliser un bon clairage de Khler est dtaille ci-dessous :

Mettre en place la prparation et effectuer la mise au point avec un objectif de
grossissement moyen (par exemple 10x). Ce rglage ne doit plus tre modifi ensuite.

Diaphragmer la source lumineuse et ajuster correctement le diaphragme du
condenseur. Pour un rglage optimal du diaphragme du condenseur, on enlve un
oculaire puis on ferme le diaphragme jusqu' ce quun tiers du champ soit obscurci.

Monter ou descendre le condenseur jusqu' ce que le bord du diaphragme de la
source lumineuse devienne trs net. Si les dfauts chromatiques du condenseur et de
l'objectif ne sont pas parfaitement corrigs, un liser bleu et rouge peut apparatre au
bord du diaphragme de la source lumineuse. Le diaphragme est parfaitement focalis
lorsque la couleur passe du rouge au bleu.

Centrer le diaphragme de 1a source lumineuse. Pour la plupart des microscopes ce
rglage se fait l'aide de deux vis de centrage places sur le condenseur.

Terminer le rglage en ouvrant le diaphragme de la source lumineuse jusqu' ce qu'il
disparaisse du champ optique.

Quel grossissement?

Pour une bonne rsolution, il est absolument crucial d'assurer une grande ouverture
numrique, mais le grossissement ne dit rien sur le contenu de limage et cest souvent une
question de convenance de lobservateur. Il faut cependant assurer qu'aucune information de
l'image ne sera perdue.

Le grossissement dun microscope se calcule par le produit du grandissement de lobjectif
(par exemple 100x) par celui de loculaire (par exemple 10x) do un grossissement de1000x.
Le choix du grossissement dpend de la mthode dobservation :

Observation visuelle : une distance de lecture confortable de 25 cm (qui est ce que
nous avons approximativement en microscopie), les personnes ayant une excellente vue
peuvent rsoudre des dtails de 0,3 mm, dautres de seulement 0,5 mm. Un grandissement de
1000x est suffisant pour certains, alors que 1500x est mieux pour dautres.

Microphotographie : les films de documentation utiliss en microphotographie
peuvent avoir un pouvoir de rsolution de 100 lignes/mm, c'est dire 10 m. Avec des films
de moins bonne rsolution, par exemple 60 m, un grossissement de 200x sera suffisant pour
enregistrer un dtail de 0,3 m.

Moniteurs vido, ordinateurs : la trame de limage de tlvision o la structure
pixlise de lcran dordinateur sera le facteur limitant, ce qui signifie quon ne peut esprer
montrer le dtail d'une copie photographique au mme grossissement sur l'cran.


26
2.2- Microscopie fond noir - Ultramicroscopie

2.2.1 Microscopie fond noir

Lorsque le soleil entre dans une chambre obscurcie travers une fente des volets, les fines
particules de poussire autrement invisibles apparaissent sur le fond noir car elles diffusent la
lumire. La lumire non dvie est exclue, la lumire dvie produit l'image. Une faon
simple d'obtenir un clairage en fond noir est de placer un cache central dans le support
filtre du condenseur. Ce cache opaque est coll au centre d'un disque transparent ajust sur le
support du filtre du condenseur (Fig. 2.1).

Ce cache central arrte la lumire directe et seuls les rayons formant un angle plus grand que
"l'angle d'admission" de l'objectif utilis peuvent atteindre l'objet. Le fond est noir et la
lumire diffuse (dvie) par l'objet (dessin en bleu clair dans la figure 2.1) est vue par
l'objectif.



Figure 2.1 : Lchantillon nest clair que par des rayons trs obliques et seule la lumire diffuse par lobjet
(en clair sur le schma) pntre travers lobjectif.

La grandeur du cache central dpend de l'ouverture numrique de l'objectif. Un cache central
d'environ 15 mm de diamtre suffit gnralement pour donner un fond noir avec un objectif
denviron 0,5 d'ouverture numrique, selon les proprits du condenseur du microscope. Un
cache central de 20 mm permettra gnralement de donner un fond noir un objectif de
40x/NA 0,65.

La hauteur du condenseur doit tre ajuste pour un maximum de luminosit au centre du
champ. Le diaphragme de champ peut tre ouvert compltement puisqu'il n'y a pas grande
diffrence entre un clairement de Khler et un clairage critique dans cette situation.

Pour les fonds noirs des ouvertures numriques plus grandes, des condenseurs spciaux de
type "cardiodes" fond noir utilisant des miroirs (Fig. 2.2) sont fabriqus. Ils sont huils la
lame (on peut pour des raisons pratiques utiliser de l'eau) et exigent une mise au point et un
centrage exacts.

27
Mme ces condenseurs spciaux ne peuvent pas tre utiliss avec des objectifs ouverture
numrique de 1,2 ou suprieure. La raison est qu'il faut considrer deux ouvertures
numriques pour ces condenseurs fond noir : l'ouverture numrique interne (c'est--dire la
portion de lumire bloque) et l'ouverture numrique externe (qui pour des raisons techniques
est limite 1,4).



Figure 2.2 : Schma dun condenseur type cardiode.

Pour un objectif NA 1,25, il faut arrter toute la lumire jusqu l'ouverture numrique 1,3 au
moins. Le cne de lumire restant est ainsi limit entre NA 1,3. et NA 1,4. Ce n'est tout
simplement pas assez pour produire un fond noir utilisable. L'ouverture numrique interne
limite atteignable avec les condenseurs fond noir actuels est aux alentours de NA 1,0 ce qui
est adapt des objectifs immersion d'huile de puissance moyenne 40x 60x.

Le contraste en fond noir est extrme et la rsolution est aussi bonne que peut le donner
l'objectif utilis. Le fond noir est spectaculaire pour l'observation des protozoaires vivants ou
des bactries (Fig. 2.3) car il rend visibles les cils et les flagelles, et pour les diatomes.



Figure 2.3 : Image sur fond noir de bactries.

Les limitations du fond noir sont les suivantes : tout dabord, des objets pais, tendus ou trop
diffusants sont inexploitables en fond noir. Ensuite, les erreurs rsiduelles des objectifs
(notamment les aberrations sphriques) deviennent visibles au maximum. C'est spcialement
28
le cas avec des objectifs 40x et forme la raison principale d'utilisation d'objectifs 40x
immersion, beaucoup plus avantageux dans ce cas.

Pour l'examen de spcimens vivants en fond noir, un objectif 40x immersion d'eau est idal.
Enfin, tous les grains de poussire ou les traces de graisse deviennent galement visibles au
maximum. Il faut donc disposer dune chane dclairage mticuleusement propre : lentilles
suprieures du condenseur, les deux surfaces de la lame, chantillon dilu et "propre", sans
graisse.

2.2.2 Ultramicroscopie

Lultramicroscopie est une technique de microscopie en fond noir mais lorigine et la
diffrence de la technique prcdente, lchantillon est violemment clair latralement et non
en transmission. Cette technique est particulirement adapte pour dtecter des particules de
dimensions trs infrieures la longueur donde.

Lultramicroscopie utilise les capacits de diffusion des particules (effet Tyndall) et est
particulirement adapte la dtection de particules mtalliques (collodes dor ou dargent).
Invent par R.A. Zsigmondy, lultramicroscope a t perfectionn par A. Cotton et H.
Mouton.

Biographie de Richard Adolf Zsigmondy

Richard Adolf Zsigmondy fut un chimiste allemand n Vienne en 1865 et
dcd Gttingen en 1929. Il fit ses tudes Vienne puis Munich o il obtint
son doctorat en 1889. Il fut assistant lUniversit de Berlin puis devient en 1893
matre de confrence lEcole Polytechnique de Graz en Autriche. De 1897
1900, il travailla pour Schott Ina. Il devint ensuite professeur et directeur de
lInstitut de Chimie Gttingen.
A Berlin, il sintressa aux couleurs produites par des solutions collodales dor
appliques sur de la porcelaine. Lorsquil arriva Ina, il tudia les verres colors,
ce qui le conduisit ltude des collodes. En 1903, avec un de ses collaborateurs, il
inventt et construisit lultramicroscope qui exploite leffet Tyndall. Ce microscope
devint linstrument de rfrence jusqu larrive du microscope lectronique en
1939 pour observer les collodes.
Il obtint le prix Nobel de chimie en 1925 "pour son explication de la nature htrogne des solutions
collodales et pour les mthodes appliques au cours de ses recherches qui ont une importance fondamentale
dans la chimie moderne des collodes".

Note sur les collodes : On ne peut observer correctement au microscope classique que des objets dont la
taille est suprieure la longueur donde de la lumire visible. Les collodes sont constitus de particules plus
petite que cette longueur donde mais pouvant diffuser de la lumire par effet Tyndall.

Dans le livre crit en 1906 par Cotton et Mouton (Fig. 2.4), il est rapport que les plus
petites dimensions estimes ainsi dans les conditions les plus favorables, avec la lumire
solaire du milieu dune belle journe dt sont de 3 6 nm .

Mme si cette technique na plus quun intrt historique aujourdhui, il est important de
remarquer que certains des montages utiliss sont dune grande actualit, notamment le
dispositif ondes vanescentes de Cotton et Mouton que lon retrouve dans certains montages
de microscopie en champ proche.

29



Figure 2.4 : Page de couverture du livre de A. Cotton et H. Mouton crit en 1906 sur lultra-microscopie. A
droite, un montage dultramicroscopie tel quutilis lpoque. En dessous, le dispositif ondes vanescentes
imagin par Cotton et Mouton


2.3- Microscopie contraste de phase

Le microscope contraste de phase est un dispositif permettant d'observer des prparations
qui n'ont pas t colores. Il est donc particulirement bien adapt l'observation de cellules
vivantes.

Le principe repose sur la formation d'un contraste d'intensit cr par l'interfrence de rayons
lumineux auquel on fait subir un dphasage diffrentiel : le microscope contraste de phase
transforme les diffrences de phase inapparentes en zones visibles claires et sombres. Pour
cela, on place un anneau de phase (un diaphragme annulaire) dans le condenseur et une lame
de phase annulaire dans l'objectif du microscope (Fig. 2.5).

L'anneau de phase permet de crer une illumination de forme annulaire qui sera totalement
stoppe par l'anneau opaque de la plaque de phase. Cet anneau opaque arrte la transmission
directe de la lumire et vite l'blouissement de l'observateur. Les rayons lumineux diffracts
par les structures fines (membranes cellulaires, organites...) traversent la plaque de phase soit
dans la zone priphrique, soit dans la zone centrale. La zone centrale est constitue d'une
lame birfringente /4 dont le rle est de retarder lgrement les rayons diffracts qui la
traversent. Ces rayons retards vont interfrer avec ceux transmis sans retard sur la priphrie.

30
Le dphasage diffrentiel entre ces rayons, cr le contraste et permet de mettre en vidence
les structures cellulaires.



Figure 2.5 : Microscope contraste de phase. Le dispositif repose sur un anneau de phase plac dans le
condenseur, et une plaque de phase situe dans l'objectif. La plaque de phase est une lame de verre avec un
anneau opaque qui enserre une lame birfringente quart d'onde.

On peut rendre compte de manire simple du principe du contraste de phase en considrant
linterfrence de deux ondes. Dans la figure 2.6, deux ondes de lumire sont reprsentes :"B"
est l'onde passant en dehors de l'objet de phase (c'est--dire quelle provient directement de
l'clairage du fond), "O" est l'onde passant travers l'objet. Lobjet de phase nabsorbant pas,
ces deux ondes ont la mme amplitude, mais cause de la diffrence dindice (ou paisseur),
londe "B" retarde. Le rsultat de linterfrence est londe "D" qui reprsente la diffrence
entre le fond et l'objet.



Figure 2.6 : Schma simplifi du contraste de phase. Londe "B" qui a travers lobjet de phase est retarde par
rapport londe "O". Londe diffrence "D" est dphase de /4 par rapport "B".

Pour une petite diffrence de phase, londe "D" est toujours dphase d'environ de longueur
d'onde. La diffrence de phase est donc de /4. Si on dcale artificiellement londe "D" d'un
de longueur donde supplmentaire et quon la fasse interfrer avec "B", alors une nouvelle
onde "O" en rsulte, mais avec une plus petite amplitude que "B". L'objet apparat donc plus
fonc que le fond. Ainsi, la diffrence de phase normalement invisible a t convertie en
diffrence d'amplitude visible. Cet effet peut tre accentu lorsque londe "B" est attnue de
telle sorte que son amplitude devienne identique mais en opposition de phase avec celle de
londe "D". L'onde "O" est alors proche de zro, ce qui quivaut un assombrissement
31
maximal. Ce raisonnement est galement valide si "D" n'est pas retard, mais avanc en
phase, dans ce cas "O" devient plus clair que le fond plutt que plus fonc.

Ainsi, le microscope contraste de phase renseigne sur l'indice de rfraction des objets et sur
leurs dtails. Le contraste de phase est dit positif si lobjet (par exemple des bactries dans
une solution nutritive) d'indice de rfraction plus lev apparat plus sombre que le milieu qui
lentoure. Dans le cas contraire, (par exemple des vacuoles, une membrane plasmique) les
objets apparaissent en clair sur fond sombre. La condition essentielle pour obtenir un bon
contraste de phase est que le dphasage par rapport la longueur d'onde de la lumire utilise
soit trs faible (faible paisseur des dtails observer et diffrence minime entre les indices de
rfraction). Si ce n'est pas le cas, des anneaux de diffraction gnants peuvent apparatre.
Notons cependant que le contraste de phase ne distingue pas entre une diffrence dindice
optique et une diffrence dpaisseur.

La figure 2.7 montre comment cela est ralis en pratique. Le cache annulaire est plac dans
le plan focal avant du condenseur, dont l'image est l'infini : un faisceau de lumire parallle
sort du condenseur. La lumire venant du condenseur est divise en deux par l'objet, un
faisceau non dvi et un faisceau dvi.



Figure 2.7 : Schma dcrivant le cheminement des faisceaux de lumire dans un microscope contraste de
phase.
32

Formation de l'image du faisceau non dvi ( gauche sur la figure 2.7) : le faisceau de
lumire non dvi "B" continue son chemin parallle et forme une image sur le plan focal
arrire de l'objectif.

Formation de l'image du faisceau dvi ( droite sur la figure 2.7) : le faisceau de lumire
dvi "D" sort de l'objet et forme une image l'intrieur de l'oculaire, environ 160 mm au-
dessus de l'objectif.

Parce que ces deux images sont autant spares, le faisceau "B" peut tre utilis en laissant le
faisceau "D" seul. L'objectif possde un plateau de phase annulaire spcial dans son plan focal
arrire, dont la grandeur correspond l'image de l'anneau de phase du condenseur. Sur ce
plateau de phase, londe "B" acquiert le dphasage dun de longueur donde supplmentaire
et est galement attnu (l'anneau peut tre observ en regardant travers l'objectif).

Pour lobservation, on procde comme suit. On ajuste dabord l'clairage selon Khler. En
fait, on peut laisser le diaphragme de champ ouvert car il n'est pas trs effectif ici. Le
diaphragme du condenseur doit aussi tre compltement ouvert. On slectionne l'anneau de
phase correct pour l'objectif utilis (10x, 20x, etc. comme indiqu sur le plateau du
condenseur), on insre le tlescope de centrage et on centre l'anneau. Le centrage des anneaux
de phase est crucial comme rappel sur la figure 2.8.



Figure 2.8 : Centrage pour le contraste de phase : A Diaphragme annulaire et anneau de phase centrs. B
Diaphragme annulaire clair masqu par l'anneau de phase sombre. C Diaphragme annulaire et anneau de
phase centrs mais diaphragme annulaire flou car le condenseur est rgl trop bas et les conditions de
l'clairage de Khler ne sont pas ralises.

Le contraste de phase possde galement des limitations. En premier, il n'est utile que pour les
objets de phase, c'est dire : des objets fins qui n'absorbent que trs peu la lumire. Dautre
part, le contraste de phase peut tre la cause dune perte de rsolution. En effet, l'anneau de
phase dans le condenseur limite "l'angle d'admission" en dessous de l'angle maximum que
l'objectif utilise.

Pour des objectifs de 10x, 20x et 40x d'un systme contraste de phase, cette rduction est la
plupart du temps imperceptible ou acceptable, il arrive que l'anneau du plateau de phase
dobjectifs 100x, avec lesquels on souhaite avoir la plus grande rsolution possible est
beaucoup trop petit dans bien des microscopes de routine. De tels objectifs ne rsolvent plus
une diatome du type Surirella gemma, qui est facilement rsolue en champ clair (sans le
contraste de phase), mme avec des objectifs d'ouverture numrique plus petite. On trouve
33
cependant des objectifs 100x contraste de phase avec un anneau correspondant une
ouverture numrique d'environ 0,9 qui procurent la fois une bonne rsolution et un bon
contraste. La figure 2.9 compare une image obtenue en microscopie en fond clair avec celle
ralise en contraste de phase.



Figure 2.9 : Images en microscopie fond clair gauche et contraste de phase droite avec un objectif
ordinaire 20x 0,45 de cristaux de chlorure de strontium.


2.4- Microscopie en lumire polarise

La microscopie en lumire polarise est surtout une mthode analytique qui permet de
dterminer diverses proprits optiques des cristaux. Dans un microscope polarisant, lobjet
est plac entre deux polariseurs croiss.

La microscopie en lumire polarise permet l'observation d'objets birfringents anisotropes.
Un filtre polariseur polarise la lumire issue du condenseur, cest le polariseur, un second
polariseur crois avec le prcdent slectionne la lumire polarise dans une direction
perpendiculaire, cest l'analyseur.

Un objet birfringent caractris par ces deux indices optiques, respectivement indice
ordinaire et indice extraordinaire, partage un faisceau de lumire incident en deux faisceaux,
lun le faisceau ordinaire suivant le chemin dfini par lindice ordinaire, lautre, le faisceau
extraordinaire suivant le chemin dfini par lindice extraordinaire. Ces deux faisceaux sont
polariss selon des directions perpendiculaires.

Comme ces deux rayons ont chacun une vitesse de propagation propre, une diffrence de
marche apparat entre les deux rayons, induisant une diffrence de phase qui varie avec la
longueur d'onde. Linterfrence des deux rayons gnre une onde elliptique dont ltat de
polarisation dpend de la diffrence de marche.

Des structures birfringentes en forme de btonnet places entre deux filtres de polarisation
croiss apparatront quatre fois sous forme lumineuse lorsqu'on les fait tourner de 360. Des
objets prsentant une symtrie sphrique, comme les grains d'amidon ou les ponctuations
34
aroles, font apparatre la croix sphrique caractristique (Fig. 2.10). Les structures qui ne
sont pas birfringentes restent invisibles.



Figure 2.10 : A gauche, images de grains damidon en microscopie de polarisation. A droite, on compare les
images de ponctuation aroles dans du bois de pin observes en fond clair et entre polariseurs croiss.

Place entre polariseur et analyseur croiss, une substance birfringente peut aussi donner
naissance lapparition de colorations dpendant du dphasage entre les deux rayons et
conduire des observations spectaculaires (Fig. 2.11).



Figure 2.11 : Observation de cristaux de bichromate de potassium en lumire polarise.

Dans un domaine particulier de couleur, de trs petits dphasages produisent une diffrence
marque de couleur. Ce domaine se situe dans le rouge, une longueur d'onde appele
"premier ordre rouge".

Un filtre de premier ordre rouge plac entre le polariseur et l'analyseur augmente fortement
les diffrences de couleurs comme montr dans la figure 2.12.

Comme la microscopie contraste de phase, la lumire polarise permet de rvler des dtails
normalement invisibles en fond clair.

35


Figure 2.12 : Structures vasculaires et microcristaux dans une peau doignon rvls en lumire polarise et
par lutilisation dun filtre de premier ordre rouge.


2.5- Microscopie contraste interfrentiel diffrentiel Nomarski

Plusieurs types de microscopes contraste interfrentiel furent imagins dans les annes
1940-1950. Les microscopes conus par F. Smith furent les premiers utiliser des prismes de
Wollaston pour la sparation et la recombinaison des faisceaux. Un problme li lutilisation
de prismes Wollaston conventionnels tait que le prisme utilis pour la recombinaison des
faisceaux devait tre dans le plan focal de lobjectif, cest dire gnralement dans lobjectif.

Biographie de Georges Nomarski

Georges (Jerzy) Nomarski est n en Pologne en 1919. Aprs des tudes
lEcole Polytechnique de Varsovie, il se passionne pour loptique et dcide de
mener toute sa carrire dans cette voie. Il participa la rsistance polonaise et fut
fait prisonnier de guerre jusquen mars 1945. Nomarski entre ensuite lUniversit
de Louvain en Belgique o il sollicita le statut de rfugi politique en 1945. En
1947, il choisi la France comme rsidence permanente.
Nomarski fut diplm de lEcole Suprieure d'Optique (ESO) de Paris en 1949.
En 1950, il cra le Laboratoire de Microscopie Optique de lInstitut dOptique
dOrsay) et dbuta comme Professeur de Microscopie lESO partir de 1953. Il
fut embauch comme chercheur au CNRS o il fut promu Directeur de Recherche
en 1965. Il est lorigine de nombreuses inventions et auteur de plusieurs brevets
son nom, dont le plus connu est celui du systme DIC de microscopie contraste
interfrentiel diffrentiel quil dveloppa dans les annes 1950.
Sa carrire a t jalonne de multiples rcompenses. Il a reu le prix du Duc dAumale dcern par
lAcadmie des Sciences en 1952, le prix Gaumont de la Socit dEncouragement pour lIndustrie Nationale en
1963, le prix de la Socit Microscopie de Chicago en 1970, le prix le plus prestigieux de la Socit new-
yorkaise de Microscopie dcern la mmoire dErnst Abbe en 1973.
En 1995, il a t rcompens pour toute sa carrire scientifique par la Mdaille dOr de la SPIE (Society of
Photo-optical Instrumentation Engineers) en hommage limportance et limpact de ses dcouvertes dans des
disciplines trs diffrentes. Georges Nomarski prit sa retraite en 1980 et vcut Antony, au sud de Paris o il
mourut le 17 fvrier 1997.

La dcouverte dcisive de G. Nomarski a t dimaginer comment modifier le prisme de
Wollaston standard en sorte quil puisse tre facilement plac lextrieur de lobjectif. Dans
36
un prisme de Wollaston modifi par Nomarski, les cristaux sont taills obliquement laxe
optique ce qui permet au plan de localisation des franges dtre lextrieur du prisme et
donc, de pouvoir tre plac dans le plan focal arrire de lobjectif.

Ainsi, le prisme de recombinaison peut tre install dans la tourelle porte-objectifs et le
dispositif de Nomarski est simple. Les premiers microscopes contraste interfrentiel
diffrentiel ont t produits et commercialiss par Carl Zeiss en 1965.

Le contraste interfrentiel diffrentiel (DIC) galement appel contraste Nomarski est aussi
utilis pour l'observation de prparations non colores. Le principe repose sur la division d'un
rayon lumineux polaris en deux rayons de mme longueur d'onde, mais polariss
orthogonalement et spars spatialement d'une distance trs courte (une fraction de la
longueur d'onde). La sparation en deux rayons est ralise par un Wollaston (assemblage
particulier de deux cristaux birfringents) comme montr sur la figure 2.13.

Ces deux rayons (nomms respectivement ordinaire et extraordinaire) traversent les
spcimens en deux points diffrents mais trs proches. Suivant les milieux traverss par
chacun des deux rayons, par exemple cytoplasme pour le rayon ordinaire et la membrane
cytoplasmique pour l'extraordinaire, ceux-ci subissent un dphasage diffrent. Aprs
collection par l'objectif, les deux rayons sont re-combins par un second Wollaston et
viennent interfrer sur un filtre polariseur. Suivant la diffrence de phase entre les rayons, un
contraste positif ou ngatif sera cr rvlant ainsi les structures cellulaires.



Figure 2.13 : Microscope contraste Nomarski. Le condenseur contient un filtre polariseur suivi d'un Wollaston
qui spare le rayon ordinaire (trait plein) du rayon extraordinaire (trait pointill). Aprs l'objectif, les deux
rayons sont superposs par un second Wollaston et un filtre polariseur crois analyse la diffrence de phase
entre les deux rayons.

Comme le microscope contraste de phase, le microscope interfrentiel rend visibles les
petites diffrences dindice optique prsentes dans un objet optiquement mince, sous forme de
diffrences de couleur ou dintensit.

Il existe plusieurs techniques pour raliser un microscope interfrentiel. A la diffrence du
microscope contraste de phase mais comme le microscope en lumire polaris, la
microscopie interfrentielle fut dabord dveloppe comme une mthode analytique
permettant des mesures de grande sensibilit des proprits optiques dun objet. Dailleurs, un
microscope polarisant est en ralit une forme de microscope interfrentiel.

37
3- Microscopies optiques confocales

L'invention des mthodes de microscopie confocale photonique a t faite au milieu des
annes 1950. A cette poque, Marvin Minsky se trouvait devant la ncessit d'observer des
cellules neuronales dans des coupes paisses de tissus nerveux. En 1957, il mit alors au point
un prototype de microscope avec platine de balayage et dot de ce qui fut nomm l'poque
un systme de focalisation double. Ce dispositif fut rapidement baptis systme confocal.
Cette technique cependant resta longtemps inutilise, car elle ncessitait l'emploi d'une source
ponctuelle dlivrant une grande intensit lumineuse et l'image devait tre forme sur un cran
haute rmanence. En fait, il faudra attendre le dbut des annes1980 o la production de
sources lasers bas cot et le dveloppement exponentiel de l'informatique permit que cette
technique innovante de microscopie trouve la place qu'elle occupe dsormais dans le domaine
de la biologie.


3.1- Principe

La microscopie conventionnelle par pi-fluorescence, largement utilise de nos jours en
biologie cellulaire, dlivre des images qui malheureusement souffrent d'une rsolution limite
et apparaissent comme vues au travers d'une brume diffuse. En effet, le champ du microscope
est fortement clair par la source lumineuse et les fluorochromes sont excits au travers de
toute l'paisseur de la prparation (Fig. 3.lA). Il en rsulte que l'image forme par le
microscope est contamine par de la lumire provenant de points situs hors du plan focal et
apparat peu contraste.



Figure 3.1 : Principes compars de la microscopie conventionnelle par pi-fluorescence (A) et de la
microscopie confocale (B).

Le secret de l'imagerie confocale consiste liminer la lumire parasite hors focale. Dans le
plus simple des cas (Fig. 3.1B), ceci est obtenu en illuminant la prparation au moyen d'un
point lumineux dont le diamtre est limit par les lois de la diffraction de la lumire. Ainsi
un instant donn, seule une infime partie du spcimen est fortement illumine et va mettre de
la fluorescence. Les photons mis par les fluorochromes vont tre dtects point par point
avec un tube photomultiplicateur durant le balayage de la prparation. Un trou daiguille
(appel pinhole ) plac devant le photodtecteur et centr au niveau du foyer arrire de
l'objectif rejette la lumire parasite provenant des points situs hors du plan focal. Le nom
'confocal' provient de la mise en correspondance de trois points: la source lumineuse
ponctuelle (en gnral une source laser), le point illumin situ au foyer avant (ou foyer
'objet') de l'objectif et le pinhole situ au foyer arrire (ou foyer 'image').
38

Le rle du trou daiguille est dterminant pour garantir la rsolution et le contraste de
linstrument comme illustr sur la figure 3.2.



Figure 3.2 : Illustration du rle du diaphragme de dtection dans la rsolution du microscope confocal.

Le diaphragme de dtection peut tre un diaphragme iris permettant d'ajuster le volume
lmentaire analys par la sonde laser. Outre le respect des conditions d'optique classique
(choix de la longueur d'onde, ouverture numrique maximale de l'objectif), la rsolution
spatiale maximale est obtenue par l'ajustement du diamtre du pinhole la limite de
diffraction, cest dire lorsquil est gal au diamtre de la tache d'Airy.


3.2- Formation de l'image confocale

Comme dans tout instrument doptique, le microscope confocal obit aux limitations
imposes par les lois de la diffraction lumineuse. Cependant, la configuration confocale
procure un gain en termes de rsolution axiale et radiale par rapport la microscopie
conventionnelle, comme illustr sur la figure 3.3.



Figure 3.3 : Comparaison entre les fonctions d'talement du point (PSF) en microscopie conventionnelle (
gauche) et en microscopie confocale ( droite). Les intensits sont en ngatif pour une meilleure lisibilit.

39
Rappelons que la PSF dans le plan focal, note h
i
(x,y), dcrit la faon dont la lumire qui
idalement devrait rester concentre en un point est tale par diffraction autour de ce point.
En thorie du signal, on dirait que la PSF est la fonction de transfert du systme optique
( Optical Transfer Function , OTF). Applique une source ponctuelle o(x,y), limage
i(x',y') aprs traverse dun systme optique sans aberration s'exprime sous la forme :

i(x',y') = o(x,y)h
i
(x,y) (3.1)

o le symbole est l'oprateur de convolution.

De mme, on peut introduire la PSF de dfocalisation, h
0
(x,y), qui dcrit la faon dont la tache
dAiry est altre lorsque dplace l'objet le long de l'axe optique Z. Limage complte en
3D sexprime alors sous la par la relation :

i(x',y') = o(x,y)h
i
(x,y)h
0
(x,y,z) (3.2)

o z reprsente l'loignement de lobjet par rapport au foyer de la lentille. Les deux PSF,
axiale et radiale, peuvent tre fusionnes en une seule h(x,y,z), reprsentant la PSF
tridimensionnelle de l'objectif :

i(x',y',z') = o(x,y,z)h(x,y,z) (3.3)

3.2.1 Amlioration de la rsolution en microscopie confocale

Rsolution axiale en x,y

Ladjonction dun pinhole entrane une amlioration de la rsolution latrale. La formule du
pouvoir sparateur latral devient dans le cas du microscope confocal :

d
min
0,46.
NA

(3.4)

comparer avec la relation 1.24 obtenue pour un microscope conventionnel. On remarque
cependant que l'amlioration de la rsolution latrale n'est pas spectaculaire.

C'est plutt au niveau de la rsolution axiale et du pouvoir de sectionnement que se situe
l'avantage de la microscopie confocale.

Rsolution radiale en z

On value la rsolution axiale dun microscope confocal en mesurant la dcroissance en
intensit le long de l'axe Z pour un objet idalement ponctuel. La profondeur de champ (ou
rsolution axiale) sera dfinie comme la largeur mi-hauteur du profil d'intensit (en Z).
Ainsi on constate que la profondeur de champ en microscopie confocale, est diminue d'un
facteur 1,4 par rapport la microscopie conventionnelle. La rsolution axiale d
z
en
microscopie confocale s'exprime par la relation :

d
z
= 1,77.
2
) (NA


(3.5)
40

On note que la rsolution axiale est inversement proportionnelle au carr de l'ouverture
numrique de l'objectif. Il est donc impratif d'utiliser des objectifs grande ouverture
numrique pour obtenir le meilleur sectionnement optique.

On notera que la rsolution spatiale dun microscope confocal est anisotrope, en ce sens que
la rsolution latrale (d
xy
) et la rsolution axiale (d
z
) ont des valeurs diffrentes pour une
mme longueur d'onde , un mme indice de rfraction n et une mme ouverture numrique
NA.

En pratique, et selon l'ouverture numrique de l'objectif, la rsolution est 2,5 4 fois moins
fine dans la direction axiale que latralement.

Le sectionnement optique se dfinit comme la dcroissance de la quantit totale de lumire
prsente dans le plan focal mesure que l'on s'loigne d'un objet lumineux ponctuel.
Autrement dit, cela consiste intgrer pour chaque position z la PSF de dfocalisation.



Figure 3.4 : Proprit de sectionnement optique en microscopie conventionnelle (pointills) et microscopie
confocale (continu). Les courbes reprsentent les valeurs de l'intensit de la lumire intgre (c'est--dire
somme) dans des plans parallles xy en s'loignant graduellement du plan focal. Les images sont prsentes en
contraste ngatif.

La figure 3.4 reprsente les courbes de sectionnement optique obtenues en intgrant la
lumire dans les plans (xy) successifs. Dans le cas de la microscopie conventionnelle,
l'intensit lumineuse intgre reste constante quelque soit la dfocalisation. Au contraire, dans
le cas de la microscopie confocale, on observe une chute rapide de l'intensit intgre
mesure que l'on s'loigne du point source. Le pinhole remplit donc parfaitement son rle
slectif en rejetant la lumire "hors focale".

Cette proprit de sectionnement optique du microscope confocal est parfaitement illustre
par la figure 3.5A. Sur cette figure sont reprsentes des coupes optiques sries ralises au
travers d'une cellule vivante en culture dont les mitochondries ont t colores au moyen d'un
fluorochrome spcifique(rhodamine 123). Les coupes optiques sont obtenues en montant la
platine porte-objet d'un pas de 2 m entre l'enregistrement de chaque plan.
41


Figure 3.5 : Comparaison entre microscopie confocale (range du haut) et microscopie conventionnelle (range
du bas). A : Quatre sections optiques transversales (xy) spares de 2 m au travers d'une cellule in vitro dont
les mitochondries ont t colores par la rhodamine 123. B : Section optique axiale (xz), la ligne en pointill
indique la position du support en verre. Le contraste a t invers pour faciliter la visualisation des images.

La range suprieure prsente les coupes acquises en mode confocal et la range infrieure
montre les coupes correspondantes acquises en mode conventionnel. La diffrence entre les
deux modes apparat trs vidente.

Dans les coupes confocales, les mitochondries sont trs bien rsolues, elles s'amassent dans le
cytoplasme tout autour du noyau cellulaire qui est vide de tout marquage. Chacune des coupes
apporte une information diffrente de celle de ses voisines.

En mode conventionnel, les mitochondries sont plus difficiles distinguer. Elles apparaissent
comme noyes dans une brume diffuse due au fond de fluorescence mis par les plans
adjacents. La figure 3.5B illustre une autre possibilit de sectionnement confre par le mode
confocal. En effet, il est possible de raliser un sectionnement axial, c'est--dire d'effectuer
une coupe optique selon un plan parallle l'axe optique du microscope. L encore, le mode
confocal se montre trs suprieur au mode conventionnel. Cependant, on notera que l'image
obtenue prsente un lger flou dans la direction axiale.

Qu'en est-il de la rsolution relle? Elle est toujours altre par diffrents facteurs lis au
systme optique rel et les constructeurs fournissent gnralement une information sur les
rsolutions maximales possible selon la configuration utilise. En pratique, il est souvent
ncessaire de contrler ces valeurs du constructeur l'aide de tests optiques relativement
simples.

Ainsi avec = 488 nm et NA = 1,4, la rsolution maximale thorique dun microscope
confocal serait de 160 nm dans le plan (xy). En fait, elle est moins bonne que la valeur donne
par le constructeur : 212 nm pour un objectif 100x/NA1,4.

Notons que l'paisseur dune membrane plasmique est d'environ 10 nm selon les types
cellulaires, ce qui veut dire que lon est bien en de de la rsolution maximale du microscope
confocal le plus performant soit-il !

Un dernier paramtre prendre en compte dans le domaine de la rsolution est l'paisseur des
structures que l'on observe. Il est communment admis qu'une paisseur maximale d'environ
50 m constitue la limite pour la microscopie confocale mono-photonique. Au-del de cette
valeur la dispersion de la lumire par le milieu travers devient trop importante pour pouvoir
assurer une bonne rsolution. D'autre part la dgradation du rapport signal sur bruit devient
42
galement prohibitive. Par contre, en mode multi-photonique, du fait de l'illumination infra-
rouge, cette paisseur peut atteindre 400m.

3.2.2 Traitement et dconvolution de limage confocale

Nous avons vu que lobjectif du microscope comme toute lentille effectue instantanment une
opration de convolution (q. 3.3). En principe, par une opration de dconvolution de
limage, il pourrait tre possible de restituer lobjet et dliminer les effets de diffraction dus
lobjectif comme symboliquement reprsent sur la figure 3.6.



Figure 3.6 : L'image d'un point n'est pas un point, mais une tache dite d'Airy. Est-il possible par un procd
inverse de reconstituer lobjet par dconvolution ?

En connaissant la fonction de restitution des frquences spatiales d'un objet ponctuel, cest
dire la Point Spread Function , PSF ou ce qui est quivalent, la Optical Transfer
Function , OTF caractristique d'un systme optique donn, on doit pouvoir rassigner
chaque photon dtect son point objet-source. C'est le sens des calculs de dconvolution en
3D symboliss par la flche retournant vers la droite dans la figure 3.6. Cette ide est
lorigine de ce que lon appelle parfois la super-rsolution directement reli loptique dite de
Fourier qui nest autre que la transposition loptique de mthodes danalyse frquentielle
utilise en lectrique. On parle aussi de problme de la diffraction inverse.

Il existe de nombreux algorithmes, souvent appels algorithmes de restauration dimages, qui
permettent deffectuer ces calculs de dconvolution. On peut citer par exemple :
Lalgorithme destimation du maximum de ressemblance ( Maximum Likelihood
Estimation , MLE),
Lalgorithme de itratif avec contraintes de restauration de Tikhonov-Miller
( Iterative Constrained Tikhonov-Miller Restoration , ICTM),
Lalgorithme non-itratif de Tikhonov-Miller ( Non-iterative Tikhonov-Miller
Algorithm , QTM).

En fait, il importe surtout de savoir que cette opration se heurte deux types de problmes
fondamentaux et en principe quasiment insurmontables.

43
Le premier problme est dordre mathmatique. Si une transforme de Fourier inverse est tout
fait lgitime, il faut rappeler que lopration de convolution est associe la transforme de
Laplace et non la transforms de Fourier. Il a t dmontr quen toute rigueur, sans
hypothses priori, la transform de Laplace inverse nest pas possible. Bien sr, en pratique,
on peut souvent justifier de remplacer Laplace par Fourier et rsoudre ainsi la dconvolution.

Lautre problme est d aux bruits de toute nature qui perturbent lacquisition dune image.
Ces bruits toujours prsents sont difficiles liminer et sont sources dinstabilits dans le
traitement des donnes par des moyens informatiques.


3.3- Ralisation dun microscope confocal

Les microscopes confocaux sont conus pour travailler en rflexion ou en pi-fluorescence.
Ces modes et plus particulirement l'pi-fluorescence constituent la voie la plus facile pour
raliser la confocalit dans un microscope puisque l'optique d'illumination est la mme que
celle d'observation.

De plus, en utilisant la fluorescence, comme les longueurs d'onde des lumires d'excitation et
d'mission sont toujours dcales cause du dplacement de Stokes, on peut les sparer
l'aide d'un miroir dichroque. Ces miroirs rflchissent la lumire dune longueur donde
infrieure ou gale une certaine longueur d'onde mais laissent passer la lumire de longueur
d'onde suprieure. Cela permet d'obtenir un trs bon rapport signal/bruit puisqu'en pi-
fluorescence il sera relativement facile dobtenir des taux levs de rjection de la lumire
d'excitation.

La conjugaison dun point source dans lchantillon illumin par au point focal dun faisceau
laser avec le diaphragme de dtection situ dans le plan focal de lobjectif dfinit un plan de
coupe optique dans lchantillon. Le passage du faisceau lumineux par un diaphragme de
taille trs infrieure au champ d'observation oblige effectuer un balayage de la surface du
champ pour reconstruire une image de lobjet tudi.

La microscopie confocale est une microscopie balayage. De manire trs gnrale, on peut
considrer quil existe deux types d'imagerie balayage :

Imagerie balayage dans le plan image : l'image de lobjet est focalise directement
sur la surface sensible du capteur. Ce capteur qui peut tre soit un tube vido type VIDICON
ou une matrice lments CCD analyse l'image forme en la parcourant ligne par ligne et de
haut en bas.

Imagerie balayage dans le plan objet : dans ce cas, c'est la prparation elle-mme
qui est parcourue par un point lumineux (tache de lumire focalise). L'interaction de ce point
lumineux avec le spcimen est enregistre au vol par un dtecteur soit un tube
photomultiplicateur ou une photodiode avalanche. L'image du champ analys point par
point est recompose lectroniquement point par point sur l'cran d'un oscilloscope (ou sur un
moniteur vido) ou numriquement dans la mmoire d'un ordinateur. Le balayage de l'objet
est obtenu soit en utilisant un point lumineux fixe et en dplaant l'objet sous l'objectif du
microscope, soit en gardant l'objet fixe et en dviant le point lumineux.

44


Figure 3.7 : Schma de principe dun microscope confocal.

Dans un microscope confocal tel que celui schmatis sur la figure 3.7, ce balayage peut se
faire de plusieurs faons.

Le faisceau laser dexcitation tant fixe, on peut simplement dplacer la platine supportant la
prparation dabord en (X,Y) pour raliser une premire coupe optique, puis la dplacer selon
Z pour accder un plan voisin. Cette technique est trop lente pour la reconstruction dune
image et elle nest pas utilise dans les instruments commerciaux.

Il est bien prfrable de reconstruire limage de lobjet point point par balayage du champ
analys dans le plan (X,Y) l'aide de miroirs de dflection de la source lumineuse. Cette
technique est bien plus rapide pour lobtention dune image. Une platine motorise sert
seulement dplacer la prparation suivant l'axe Z permettant la saisie de diffrents plans
optiques dans l'paisseur de l'objet. Les images ainsi formes sont stockes sur la mmoire de
masse d'un ordinateur pour servir ensuite la reconstruction dune image en 3 dimensions.

Commercialement, il existe deux types principaux de microscopes confocaux balayage : les
microscopes balayage laser et les microscopes disque de Nipkow.

3.3.1 Microscope confocal balayage laser (MCB)

Le dispositif le plus courant de microscope confocal balayage laser est dcrit sur la
figure 3.8. Il s'agit d'un systme d'pi-illumination o la source de lumire est constitue par
un rayon laser. La lumire est envoye vers un objectif grande ouverture numrique
(NA>1,0) par rflexion sur un miroir dichroque.

45


Figure 3.8 : Principe d'un microscope confocal balayage laser.

Avant l'objectif le rayon passe par un couple de miroirs de dflexion monts sur des axes de
bascule orthogonaux, non reprsents sur la figure 3.8. Les angles forms par ces miroirs
dterminent la position en X et Y du point lumineux aprs la traverse de l'objectif. Le
spcimen peut tre balay point par point en faisant varier ces angles somme schmatis sur la
figure 3.9.



Figure 3.9 : Principe du balayage en X,Y du spot laser pour exciter tout un plan de lchantillon.

Le signal de fluorescence mis par chaque point une longueur donde diffrente de la
longueur donde dexcitation passe travers le miroir dichroque et est dtect travers le
diaphragme de dtection par le photomultiplicateur.

46


Figure 3.10 : Schma complet dun microscope confocal balayage laser.

L'image est ensuite reconstruite par des moyens de calcul informatique en additionnant tous
les signaux obtenus aprs le balayage du plan. Un systme complet tel celui reprsent sur la
figure 3.10 est ainsi quip dun ordinateur puissant ou dune station de travail pour contrler
les diffrentes fonctions de balayage et raliser rapidement les oprations ncessaires de
reconstruction et de traitement dimage. Un tel microscope permet la reconstitution dimages
tri-dimensionnelles.

3.3.2 Microscope confocal disque de Nipkow

Dans cette approche, on ralise un balayage quasi instantan de tout le champ grce la
rotation rapide plus de 300 tours/sec d'un disque de Nipkow plac dans le champ image de
l'objectif. Un disque de Nipkow est perc d'un grand nombre de micro-diaphragmes disposs
de faon recouvrir la totalit du champ chaque rotation (Fig. 3.11).



Figure 3.11 : Reprsentation schmatique dun disque de Nipkow.
47

Dans ce type de microscope, lillumination est effectue au travers de ce disque en lumire
blanche par une source de lumire tendue couvrant un rayon du disque de Nipkow. La
rcupration du signal "confocal" est effectue par une camra d'acquisition classique
permettant lobtention dune image quasiment en temps rel (Fig. 3.12). Cette stratgie
permet l'acquisition en mode confocal d'vnements rapides sans compromettre la haute
rsolution du mode confocal. Un disque de Nipkow peut tre quip d'une micro-lentille sur
chacun des diaphragmes pour mieux rcuprer la lumire mise par le point source et
augmenter ainsi la sensibilit de linstrument.



Figure 3.12 : Principe d'un microscope confocal balayage du type Tandem (tandem scanning). L'exploration
du spcimen est obtenue par la rotation d'un disque de Nipkow ( droite) perc de milliers de trous disposs
selon des spirales d'Archimde imbriques.

D'autres dispositifs apparents existent qui font appel des circuits intgrs micro-miroirs,
une technologie dveloppe lorigine pour les systmes de vido projection.

3.3.3 Description dun microscope confocal invers commercial

Il sagit du microscope confocal invers modle SP2 de Leica (Fig. 3.13). La configuration
retenue comprend plusieurs sources laser pour permettre d'analyser simultanment 2 ou 3
fluorochromes diffrents, sans interfrences, et un analyseur spectral qui permet doffrir
galement une souplesse sur la dfinition des fentres pour la dtection de la fluorescence.

Ce microscope permet de cerner les proprits in situ de fluorophores naturels ou extrinsques
(comme la fameuse Green Fluorescent Protein ou GFP par exemple) et de dvelopper une
imagerie ratiomtrique, permettant notamment la lecture de flux ioniques au sein de systmes
vivants. Ce dispositif est particulirement apprci en biologie vgtale tant donn
l'importance de la fluorescence intrinsque dans de nombreux cas.

48


Figure 3.13 : Vue clate du microscope confocal Leica SP2.

49
L'quipement comprend galement des objectifs eau (entre autres), facilitant le travail sur
des tissus pais et sur des tissus perfuss, le photo-blanchiment de zones amorphes pour
l'exprimentation en FRAP
?
et FLIP
?
concernant la communication entre cellules, entre
compartiments et mouvements d'organites, et une platine lectronique mmorisation de
points permettant le suivi de diffrentes cellules ou zones sur une cintique longue (tudes en
multiplex). Des logiciels 3D et d'analyses cintiques sont disponibles avec cet appareil.


3.3- Exemples dapplications

La microscopie confocale possde de nombreux avantages par rapport la microscopie
conventionnelle. Tout d'abord la faible profondeur de champ (0,5 - 1,5 m) du microscope
permet d'obtenir une image d'un plan focal, ralisant ainsi une coupe optique avec une
dfinition bien suprieure celle obtenue avec un microscope conventionnel. En outre le bruit
de fluorescence d au fond de lchantillon est pratiquement limin. Il en rsulte une trs
bonne sensibilit de dtection, une augmentation du contraste et une "clarification" des
images.

Un autre avantage du microscope confocal est que l'on peut obtenir des coupes optiques non
seulement dans le plan X,Y mais galement suivant un plan parallle l'axe optique (plan
X,Z) qui peuvent ainsi permettre de raliser des reconstructions tridimensionnelles. Ces
coupes optiques n'affectent en rien l'intgrit de l'chantillon biologique contrairement aux
coupes physiques ncessaires en microscopie photonique et lectronique. En outre,
l'acquisition numrise des images permet sur station de traitement d'images, d'accrotre les
possibilits d'analyse et de quantification.

Les applications principales de la microscopie confocale concernent la biologie. La
configuration la plus communment adopte est celle du microscope confocal balayage laser
(Laser Scanning Confocal Microscope) travaillant en pi-fluorescence.

En principe rien n'oblige l'utilisation de la fluorescence et certaines applications en science
des matriaux utilisent de la lumire blanche rflchie mais c'est au dtriment de la rsolution.
Pour ce qui concerne les biologistes, c'est lpi-fluorescence qui constitue la voie d'approche
privilgie, surtout parce que des techniques comme l'immunofluorescence offrent par nature
une trs grande prcision dans le positionnement des marquages sur les structures biologiques.

Les longueurs d'ondes d'excitations sont gnralement multiples soit en utilisant des lasers
multi raies, soit en utilisant plusieurs lasers. En combinant les proprits des miroirs, des
filtres dichroques et des filtres d'mission, on peut slectionner telle ou telle bande
d'excitation, sparer les longueurs d'ondes mises et rcuprer la lumire dans telle ou telle
zone spectrale.

L'utilisation de traceurs fluorescents trs spcifiques permet de localiser in situ avec une
rsolution spatiale de l'ordre quelques centaines de nanomtres, des composants
macromolculaires tels quacides nucliques ou protines, mais galement des petites
molcules telles que des peptides, des lipides et mme des ions. Les figures 3.14 et 3.15
montrent deux exemples de marquage par des marqueurs fluorescents de couleurs diffrentes.


?
Voir la signification de FRAP et FLIP dans le glossaire en annexe.
50


Figure 3.14 : Images stroscopique dune prparation soumise un triple marquage en Actine (rouge),
Clathrine (vert) et Tubuline (bleu). Vous pouvez faire apparatre la sensation de relief en en louchant
lgrement pour superposer visuellement les deux images.




Figure 3.15 : Images obtenues en microscopies confocales o lusage de marqueurs fluorescents et de filtres
appropris permet de sparer les diffrents constituants dune structure complexe.

Malgr ses avantages, la microscopie confocale a aussi ses limites et ses dsavantages. Tout
dabord, le faisceau laser pouvant tre absorb dans lchantillon, on peut avoir une perte de
signal en pntrant dans les couches plus profondes de lchantillon. Dautre part, lexcitation
de la totalit de lpaisseur de lchantillon chaque balayage pour reconstruire une image en
3 dimensions peut conduire au photo-blanchiment des fluorochromes utiliss comme
marqueur sous leffet de la densit dirradiation prsente au point focal du faisceau laser.
Enfin dans le cadre de lexamen de tissus biologiques vivants, les densits dirradiation
ncessaires peuvent aussi tre cause de cytotoxicit, cest dire dune activit toxique capable
de tuer certaines cellules.

51
52
4- Microscopies optiques en champ proche

Le microscope champ proche dit encore microscope tunnel optique est issu de la
longue histoire de londe vanescente de Fresnel. Certains prcurseurs, comme A.E. Synge
ds 1928, J.A. O'Keefe en 1956 puis E.A. Ash et G. Nicholls en 1972 avaient imagin la
possibilit de franchir la limite de Rayleigh. Ils avaient aussi propos des dispositifs
capables de rcuprer quelques informations concernant des objets sub-longueur d'onde.

Il est ainsi trs intressant de rappeler les spculations de Synge qui entretint une
correspondance avec A. Einstein sur la possibilit dutiliser des dispositifs avec des collodes
dor, des cnes de quartz mtalliss comme sondes locales (Fig. 4.1).



Figure 4.1 : Trois ides spculatives mises dans le dbat entre Synge et Einstein pour accrotre la rsolution
spatiale dun microscope optique.

Ce n'est cependant qu'au dbut des annes 80, grce aux travaux de D.W. Pohl et al. et U.
Fischer en Europe, de G.A. Massey et E. Betzig aux Etats-Unis, de D. Courjon et al.
Besanon, puis de bien dautres groupes que se sont vraiment dveloppes les techniques
permettant de franchir ce qui, de simple "critre" l'origine, tait devenu une "limite
infranchissable".

Ce glissement de vocabulaire, qui avait fini par striliser toute ide de recherche d'une
meilleure rsolution, est d'autant plus intressant souligner que E. Abbe, qui est l'origine
de la formulation du critre de Rayleigh, n'a lui-mme jamais considr qu'il puisse s'agir
d'une limite dfinitive. Il crivait ainsi en 1876 : "Il se peut que dans l'avenir, l'esprit humain
dcouvre des processus et des forces permettant de franchir ce mur qui nous parait
actuellement infranchissable. Je pense personnellement que cela se fera. Mais en mme
temps, je crois que quel qu'il soit, l'outil qui nous permettra d'tudier l'infiniment petit de
manire plus efficace que notre microscope actuel n'aura en commun avec lui que le nom". Il
est inutile de souligner la pertinence de cette remarque : le microscope champ proche n'a
rien voir avec les microscopes classiques.


4.1- Ondes vanescentes

L'imagerie optique classique trouve une limite dans l'impossibilit de sparer les images de
deux objets loigns d'une distance infrieure la demi-longueur d'onde du rayonnement
utilis. En effet, le critre de Rayleigh stipule que deux points ne sont vus sparment que si
la distance qui les spare est suprieure /(2nsin), o est la longueur d'onde du
rayonnement utilis, n est l'indice optique du milieu ambiant et est le demi-angle d'ouverture
53
du systme optique imageur. Ce rsultat, exprim sous la forme d'un critre, se retrouve dans
le principe d'indtermination de Heisenberg.

Pour cette raison, les microscopistes ont longtemps pens qu'il ne serait jamais possible de
descendre en dessous de la limite impose par le critre de Rayleigh et donc d'observer des
objets de dimension sub-longueur d'onde. En fait, les relations d'incertitude ne limitent en
rien la rsolution thorique d'un instrument ; elles nous indiquent seulement quelle prcision
nous pouvons esprer sur la position d'un objet pour une valeur donne du vecteur d'onde. Si
le vecteur d'onde utilis pouvait tre infini, la rsolution serait infinie. On voit donc o se
situe le paradoxe d'une super-rsolution : les ondes progressives vrifient toujours la relation
d'indtermination ; elles ne peuvent donc conduire qu' une rsolution vrifiant le critre de
Rayleigh. Rien n'interdit pourtant de dpasser ce critre.

4.1.1 Introduction

Le phnomne de rflexion totale frustre est bien connu. Il sobserve lorsque la lumire se
propage dans un milieu dindice de rfraction n
1
pour se rflchir sur un milieu dindice
n
2
<n
1
, ds que langle dincidence
1
du faisceau est suprieur une valeur critique
c
dfinie
par la relation n
1
sin
c
= n
2
. Dans un tel cas, toute lnergie incidente se trouve rflchie vers
le premier milieu et on parle alors de rflexion totale. Malgr cette rflexion totale de la
lumire, on peut constater nanmoins lexistence dune perturbation lectromagntique dans
le second milieu o il est malgr tout possible de dtecter une onde.

A cause de sa structure particulire qui lui impose de ne se propager quau voisinage
immdiat de la surface de sparation des deux milieux, cette onde est dite vanescente. La
figure 4.2 indique la manire de gnrer une onde vanescente soit propagative le long de la
surface, soit stationnaire.



Figure 4.2 : Champs vanescents utiliss pour gnrer localement une source non-radiative. A gauche, londe
vanescente se dplace selon la direction x. A droite, londe vanescente est stationnaire.

La premire vrification exprimentale de lexistence de ce type donde est attribue
Newton. Cette exprience se rpte aisment avec les moyens actuels. Envoyons un faisceau
laser sous un angle dincidence suprieur langle critique
c
dans un prisme rflexion
totale et approchons de sa surface une lentille plan convexe dont la courbure est tourne du
cot du prisme. Ds que la distance qui spare la lentille et le prisme est infrieure
lquivalent dune demi-longueur donde, donc avant le contact des deux milieux, une partie
de la lumire jusque l totalement rflchie dans le prisme, est maintenant transmise dans la
lentille. On dit que la rflexion totale est frustre.
54

Lorsque la lentille est pose sur le dioptre, une tache de lumire peut tre observable sur un
cran plac au-del de la lentille. Si au lieu dun laser monochromatique, on utilise un
faisceau de lumire blanche, on observe alors que cette tache est irise : son centre est blanc
alors que ses bords sont rouges. Cette zone priphrique correspondant celle o la distance
dioptre-lentille est la plus grande, cette observation indique que la lumire rouge est capable
de franchir une couche dair plus paisse que les autres couleurs du spectre : le phnomne de
frustration de la rflexion totale dpend de la longueur donde et peut se raliser sur des
paisseurs dautant plus importantes que la longueur donde est grande.

Aprs Newton, londe vanescente a t tudie en dtail par Fresnel. Depuis, la seule
dcouverte importante fut faite en 1947 par Goos et Hanchen qui avaient mis en vidence un
dplacement longitudinal du faisceau lors de la rflexion totale. Aujourdhui, elles sont la
base dun domaine part entire de loptique appele optique du champ proche. Ce
domaine qui concerne des phnomnes lumineux observables sur des zones spatiales trs
infrieures la longueur donde sinscrit tout naturellement dans le champ de la physique
msoscopique, des nanosciences et des nanotechnologies.

4.1.2 Les ondes vanescentes de Fresnel

La description ondulatoire de la lumire permet une description du phnomne. Rappelons
tout dabord quune onde qui remplit les conditions de propagation dans lair est dite
progressive ou homogne. Par contre, une onde qui ne remplit pas ces conditions ne peut se
propager dans lair et reste confine sur la surface, elle est dite alors vanescente. Comme
toute onde, londe vanescente est dfinie par son vecteur donde et sa polarisation.

Le vecteur d'onde de l'onde vanescente

Soient deux milieux dilectriques dindices respectif n
1
et n
2
<n
1
et Oxyz un systme de
rfrence dans lequel le dioptre sparant les deux milieux correspond au plan Oxy. Le plan
dincidence est le plan Oxz. Les composantes du vecteur donde de la partie transmise dune
onde plane qui se propage initialement dans le milieu n
1
et qui se rflchit sur le dioptre avec
un angle dincidence
1
scrivent :

1
2 2
1
2
2 z
y
1 1 2 2 x
T
sin n n
c
K
0 K
sin n
c
sin n
c
K
k K

=
=

=

r r

(4.1)

La structure de l'onde transmise dans n
2
dpend donc du caractre rel ou imaginaire de K
z
.
Ce terme est rel lorsque 0<n
1
sin
1
<n
2
mais il devient imaginaire pur ds que n
1
sin
1
>n
2
. Il y
a alors rflexion totale de la lumire sur le dioptre et londe transmise dans le second milieu
est vanescente. Pour simplifier, nous nous limitons dans la suite au cas particulier o n
2
=1.
Dans ce cas, les composantes du vecteur donde de londe vanescente scrivent :

55
K
~
1 sin n
c
K
0 K
c
sin n
c
sin
c
K
k K
1
2 2
1 z
y
1 1 2 x
T
i i

=
=

>

=

r r

(4.2)

En utilisant ces valeurs, on notera que le module du vecteur donde est :
c / 1 sin n 2 ) c / ( k
1
2 2
1
T
> =
r
,
Bien quil soit plus grand que /c, le produit scalaire du vecteur donde avec lui-mme reste
bien gal /c : c / k . k
T T
=
r r
, comme cest le cas pour toute onde lectromagntique se
propageant dans le vide.

En rsum :

- le vecteur donde de londe vanescente est complexe ;

- sa composante parallle au dioptre K
x
vrifie la proprit inhabituelle dtre en
module suprieure /c dans le vide (alors que pour une onde progressive
homogne aucune des composantes du vecteur donde ne peut y tre suprieure
cette valeur) ;

- sa composante perpendiculaire au dioptre K
z
est imaginaire pure.

A cause de cette dernire proprit, lamplitude de londe vanescente dcrot
exponentiellement en fonction de z. En effet, si on porte lq. 4.2 dans lexpression usuelle
dune onde plane, on obtient lquation gnrale dune onde vanescente damplitude
T
E
r
:

) t x K ( exp ) z K
~
exp( E ) t z K x K ( exp E E
x
T
z x
T
= + = i i
r r r
(4.3)

Ainsi londe vanescente, qui a une structure progressive dans la direction Ox, voit-elle son
amplitude dcrotre exponentiellement dans la direction Oz (Fig. 4.3).



Figure 4.3 : Schma de rflexion totale interne et structure de londe vanescente.

56
Cest cause de cette dcroissance exponentielle que londe vanescente nest dtectable qu
une distance trs faible de la surface de sparation des deux milieux. Par convention sa
profondeur de pntration dans le second milieu (ici lair) est dfinie comme la distance
pour laquelle son amplitude ) z K
~
exp( E
T

r
devient gale e / E
T
r
soit :

1 sin n 2
K
~
1
1
2 2
1


= =
(4.4)

La polarisation de l'onde vanescente

Dans le cas d'une onde transverse lectrique (TE), la polarisation de londe vanescente ne
prsente pas de caractristique particulire. Tel nest plus le cas pour une onde transverse
magntique (TM). Dans le systme de rfrence Oxyz, le vecteur polarisation de londe
incidente sur le dioptre scrit dans le premier milieu ) sin , 0 , cos (
1 1
I
=
r
. La polarisation
de londe transmise dans le second milieu sobtient partir de cette expression en utilisant les
lois de Snell-Descartes. On obtient ) sin n , 0 ,
1 1 1
2
sin n 1 (
2
1
T
TM
=
r
. Quand n
1
sin
1
>n
2
= 1,
cest dire dans le cas dune onde vanescente, cette expression devient :

1 sin n
0
1 sin n
1 1 z
y
1
2 2
1 x
T
TM
> =
=
=
=
i
r

(4.5)

On notera qualors que la polarisation de londe incidente sur le dioptre tait rectiligne
(polarisation TM) :

- la polarisation de londe vanescente est elliptique, puisque les deux composantes
E
x
et E
z
du vecteur polarisation ont une longueur diffrente et quelles sont
dphases de /2;

- cette ellipse est situe dans le plan d'incidence Oxz (alors quusuellement
lextrmit du vecteur polarisation dune onde plane tourne dans un plan qui lui est
perpendiculaire)

- le grand axe de l'ellipse est suprieur 1 ce qui nest jamais le cas avec une onde
progressive.

La connaissance du champ lectromagntique au voisinage de la surface permet dtudier le
flux dnergie dans londe vanescente. En calculant le flux du vecteur de Poynting, on trouve
que ce flux dnergie est nul en moyenne dans la direction Oz alors quil ne lest pas le long
de la surface.

4.1.3 Consquences de ces proprits inhabituelles

Les q. 4.2 et 4.5 du vecteur donde et de la polarisation de londe vanescente sont
totalement inhabituelles. Quelques consquences peuvent tre considres.

57
Retour sur le problme de la rsolution dun instrument doptique

Nous avons vu que le critre de Rayleigh dtermine l'ordre de grandeur de la rsolution dun
instrument doptique. En bref, on ne peut pas discerner d'objet de dimension infrieure une
demi-longueur d'onde du rayonnement utilis pour l'observer. Dans le domaine optique, o la
longueur d'onde utilisable est de lordre de 600 nanomtres, cela correspond une limite de
visibilit situe aux alentours de 300 nanomtres. Pour observer des objets de dimension
infrieure, il semble donc indispensable dutiliser des longueurs d'ondes infrieures aux
longueurs d'ondes lumineuses. Cest la raison pour laquelle la microscopie lectronique a
historiquement pris le relais de la microscopie optique pour observer de toutes petites
structures.

Une tude dtaille du problme permet cependant de comprendre lorigine de ces rsultats et
dimaginer une faon de franchir ce mur de rsolution. Si lon appelle Oxy le plan dun
cran diffractant, on peut montrer que le pouvoir rsolvant dun instrument doptique est
inversement proportionnel la composante k
//
(parallle au plan de lobjet) du vecteur donde
du rayonnement utilis. Sachant que cette composante est plus grande dans une onde
vanescente quelle ne lest dans une onde progressive, on peut entrevoir une faon
damliorer la rsolution.

Cette possibilit d'obtenir des rsolutions x au del de la rsolution limite indique par le
critre de Rayleigh peut surprendre. Cela ne correspondrait-il pas violer les ingalits de
Heisenberg ? On peut souligner tout dabord que les relations de Heisenberg n'imposent
aucune limite la mesure de la position x d'un objet, mais seulement au produit x.p
x
des
incertitudes obtenues sur des mesures simultanes de la position et de la quantit de
mouvement dun objet. Si l'on ne cherche pas mesurer simultanment ces deux grandeurs,
rien n'interdit a priori d'obtenir un x aussi petit que l'on veut. Ainsi, plutt que d'interdire de
franchir le mur de Rayleigh, les ingalits de Heisenberg nous montrent au contraire comment
procder pour s'en affranchir : applique dans la direction Ox, et transpose au couple
position-vecteur d'onde, cette relation dingalit s'crit :

x.k
x
> 2 (4.6)

Elle montre que pour obtenir une grande rsolution (x petit), il faut que l'intervalle k
x
des
valeurs de k
x
capte soit le plus grand possible. Lorsque l'on ne capte que les ondes
progressives, l'intervalle des valeurs de k
x
est [/c,+/c] = [2/,+2/] do lon dduit
lexpression de lintervalle total k
x
= 4/. En portant cette valeur dans l'q. 4.6, on en
dduit :

x 2/k
x
= /2 (4.7)

Les ondes progressives dans le vide ne peuvent donc permettre au mieux qu'une rsolution de
/2 conformment au critre de Rayleigh.

Si l'on veut obtenir une rsolution suprieure /2, lingalit 4.6 indique quil faut utiliser un
intervalle de valeurs de k
x
suprieur lintervalle [/c,+/c] = [2/,+2/] et donc
considrer des ondes pouvant avoir des composantes k
x
suprieure /c. De telles ondes sont
des ondes vanescentes qui offrent ainsi un moyen daugmenter la rsolution dun systme
optique.
58

Les limites de londe vanescente de Fresnel

Malheureusement, il y a des limites. Dans londe vanescente de Fresnel, le vecteur donde
parallle la surface est certes suprieur /c, mais il reste bien peu suprieur cette valeur
puisque son expression K
x
= n/c sin (q. 4.2) montre quil ne peut tre au mieux qugal
n/c. En ce qui concerne cette composante, la seule diffrence entre une onde homogne et
londe vanescente de Fresnel provient ainsi de la prsence de lindice de rfraction n.
Sachant que dans le domaine optique cet indice nest jamais trs suprieur 2, le seul gain
que lon puisse esprer serait au mieux un facteur 2.

Exprim par la relation x 2/k
x
(q. 4.6), le critre de Rayleigh devient en utilisant la
valeur k
x
= n/c sin = n(2/) sin de londe vanescente de Fresnel :

n 2 sin n 2
x

(4.8)

Cest la mme expression de la rsolution axiale que celle que lon peut esprer obtenir avec
un microscope immersion !

Dans lapproche prcdente, nous navons considr que londe vanescente de Fresnel
obtenue par rflexion totale. Pour obtenir des effets plus spectaculaires, il faut des types
dondes vanescentes avec des vecteurs donde k
//
plus grands. De telles ondes vanescentes
ne sont pas obtenues par rflexion totale mais par diffraction.

4.1.4 La diffraction vanescente

Pour mesurer l'effet des petits dtails dun objet sur le comportement dune onde vanescente,
on doit tenir compte de la diffraction de la lumire par ces objets. Considrons le cas d'une
onde plane monochromatique clairant un cran plat perc d'un trou de diamtre variable
comme reprsent sur la figure 4.4.

Lorsque le trou est assez grand, la plus grande partie de la lumire traverse le trou sans subir
aucune modification et seule une faible partie due la diffraction de la lumire par les bords
du trou, va merger en s'loignant de la direction de l'onde incidente d'un angle . Plus le
diamtre du trou devient petit, plus l'angle devient grand, cest dire que la composante
tangentielle du vecteur d'onde augmente. Quand le trou aura un diamtre quivalent la limite
de Rayleigh, l'angle atteindra 90 et la lumire, la sortie du trou, diffractera dans tout un
demi-espace. Si la dimension du trou continue diminuer, la lumire ne peut pas tre
diffracte au-del de 90, mais la composante tangentielle du vecteur d'onde continue, quant
elle, augmenter au-del de /c conduisant ainsi la gnration d'ondes vanescentes de
grand vecteur k
//
.

Pour un trou de dimension infiniment petite, la composante tangentielle du vecteur d'onde
sera infiniment grande et l'onde vanescente correspondante sera caractrise par une
dcroissance exponentielle, suivant la direction transversale, beaucoup plus rapide que dans le
cas de la rflexion totale.

59


Figure 4.4 : Diffraction de la lumire par une ouverture dont les dimensions peuvent tre bien plus petites que
la longueur donde de la lumire.

Dun point de vue plus mathmatique, considrons la diffraction d'une onde plane par une
fente de largeur 2L (le problme est restreint au plan Oxy). Avant la fente, le champ
lectromagntique se propage selon Oz :

) t z k ( exp E ) z ( E
z 0 0
= i
r r
(4.9)

Juste derrire la fente, il peut s'crire en premire approximation :

) L , L , x ( C ) 0 z ( E ) 0 z ( E
0 1
= = =
+
(4.10)

o C est la fonction rectangle : C(x,a,+a) = 1 si | | a , a x + et C(x,a,+a) = 0 si x est
l'extrieur de [a,+a].

Pour calculer le champ en z = Z, il faut propager chaque onde plane de sa transforme de
Fourier. La transforme de Fourier E(k
x
,0
+
) du champ juste derrire la fente donn par lq.
4.10 scrit :

| |
L k
L k sin
L E 2
k
e e
E dxe E
) L , L , x ( C ) 0 z ( E dxe ) 0 , k ( E
x
x
0
x
L k L k
0
L
L
X k
0
0
x k
x
x x
x
x
=

= =
+ = =
+
+

+

+

i
i i
i
i

(4.11)

Le champ au point X sur un cran plac la distance Z de la fente sobtient alors en
propageant chacune des composantes de Fourier du spectre jusquen (X,Z). On obtient :

x
X k
k
c

z
x
x
0 x
X k
x
dk e e
L k
L k sin
L E 2
2
1
dk e ) Z , k ( E
2
1
) Z , X ( E
x
2
x
2
2
x
i
i
i

+

=
(4.12)
60

o ( )
2
x
2
z y x
k k k , 0 k , k k = = =
r
vrifie la condition de propagation k
2
=
2
/c
2
.

Comme le montre lintervalle dintgration de lq. 4.12, ce champ contient deux
contributions :
- une partie homogne correspondant lintgration de k
x
sur lintervalle [/c,+/c].
- une partie vanescente correspondant au reste de lintgration.

Le point essentiel en ce qui nous concerne est de noter que les valeurs de k
x
vanescentes ne
sont plus limites :

c
n k
c
x

(4.13)

comme dans londe vanescente de Fresnel associe la rflexion totale de la lumire, mais
occupent thoriquement tout l'intervalle :

+

x
k
c
(4.14)

En pratique cependant, la fonction sinus cardinal sin
c
=
L k
L k sin
x
x
rduit cet intervalle en
ramenant lintgration dans un intervalle dont les bornes sont dfinies par :

L
k L k
x x

= = (4.15)

On en dduit :

- que des ondes vanescentes diffractes apparaissent ds que k
x
= /L > /c = 2/.
nous retrouvons l le critre de Rayleigh L < /2.
- que plus L est petit plus la partie vanescente du spectre est importante et surtout,
- que plus L est petit plus les valeurs de k
x
sont grandes.

Ainsi chaque "objet" sur la surface diffracte la fois des ondes homognes et des ondes
vanescentes, la partie vanescente de son spectre de diffraction tant d'autant plus importante
que ses dimensions sont petites. Comme les ondes vanescentes ne vrifient pas la condition
de propagation, ces ondes restent en quelque sorte piges sur la surface.

Ces ondes auront une profondeur de pntration beaucoup plus faible que l'onde de Fresnel et
leur dtection ncessitera l'emploi d'une sonde capable d'aller les capter presque en contact
avec la surface de l'objet. De faon plus prcise, nous avons vu que lamplitude dune onde
vanescente dcrot de faon exponentielle lorsquon sloigne de lobjet. Lcriture de leur
composante k
z
permet de dterminer la distance laquelle le dtecteur va devoir sapprocher :

2
2
2
x
2
x 2
2
z
c
k k
c
k

=

= i (4.16)

61
Ainsi, daprs lq. 4.16, k
z
est d'autant plus grand que k
x
est grand ce qui signifie que
lamplitude des ondes associes chaque frquence "vanescente" dcrot donc d'autant plus
rapidement que k
x
est grand. Les informations concernant les dtails les plus fins restent donc
confines le plus prs de la surface et la rsolution pourra tre dautant plus grande que le
dtecteur pourra sapprocher plus prs de lobjet. C'est sur le principe de la dtection de ces
ondes qu'est base la microscopie tunnel optique (STOM), mais on conoit aussi la difficult
de raliser un microscope optique champ proche.

La microscopie optique en champ proche

Les dveloppements technologiques ont cependant permis de telles ralisations. Une question
pourrait se pose cependant : si londe vanescente ne vrifie pas les conditions de
propagation, comment peut-elle tre rcupre par une fibre optique ? La rponse cette
question tient dans le principe du retour inverse de la lumire : si un objet sub-longueur
d'onde peut transformer par diffraction une onde progressive en ondes vanescentes, il peut,
de la mme faon, transformer par diffraction des ondes vanescentes en ondes progressives.

Ainsi, en plongeant une pointe sub-longueur d'onde dans le champ proche de l'objet observ,
les ondes vanescentes prsentes sur sa surface vont tre partiellement transformes en ondes
progressives. Le signal rsultant de ce processus de double diffraction sera constitu, en
grande partie, d'ondes homognes porteuses d'informations et pouvant se propager, dans l'air
ou dans tout autre guide dilectrique, jusqu'au dtecteur.

Comme lamplitude de ces ondes dcrot exponentiellement avec la distance d'analyse, les
informations qu'elles contiennent ne peuvent pas tre dtectes en champ lointain. Les
informations relatives aux dtails de l'objet devant tre captes sur leurs lieux d'existence, le
dtecteur doit avoir une dimension nanomtrique et pouvoir dtecter les photons. Cette
dernire remarque montre que la rsolution dun tel microscope, qui dpend de la distance
pointe-objet, dpend aussi de la dimension de lextrmit de la fibre optique : plus celle-ci
sera petite, plus son pouvoir de rcupration dondes vanescentes de trs grands vecteurs
donde sera grand et plus la rsolution pourra donc tre importante. Elle ne sera plus limite
que par la dimension de la sonde.


4.2- Principales configurations

Les diffrents types de microscopes optiques en champ proche balayage se
distinguent par les modes opratoires utiliss pour raliser lillumination ou de collecte de la
lumire trs prs de la surface de lchantillon.

La technique la plus commune consiste utiliser des sondes ouverture (trou ou fibre
optique) pour amener ou collecter la lumire sur la surface. Les principales configurations
sont rsumes sur la figure 4.5.

62


Figure 4.5 : Diffrentes configurations pour une microscopie optique en champ proche.

La sonde ouverture pour une microscopie en transmission peut tre utilise soit pour
lillumination (Fig. 4.5a), soit pour la collection (Fig. 4.5b) de lumire. Cependant, cette
mthode ne peut sutiliser avec des chantillons opaques pour lesquels il faut travailler en
rflexion (Fig. 4.5c). La lumire rflchie peut tre collecte par une optique proche de la
sonde ou par la fibre elle-mme, auquel cas, ce sont des fibres non mtallises qui sont
utilises.

Une approche diffrente est choisie avec la configuration 4.5d o des ondes vanescentes sont
cres sur la surface de lchantillon par une illumination oblique en champ lointain. La
pointe de la sonde agit alors comme un lment diffuseur du champ vanescent, conduisant
la formation dondes homognes qui peuvent tre dtectes. Si cette configuration est
relativement facile mettre en uvre, linterprtation des signaux nest cependant pas
vidente. Larrangement dans lequel le chemin de la lumire est invers est dun grand intrt.
Comme dans le cas prcdent, la lumire peut tre diffuse du champ vanescent par une
autre pointe de sonde comme la pointe dun microscope force atomique (Fig. 4.5e). Enfin,
dans la dernire configuration 4.5f, un film mtallique est dpos sur la surface de
lchantillon et des plasmons de surface sont gnrs par la pointe dune sonde. Ces deux
dernires approches constituent des techniques de microscopie champ proche optique sans
ouverture.

La figure 4.6 rsume les caractristiques dun microscope optique sonde locale.

63


Figure 4.6 : Les diffrents types de microscopes optiques sonde locale.

L'clairage de l'objet pouvant tre ralis de plusieurs faons, chaque type d'clairage (Fig.
4.6 a, b, c ou d) va dfinir une variante de ce microscope dont nous indiquons les
dnominations habituellement utilises :

* le STOM ( Scanning Tunneling Optical Microscope ) aussi appel PSTM
( Photon Scanning Tunneling Microscope ) est caractris par un clairage en rflexion
totale par transmission (Fig. 4.6a). Destin aux objets optiquement transparents, il s'est
impos dans les laboratoires en raison de la dcroissance exponentielle de l'intensit
lumineuse au-dessus de l'objet avec la distance qui le spare de la sonde. Le rapport signal sur
bruit en est positivement affect.

* le SNOM ( Scanning Near-field Optical Microscope ) peut fonctionner soit avec
un clairage en rflexion externe o la sonde joue le rle de pointe dtectrice et mettrice la
fois (Fig. 4.6b), soit en clairant directement l'objet en rflexion sous incidence oblique (Fig.
4.6c). Il permet d'analyser tout type d'objet, transparent ou non, et il prsente l'avantage d'un
clairage isotrope par comparaison au STOM.

* le NSOM ( Near-field Scanning Optical Microscope ) travaille en transmission, la
pointe claire l'objet, elle joue ici le rle d'metteur seulement (Fig. 4.6d). Dans ce cas la
dtection s'effectue en champ lointain en utilisant une lentille collectrice.

De par le retour inverse de la lumire, tous ces microscopes peuvent travailler en inversant le
sens d'clairage. Seul le SNOM est parfaitement symtrique.

On peut aussi citer deux techniques de microscopie en champ proche sans ouverture. Il sagit
du i-PSTM ou Tunnel Near-Field Optical Microscope (TNOM) ou encore du microscope
champ proche optique en lumire interdite. Citons enfin, le Plasmon Near-Field Microscope
64
dans lequel les ondes de surface sont exacerbes par le dpt dun film mtallique et la
gnration de plasmons de surface.

L'lment essentiel d'un microscope en champ proche est la sonde. Le type de sonde le plus
couramment utilis est une fibre optique taille en pointe fine.

Le dplacement de la sonde au-dessus de l'objet est assur l'aide de translateurs pizo-
lectriques. Des surfaces de balayage allant de quelques nanomtres carrs quelques
centaines de microns carrs sont ainsi obtenues. Les vitesses de balayage peuvent tre assez
importantes : une image de 128x128 points correspondant une surface de l'objet de quelques
nanomtres est rgulirement effectue en moins d'une minute. L'incertitude en z du
dplacement de la fibre qui doit tre de quelques picomtres seulement dpend
essentiellement de la qualit de l'lectronique de commande.

Deux modes de dtection sont utiliss en microscopie optique en champ proche. Le premier,
dit altitude constante, consiste balayer la surface de l'objet en gardant la pointe distance
constante d'un plan de rfrence. La sonde dtecte la distribution de l'intensit lumineuse dans
le plan de rfrence au-dessus de l'objet. Le second, dit intensit constante, consiste
asservir, par voie lectronique, l'intensit du signal lumineux dtect sur une valeur de
rfrence. Le signal enregistr est, dans ce cas, la tension lectrique de commande du pizo
qui est directement lie la position en z de la sonde dtectrice. Ce mode de dtection fournit
une topographie des lignes d'iso-intensit lumineuse au-dessus de l'objet.

Nous allons dtailler ces diffrentes configurations et modes opratoires en classant les
microscopes optiques en champ proche en quatre catgories principales :
Les microscopes en transmission travaillant en mission ou collection
Les microscopes en rflexion
Les microscopes en effet tunnel photonique
Les microscopes hybrides

4.2.1 Microscopes en transmission

La figure 4.7 schmatise la configuration de base dun microscope en transmission.



Figure 4.7 : Configuration de base dun microscope champ proche fonctionnant en transmission.

65
Les microscopes en champ proche en transmission peuvent travailler avec une sonde soit
mettrice de lumire, soit collectrice de lumire. En fait les deux configurations ne sont pas
tout fait similaire.

La figure 4.8 rsume les diffrentes approches utilises en microscopie en champ proche par
transmission.



Figure 4.8 : Diffrents types de microscopes en champ proche optique en transmission.

En mission, la pointe de la fibre est utilise comme une nano-source et le champ transmis est
collect en champ lointain. Lavantage de cette mthode est que le champ illumin a une aire
trs rduite, ce qui limine un grand nombre deffets parasites. Cette aire est donne par
lenveloppe de la distribution du champ autour de la pointe. Ce champ est limit quelques
centaines de nanomtres autour de lapex de la pointe et tombe zro ds que la pointe est
loigne de la surface.

A la diffrence, dans les microscopes o la fibre est utilise pour collecter la lumire
transmise, lchantillon est intensment illumin par un faisceau de lumire fortement
focalis. Dans ce cas, laire illumine est celle rsultant de la distribution dun champ de type
gaussien et couvre une extension de quelques dizaine de microns. Pour des objets de taille
sub-micromtrique, on en dduit quils sont uniformment illumins. La consquence d cette
66
illumination non parfaitement locale est le risque deffets non-locaux lis des phnomnes
de propagation sur de longues distances comme par exemple la propagation de plasmons.

Pour des raisons similaires, les deux mthodes ne sont pas quivalentes en ce qui concerne les
problmes de polarisation. En mode collection, il est trs facile de polariser le faisceau de
lumire incidente et la lumire peut tre collecte dans une fibre mono-mode classique. Par
contre, en mode mission, ltat de polarisation lapex de la fibre nest pas simple
dterminer.

4.2.2 Microscopes en rflexion

Les premiers exemples de microscopes en champ proche travaillant en rflexion utilisaient
une petite ouverture dans une film mtallique ou une nano-sphre de polystyrne mtallise
violemment illumine (Fig. 4.9). Dans cette configuration, la particule de polystyrne
remplace la nano-ouverture et joue le rle dune nano-antenne.



Figure 4.9 : Exemples de microscopes en champ proche utilisant soit une petite ouverture, soit une petite bille
comme metteur-collecteur. A gauche, le microscope en rflexion utilise la diffraction travers un petit trou
dun faisceau totalement rflchi lintrieur dune lame de verre. A droite, le microscope utilise la rflexion
sur une bille de polystyrne mtallise.

Une autre technique consiste illumine la surface tudier en rflexion et dtecter le champ
vanescent laide dune sonde (Fig. 4.10b). Inversement, il est possible dilluminer travers
la fibre et de dtecter au moyen dun collecteur appropri (Fig. 4.10c). Le principal dfaut de
la mthode est d lombre produite par la pointe.

On peut aussi utiliser la fibre pour illuminer lchantillon et collecter la lumire rflchie (Fig.
4.10a). Cette technique a quelque ressemblance avec la microscopie confocale. Son principal
avantage est de combiner lillumination locale avec une collection locale de la lumire,
favorisant les rayons se propageant le long de laxe de la pointe.

Une autre configuration consiste dtecter le champ proche gnr en illuminant lchantillon
en rflexion et en dtectant le champ diffus par lexcitation dune pointe au moyen dun
collecteur adapt (Fig. 4.10d). La pointe joue le rle dun lment perturbateur du champ
vanescent et ces microscopes sont appels microscopes sans ouverture.

Dautres configurations similaires sont montres sur les figures 4.10e et 4.10f. Utilisant des
pointes mtalliques ou en tous cas opaques puis quelle ne servent pas vhiculer la lumire,
ces microscopes sans ouverture peuvent utiliser les mmes technologies que celles
67
dveloppes pour les microscopes effet tunnel lectronique (STM) ou force atomique
(AFM). Par cette approche, les meilleures rsolutions spatiales ont pu tre dmontres.


Figure 4.10 : Diffrents types de microscopes en champ proche optique en rflexion.

4.2.3 Microscopes effet tunnel photonique

En fait, cest la technique la plus ancienne exprimente dans les annes 1960. Son principe
est prsent dans la figure 4.11.



Figure 4.11 : Frustration de la rflexion totale interne lintrieur dun prisme par une surface ondule
(exprience des deux prismes de Newton).

68
De ltude des ondes vanescentes, nous savons que la frustration de la rflexion totale est
fortement dpendante de la distance la surface. En consquence, si la surface dun
chantillon est ondule, les parties les plus hautes frustreront la rflexion totale alors que les
parties les plus basses ne pourront pas le faire. Le champ rsultant sera comme une sorte
dempreinte de la topographie de la surface.

La configuration de Guerra dcrite sur la figure 4.12 est une variante moderne des premiers
microscopes effet tunnel photonique.



Figure 4.12 : Configuration de Guerra. Une lentille hmisphrique (gnralement la lentille frontale dun
objectif de microscope) remplace le prisme habituel.

Microscopes effet tunnel optique balayage STOM ou PSTM

Cette technique exploite le fait quun faisceau tombant sur un prisme peut tre totalement
rflchi lintrieur, gnrant une onde vanescente. Cette rflexion interne est utilise
comme un moyen particulier dillumination comme montr sur la figure 4.13.



Figure 4.13 : Diffrentes configurations de montages en champ proche utilisant la rflexion interne.
69
On remarquera la ressemblance du dispositif utilis en (a) avec le montage imagin par A. Cotton pour son
ultramicroscope en 1905.

Lintrt de cette approche est que le champ vanescent ne se propageant pas, il ne peut
perturber le signal utile pendant lenregistrement. En plus, elle offre une possibilit de
contrler la position de la pointe par rapport la surface en utilisant la dcroissance
exponentielle du champ vanescent. Malheureusement, en travaillant de cette faon, la
manire dun microscope a effet tunnel lectronique, il est difficile de maintenir une
rsolution sub-longueur donde comme espr.

La figure 4.14 montre quelques variantes de configurations STOM/PSTM. La figure 4.14c
montre une version o un clairage isotrope symtrie de rvolution autour dun axe vertical
amliore lillumination oblique.



Figure 4.14 : Quelques configurations de microscopes STOM/PSTM.


Microscopes STOM/PSTM invers : le i-PSTM ou TNOM

Une nouvelle configuration a t imagine o lon inverse le sens de cheminement de la
lumire par rapport la configuration STOM. Elle peut tre considre comme une variante
de la microscopie en champ proche en transmission. Son intrt rside dans sa capacit
70
dtecter ce que certains auteurs appellent la lumire interdite qui correspond la lumire
diffuse par les protubrances dun petit objet.


4.2.4 Microscopes en champ proche plasmons de surface

Les plasmons de surface sont les modes propres d'une interface mtallique. Optiquement,
l'excitation d'un plasmon de surface peut tre obtenue par diffrentes configurations.

La premire configuration dite de Kretschmann-Raether consiste dposer un film mtallique
sur un dilectrique et clairer l'interface avec une lumire polarise TM (transverse
magntique) en rflexion totale comme reprsent sur la figure 4.15.



Figure 4.15 : Principe de la dtection de plasmons de surface en combinant le STOM avec la configuration de
Kretschmann-Raether. Le film mtallique est souvent un film dargent ou dor.

Le plasmon de surface est obtenu lorsque la composante tangentielle du vecteur d'onde
associ au faisceau incident est gale celle du mode propre du plasmon. L'intensit du
plasmon dcrot exponentiellement lorsqu'on s'loigne de l'interface. La lumire est confine
sur l'interface et la prsence d'un dfaut (topographique ou d'indice) peut fortement modifier
sa distribution d'intensit. La dtection en champ proche de ces plasmons de surface apparat
donc comme un moyen potentiel d'imagerie super-rsolvante.

La dtection de tels plasmons de surface gnrs par un faisceau gaussien "quasiment
polaris" peut tre modlise en considrant un faisceau gaussien 3D et une dtection en
champ proche. Le faisceau gaussien incident est dcompos en ondes planes et le calcul des
champs transmis et rflchis est effectu l'aide d'une mthode matricielle.

71


Figure 4.16 : Schma du montage utilis pour la modlisation de la dtection de plasmons.

On considre un faisceau gaussien incident sur une interface sparant un dilectrique d'indice
n = 2,123 d'une couche d'aluminium dindice n = -17,9 + i.0,7 et d'paisseur 53 nm (Fig.
4.16). Le faisceau de longueur d'onde gale 632,8 nm (laser HeNe) est focalis sur
linterface o son waist est de 7,9 m. L'angle d'incidence 44,97 est celui qui
correspond la gnration du plasmon de surface la mme longueur d'onde.

Le rsultat de la simulation est montr sur la figure 4.17.



Figure 4.17 : Simulation en 3D du comportement de plasmons dans diffrentes situations. A gauche, la face du
prisme est nue. Au milieu, la face du prisme est recouverte dun film dargent et on considre le mode TM. A
droite, la face du prisme est mtallise et on considre le mode TE.

Le faisceau incident est suppos polaris TM et la figure 4.17a montre l'intensit lumineuse
dtecte en champ proche dans le cas o le mtal est absent. La figure 4.17b prsente la
distribution de l'intensit lumineuse dans le cas o la surface du prisme est mtallise et o le
plasmon de surface est excit par une onde incidente polarise TM. Dans le cas d'un faisceau
incident polaris TE (Fig. 4.17c), deux faibles rsonances plasmons existent sur les ailes du
faisceau. Ceci est d au fait qu'un faisceau gaussien ne peut pas tre strictement polaris et
que des termes TM apparaissent sur les ailes et conduisent une faible rsonance. On notera
la diffrence entre les valeurs des maximums d'intensit dans les trois cas.

La figure 4.18 prsente l'intensit du champ lectromagntique dans chaque couche. Z<0 est
le dilectrique (faisceaux incident et rflchi), le mtal est situ entre Z=0 et Z=53 nm et le
vide pour Z>53 nm. A gauche, le faisceau incident est polaris en TM et la rsonance
plasmon apparat clairement l'interface dilectrique-mtal, le faisceau rflchi est trs faible
par rapport au faisceau incident. A droite, le faisceau incident est polaris en TE et le faisceau
72
rflchi est aussi intense que le faisceau incident. On note que les chelles de l'axe Z et de
l'intensit ne sont pas les mmes dans les trois milieux.



Figure 4.18 : Simulation de la gnration de plasmons en mode TM gauche et en mode TE droite. On note
sue la rsonance est forte seulement en mode TM.

Une deuxime configuration consiste exciter le plasmon de surface directement en champ
proche : la sonde d'un microscope optique en champ proche claire l'objet et le plasmon de
surface est excit, localement, par l'onde vanescente dont le vecteur d'onde correspond
celui de la rsonance plasmon. La figure 4.19 prsente le schma de principe : un mince film
d'aluminium est dpos sur la surface d'une lentille hmisphrique alors qu'une sonde de
microscope optique en champ proche travaillant en mission, claire la surface mtallique. La
dtection s'effectue en champ lointain (le dtecteur balaye le plan xy).



Figure 4.19 : Excitation du plasmon de surface par une sonde en champ proche. La figure de droite montre la
distribution dintensit.

La partie droite de la figure 4.19 reprsente la distribution d'intensit lumineuse dans ce plan
calcule dans le cadre du modle. Ce rsultat est accord avec ce qui a t obtenu
exprimentalement.

4.2.5 Microscopes hybrides

73
Le fait de combiner diffrentes technique dobservation peut avoir deux intrts : dabord,
rpondre la ncessit de contrler la distance entre la sonde et la surface plus soigneusement
et prcisment, ensuite, permettre dobtenir des informations complmentaires facilitant
linterprtation des images obtenues en champ proche optique.

Microscopes avec contrle de la force de cisaillement ( shear-force control )

La mthode utilisant la force de cisaillement ( shear-force ) sera vue plus en dtail plus
loin. Elle consiste faire osciller la pointe une frquence proche de sa frquence de
rsonance. Lamortissement de la vibration lorsque la pointe sapproche de la surface peut
tre facilement dtect et utilis pour maintenir la pointe une distance constante de la
surface. Cest une technique de contrle purement lectronique qui peut tre adapte la
plupart des configurations. La plupart des microscopes en champ proche utilisent cette
mthode pour le contrle de la distance.

Microscopes en champ proche avec contact

Cest une solution compltement diffrente puisque la pointe touche la surface. Pour viter ou
limiter le risque draflures, la pointe est monte sur un micro-cantilever dont la raideur est
suffisamment petite pour garantir un contact trs doux. Cette technique de contact peut tre
convertie en mode avec tapotement ( tapping mode ) avec laquelle le risque dendommager
la surface de lobjet est grandement rduit. Lavantage est que lon peut utiliser toute la
technologie et llectronique dveloppe pour les microscopes force atomique.


4.3- Structure de base dun microscope SNOM

La figure 4.20 dcrit les trois classes de composants constituant n'importe quel microscope
champ proche.

Les composants optiques sont la source de lumire, gnralement un laser, un
ensemble de composants tels que miroirs, lentilles, objectifs, fibres, polariseurs et un photo-
dtecteur (photomultiplicateur ou photodiode avalanche).

Les lments mcaniques sont les diffrents supports pour l'objet, la fibre, les
modules de translation. On dot aussi, rajouter une table anti-vibratoire et ses dispositifs
d'amortissement.

Les composants lectroniques sont constitus par les tages de dtection la fois
pour le signal optique et les signaux de contrle de la distance de la pointe la surface,
l'lectronique de commande du balayage des modules de translation (gnralement des tubes
pizo-lectriques) ou d'autres transducteurs pizo ou mcaniques plus sophistiqus et l'tage
de contrle de la distance compos d'un ensemble d'amplificateurs associ un dispositif
d'asservissement PID (Proportionnel-Diffrentiel-Intgral).

74


Figure 4.20 : Structure typique dun microscope optique en champ proche optique.

4.3.1 Partie mcanique

L'tage de translation

Il existe aujourd'hui des tages de translation en xy ou xyz qui combinent des dispositifs
base de systme vis-crou diffrentiel et des modules pizo-lectriques. Cependant, la
technique reposant sur l'utilisation d'un simple tube pizo-lectrique demeure une excellente
solution, la fois bon march, efficace et prcise.

L'effet pizo-lectrique est la capacit de certains matriaux de se contracter ou de se dilater
sous l'influence dun champ lectrique. L'effet pizo-lectrique est rversible ce qui signifie
que, lorsque une partie d'un matriau pizo-lectrique est courbe, comprim ou tire, des
charges apparaissent sa surface gnrant un champ lectrique apprciable (on connat
l'application aux allumes-gaz ou aux briquets). Remarquons que bien que la relation entre le
champ et la dformation ne soit pas linaire, il est possible de gnrer des dplaceme,nts sub-
nanomtriques en appliquant simplement des champs lectriques tout fait modestes.
Finalement, les temps de rponse sont gnralement de loin bien plus rap^de que les temps
ncessaires un balayage. Ainsi, ce sont des matriaux idaux pour le dplacement aux
prcisions nanomtriques ncessaire pour n'importe quel microscope champ proche.

La plupart des cristaux pizo-lectriques sont des matriaux ferro-lectriques comme par
exemple le titanate de baryum (BaTiO
3
) et plusieurs autres sels (titanates, zirconates,
stannates) avec la structure cristalline de la provskite. Le compos le plus connu est
75
certainement le PZT (titanate zirconate de plomb, PbTiO
3
ZrO
4
). Il est caractris par 4
constantes qui sont interdpendantes. La plus importante (pour la ralisation d'tage de
translation est la constante de charge d
ji
qui est le rapport de la densit de charge
charge
sur
l'lectrode normale l'axe i la contrainte applique le long de l'axe j sous champ E
0

constant.

(
(

=
0
E
j
e arg ch
ij
d en Cb.N
-1

(4.17)

On peut aussi dfinir le rapport inverse entre la contrainte relative
j
le long de l'axe j au
champ lectrique E
i
le long de l'axe i contrainte
0
constante.

(
(

0
i
j
ij
E
d en mV
-1

(4.18)

La tableau 4.1 rassemble les paramtres utiles pour une cramique PZT P160 de la socit
Quartz & Silice .

Paramtres Symboles Units Valeurs typiques
Modules dYoung Y
D
33
10
9
Nm
-2
90
Coefficient de Poisson E - 0,3
Temprature de Curie - C 340
Rsistivit - 10
10
m 1
Constante de charge
d
33

d
31

10
-12
mV
-1

10
-12
mV
-1

400
-175
Champ lectrique
maximal
- Vmm
-1
800

Tableau 4.1 : Caractristiques de la cramique pizo-lectrique P160 de Quartz & Silice.

Les tubes pizo-lectriques

Les tubes pizo-lectriques ont gnralement quelques centimtres de long. Leur paisseur est
entre 0,6 et 1 mm et leur diamtre varie de 5 mm quelques centimtres. Les composants
pizo-lectriques sont mtalliss l'intrieur et l'extrieur du tube. Le paramtre responsable
de l'expansion du tube est d
31
. Ainsi, l'longation L d'un tube de longueur L et d'paisseur e
auquel on applique une tension V sera donn par :

e
VL
d L
31
= (4.19)

76
Par exemple, si V= -50 V, e = 1 mm, L = 3 cm et d31=-175, l'longation peut atteindre DL =
262 nm.

Les lectrodes mtalliques dposes sur les tubes pizo-lectriques utiliss en champ proche
sont divises en 4 secteurs le long de laxe de symtrie du tube. Des tensions diffrentes
peuvent tre appliques chacune delles. La figure 4.21 montre ce qui se passe dans ce cas.



Figure 4.21 : Courbure de tubes PZT selon les tensions appliques aux quatre segments. La dilatation
dpendant de la longueur du tube, elles peuvent tre combines et excites comme montr en (c) et (d).

Par exemple, sur la figure 4.21a, quand deux tensions diffrentes sont appliques deux
lectrodes opposes, le tube va se contracter dun ct et se dilater de lautre. Le rsultat
global sera une courbure du tube.

Le problme des modules pizo-lectriques est quils ne sont pas exempts dhystrsis et que
ce dfaut doit tre corrig par un contrle lectronique sophistiqu.


4.4- Nano-collecteurs et nano-metteurs

Il est dsormais clair que les hautes frquences spatiales de lobjet sont codes dans la partie
non rayonnante du champ proche. Le nano-collecteur ou le nano-metteur est donc la partie
cruciale dun microscope en champ proche. Cependant, la conception et la ralisation de ces
nano-sondes sont loin dtre standardises.

4.4.1 Diffrents concepts de nano-collecteurs

La figure 4.22 illustre diffrents concepts de nano-sondes o le nano-collecteur/meteur peut
tre un lment diffusant, un cne mtallique ou dilectrique ou une minuscule ouverture de
quelques dizaine e nanomtres perce lextrmit dune fibre mtallise.

77


Figure 4.22 : Trois concepts de nano-collecteurs. A gauche, avec un centre diffuseur, au milieu, avec une pointe
dilectrique, droite avec une ouverture lextrmit dune fibre mtallise.

Lide dutiliser une molcule fluorescente unique fixe lextrmit dune fibre t mise
mais na pas encore abouti. Les structures dendrimres sont envisages pour russir une telle
performance.

4.4.2 Fabrication des pointes

Deux mthodes sont prfrentiellement utilises pour mettre en forme lextrmit des fibres
utilise dans les microscopes en champ proche : la mthode chimique et la mthode thermo-
mcanique.

La mthode chimique utilise lrosion chimique par attaque acide de lextrmit de la fibre.
La fibre plonge dans une solution dacide fluorhydrique dont la concentration, la temprature,
le temps dexposition ont t pralablement dfinis (Fig. 4.23).


(a) (b) (c)

Figure 4.23 : Ralisation dune pointe par rosion chimique de lextrmit de la fibre de verre dans une solution
dacide fluorhydrique. (a) Lacide peut monter le long de la fibre par capillarit. (b) Lutilisation dun film
dhuile empche la capillarit. (c) Un tube de cramique protge la fibre.

La mthode thermo-mcanique consiste chauffer la fibre jusqu une temprature proche de
la temprature de transition vitreuse o la fibre est ramollie et ltirer progressivement
jusqu sa rupture. Le chauffage peut tre ralis par un chalumeau ou par un faisceau laser. A
cet usage, on utilise souvent un faisceau de laser CO
2
10,6 m.

La figure 4.24 montre les diffrences que lon peut observer entre deux fibres produit par
lune ou lautre mthode. On remarque que lextrmit de la fibre mise en forme par
chauffage/tirage est bien plus sphrique que dans le cas de lattaque chimique, ce qui peut
78
tre attribu la rorganisation des atomes lextrmit aprs la cassure alors que la fibre est
encore chaude.


(a) (b)

Figure 4.24 : Mise en forma de lextrmit dune fibre par rosion chimique lacide fluorhydrique en (a) ou
par chauffage/tirage en (b).

Lavantage de la mthode chimique est de ne pas affecter le cur de la fibre par o la lumire
est guide. En outre, elle permet de raliser des extrmits (apex) extrmement fines. Par
contre, la ralisation dune pointe peut tre longue et la mthode manque aussi de fiabilit
dans la rptition de pointes identiques.


(a) (b)

Figure 4.25 : Forme typique dune pointe de fibre obtenue en combinant le prformage par chauffage/tirage et
une brve tape drosion chimique en (a). On notera lillumination de la pointe sur limage (b).

La combinaison des deux mthodes est souvent une bonne ide comme illustr dans la figure
4.25 o un prformage est effectu par chauffage tirage, puis une mise en forme finale par
attaque chimique.

Selon la configuration du microscope, la fibre doit tre mtallise. La figure 4.26 rsume
lensemble des tapes raliser. La mtallisation de la fibre peut se faire par des mthodes
conventionnelles de dpt sous vide. Lpaisseur de la couche mtallique, le plus souvent
dargent, dor, daluminium ou de chrome nexcde pas 50 nm. Ltape finale dlicate
consiste percer une ouverture aussi petite que possible lextrmit de la fibre pour
permettre le passage de la lumire.

79


Figure 4.26 : A gauche, le principe de la mthode par chauffage/tirage est schmatis. A droite, on dtaille la
mthode par attaque chimique et de mtallisation par dpt sous vide.

Une vue de dessus de louverture perce dans le film mtallique dune fibre mtallise est
montre sur la figure 4.27.



Figure 4.27 : Vue de dessus de louverture de 100 nm perce lextrmit dune fibre mtallise.

Il va sans dire que ces fibres sont fragiles et que la matrise de leur fabrication est un atout
important pour garantir la qualit dobservation et la rsolution dun microscope en champ
proche.

4.4.3 Contrle de la distance la surface

Aprs la technique de fabrication de pointes de fibre, cest lautre problme crucial rsoudre
pour matriser la microscopie en champ proche.

Les deux techniques principales de contrle de la distance sont le contrle optique et le
contrle par la force de cisaillement ( shear-force en anglais).

Contrle optique

80
Cette technique est utilisable dans les microscopes du type STOM/PSTM parce que dans cette
configuration, le champ moyen vanescent dcrot exponentiellement. Elle est cependant
limite aux matriaux qui nont que de petites irrgularits topographiques et/ou variations de
rflectivit.



Figure 4.28 : Contrle optique de la distance. (a) dans la configuration dun STOM/PSTM. (b) dans un
microscope en rflexion utilisant une cavit ente la pointe et la surface. (c) En utilisant la rflexion sur
lchantillon.

Technique shear-force

Cest le procd le plus utilis pour contrler la distance. Il fut propos la premire fois par
Betzig et al. et par Toledo-Crow et al. en 1992 (Fig. 4.29). Ils ont observ la sensibilit de
lamortissement de lamplitude de vibration de la fibre excite une frquence voisine de sa
frquence de rsonance lorsque la fibre sapproche quelques nanomtres de la surface.



Figure 4.29 : Les deux premires mthodes de contrle par shear-force .

81
La mthode actuelle est purement lectronique. Elle exploite loscillation dun composant
pizo-lectrique rsonnant comme un bilame ou un diapason. Le diapason est gnralement
coll la fibre (Fig. 4.30).



Figure 4.30 : Mesures lectroniques d la force de cisaillement en utilisant un diapason commercial ou artisanal.
Le diapason peut servir de dtecteur seulement ou de gnrateur/dtecteur. La photographie de droite montre la
fibre illumine colle au diapason.

La fibre est excite soit de faon externe par un petit composant pizo-lectrique, soit en
intgrant le diapason dans un dispositif lectronique rsonnant. Lintrt principal est de
pouvoir fabriquer des ttes de microscopes trs compactes et autonomes.


4.5- Traitement des images

Lacquisition dune image laide dun microscope champ proche optique est soumise de
nombreuses perturbations qui peuvent venir des imperfections de linstrument comme les
dfauts de linarit dans les dplacements de la pointe ou plus gnralement des bruits
lectroniques et/ou optiques.

Les distorsions linaires sont gnralement faciles corriger ds lors quelles auront t
correctement identifies. Lenregistrement dchantillons tests constitu de rseaux de traits
peut aider identifier le problme et introduire les corrections ncessaires par un traitement
informatique appropri.

4.5.1 Filtrage par transformation de Fourier

Cest une technique bien connue en traitement du signal ou dimages. Elle permet la rduction
ou llimination de bruits priodiques. En calculant le spectre transforme de Fourier de
limage, un bruit priodique sidentifiera par une bande de frquence parasite troite (Fig.
4.31).
82


Figure 4.31 : Principe du filtrage de Fourier. Le spectre de limage pollue par un bruit priodique fait
apparatre des bandes latrales symtriques qui peuvent tre limines par un procd de masquage.

La figure 4.33 montre la puissance de la mthode de filtrage de Fourier liminer un bruit
priodique. Un tel procd nest cependant vraiment efficace que dans le cas de bruits additifs
qui nimpliquent pas une interaction forte avec linformation extraire.


(a) (b)

(c) (d)

Figure 4.32 : Autre illustration du filtrage de Fourier. (a) Image brute de la surface dun CDROM perturbe
par du bruit. (b) Spectre de Fourier de limage brute. (c) Multiplication du spectre de Fourier par un masque
rectangulaire. (d) Image obtenue aprs traitement et transforme de Fourier inverse.

Au-del des mthodes de traitement dimages qui, grce aux dveloppement des moyens
informatiques existent en grand nombre, la question importante de ce type de microscopie
reste linterprtation correcte des images.


83
84
5- Dveloppements actuels

Les dveloppements actuels de la microscopie moderne vont de pair avec celui des nano-
sciences et des nano-technologies. Cest l un vaste champ de recherches qui ne peut tre
abord dans ce cours. Nous nous limitons volontairement deux aspects qui concernent les
applications la biologie et ltude du comportement de molcules individuelles.

5.1- Microscopie de fluorescence multi-photonique

La microscopie de fluorescence permet d'examiner des prparations qui sont fluorescentes par
elles-mmes ou qui ont t imprgnes (on dit marques) avec des colorants fluorescents. De
nombreuses prparations soumises une radiation ultraviolette re-mettent de la lumire des
longueurs donde plus grande dans le visible du violet au rouge. Avec les microscopes actuels
travaillant en pi-fluorescence, la lumire d'excitation arrive sur la prparation par l'objectif.
Dans cette configuration, l'objectif joue galement la fonction du condenseur (Fig. 5.1).




Figure 5.1 : Schma dun microscope de fluorescence par pi-illumination. La source lumineuse est dporte
sur le ct et est constitue par une lampe offrant un spectre de longueur d'onde tendu vers les UV. Un filtre
d'excitation permet de slectionner une bande de longueur d'onde adapte au fluorochrome visualiser. Un
miroir dichroque rflchit la lumire d'excitation vers l'objectif qui joue ici le rle de condenseur. La
fluorescence mise est collecte par l'objectif et va traverser le miroir dichroque. Un filtre d'arrt permet de
slectionner la longueur d'onde d'mission du fluorochrome.

Un miroir dichroque dirige la lumire excitatrice de courte longueur d'onde sur la prparation
travers l'objectif. La lumire mise, de longueur d'onde plus leve (fluorescence) n'est pas
rflchie par le miroir dichroque. Des filtres d'arrt empchent la lumire excitatrice de
pntrer dans l'oculaire ou datteindre le dtecteur.

La microscopie de fluorescence occupe une place de choix depuis quelques annes dans le
diagnostic mdical et il est probable qu'elle va se dvelopper pour l'analyse des denres
alimentaires. C'est ainsi que l'on recherche des protines spcifiques et d'autres substances par
immunofluorescence. C'est la mthode dite "indirecte" qui est la plus employe. Un anticorps
spcifique non fluorescent, par exemple de lapin, ragit tout d'abord avec les sites
85
antigniques de la prparation puis est rvl avec des anticorps anti-immunoglobuline
fluorescents de lapin. Les applications possibles dans l'analyse des denres alimentaires
permettent l'identification immunologique des microorganismes et des farines base sur les
protines spcifiques. L'immunofluorescence est une mthode relativement simple pour la
dtection de faibles quantits de substances.

Les dveloppements rcents utilisent lexcitation bi-photonique et plus gnralement multi-
photonique. Les avantages sont que lintensit se fait une grande longueur donde, le plus
souvent voisine de 800 nm (laser dexcitation saphir dop au titane). A cette longueur
donde, la lumire pntre facilement les prparations biologiques, sans avoir de
consquences cytotoxiques ou de blanchiment. Labsorption bi-photonique tant
proportionnelle au carr de lintensit dexcitation, le volume dexcitation est bien mieux
dfini quen excitation un seul photon (Fig. 5.2).



Figure 5.2 : Illustration de lexcitation en mode 1 photon avec un laser argon 514 nm et en mode 2
photons avec un laser saphir dop titane 800 nm.

En mode bi-photonique, le microscope de fluorescence se comporte comme un microscope
confocal dans lequel liris confocal nest plus ncessaire.

Lefficacit de labsorption multiphotonique est accrue avec lutilisation dimpulsions lasers
ultra brves, et de ce point de vue le laser femtoseconde saphir dop au titane constitue la
source dexcitation de choix. La technique de microscopie multiphotonique se prte donc
aussi la mesure des dures de vie de fluorescence de fluorochromes dans diffrents
environnements.

On visitera avec intrt le site :

http://confocal.medecine.uhp-nancy.fr/bouton2/microscopie-multiphoton.html

ou des sites similaires pour y rechercher des exemples dapplication en biologie vgtale,
animale et humaine notamment.


5.2- Microscopie dobjets individuels

86
Nous nous limitons montrer un exemple particulier o lon combine de loptique non-
linaire, lutilisation de sources lasers ultra-brves et la microscopie confocale.

Loptique non linaire sintroduit ici avec le phnomne Raman stimul exacerb par les
effets de surface (Surface Enhanced Raman Scattering SERS).

Ce phnomne a t observ par hasard en 1974 par Fleischman, Hendra et McQuillan sur des
signaux Raman de pyridine adsorbe sur des lectrodes grossires dargent. Ils attriburent
leffet daugmentation de lintensit Raman un effet de surface. En ralit, on dmontra
ensuite que bien plus quun effet de surface, le SERS est un effet associ des nano-objets
essentiellement mtalliques comme des particules collodales dor ou dargent, dans lesquelles
lexcitation de modes de rsonance plasmon contribuent efficacement.

Le rsultat remarquable est qualors que le phnomne Raman spontan est un effet non-
linaire du troisime ordre, donc de faible efficacit avec des sections efficaces de lordre de
10
-30
cm
2
, le gain associ au SERS peut atteindre 10
10
10
14
, permettant la dtection Raman
et du spectre Raman complet de molcules ou de nano-objets individuels.

La figure 5.3 reprsente le schma dune exprience de spectroscopie Raman utilisant un
microscope confocal associ un spectromtre.



Figure 5.3 : Schma dune exprience de spectroscopie Raman sur des nano-particules.

Pour les applications concernant la biologie, on a recourt des marqueurs non-fluorescent
adsorb sur des particules mtalliques de taille nanomtrique. Ces particules peuvent tre
introduites ou ingres par des cellules vivantes et il sera possible de les localiser trs
prcisment grce au signal SERS. Pour cet effet, les particules collodales dor ou dargent
sont quasiment quivalentes.

87


Figure 5.4 : Spectroscopie Raman haute sensibilit lintrieur de cellules vivantes. A gauche, on montre
limage en microscopie contraste de phase de deux cellules vivantes contenant des particules dor collodal. A
droite, limage SERS des mmes cellules est prsente qui permet de localiser prcisment les particules dor.





Figure 5.5 : Spectres Raman dun chromophore adsorb sur des particules dor lintrieur dune cellule. On
note les changements du spectre selon la localisation des particules.


5.3- Microscopie Raman
5.3.1 Raman de rsonance
5.3.2 Raman exacerb de surface (SERS Surface Enhanced Raman Scattering )

Voir le cours de Spectroscopie Raman.
88
6- Annexe

GLOSSAIRE DE MICROSCOPIE PHOTONIQUE
adapt par S Brown et C Talbot, de Grard Graud, Institut Jacques Monod

Aberration :
Phnomne dun systme optique qui produit une image floue. Un point image est
reprsent par une tache plus ou moins gomtrique suivant le type daberration.

Aberration chromatique :
Phnomne dans lequel les rayons de lumire passant au travers dune lentille
focalisent en diffrents points dpendant des longueurs dondes. Il existe deux types
daberration chromatique : a) axiale, caractrise par une variation de focale suivant la
longueur donde utilise; b) latrale, caractrise par une variation de grandissement
suivant la longueur donde utilise.

Aberration sphrique :
Erreur de convergence des rayons lumineux entre la zone axiale et latrale de la
lentille ou du milieu travers.

Achromatique :
Correction daberration dun systme optique, pour deux longueurs dondes.

Airy :
Image dune source ponctuelle, compose dun disque dintensit maximale (la
premire tche dAiry), entour par une succession danneaux dintensit dgressives.
Cest la reprsentation de la fonction dtalement dun point, Point Spread
Function ou PSF en anglais.

Aliasing :
Motif dune image numrique dont lchantillonnage nest pas correct. Les hautes
frquences spatiales plus grande que la frquence de Nyquist sont progressivement
images comme des basses frquences. Laliasing introduit un indsirable motif
moir quand les frquences spatiales du signal excdent le taux de numrisation du
capteur. Communement, on le constate quand une grande image numrique est
affiche sur un moniteur, un vidoprojecteuretc.

AOBS : Acousto Optical Beam Splitter (filtre dichroque opto-acoustique accordable)
Systme lectro-optique utilis comme un miroir dichroque dans un microscope
permettant lentre dun faisceau laser et en retour la transmission de signaux mis par
lchantillon vers les dtecteurs.

AOTF : Acousto Optical Tunable Filter (filtre opto-acoustique accordable)
Systme lectro-optique qui permet de slectionner une raie laser et den ajuster
lintensit. Ce composant comprend un cristal birfringent de dioxyde de Tellurium
modul par des ondes acoustiques, auquel on a attach un transducteur pizo-
lectrique qui envoie dans le cristal des vibrations acoustiques.

Aplantique :
Systme de lentilles dont la sphricit est corrige pour donner une image plane.
89

Apochromatique :
Systme de lentilles dont la chromaticit et la sphricit sont respectivement corriges
pour trois et deux longueurs dondes (et pas forcment pour tout le spectre visible).

Bertrand : (Lentille de Bertrand)
La lentille de Bertrand place dans le tube du microscope ou la place dun oculaire,
permet dobserver limage forme dans le plan focal arrire de lobjectif.

BiFC : Bimolecular Fluorescence Complementation
Technique base sur la complmentation de deux fragments non fluorescents dune
protine fluorescente, par exemple de la YFP ( Yellow Fluorescent Protein ) avec un
peptide espaceur libre rotation. Chaque fragment est rapporteur dune protine
distincte. Si ces protines interagissent, les deux fragments de la YFP se
complmentent par auto-assemblage et lensemble fluoresce.

Bleaching : (photo-blanchiment)
Destruction irrversible des fluorochromes par une illumination trs intense. En
microcopie confocale, les fluorochromes sont excits par un laser un niveau lev
dnergie, ltat singulet. Quand les molcules retournent leur tat normal dnergie,
un signal fluorescent est mis. Si lintensit dexcitation est trop leve, les molcules
excites passent dun tat singulet un tat triplet et peuvent intragir entre elles
(excimres). La dure de vie des molcules dans ltat triplet tant significativement
plus longue, elles peuvent interagir avec des triplets-oxide et perdent ainsi
dfinitivement leur capacit de fluorescence.

CALI : Chromophore-Assisted Laser Inactivation
Photo-ablation assiste par chromophore : technique mettant en uvre un anticorps
coupl un chromophore telle que la Malachite Green pour reconnatre une protine
spcifique. Suite leffet dun laser, des radicaux libres produits par ce chromophore
inactivent par peroxydation toute protine dans un rayon de quelques dizaines de nm.

Cercle de moindre confusion :
Zone derreurs de focalisation des rayons entrane par les diffrents types
daberrations.

Colocalisation :
Deux objets prsentant des coordones spatiales identiques, dans la limite du pouvoir
rsolutif du systme utilis. Notons que des positions sont rsolues avec plus de
prcision que des volumes.

Confocal :
Un microscope est dit confocal lorsque un point de lchantillon est vu sous le
mme angle par le condenseur et lobjectif.

Contraste de phase :
Technique qui transforme les diffrences dordre de marche (phase) des ondes
lectromagntiques introduites par lchantillon en une diffrence damplitudes
(intensit).

90
Contraste interfrentiel : (Differential Interference Contrast, DIC, Nomarski ou Hoffman)
Technique qui consiste introduire et analyser une diffrence de marche de deux
trains dondes polariss et qui est proportionnelle lpaisseur et aux indices de
rfractions de lchantillon. Il en rsulte un contraste pseudo-topographique ou
pseudo-relief.

Cross-Talk :
Passage dune mission de fluorescence dans un canal de dtection non appropri.

Diaphragme de champ :
Contrle la zone dillumination de lchantillon. Son image doit tre situe, selon les
principes de Khler, dans le plan focal avant de lobjectif.

Dplacement de Stokes : (Stokesshift)
Diffrence spectrale entre le maximum dexcitation ou dabsorption et le maximun
dmission dun fluorochrome.

Epimicroscope : (microscope pi-illumination)
L'objectif dun tel microscope sert la fois illuminer et observer la prparation.
(pi signifie par dessus).

FCS : Fluorescence Correlation Spectroscopy
Technique de spectroscopie mesurant les temps de diffusion des particules
fluorescentes en solution ou dans un volume minime et la corrlation (association) des
diffrentes particules.

Filtres :
- bloc filtre dpi-fluorescence
Jeu de filtres compos typiquement de trois filtres : un filtre dexcitation, un miroir
dichroque diviseur de faisceaux 45 et un filtre dmission.

- filtre dexcitation (orthogonal)
Transmet slectivement une portion du spectre de la source (typiquement dune lampe
mercure) ou supprime quelques raies dun laser.

- miroir dichroque
Sparateur interfrentiel de spectre, conu gnralement pour couper le faisceau
incident 45. Il rflchit une lumire et en transmet une autre. Par exemple, dans un
microscope pi-fluorescence, il rflchit la lumire ondes courtes slectionne par
le filtre dexcitation et lenvoie sur lchantillon. En retour, il transmet la fluorescence
( ondes plus longues) mise par lchantillon vers le filtre dmission.

- filtre dmission (orthogonal)
Arrte slectivement toutes les lumires dues des rflexions parasites ou dautres
fluorophores et laisse passer une slection de la lumire mise par lchantillon.

- filtre Band-Pass BP (filtre passe-bande)
Transmet une bande spectrale particulire de la lumire, utilis dans les cas o une
discrimination spectrale est ncessaire. Les filtres passes-bandes caractristique
91
spectrale large sont utiliss pour obtenir une image dintensit et de contraste maximal
tout en maintenant un isolement correct.

- filtre DD (Double Dichroque)
Laisse passer spcifiquement 2 longueurs donde dexcitation.

- filtre TD (Triple Dichroque)
Laisse passer spcifiquement 3 longueurs donde dexcitation.

- filtre Long-Pass LP (filtre passe-haut)
Transmet une large bande de longueurs donde suprieure une valeur spcifie (et si
le filtre est interfrentiel, rflchit les longueurs infrieures vers un autre canal du
systme optique). Utilis quand lapplication requiert la collection du maximum
dmission lorsque la discrimination spectrale nest pas recherche comme dans le cas
de la dtection dun seul signal de fluorescence ou dans le cas de multi-fluorescences
trs bien spares.

- filtre Short-Pass SP (filtre passe-bas)
Transmet une large bande de longueur donde infrieure une valeur spcifie.
Quelquefois utilis en combinaison avec un filtre long-pass (ou passe-haut) pour isoler
une rgion spectrale.

- filtre de discrimination DF (Discriminating Filter)
Filtre d'excitation ou dmission de type passe-bande avec une transition trs raide en
marches descalier comportant une attnuation spciale dnergie prs de la bande
spectrale de transmission.

- KG
Filtre passe-bas dabsorption colorimtrique, transmet une bande spectrale et attnue
les nergies des longueurs dondes infrieures ou suprieures la bande de
transmission.

- MB: Multiband Filter Set
Composition de filtres requits pour exciter et dtecter simultanment, deux, trois et
mme quatre fluorochromes.

- NB : Narrow-Band filter
Dsign pour optimiser le rapport signal sur bruit dans des applications o lisolement
du spectre est plus important que lintensit du signal.

- ND : Neutral Density filter
Filtre dattnuation de lintensit de lumire dans un domaine spectral plat. Le niveau
dattnuation dun filtre est exprim en densit optique (de 0,4 4 DO).

- OG : Orange Glass
Filtre passe-haut, absorbe 99,999% de la lumire bleue.

- RG : Red Glass
Filtre passe-haut, absorbe 99,999% de la lumire bleue + verte.

92
FLIP : Fluorescence Loss In Photobleaching
Technique drive du FRAP la diffrence que le rayonnement laser devant teindre
la fluorescence est mis en continu et non pas sur une courte priode. En consquence
toute particule fluorescente qui entre dans le champ de rayonnement est teinte,
jusqu' extinction complte du compartiment contigu. Cela permet en particulier de
mesurer le volume dun compartiment.

FLIM : Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
Technique dimagerie consistant mesurer sur une chelle de temps variant de la
picoseconde quelques dizaines de nanosecondes la dure de vie de fluorescence ()
des molcules. Cette dure de vie ou dure de vie de ltat excit singulet, est un
paramtre caractristique de ltat physico-chimique de la sonde fluorescente tudie.

FRAP : Fluorescent Recovery (Redistribution) After Photobleaching
Aprs photodestruction du fluorophore, suivi de la rapparition de la fluorescence
grce la communication cellulaire ou la diffusion qui ramne de nouvelles
molcules fluorescentes vers la zone photoblanchie.

FRET : Fluorescence Resonant Energy Transfer
(voir Transfert dEnergie par Rsonance (RET))

Fluorite :
Les objectifs en fluorite sont corrigs au moins pour 3 longueurs dondes pour la
sphricit et pour 3 et plus pour la chromaticit.

Grandissement : (magnification)
Rapport qui dfinit la distance relle entre deux points dans le plan focal de lobjectif
et la distance observe dans loculaire.

FWHMT : Full Width at Half Maximum Transmission
Dfinit la largeur de la bande spectrale transmise par le systme optique. Pour un filtre
passe-bande, elle est rfrence par rapport la transmission prise demi-hauteur du
maximum.

Iris condenseur :
Diaphragme condenseur, plac dans plan focal avant du condenseur. Visible par la
lentille de Bertrand dans le plan arrire de lobjectif. Il ajuste louverture numrique et
la profondeur de champ de la lentille.

Illumination Khler :
Mthode dillumination dcrite par A. Khler, pour laquelle une image de la source est
focalise dans le plan focal avant du condenseur et le diaphragme de champ est
focalis dans le plan de lobjet. Cela permet de minimiser les aberrations, rflections
parasites, lblouissement et lchauffement.

Image intermdiaire :
Situe dans le tube entre les oculaires et le plan arrire de lobjectif.

Immersion : (liquide dimmersion)
93
Liquide occupant lespace entre lobjectif et lchantillon. Un tel liquide est requis
pour des objectifs avec une focale de 3 mm ou moins afin de limiter lincidence des
interfaces entre lchantillon et lobjectif.

Index de rfraction, n :
Lindex ou lindice de rfraction n est la constante de proportionnalit qui est dfinie
par le rapport entre la vitesse de propagation de la lumire dans le vide c et la vitesse
de propagation de la lumire dans un milieu transparent v : n = c / v.Quelques indices :
n
air
1, n
eau
= 1,33, n
verre
= 1,518, n
huile
= 1,515, n
milieu de montage
= 1,3 - 1,5

Iris objectif :
Diaphragme objectif, ajuste louverture numrique et la profondeur de champ de la
lentille.

Longueur de tube : (Optical tube-length)
La distance est mesure entre le plan focal arrire de lobjectif et le plan focal avant
dun oculaire. Typiquement cette distance vaut 160 mm, avant lintroduction
doptiques corrigs linfini .

Moyennage laquisition :
Permet damliorer le rapport signal/bruit : entre 2 et 4 en gnral
- Moyennage par ligne : rapide pour un point donn et donc convient pour les tudes
de vivant, favorise le photo-blanchiment.
- Moyennage par sections : convient pour les tudes de matriel fix.

NLO : Non Linear Optics
Systmes faisant appel dautres ordres de la lumire incidente tels que la
modulation/dmodulation de frquence ou surtout aux lasers impulsionnels pour la
microscopie bi-photonique.

Nyquist : (thorme de Shannon)
Loi dchantillonnage dune image : d/2,3. La taille du pixel doit tre plus petit ou
gale la distance sparant deux points rsoudre d, divise par 2,3.

OD : Optical Density
Unit mesurant la transmission T de la lumire. Conversion : OD = -log
10
(T)
Par exemple, 1% Transmission, 0,01 absolu, ainsi -log
10
(0.01) = OD 2.

ON : Ouverture Numrique (NA, Numerical Aperture)
Ouverture numrique dune lentille. Dfini comme le produit de lindice de rfraction
n du milieu dans lequel est plac lchantillon, par le sinus du demi-angle douverture
de lobjectif : ON = NA = n.sin

Ondes vanescentes : (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence)
A linterface entre deux milieux dindices de rfraction diffrents, un rayon laser
oblique incident sous un angle critique entrane une rflexion totale mais son champ
lectromagntique (ondes vanescentes) peut exciter des fluorochromes sur 100 nm
dans le second milieu.

OTF : Optical Transfer Function (Point Spread Function, PSF)
94
Caractrise pour un systme optique, la fonction de restitution des frquences spatiales
dun objet.

Overlap : (recouvrement)
Chevauchement de deux spectres dmission ou dexcitation de fluorochromes.

Pinhole : (trou daiguille)
Diaphragme de dtection : diaphragme iris sur la plupart des appareils qui permet
dajuster le volume analys. Il joue un rle essentiel dans la rsolution spatiale. Il est
rgl sur la valeur de la tche dAiry pour un objectif donn.

Pixel : (de langlais Picture Element)
Elment de base du format dune image numrise. Chaque pixel exprime un niveau
de gris. Pour un champ donn (x,y) le nombre de pixels dtermine la dfinition de
limage (typiquement 514 x 514 ou 1024 x 1024). Par extension, une srie dimages
sur un volume (x,y,z) est constitu de voxels (Volume Element).

Plan-Apochromatique :
Objectif avec corrections de planit et daberration chromatique pousses.

Plan de champ : (Field plane)
Dans un microscope ajust selon Khler, les diffrents plans de champ sont conjugus
avec lchantillon focalis. Ils incluent donc le plan de lchantillon, le diaphragme de
champ, le plan image intermdiaire et limage sur la rtine ou le capteur.

Profondeur de focalisation : (Depth of focus)
Se rfre la zone en avant et arrire du plan focal image o un point image flou est
plus petit que le cercle de confusion.

Profondeur de champ : (Depth of field)
Cest la distance qui spare, de part et dautre du plan focal objet de la lentille, les
objets qui apparaissent nets. La profondeur de champ varie avec la longueur focale de
la lentille, NA et .

PSF : Point Spread Function (Optical Transfer Function, OTF)
Caractrise pour un systme optique la fonction de restitution des frquences spatiales
dun objet.

Quenching : (dsexcitation)
Tout phnomne qui diminue le rendement quantique dun fluorophore. En termes
lectroniques, on parlera de quenching dynamique (collisions), ou statiques
(complexes), ou distance (rsonance). En termes chimiques, on observe la
photodgradation avec formation dexcimer, transfert de H
+
Inversement la
photostabilit correspond au nombre dexcitations que peut subir une molcule
fluorescente avant dtre dtruite.

Rfraction :
Dviation dun rayon lumineux qui franchit la surface de sparation de deux milieux,
dans lesquels les vitesses de propagation sont diffrentes.

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Rendement quantique :
Rapport du nombre total de photons mis dans tout le spectre d'mission de
fluorescence au nombre de photons reus et absorbs dans la zone spectrale
d'excitation.

Resel :
On appelle ainsi lunit de rsolution pour resolution element .

Rsolution :
La rsolution correspond au pouvoir sparateur, cest--dire la capacit dun systme
optique distinguer deux points distincts. Ernst Abbe (1840-1905) a dfini la
rsolution la limite de diffraction. Deux dtails d'un chantillon spar dune
distance sont rsolus quand louverture numrique (ON) de lobjectif est
suffisamment grande pour capturer le premier ordre de diffraction produit par ces
dtails la longueur donde utilise. La rsolution ou pouvoir sparateur, , dun
objectif de microscope dpend de louverture numrique et se dfinit par : rsolution =
= 0.61 / ON o est la longueur donde. Donc, la rsolution est meilleure (la
plus petite) si est faible et si lOuverture Numrique est grande. Les limites
thoriques du pouvoir sparateur dun microscope se situent autour dune demi-
longueur donde (250 nm) et son grandissement 1000 fois louverture numrique.

Shannon :
(voir Nyquist).

Spectromtre optique :
Systme optique qui transmet une bande spcifique du spectre lectromagntique. La
dispersion des diffrentes longueurs dondes est obtenue par la capacit dun prisme
diffracter la lumire. Systme utilis chez les microscopes confocaux LEICA SP.

TC-SPC : Time Correlated- Single Photon Counting
Imagerie par enregistrement x,y,t de la position et du temps de dtection de chaque
photon. A posteriori, on peut ainsi rejouer les donnes avec des rgions dintrt, des
fentres de temps et des temps dintgration moduls daprs la ractivit observe.

Transfert dnergie par rsonance : Frster Resonant Energy Transfert (RET)
Deux chromophores rapprochs ( 7 nm) ayant un chevauchement du spectre
dmission dun donneur dnergie et du spectre dabsorption dun accepteur dnergie
peuvent, en fonction de lorientation de leurs diples, produire un transfert non radiatif
par rsonance. Dans le cas de fluorophores, Fluorescence Resonant Energy Transfert
(FRET) : on excite le donneur et on observe lmission de laccepteur. Egalement dans
ce cas, la dure de vie du donneur (
f
) diminue. Le FRET permet destimer la distance
entre deux molcules.

Wide-field :
Microscopie champ large, microscopie conventionnelle.

WD : Working distance (distance de travail)
Distance entre la lentille et lobjet focalis, moins lpaisseur de la lame couvre-objet
(normalement de 170 m dpaisseur).

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Bibliographie

[1] M. Born et E. Wolf, Principles of Optics, 6
me
didition, Pergamon Press, Oxford (1995).

[2] B. Rossi, Optics, Addison-Wesley (1957).

[3] J. Surrel, Optique instrumentale, optique de Fourier, Ellipses (1996).

[4] J.W. Goodman, Introduction to Fourier Optics, 2
me
dition, Mc Graw-Hill International
Editions (1996).

[5] The Handbook of Biological Confocal Microscopy, J. Pawley Ed., 2
me
dition, Plenum
Press, New York (1995).

[6] D. Courjon, Near-Field Microscopy and Near-Field Optics, Imperial College Press
(2003).

[7] D. Courjon et C. Bainier, Le champ proche optique : thorie et applications, Springer
(2001).

[8] Biomedical Photonics Handbook, Tuan Vo-Dinh Ed., CRC Press, 2003.

[9] Visitez les sites :
http://www.olympusmicro.com/primer/java/index.html
http://confocal.medecine.uhp-nancy.fr/bouton2/microscopie-multiphoton.html

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