Vous êtes sur la page 1sur 97

Programme PREPA

Mastère « Optique et Photonique, Lasers et Applications »

Universidad de Antioquia

Medellin (Colombia)










Nouvelles microscopies










Jean-Pierre Galaup

Laboratoire Aimé Cotton
Bât. 505, Centre d’Orsay
91405 ORSAY cedex (France)

http://www.lac.u-psud.fr

e-mail : jean-pierre.galaup@lac.u-psud.fr





Mai 2006
2
Plan du cours

1- Introduction
1.1- Histoire de la microscopie
1.2- Principe de la formation des images
1.2.1 Optique géométrique
1.2.2 Diffraction de Fraunhofer
1.2.3 Théorie d’Abbe
1.3- Limite de résolution d’un microscope
1.3.1 Critère de Rayleigh
1.3.2 Ouverture numérique
1.3.3 Aberrations géométriques et chromatiques
1.3.4 Rôle du condenseur
1.4- Performances comparées des microscopies optiques

2- Microscopies photoniques classiques
2.1- Microscopie à fond clair
2.1.1 Conditions d’une bonne observation
La contribution du condenseur
Eclairage de Köhler
Quel grossissement?
2.2- Microscopie à fond noir – Ultramicroscopie
2.2.1 Microscopie à fond noir
2.2.2 Ultramicroscopie
2.3- Microscopie à contraste de phase
2.4- Microscopie en lumière polarisée
2.5- Microscopie à contraste interférentiel différentiel « Nomarski »

3- Microscopies optiques confocales
3.1- Principe
3.2- Formation de l'image confocale
3.2.1 Amélioration de la résolution en microscopie confocale
Résolution axiale en x,y
Résolution radiale en z
3.2.2 Traitement et déconvolution de l’image confocale
3.3- Réalisation d’un microscope confocal
3.3.1 Microscope confocal à balayage laser
3.3.2 Microscope confocal à disque de Nipkow
3.3.3 Description d’un microscope confocal inversé commercial
3.4- Exemples d’applications

4- Microscopies optiques en champ proche
4.1- Ondes évanescentes
4.1.1 Introduction
4.1.2 Les ondes évanescentes de Fresnel
Le vecteur d’onde de l’onde évanescente
3
La polarisation de l'onde évanescente
4.1.3 Quelques conséquences de ces propriétés inhabituelles
Retour sur le problème de la résolution d’un instrument d’optique
Les limites de l’onde évanescente de Fresnel
4.1.4 La diffraction évanescente
La diffraction d’une onde plane
La microscopie optique en champ proche
4.2- Principales configurations
4.2.1 Microscopes en transmission
4.2.2 Microscopes en réflexion
4.2.3 Microscopes à effet tunnel photonique
Microscopes à effet tunnel optique à balayage STOM ou PSTM
Microscopes STOM/PSTM inversé : le i-PSTM ou TNOM
4.2.4 Microscopes en champ proche à plasmons de surface
4.2.5 Microscopes hybrides
Microscopes avec contrôle de la force de cisaillement (« shear-force control »)
Microscopes en champ proche avec contact
4.3- Structure de base d’un microscope SNOM
4.3.1 Partie mécanique
L’étage de translation
Les tubes piézo-électriques
4.4- Nano-collecteurs et nano-émetteurs
4.4.1 Différents concepts de nano-collecteurs
4.4.2 Fabrication des pointes
4.4.3 Contrôle de la distance à la surface
Contrôle optique
Technique « shear-force »
4.5- Traitement des images
4.5.1 Filtrage par transformation de Fourier

5- Développements actuels
5.1- Microscopie de fluorescence multi-photonique
5.2- Microscopie d’objets individuels
5.3- Microscopie Raman
5.3.1 Raman de résonance
5.3.2 Raman exacerbé de surface (SERS « Surface Enhanced Raman Scattering »)

6- Annexe : Glossaire de microscopie photonique

Bibliographie
4
1- Introduction

Depuis son invention au XVII
ème
siècle, le microscope optique est devenu un instrument
d’usage courant indispensable dans beaucoup de domaines de la métallurgie à la biologie et à
la médecine.

C’est un instrument simple qui accroît considérablement les capacités de perception du monde
à l’échelle micrométrique par l’œil humain.

Les performances d’un microscope dépendent des qualités de son optique (Fig. 1.1), des
conditions d’observations utilisées (Fig. 1.2), mais jusqu’à présent, elles ne se comparent pas
toutefois aux observations réalisées en microscopie électronique, seule technique permettant
d’atteindre des résolutions sub-nanométriques (Fig. 1.3)



Figure 1.1 : Performances comparées d’un microscope type jouet (à gauche) avec un microscope de laboratoire
(à droite).



Figure 1.2 : Comparaison entre deux observations faites avec un même microscope mais avec un éclairage
incorrect (à gauche) et un éclairage correct (à droite).

5


Figure 1.3 : Observation comparée de Gyrosigma sinense en microscopie optique (à gauche) et en microscopie
électronique (à droite). La barre représente une distance de 1 µm.

Le problème de la finesse des détails observables et de leur résolution constitue le problème
majeur de la microscopie. A cause de la diffraction de la lumière par l’ouverture limitée de
l’objectif, un point source parfait ne peut donner une image également ponctuelle, mais
seulement une tache de diffraction d’autant plus grande que l’ouverture sera limitée et le
grandissement recherché élevé.

Les développements récents ont conduit à rechercher d’autres moyens pour dépasser cette
limite imposée par la diffraction de la lumière et améliorer les conditions d’observations
d’objets particuliers, d’où les développements de la microscopie sur fond noir ou
ultramicroscopie, des microscopies à contraste de phase ou interférentielles. Le progrès le
plus notable dans le domaine e la microscopie photonique en champ lointain est celui de la
microscopie dite confocale qui, si elle n’accroît pas considérablement la résolution
instrumentale, permet une qualité d’image inégalée et la possibilité de reconstituer en 3
dimensions l’image d’un objet.

La révolution dans ce domaine est venue du développement des techniques de microscopie en
champ proche où l’utilisation des ondes évanescentes qui n’existent que très près de la surface
d’un objet. En « captant » ces ondes évanescentes par une sonde optique placée à quelques
nanomètres de l’objet, on peut reconstituer une image de l’objet avec une résolution
largement sub-longueur d’onde et seulement dépendante de la dimension de la sonde.


1.1- Histoire de la microscopie

Quelques dates...

• II
ème
siècle av. JC : Néron utilisait le chaton de sa bague comme loupe.
• 1608 : Z. Jansen construit un microscope à deux lentilles convergentes.
• 1633 : René Descartes (1596-1650) établit les lois de l'optique.
• 1665 : Robert Hooke (Freshwater 1635-Londres 1703) publie Micrographia, le
premier recueil de micrographies décrivant des lames minces de bois et où apparaît le
terme cellule (Fig. 1.4). Tout à la fois biologiste, paléontologue, météorologiste,
mécanicien et astronome, Hooke fut un des plus brillants expérimentateurs de son
6
temps. Son nom est resté associé aux lois de déformations élastiques des corps (loi de
Hooke).



Figure 1.4 : Microscope de Hooke et micrographie d’une lame de liège prise par Hooke.

• 1669 : Isaac Newton (1642-1727) découvre la décomposition de la lumière blanche.
• 1695 : Antonie Van Leeuwenhoek (1632-Delft 1723) construisit près de 500
microscopes qui lui permirent d'observer et de décrire pour la première fois des
microorganismes tels que : bactéries, spermatozoïdes, protozoaires, cellules
sanguines... (Fig. 1.5).



Figure 1.5 : Leeuwenhoek et son fameux microscope à une seule lentille.

Leeuwenhoek était drapier et commença à polir des «lentilles» après la lecture du
Micrographia de Hooke. Ami intime du peintre Vermeer dont il n'avait pas les dons, il
dût faire appel à un illustrateur pour ses planches.

• 1746 : J. Adams adapte un barillet porte-objectifs.
• 1828 : W. Nicol développe la microscopie en lumière polarisée.
• 1849 : J. Quekett publie un traité pratique sur l'usage du microscope.
• 1890 : Ernst Abbe (Eisenach 1840 - Iéna 1905), physicien, il établit les bases de la
formation des images dans le microscope et élabore la théorie de la résolution des
instruments (Fig. 1.6). En 1866 il rejoint le mécanicien Carl Zeiss avec qui il conçoit
des lentilles aux aberrations très faibles (objectif apochromatique et à immersion). En
1896, il réforme la société Carl Zeiss, dont les profits sont dès lors répartis entre la
direction, les travailleurs et l'université d'Iéna.

7


Figure 1.6 : Portrait d’Ernst Abbe.

• 1903 : R. Zsigmondy invente l’ultra-microscope (perfectionné par A. Cotton). Il
recevra le prix Nobel de Chimie en 1925 pour son travail sur les colloïdes.
• 1908 : Köhler et Siedentopf réalisent le microscope à fluorescence.
• 1928 : E. Synge suggère un nouveau concept pour vaincre la limite de diffraction et
introduit la notion de super-résolution.
• 1942 : F. Zernike (1888-1966) obtient le prix Nobel en 1953 pour la microscopie à
contraste de phase.
• 1952 : G. Nomarski imagine le microscope interférentiel différentiel.
• 1982 : G. Binning et H. Rohrer décrivent le premier microscope à pointe utilisant le
courant tunnel électronique, le « Scanning Tunneling Microscope » (STM).
• 1984 : Les premiers équivalents optiques du STM apparaissent ouvrant la voie à la
microscopie optique en champ proche.
• 1985 : Mise au point de la microscopie confocale à balayage laser.
• 1990 : M. Orrit et J. Bernard détectent des molécules uniques par fluorescence.


1.2- Principe de la formation des images

1.2.1 Optique géométrique

Dans un microscope l'image agrandie de l'objet est formée par la lentille de l'objectif.
L’objectif est l’élément crucial du microscope qui conditionne généralement les performances
globales de l’instrument. L'objet à observer est placé au voisinage du foyer objet Fo de la
lentille. L'image agrandie se construit dans un plan image situé bien au-delà du foyer image Fi
de la lentille (Fig. 1.7).

D’après les lois de l’optique géométrique, pour un objectif assimilé à une lentille mince, on a
la relation :

f
1
' p
1
p
1
= +
(1.1)

où p et p’ sont respectivement les distances de l’objet et de l’image au centre de la lentille et f
est la distance focale de la lentille. On note que l’image est inversée par rapport à l’objet.

8
objectif
objet
axe optique
image agrandie
Fo
Fi
p’ p


Figure 1.7 : Agrandissement par un objectif de microscope. Fo est le foyer objet, Fi est le foyer image de
l’objectif. Le grandissement est la conséquence directe de la courte focale de l’objectif.

Le grandissement linéaire est évalué par :

p
' p
− = γ
(1.2)

D’après l’éq. 1.1, si p → f, alors p’ → ∞, ce qui signifie que si l’objet est au foyer de la
lentille, l’image est envoyée à l’infini. Compte tenu de l’éq. 1.2 du grandissement, on en
déduit que l’image sera d’autant plus grande que l’objet sera près du foyer Fo et que la focale
de la lentille sera courte. Cependant, il n'est pas possible d'agrandir infiniment un objet en
réduisant la distance au foyer et la focale de l’objectif.

De plus, l’optique géométrique ne prend pas en compte le caractère ondulatoire de la lumière
et les phénomènes de diffraction vont limiter le grandissement linéaire d’un objectif à des
valeurs qui ne dépasseront guère l00x. Dans un microscope composé, l’image formée dans le
plan image de l’objectif est reprise par l’oculaire et le grandissement total s’obtient en
multipliant celui de l’objectif par celui de l’oculaire.

1.2.2 Diffraction de Fraunhofer

Les phénomènes de diffraction sont normalement étudiés dans un cours d’optique ondulatoire.
La théorie la diffraction repose sur le principe de Huygens-Fresnel qui indique que la
perturbation lumineuse en un point P résulte de la superposition d’ondes secondaires émises
par tous les points d’une surface située entre ce point et la source de lumière. La traduction
mathématique de ce principe est l’intégrale de Fresnel-Kirchhoff qui s’écrit :

| |dS ) s , n cos( ) r , n cos(
rs
e
2
A
) P ( U
) s r ( k

λ
− =
∫∫
+ i
i
(1.3)

dans le cas où on considère le passage de la lumière à travers une ouverture de forme
quelconque percée dans un écran (Fig. 1.8). k est le vecteur d’onde = 2π/λ. Si (x
0
,y
0
,z
0
) et
9
(x,y,z) sont les coordonnées des poins P
0
et P respectivement et (ξ,η) les coordonnées du
point Q dans l’ouverture, on peut montrer que l’éq. 1.3 peut s’écrire :

∫∫
η ξ
λ
δ
− =
η ξ
+
d d e
' s ' r
Ae A cos
) P ( U
) , ( kf
) ' s ' r ( k
i
i
i
(1.4)

où : ...
' s 2
) y x (
' r 2
) y x (
' s 2 ' r 2 ' s
y x
' r
y x
) , (
3
2
3
2
0 0
2 2 2 2
0 0
η + ξ

η + ξ

η + ξ
+
η + ξ
+
η + ξ

η + ξ
− = η ξ f (1.5)

L’évaluation de l’intégrale 1.4 est plus simple lorsque les termes quadratiques et ceux
d’ordres plus élevés en ξ et η peuvent être négligés. Dans ce cas, on parle de la diffraction de
Fraunhofer. Quand les termes quadratiques ne peuvent pas être négligés, on parle alors de la
diffraction de Fresnel. Heureusement, le cas plus simple de la diffraction de Fraunhofer est
celui de plus grande importance en optique.

x
y z
P
0
P
O
Q
r
r’
s’
s


Figure 1.8 : Diffraction par une ouverture de forme quelconque dans un écran plan.

Strictement parlant, les termes quadratiques et ceux d’ordres plus élevés disparaissent
seulement quand r’ et s’ tendent vers l’infini, c’est à dire quand à la fois le point source et le
point d’observation sont à l’infini. C’est pourquoi, on parle aussi de diffraction à l’infini (ou
en champ lointain) dans le cas de la diffraction de Fraunhofer. La diffraction de Fresnel est
observée lorsque la source et l’écran sont très proches. Du point de vue de la théorie, la
diffraction de Fresnel est plus générale et elle inclut la diffraction de Fraunhofer comme un
cas particulier.

Dans les conditions de la diffraction de Fraunhofer, nous pouvons évaluer la tache de
diffraction produite par une ouverture circulaire interposée entre une source ponctuelle et un
écran « renvoyé » à l’infini à l’aide d’une lentille.

En utilisant les coordonnées polaires (ρ,θ) pour le point Q dans l’ouverture circulaire :

ρcosθ = ξ et ρsinθ = η

et les coordonnées (w,ψ) pour le point P dans le plan de diffraction :

wcosψ = p et wsinψ = q
10

De cette définition de p et q, il s’ensuit que w =
2 2
q p + est le sinus de l’angle que la
direction (p,q) fait avec la direction centrale p = q = 0. L’intégrale de Fresnel-Kirchhoff se
met alors sous la forme :

θ ρ ρ =
∫ ∫
π
ψ − θ ρ
d d e C ) P ( U
a
0
2
0
) cos( w k i -
(1.6)

Cette forme fait apparaître la représentation intégrale des fonctions de Bessel J
n
(x) :

α
π
=

π
α α
d e e
2
) x ( J
2
0
n cos x
n
i i
-n
i
(1.7)

L’intégrale 1.6 s’écrit alors :

ρ ρ ρ π =

d ) w k ( J C 2 ) P ( U
a
0
0
(1.8)

En utilisant la relation de récurrence :

{ } ) x ( J x ) x ( J x
dx
d
n
1 n
1 n
1 n +
+
+
= qui donne par intégration pour n=0 :

=
x
0
1 0
) x ( xJ ' dx ) ' x ( J ' x

on obtient :

(
¸
(

¸

π =
kaw
) kaw ( J 2
a C ) P ( U
1 2

(1.9)

d’où l’on déduit l’intensité de la tache de diffraction :

0
2
1
2
I
kaw
) kaw ( J 2
) P ( U ) P ( I
(
¸
(

¸

= = (1.10)

C’est la célèbre formule d’Airy, établie pour une ouverture circulaire. On dit aussi que I(P) est
la fonction d’étalement d’un point, « Point Spread Function » en anglais ou PSF. I
0
est
l’intensité au centre de la tache : I
0
= πa
2
E/λ
2
, E étant l’énergie totale incidente.

Les minima de la fonction de Bessel J
1
(x) avec x = kaw = 2πaw/λ sont obtenus pour x =
1.22π, 2.233π, 3.238π… d’où l’on déduit que le rayons des anneaux sombres sont :

a
610 , 0 q p w
2 2
λ
= + =
a
116 , 1
λ

a
619 , 1
λ
(1.11)

Dans le cas d’une fente de largeur 2a, l’équation correspondante fait intervenir le sinus
cardinal
x
) x sin(
c
= sin et s’écrit :

11
) x ( sin I I
kpa
) kpa sin(
) P ( U ) P ( I
2
c 0 0
2
2
=
(
¸
(

¸

= = (1.12)

1.2.3 Théorie d’Abbe

La théorie de la formation de l'image dans un microscope a été formulée par Ernst Abbe à la
fin du XIX
ème
siècle. Abbe traita l'objet comme un fin réseau de diffraction et bien que ce ne
soit pas une description exacte de la section de plantes, c'est une très bonne approximation de
la structure régulière des diatomées par exemple.

Par passage au travers d’un réseau, la lumière est diffractée. Au rayon non dévié d’ordre 0
s’ajoutent des rayons diffractés, de part et d’autre et selon les ordres de diffraction successifs :
-1 et +1, -2 et +2, -3 et +3, … Tous ces ordres contiennent une part d’information sur l’objet
étudié. L’ouverture de l’objectif limite le nombre d’ordres de diffraction susceptibles d’être
collectés à travers lui (Fig. 1.9).

Les structures diffractant fortement la lumière, c’est à dire correspondant à des fréquences
spatiales élevées équivalentes à un réseau de diffraction avec un très grand nombre de traits au
millimètre, donneront des rayons avec des angles de diffraction élevés qui ne pourront être
collectés par l’objectif. Leur absence ne permettra pas la formation d’une image,
reconstruction fidèle de l’objet.



Figure 1.9 : Illustration de la théorie d’Abbe. A gauche, l’objet est un réseau à faible nombre de traits, tous les
ordres de diffraction passent par l’objectif et l’image reconstitue l’objet. A droite, l’objet est fortement
diffractant et pas tous les ordres de diffraction sont collectés par l’objectif. En conséquence, l’image ne
reconstitue que partiellement, voire pas du tout les structures fines de l’objet.

Nous allons décrire ce processus de formation de l’image plus en détail. Dans cette
présentation de la théorie de la formation des images dans un microscope, nous limiterons
notre attention aux deux cas extrêmes d’une illumination complètement incohérente d’une
part et d’une illumination parfaitement cohérente d’autre part. Le cas d’une illumination
seulement partiellement cohérente n’est pas traité.

Illumination incohérente

Considérons un objet lumineux par lui-même comme par exemple, le filament incandescent
d’une lampe électrique. Soit P le point de l’objet situé sur l’axe optique et Q un point voisin à
une distance y de P dans le plan objet Π. Appelons P’ et Q’ les images de ces points séparées
de la distance y’ dans le plan image Π’ (Fig. 1.10). Π et Π’ sont des plans conjugués.
Appelons θ et θ’ les angles que font les rayons marginaux passant par le diaphragme avec
l’axe optique.
12

Π F’ Π’
D’
a’
P
Q
P’
Q’
θ θ’
y
y’
Y
Y’


Figure 1.10 : Schéma illustrant la théorie du pouvoir de résolution du microscope.

Soit a’ le rayon de la zone supposée circulaire dans laquelle le faisceau de lumière convergent
vers P’ coupe le plan focal arrière F’ et appelons D’ la distance entre la pupille de sortie et le
plan image, alors, puisque θ’ est petit :

' D
' a
' θ = (1.13)

Si w =
2 2
q p + est la séparation entre Q’ et P’, c’est à dire le sinus de l’angle sous lequel les
deux points sont vus du centre de l’ouverture, alors nous avons avec une bonne
approximation :

Y’ = wD’ (1.14)

Soient n et n’ les indices de réfraction, λ et λ’ les longueurs d’onde respectivement dans les
espaces objet et image et λ
0
la longueur d’onde dans le vide, alors, puisque d’après le résultat
1.11, le premier minimum de la figure de diffraction de P est donné par w = 0,61λ’/a’, nous
avons à la limite de résolution :

' ' n
61 , 0
'
'
61 , 0
' a
' D
61 , 0 ' Y
0
θ
λ
=
θ
λ
= λ = (1.15)

En utilisant la relation des sinus : nYsinθ = −n’Y’sinθ’, on substitue Y’ par Y dans l’éq. 1.15
et en assimilant sinθ’ à θ’, on déduit :

θ
λ

sin n
61 , 0 Y
0
(1.16)

L’équation 1.16 donne la distance entre deux points objets qu’un microscope peut juste
résoudre lorsque l’illumination est incohérente et que l’ouverture est circulaire.

13
La quantité nsinθ qui intervient dans cette équation est l’ouverture numérique. Elle doit être
grande pour un meilleur pouvoir de résolution.

Illumination cohérente (théorie d’Abbe)

Considérons l’autre cas extrême où la lumière émergeant de l’objet peut être traitée comme
strictement cohérente. Cette situation est approximativement réalisée lorsqu’un objet mince
avec une structure relativement simple est illuminé par de la lumière issue d’une source
suffisamment petite à travers un condenseur à faible ouverture. La première théorie
satisfaisante de la résolution d’un microscope sous illumination cohérente a été formulée et
aussi illustrée par de belles expériences par E. Abbe en 1873.

Selon Abbe, l’objet agit à la manière d’un réseau de diffraction, si bien que non seulement
chaque élément de l’ouverture de l’objectif, mais aussi chaque élément de l’objet doit être pris
en considération dans la détermination de la perturbation complexe qui intervient en
n’importe quel point particulier du plan image. Sous forme mathématique, la transition du
plan objet au plan image implique deux intégrations : l’une est étendue sur le plan objet,
l’autre est étendue sur l’ouverture. Dans la théorie d’Abbe, la diffraction par l’objet est
considérée d’abord et l’effet de l’ouverture est pris en compte dans un deuxième temps.

Pour illustrer la théorie d’Abbe, considérons la formation de l’image d’un objet en forme de
réseau de diffraction illuminé par une onde plane incident normalement sur le plan objet selon
le principe de l’illumination centrale de Köhler. L’onde est diffractée par l’objet et donne
naissance à une figure de diffraction de Fraunhofer du réseau dans le plan focal arrière F’ de
l’objectif (Fig. 1.11), aussi appelé plan de Fourier. Les maxima correspondant aux spectres
d’ordre successif de cette figure de diffraction sont notés …S
-3
, S
-2
, S
-1
, S
0
, S
1
, S
2
, S
3


Π F’ Π’
D’ f
(ξ,η)
(x’,y’)
(x,y)
S
0
S
1
S
2
S
3
S
-1
S
-2
S
-3
(p
’,q
’)
(p
,q
)


Figure 1.11 : Schéma illustrant la théorie d’Abbe de la formation de l’image dans un microscope sous
illumination cohérente.

Chaque point dans le plan focal peut alors être considéré comme le centre d’une émission
cohérente secondaire dont la contribution sera proportionnelle à l’amplitude en chaque point.
Les ondes lumineuses issues de chacun de ces points sources secondaires interfèreront entre-
elles et donneront naissance à l’image de l’objet dans le plan image Π’ de l’objectif. Pour
obtenir une image fidèle, il est nécessaire que tous les spectres (tous les ordres de diffraction)
contribuent à la formation de l’image. Ceci n’est jamais possible strictement à cause de
l’ouverture finie de l’objectif. D’un point de vue pratique cependant, il est suffisant que
14
l’ouverture soit suffisamment grande pour admettre tous les ordres qui transportent une
quantité appréciable d’énergie.

On remarquera que si l’objet possède des structures de grande finesse, équivalentes donc à un
réseau gravé très fin, les angles de diffraction dus à ces structures seront très grands et seuls
un nombre très limité d’ordres de diffraction, voire à la limite un seul, pourra passer à travers
l’objectif. Dans ces conditions, l’objet ne pourra pas être reconstitué avec toute la finesse
nécessaire et on aura atteint la limite de résolution de l’instrument.

Ces considérations peuvent être exprimées d’une manière précise sans se restreindre au cas
d’objets assimilés à des réseaux de diffraction. Soient (x,y) les coordonnées d’un point
typique du plan objet et f la distance du plan focal F’ à la lentille objectif, la perturbation au
point (ξ=pf,η=qf) du plan F’ est donnée par la formule de Fraunhofer :

∫∫ (
¸
(

¸

|
.
|

\
| η
+
ξ
− = η ξ dxdy y
f
x
f
k exp ) y , x ( F C ) , ( U
1
i
(1.17)

où F est la fonction décrivant la transmission de l’objet, C
1
une constante et l’intégration est
effectuée sur l’aire du plan objet Π couverte par l’objet.

Considérons maintenant la transition du plan focal F’ au plan image Π’. D’ étant la distance
entre ces deux plans, au point typique (x’=p’D’,y’=q’D’) du plan image, la perturbation due à
la diffraction de Fraunhofer par une ouverture située dans le plan F’ sera :

∫∫
η ξ
(
¸
(

¸

|
.
|

\
|
η + ξ − η ξ = d d
' D
' y
' D
' x
k exp ) , ( U C ) ' y , ' x ( V
2
i
(1.18)

La substitution de l’éq. 1.17 dans l’éq. 1.18 donne :

∫∫ ∫∫
η ξ
(
¸
(

¸

|
|
.
|

\
|
η
|
.
|

\
|
+ + ξ
|
.
|

\
|
+ − = d dxdyd ' y
' D
f
y ' x
' D
f
x
f
k
exp ) y , x ( F C C ) ' y , ' x ( V
2 1
i
(1.19)

Si on suppose que F(x,y) est définie comme nulle pour tous les points du plan objet qui se
trouvent à l’extérieur de l’objet lui même, c’est à dire de , alors l’intégration par rapport à x
et y peut formellement être étendue de –∞ à +∞. De même, si l’ouverture est suffisamment
grande pour que ) , ( U η ξ soit négligeable pour les points du plan focal F’ qui se trouvent en
dehors de , alors les intégrations par rapport à ξ et η peuvent également être étendues de –∞
à +∞. Appelons M (<0) le grandissement entre les plans Π et Π’, défini par :

f
' D
M − = ou
M
1
' D
f
− = (1.20)

En utilisant le théorème de l’intégrale de Fourier, on obtient :

) y , x ( CF )
M
' y
,
M
' x
( CF ) ' y , ' x ( V = = (1.21)

15
où (x,y) est le point objet dont l’image est en (x’,y’) et la quantité définie par :

C=C
1
C
2
λ
2
f
2
(1.22)

est constante. Ainsi, si l’ouverture est suffisamment large, l’image est strictement similaire à
l’objet, aussi bien en amplitude qu’en phase, mais inversée.

Dans le cas d’une illumination cohérente, on peut montrer que la limite de résolution est :

θ
λ

sin n
77 , 0 Y
0
(1.23)

A part la valeur du facteur numérique qui est en réalité quelque peu arbitraire, cette limite est
pratiquement identique à celle obtenue dans le cas d’une illumination incohérente.

1.3- Limite de résolution d’un microscope

La notion de résolution est certainement la notion la plus importante en imagerie. On parle
aussi de pouvoir de résolution. Elle décrit la capacité d’un système à résoudre les plus petits
détails d’un objet. Différents critères ont été proposés pour définir de façon simple la
résolution d’un système d’imagerie. Le plus connu et utilisé est sans aucun doute le critère de
Rayleigh qui est une forme concise du principe d’Abbe.

1.3.1 Critère de Rayleigh

Comme on vient de le voir, la résolution conférée par un objectif est limitée par la diffraction.
Elle résulte des interférences au niveau du plan image, des ondes lumineuses diffractées le
long du trajet des rayons (Fig. 1.12).



16
Figure 1.12 : Formation de l'image dans un microscope. L'image d'un point est en fait une tache de diffraction
(disque d'Airy) ou fonction d'étalement du point résultant de l'interférence entre les ondes diffractées ayant
parcouru des trajets distincts jusqu’au plan image.

La résolution telle qu'elle a été définie par Rayleigh correspond à la distance minimale d
min

entre deux points objets qui seront considérés comme séparés (résolus) si le maximum
d'intensité du disque d'Airy du premier point correspond au premier minimum d'intensité du
disque d'Airy du second point. Comme représenté sur la figure 1.13, on note que dans ces
conditions idéales, l’intensité dans le creux situé entre les deux maxima est égale à 81% de
l’intensité du maximum de l’image individuelle de chaque point.



Figure 1.13 : Définition de la résolution ou pouvoir séparateur par le critère de Rayleigh qui précise les
conditions pour permettre de discriminer deux disques d'Airy.

Selon ce critère de Rayleigh, la résolution théorique est égale à :

d
min
= 0,61.
NA
λ
(1.24)

où NA est l’ouverture numérique (« Numerical Aperture »), c’est à dire nsinθ.

Cette relation qui définit le pouvoir séparateur de l’instrument n’est en toute rigueur valable
que si l'objectif collecte de la lumière provenant d'un condenseur ayant la même ouverture
numérique que celle de l’objectif. Fort heureusement, en épi-illumination, c’est à dire
lorsqu’on collecte la lumière de fluorescence ou de la lumière diffusée sur fond noir, cette
condition est parfaitement remplie puisque l'objectif lui-même joue également le rôle de
condenseur.

En fait, dans la formation de l’image dans un microscope, il faut tenir compte de deux
fonctions de répartition de la lumière:

-la fonction d'étalement du point dans le plan focal, c’est à dire la tache d’Airy ou plus
généralement, la PSF qui conditionne la résolution latérale (en X et en Y).

-la fonction de défocalisation qui conditionne le résolution axiale (profondeur de
champ) le long de l’axe optique (en Z).

1.3.2 Ouverture numérique

17
Expérimentalement, la fonction d'étalement du point (PSF pour « Point Spread Function »)
s’obtient en observant un point lumineux idéal (infiniment petit) au travers d'un objectif. Sous
l’image familière du disque d’Airy, la PSF apparaît sous la forme d’un maximum d'intensité
entouré d'anneaux de plus en plus sombres. Elle résulte de l'incapacité de la lentille à collecter
la lumière dispersée au-delà d'un angle donné θ (demi angle d'ouverture du cône de lumière
entre le foyer et la lentille).

Le cône de lumière entre le foyer et la lentille de demi-angle au sommet θ définit l'ouverture
numérique NA = nsinθ de l'objectif. L'ouverture numérique NA est une caractéristique
essentielle d'un objectif. C'est elle qui est directement responsable de la luminosité et de la
résolution d'un objectif.

Deux autres caractéristiques de l'objectif dépendent de l'ouverture numérique: ce sont la
distance de travail D et la profondeur de champ ∆z. La figure 1.14 illustre les changements
provoqués sur la fonction d’étalement du point PSF et sur la profondeur de champ. Plus
l’ouverture numérique est grande, plus la PSF est fine et la profondeur de champ ∆z petite.

D D D
iris iris
α α α
∆z ∆z ∆z
PSF PSF PSF


Figure 1.14 : L’ouverture numérique est caractérisée par l'angle α et elle détermine la distance de travail D et
la profondeur de champ ∆z. Un iris placé devant la lentille permet de faire varier l'ouverture numérique sans
changer le grandissement et d'augmenter ainsi la profondeur de champ.

Un objectif de haute qualité sera caractérisé par une grande ouverture numérique
(1,0<NA<1,45) ce qui a comme conséquence une distance de travail limitée (90 à 180 µm) et
une profondeur de champ réduite (effet de sectionnement optique).

On peut établir la relation suivante entre la profondeur de champ ∆z et l’ouverture
numérique :

(
(
¸
(

¸

|
|
.
|

\
|
− −
λ
= ∆
2
2
1 1 4
z
n
NA
n

(1.25)

18
De manière générale, les objectifs de faible grossissement (5x à 20x) ont une faible ouverture
numérique NA (0,5 à 0,75) mais offrent une grande distance de travail et une grande
profondeur de champ. Les objectifs de grandissement supérieur (40x à l00x) ont une NA
supérieure à 0,75 et procurent une excellente résolution mais une faible profondeur de champ.
Pour obtenir une ouverture numérique effective supérieure à 0,75 les objectifs doivent être à
immersion, c’est à dire que l’on interpose entre l’objet et l’objectif un liquide adaptateur
d’indice (Fig. 1.15). L’ouverture numérique est alors augmentée. Par exemple, pour un
objectif à immersion dans 1'huile (n = 1,515) ayant un demi-angle θ de 67,5° on obtient une
ouverture numérique de 1,40 au lieu de 0,9 pour le même objectif à sec, c’est à dire dans l’air
(n = 1).

n
2
n
3
n
1
n
1
A B C A B C
Objectif à sec
n
1
≠ n
2
Objectif à immersion
n
1
≈ n
3


Figure 1.15 : Ouverture numérique et immersion de l’objectif. A gauche la différence entre les indices de
réfraction n
2
et n
1
est grande, les rayons lumineux A, B et C sont déviés vers l'extérieur lors du passage du
milieu de l’objet dans l'air. Les rayons les plus externes seront perdus. A droite, on utilise un liquide
d'immersion d'indice n
3
très proche de n
1
. Les rayons ne sont plus déviés et sont tous collectés par la lentille.

Les avantages d'un objectif à immersion sont triples :

• Augmentation de l’ouverture numérique de l’objectif,
• Elimination de l’aberration sphérique due au couvre-objet,
• Elimination de la réflexion totale à la surface supérieure du couvre-objet.

On peut de même utiliser des condenseurs à immersion, cependant, on peut calculer que le
gain en résolution que l’on obtient par immersion du condenseur n'est que marginal, NA
cond

ne passant que de 0,95 à 1,2.

Certains objectifs disposent d'un diaphragme à iris qui permet de régler l'ouverture numérique
de l’objectif. Ceci permet d'augmenter la profondeur de champ en réduisant l'ouverture de
l'iris. Bien entendu, cela entraîne une dégradation de la finesse de l'image, cependant on
constatera qu’une diminution du diamètre de l’iris à environ 80% de son ouverture complète
ne diminue que légèrement le pouvoir de résolution mais améliore beaucoup le contraste. La
formule permet de déterminer que pour une lumière à 500 nm, NA
obj
= 1,3 et NA
cond
= 0,95
(c’est à dire un condenseur "sec"), la résolution maximale du microscope peut atteindre
environ 260 nm. C'est une limite que l'on peut atteindre en routine.

1.3.3 Aberrations géométriques et chromatiques

19
La réalisation d'un objectif de microscope est extrêmement complexe et doit prendre en
compte toutes sortes de défauts.

Une correction importante de l'objectif concerne l'aberration sphérique. Avec les systèmes de
lentilles qui ne sont pas corrigés, l'image subit une déformation sphérique telle que les détails
situés au pourtour de l'image deviennent flous si la mise au point est faite sur le centre, et
inversement. Les objectifs aplanétiques corrigent totalement l'aberration sphérique. Une
correction partielle peut souvent être suffisante et donc plus économique.

Par construction, une lentille est un dioptre à courbure variable qui doit assurer la
convergence des rayons lumineux par réfraction. Cependant, à cause de la dispersion de
l’indice, l'angle de réfraction varie en fonction de la longueur d'onde. Autrement dit, pour un
objet éclairé par de la lumière blanche, on obtient une mise au point différente suivant que les
parties observées sont rouges, vertes ou bleues comme représenté sur la figure 1.16.

Fo
Fo
rayon “blanc”
Bleu Rouge
Sans correction
Avec correction
axe optique


Figure 1.16 : Aberration chromatique. Sur la moitié supérieure, l’objectif est non corrigé, la lumière blanche est
décomposée et les rayons rouges, verts et bleus convergent en des points différents le long de l'axe optique. Sur
la moitié inférieure, l’objectif est corrigé par l'adjonction d'une lentille divergente pour compenser la dispersion
des rayons de longueur d'onde différente. Tous sont maintenant focalisés au même point.

Ce défaut s'appelle l'aberration chromatique. Dans les objectifs de microscope, on corrige ce
défaut en fabriquant des objectifs composés constitués de plusieurs lentilles avec des lois de
dispersions d’indice différentes afin de se corriger mutuellement, mais cette aberration
chromatique des objectifs est corrigée de façon très différente selon les fabricants. Selon la
correction effectuée, on distingue des objectifs achromatiques, semi-apochromatiques et
apochromatiques.

En outre, si la correction de l'aberration sphérique est aussi réalisée, l'objectif comporte la
mention "aplanétique" (par exemple, un objectif sera aplanétique-apochromatique). Les
objectifs apochromatiques sont ceux qui offrent la meilleure correction chromatique et un
contraste d'image particulièrement bon. Ils sont employés pour examiner les structures fines et
colorées. Les aberrations chromatiques des objectifs achromatiques bon marché ne sont
généralement pas perceptibles. Associés à un filtre vert, les objectifs achromatiques peuvent
parfaitement être employés pour la photographie noir et blanc. Pour la photographie couleur,
il est préférable d'utiliser des objectifs semi-apochromatiques ou apochromatiques afin de
garantir la fidélité des couleurs et un bon contraste.

1.3.4 Rôle du condenseur

Le rôle du condenseur dans un microscope est essentiel en permettant d'éclairer de façon
homogène le champ du microscope. Le dispositif le plus courant est le condenseur de Köhler.
Il est constitué d'une source lumineuse, suivie d'un diaphragme de champ (limitant
20
l'illumination au champ microscopique visible). Une lentille collectrice récupère la lumière de
la source, un diaphragme d'ouverture permet d'ajuster l'ouverture numérique du condenseur en
fonction de celle de l'objectif utilisé, et enfin la lentille condenseur proprement dite focalise
l'illumination sur le spécimen. Le réglage des différents constituants du dispositif condenseur
est capital pour l'obtention d'une image résolue et d’un bon contraste (Fig. 1.17). En
particulier, le centrage et la focalisation du condenseur doivent être ajustés chaque fois que
l'on change d'objectif. De même l'ouverture des deux diaphragmes doit toujours être ajustée à
la dimension du champ du microscope.





Figure 1.17 : Influence du diaphragme du condenseur sur la résolution au sein de l'image microscopique d’une
diatomée: à gauche, le diaphragme du condenseur est réglé correctement; à droite, le diaphragme du
condenseur est trop fermé. L'image de droite même si elle paraît plus contrastée, est néanmoins mauvaise au
plan de la résolution. Les structures fines de la diatomée ne sont visibles que sur l'image de gauche obtenue avec
un réglage correct du diaphragme du condenseur.

La profondeur de netteté est déterminée par le grossissement global et l'ouverture du
condenseur. Plus le grossissement global est élevé, plus la profondeur de netteté est réduite.
La diminution de l'ouverture du condenseur permet d'augmenter quelque peu la profondeur de
netteté mais aux dépens du pouvoir séparateur.


1.4- Performances comparées des microscopies optiques

On compare les performances entre les trois principales familles de microscopies optiques.
Les microscopies classique et confocale sont dites en champ lointain. La lumière transmise,
réfléchie ou émise par l’objet est collectée par un objectif situé à une relativement grande
distance de l’échantillon. Les nouvelles microscopies en champ proche utilisent une sonde
locale, généralement une fibre optique de forme très affinée qui vient collecter l’information
au voisinage immédiat, c’est à dire à quelques nanomètres de la surface de l’échantillon.

Dans le tableau 1.1 comparatif, on prend en compte :

1) le type de détection : la première condition pour former une image d’un objet dépend
de la capacité de l’instrument à détecter la présence de cet objet et donc à collecter
suffisamment de photons portant une information pertinente sur l’objet. Un critère de
21
détection peut être défini comme la capacité à détecter un nombre minimal de photons
tel que le rapport signal/bruit soit plus grand que 1. Si δ
det
est le seuil de détection, il
doit vérifier l’inégalité :

det p
n s δ > ν = h avec δ
det
>n (1.26)

où n
p
est le nombre de photons, s le signal et n le niveau moyen de bruit en énergie.

Dans le tableau, on précise aussi le type de détection. Dans un microscope classique,
l’image est collectée directement par l’œil, une plaque photographique ou une caméra
CCD : il s’agit d’une détection en parallèle de tous les éléments de l’image. Ce n’est
pas le cas pour les autres techniques qui nécessitent le balayage d’un élément, par
exemple du faisceau laser, d’une sonde locale ou de l’objet lui-même : il s’agit alors
d’une détection séquentielle. L’image est acquise point par point. Ceci peut être un
inconvénient majeur pour l’observation de cellules vivantes ou d’objets mobiles.

2) la localisation : après avoir extrait le signal du bruit, la prochaine étape est de localiser
l’élément émetteur ou diffractant de l’objet. Même si la tache de diffraction est plus
grande que λ/2, l’élément peut être localisé avec une précision bien plus grande que la
longueur d’onde. Par exemple, le mouvement erratique d’une bactérie d’un diamètre
de 1 µm peut être suivi avec une précision de quelques nanomètres ou moins bien que
le diamètre de l’image puisse être d’environ 2 µm. Bien sûr, cela est possible si
l’image de l’objet conserve toujours la même forme dans son déplacement.

3) Résolution : nous avons examiné ce point en détail précédemment. Elle est mesurée en
comparant les fonctions d’étalement du point (PSF) de chaque instrument. Dans le cas
des microscopes en champ proche, c’est la dimension de la sonde qui est déterminante.
Remarquons que le contraste est parfois confondu avec la résolution parce qu’une
image bien contrastée est souvent considérée comme une bonne image selon les
critères de la perception visuelle humaine.

4) Enfin, on considère le problème de artéfacts. C’est la critique la plus forte concernant
les techniques de champ proche qui travaillent « en aveugle ». Selon les modes
d’interactions de la sonde avec la surface de l’échantillon, elles sont susceptibles de
générer des signaux qui, mal interprétés, peuvent conduire à une représentation
erronée de l’objet.
22



Type de microscopie Classique Confocale Champ proche
Type de détection
Parallèle
(formation d’une image)
Séquentielle
(à balayage)
Séquentielle
(à balayage)
Niveau de signal
(converti en courant)
Quelques mA à quelques
µA
Quelques mA à quelques
µA
Quelques µA à quelques
nA
Rapport signal/bruit Bon Bon Faible
Détection Facile Facile Difficile
Localisation Facile Facile à difficile Délicate à difficile
Fonction d’étalement du
point (PSF)
2
1
) ( J 2
(
¸
(

¸

=
4
1
) ( J 2
(
¸
(

¸

=
Elevée, au-delà de λ/2
Dépendante du diamètre
de la pointe
Cohérence de la lumière
Cohérente, partiellement
cohérente ou incohérente
cohérente Toujours cohérente
Risque d’artéfacts
Faible
(optique)
Faible
(optique ou électronique)
Important
(optique, électronique ou
mécanique)

Tableau 1.1 : Comparaison des trois microscopies optiques de base.

Si chaque instrument possède ses avantages et inconvénients en fonction de ce à quoi on le
destine, on notera que les microscopies à champ proche sont des instruments délicats qui
nécessitent de l’expérience à la fois en électronique, optique et traitement d’images.
23
24
2- Microscopies photoniques classiques

Nous traitons d’abord brièvement de ce qu'il est convenu d'appeler la microscopie à fond
clair, où l'image formée par la lumière déviée est vue sur un fond de lumière non déviée. C'est
la forme la plus courante de la microscopie, pour laquelle nous rappelons les conditions à
remplir pour une bonne observation.

Dans la suite du chapitre, nous discutons de techniques d'observation plus sophistiquées
complémentaires ou alternatives : la microscopie à fond noir et 3 méthodes permettant
l’accroissement du contraste des images. La microscopie à contraste de phase est détaillée et
nous mentionnons brièvement deux autres techniques : l'observation en lumière polarisée et la
microscopie interférentielle DIC Nomarski.


2.1- Microscopie à fond clair

C'est le procédé le plus classique et commun qui convient particulièrement à l'examen d'objets
colorés ou contrastés. Il peut s'agir d'objets déjà colorés ou qui le deviennent à la suite d'un
traitement approprié ou encore d'objets incolores qui possèdent un indice de réfraction très
différent de celui de l'eau comme des gouttes d'huile, les parois cellulaires, des cristaux, les
grains d'amidon, les bulles d'air, etc.

2.1.1 Conditions d’une bonne observation

La contribution du condenseur

En exposant la théorie de la formation des images, nous avons admis que l'échantillon était
éclairé par un faisceau étroit de lumière parallèle. A partir de la théorie d'Abbe, on a déduit
qu'une image se forme lorsque les deux maxima de premier ordre de diffraction peuvent
interférer avec la lumière non déviée. En fait, un seul maximum de premier ordre suffit. Il est
représentatif du réseau et porte juste suffisamment d'information pour créer une image
lorsqu'il interfère seul avec le rayon non dévié.

Cela veut dire que si on éclaire l'échantillon avec un faisceau oblique, à la fois un maximum
de premier ordre et le faisceau non dévié peuvent être collectés par l'objectif. On a donc
avantage à utiliser un éclairage conique, c’est à dire par un cône de lumière ayant un angle
égal à l'angle d'admission de l'objectif. C'est exactement ce que le condenseur fait.

Notons que pour collecter complètement la lumière avec un objectif à immersion, le
condenseur doit aussi lui aussi être huilé à la lame. Ce fait est très contraignant, augmente la
diffusion et peut tellement réduire le contraste que le bénéfice d'augmentation de la résolution
peut être perdu.

Notons aussi que le diaphragme du condenseur n'est presque jamais ouvert complètement quel
que soit l'objectif et son ouverture numérique car cela réduit le contraste. Seuls les objectifs
apochromatiques les plus récents permettent l'éclairage complet de leur ouverture, mais même
avec ces objectifs, on obtient un meilleur contraste lorsque le diaphragme du condenseur est
légèrement fermé.

Eclairage de Köhler
25

Cette méthode de réglage due à Köhler s'applique à toutes les techniques microscopiques par
transparence, c'est-à-dire au fond clair, au contraste de phase et à la polarisation. La procédure
à suivre pour réaliser un bon éclairage de Köhler est détaillée ci-dessous :

• Mettre en place la préparation et effectuer la mise au point avec un objectif de
grossissement moyen (par exemple 10x). Ce réglage ne doit plus être modifié ensuite.

• Diaphragmer la source lumineuse et ajuster correctement le diaphragme du
condenseur. Pour un réglage optimal du diaphragme du condenseur, on enlève un
oculaire puis on ferme le diaphragme jusqu'à ce qu’un tiers du champ soit obscurci.

• Monter ou descendre le condenseur jusqu'à ce que le bord du diaphragme de la
source lumineuse devienne très net. Si les défauts chromatiques du condenseur et de
l'objectif ne sont pas parfaitement corrigés, un liseré bleu et rouge peut apparaître au
bord du diaphragme de la source lumineuse. Le diaphragme est parfaitement focalisé
lorsque la couleur passe du rouge au bleu.

• Centrer le diaphragme de 1a source lumineuse. Pour la plupart des microscopes ce
réglage se fait à l'aide de deux vis de centrage placées sur le condenseur.

• Terminer le réglage en ouvrant le diaphragme de la source lumineuse jusqu'à ce qu'il
disparaisse du champ optique.

Quel grossissement?

Pour une bonne résolution, il est absolument crucial d'assurer une grande ouverture
numérique, mais le grossissement ne dit rien sur le contenu de l’image et c’est souvent une
question de convenance de l’observateur. Il faut cependant assurer qu'aucune information de
l'image ne sera perdue.

Le grossissement d’un microscope se calcule par le produit du grandissement de l’objectif
(par exemple 100x) par celui de l’oculaire (par exemple 10x) d’où un grossissement de1000x.
Le choix du grossissement dépend de la méthode d’observation :

Observation visuelle : à une distance de lecture confortable de 25 cm (qui est ce que
nous avons approximativement en microscopie), les personnes ayant une excellente vue
peuvent résoudre des détails de 0,3 mm, d’autres de seulement 0,5 mm. Un grandissement de
1000x est suffisant pour certains, alors que 1500x est mieux pour d’autres.

Microphotographie : les films de documentation utilisés en microphotographie
peuvent avoir un pouvoir de résolution de 100 lignes/mm, c'est à dire 10 µm. Avec des films
de moins bonne résolution, par exemple 60 µm, un grossissement de 200x sera suffisant pour
enregistrer un détail de 0,3 µm.

Moniteurs vidéo, ordinateurs : la trame de l’image de télévision où la structure
pixélisée de l’écran d’ordinateur sera le facteur limitant, ce qui signifie qu’on ne peut espérer
montrer le détail d'une copie photographique au même grossissement sur l'écran.


26
2.2- Microscopie à fond noir - Ultramicroscopie

2.2.1 Microscopie à fond noir

Lorsque le soleil entre dans une chambre obscurcie à travers une fente des volets, les fines
particules de poussière autrement invisibles apparaissent sur le fond noir car elles diffusent la
lumière. La lumière non déviée est exclue, la lumière déviée produit l'image. Une façon
simple d'obtenir un éclairage en fond noir est de placer un cache central dans le support à
filtre du condenseur. Ce cache opaque est collé au centre d'un disque transparent ajusté sur le
support du filtre du condenseur (Fig. 2.1).

Ce cache central arrête la lumière directe et seuls les rayons formant un angle plus grand que
"l'angle d'admission" de l'objectif utilisé peuvent atteindre l'objet. Le fond est noir et la
lumière diffusée (déviée) par l'objet (dessiné en bleu clair dans la figure 2.1) est vue par
l'objectif.



Figure 2.1 : L’échantillon n’est éclairé que par des rayons très obliques et seule la lumière diffusée par l’objet
(en clair sur le schéma) pénètre à travers l’objectif.

La grandeur du cache central dépend de l'ouverture numérique de l'objectif. Un cache central
d'environ 15 mm de diamètre suffit généralement pour donner un fond noir avec un objectif
d’environ 0,5 d'ouverture numérique, selon les propriétés du condenseur du microscope. Un
cache central de 20 mm permettra généralement de donner un fond noir à un objectif de
40x/NA 0,65.

La hauteur du condenseur doit être ajustée pour un maximum de luminosité au centre du
champ. Le diaphragme de champ peut être ouvert complètement puisqu'il n'y a pas grande
différence entre un éclairement de Köhler et un éclairage critique dans cette situation.

Pour les fonds noirs à des ouvertures numériques plus grandes, des condenseurs spéciaux de
type "cardioïdes" à fond noir utilisant des miroirs (Fig. 2.2) sont fabriqués. Ils sont huilés à la
lame (on peut pour des raisons pratiques utiliser de l'eau) et exigent une mise au point et un
centrage exacts.

27
Même ces condenseurs spéciaux ne peuvent pas être utilisés avec des objectifs à ouverture
numérique de 1,2 ou supérieure. La raison est qu'il faut considérer deux ouvertures
numériques pour ces condenseurs à fond noir : l'ouverture numérique interne (c'est-à-dire la
portion de lumière bloquée) et l'ouverture numérique externe (qui pour des raisons techniques
est limitée à 1,4).



Figure 2.2 : Schéma d’un condenseur type cardioïde.

Pour un objectif NA 1,25, il faut arrêter toute la lumière jusqu’à l'ouverture numérique 1,3 au
moins. Le cône de lumière restant est ainsi limité entre NA 1,3. et NA 1,4. Ce n'est tout
simplement pas assez pour produire un fond noir utilisable. L'ouverture numérique interne
limite atteignable avec les condenseurs à fond noir actuels est aux alentours de NA 1,0 ce qui
est adapté à des objectifs à immersion d'huile de puissance moyenne 40x à 60x.

Le contraste en fond noir est extrême et la résolution est aussi bonne que peut le donner
l'objectif utilisé. Le fond noir est spectaculaire pour l'observation des protozoaires vivants ou
des bactéries (Fig. 2.3) car il rend visibles les cils et les flagelles, et pour les diatomées.



Figure 2.3 : Image sur fond noir de bactéries.

Les limitations du fond noir sont les suivantes : tout d’abord, des objets épais, étendus ou trop
diffusants sont inexploitables en fond noir. Ensuite, les erreurs résiduelles des objectifs
(notamment les aberrations sphériques) deviennent visibles au maximum. C'est spécialement
28
le cas avec des objectifs 40x et forme la raison principale d'utilisation d'objectifs 40x à
immersion, beaucoup plus avantageux dans ce cas.

Pour l'examen de spécimens vivants en fond noir, un objectif 40x à immersion d'eau est idéal.
Enfin, tous les grains de poussière ou les traces de graisse deviennent également visibles au
maximum. Il faut donc disposer d’une chaîne d’éclairage méticuleusement propre : lentilles
supérieures du condenseur, les deux surfaces de la lame, échantillon dilué et "propre", sans
graisse.

2.2.2 Ultramicroscopie

L’ultramicroscopie est une technique de microscopie en fond noir mais à l’origine et à la
différence de la technique précédente, l’échantillon est violemment éclairé latéralement et non
en transmission. Cette technique est particulièrement adaptée pour détecter des particules de
dimensions très inférieures à la longueur d’onde.

L’ultramicroscopie utilise les capacités de diffusion des particules (effet Tyndall) et est
particulièrement adaptée à la détection de particules métalliques (colloïdes d’or ou d’argent).
Inventé par R.A. Zsigmondy, l’ultramicroscope a été perfectionné par A. Cotton et H.
Mouton.

Biographie de Richard Adolf Zsigmondy

Richard Adolf Zsigmondy fut un chimiste allemand né à Vienne en 1865 et
décédé à Göttingen en 1929. Il fit ses études à Vienne puis à Munich où il obtint
son doctorat en 1889. Il fut assistant à l’Université de Berlin puis devient en 1893
maître de conférence à l’Ecole Polytechnique de Graz en Autriche. De 1897 à
1900, il travailla pour Schott à Iéna. Il devint ensuite professeur et directeur de
l’Institut de Chimie à Göttingen.
A Berlin, il s’intéressa aux couleurs produites par des solutions colloïdales d’or
appliquées sur de la porcelaine. Lorsqu’il arriva à Iéna, il étudia les verres colorés,
ce qui le conduisit à l’étude des colloïdes. En 1903, avec un de ses collaborateurs, il
inventât et construisit l’ultramicroscope qui exploite l’effet Tyndall. Ce microscope
devint l’instrument de référence jusqu’à l’arrivée du microscope électronique en
1939 pour observer les colloïdes.
Il obtint le prix Nobel de chimie en 1925 "pour son explication de la nature hétérogène des solutions
colloïdales et pour les méthodes appliquées au cours de ses recherches qui ont une importance fondamentale
dans la chimie moderne des colloïdes".

Note sur les colloïdes : On ne peut observer correctement au microscope classique que des objets dont la
taille est supérieure à la longueur d’onde de la lumière visible. Les colloïdes sont constitués de particules plus
petite que cette longueur d’onde mais pouvant diffuser de la lumière par effet Tyndall.

Dans le livre écrit en 1906 par Cotton et Mouton (Fig. 2.4), il est rapporté que « les plus
petites dimensions estimées ainsi ÷ dans les conditions les plus favorables, avec la lumière
solaire du milieu d’une belle journée d’été ÷ sont de 3 à 6 nm ».

Même si cette technique n’a plus qu’un intérêt historique aujourd’hui, il est important de
remarquer que certains des montages utilisés sont d’une grande actualité, notamment le
dispositif à ondes évanescentes de Cotton et Mouton que l’on retrouve dans certains montages
de microscopie en champ proche.

29



Figure 2.4 : Page de couverture du livre de A. Cotton et H. Mouton écrit en 1906 sur l’ultra-microscopie. A
droite, un montage d’ultramicroscopie tel qu’utilisé à l’époque. En dessous, le dispositif à ondes évanescentes
imaginé par Cotton et Mouton


2.3- Microscopie à contraste de phase

Le microscope à contraste de phase est un dispositif permettant d'observer des préparations
qui n'ont pas été colorées. Il est donc particulièrement bien adapté à l'observation de cellules
vivantes.

Le principe repose sur la formation d'un contraste d'intensité créé par l'interférence de rayons
lumineux auquel on fait subir un déphasage différentiel : le microscope à contraste de phase
transforme les différences de phase inapparentes en zones visibles claires et sombres. Pour
cela, on place un anneau de phase (un diaphragme annulaire) dans le condenseur et une lame
de phase annulaire dans l'objectif du microscope (Fig. 2.5).

L'anneau de phase permet de créer une illumination de forme annulaire qui sera totalement
stoppée par l'anneau opaque de la plaque de phase. Cet anneau opaque arrête la transmission
directe de la lumière et évite l'éblouissement de l'observateur. Les rayons lumineux diffractés
par les structures fines (membranes cellulaires, organites...) traversent la plaque de phase soit
dans la zone périphérique, soit dans la zone centrale. La zone centrale est constituée d'une
lame biréfringente λ/4 dont le rôle est de retarder légèrement les rayons diffractés qui la
traversent. Ces rayons retardés vont interférer avec ceux transmis sans retard sur la périphérie.

30
Le déphasage différentiel entre ces rayons, créé le contraste et permet de mettre en évidence
les structures cellulaires.



Figure 2.5 : Microscope à contraste de phase. Le dispositif repose sur un anneau de phase placé dans le
condenseur, et une plaque de phase située dans l'objectif. La plaque de phase est une lame de verre avec un
anneau opaque qui enserre une lame biréfringente quart d'onde.

On peut rendre compte de manière simple du principe du contraste de phase en considérant
l’interférence de deux ondes. Dans la figure 2.6, deux ondes de lumière sont représentées :"B"
est l'onde passant en dehors de l'objet de phase (c'est-à-dire qu’elle provient directement de
l'éclairage du fond), "O" est l'onde passant à travers l'objet. L’objet de phase n’absorbant pas,
ces deux ondes ont la même amplitude, mais à cause de la différence d’indice (ou épaisseur),
l’onde "B" retardée. Le résultat de l’interférence est l’onde "D" qui représente la différence
entre le fond et l'objet.



Figure 2.6 : Schéma simplifié du contraste de phase. L’onde "B" qui a traversé l’objet de phase est retardée par
rapport à l’onde "O". L’onde « différence » "D" est déphasée de λ/4 par rapport à "B".

Pour une petite différence de phase, l’onde "D" est toujours déphasée d'environ ¼ de longueur
d'onde. La différence de phase est donc de λ/4. Si on décale artificiellement l’onde "D" d'un ¼
de longueur d’onde supplémentaire et qu’on la fasse interférer avec "B", alors une nouvelle
onde "O" en résulte, mais avec une plus petite amplitude que "B". L'objet apparaît donc plus
foncé que le fond. Ainsi, la différence de phase normalement invisible a été convertie en
différence d'amplitude visible. Cet effet peut être accentué lorsque l’onde "B" est atténuée de
telle sorte que son amplitude devienne identique mais en opposition de phase avec celle de
l’onde "D". L'onde "O" est alors proche de zéro, ce qui équivaut à un assombrissement
31
maximal. Ce raisonnement est également valide si "D" n'est pas retardé, mais avancé en
phase, dans ce cas "O" devient plus clair que le fond plutôt que plus foncé.

Ainsi, le microscope à contraste de phase renseigne sur l'indice de réfraction des objets et sur
leurs détails. Le contraste de phase est dit positif si l’objet (par exemple des bactéries dans
une solution nutritive) d'indice de réfraction plus élevé apparaît plus sombre que le milieu qui
l’entoure. Dans le cas contraire, (par exemple des vacuoles, une membrane plasmique) les
objets apparaissent en clair sur fond sombre. La condition essentielle pour obtenir un bon
contraste de phase est que le déphasage par rapport à la longueur d'onde de la lumière utilisée
soit très faible (faible épaisseur des détails à observer et différence minime entre les indices de
réfraction). Si ce n'est pas le cas, des anneaux de diffraction gênants peuvent apparaître.
Notons cependant que le contraste de phase ne distingue pas entre une différence d’indice
optique et une différence d’épaisseur.

La figure 2.7 montre comment cela est réalisé en pratique. Le cache annulaire est placé dans
le plan focal avant du condenseur, dont l'image est à l'infini : un faisceau de lumière parallèle
sort du condenseur. La lumière venant du condenseur est divisée en deux par l'objet, un
faisceau non dévié et un faisceau dévié.



Figure 2.7 : Schéma décrivant le cheminement des faisceaux de lumière dans un microscope à contraste de
phase.
32

Formation de l'image du faisceau non dévié (à gauche sur la figure 2.7) : le faisceau de
lumière non dévié "B" continue son chemin parallèle et forme une image sur le plan focal
arrière de l'objectif.

Formation de l'image du faisceau dévié (à droite sur la figure 2.7) : le faisceau de lumière
dévié "D" sort de l'objet et forme une image à l'intérieur de l'oculaire, environ 160 mm au-
dessus de l'objectif.

Parce que ces deux images sont autant séparées, le faisceau "B" peut être utilisé en laissant le
faisceau "D" seul. L'objectif possède un plateau de phase annulaire spécial dans son plan focal
arrière, dont la grandeur correspond à l'image de l'anneau de phase du condenseur. Sur ce
plateau de phase, l’onde "B" acquiert le déphasage d’un ¼ de longueur d’onde supplémentaire
et est également atténué (l'anneau peut être observé en regardant à travers l'objectif).

Pour l’observation, on procède comme suit. On ajuste d’abord l'éclairage selon Köhler. En
fait, on peut laisser le diaphragme de champ ouvert car il n'est pas très effectif ici. Le
diaphragme du condenseur doit aussi être complètement ouvert. On sélectionne l'anneau de
phase correct pour l'objectif utilisé (10x, 20x, etc. comme indiqué sur le plateau du
condenseur), on insère le télescope de centrage et on centre l'anneau. Le centrage des anneaux
de phase est crucial comme rappelé sur la figure 2.8.



Figure 2.8 : Centrage pour le contraste de phase : A Diaphragme annulaire et anneau de phase centrés. B
Diaphragme annulaire clair masqué par l'anneau de phase sombre. C Diaphragme annulaire et anneau de
phase centrés mais diaphragme annulaire flou car le condenseur est réglé trop bas et les conditions de
l'éclairage de Köhler ne sont pas réalisées.

Le contraste de phase possède également des limitations. En premier, il n'est utile que pour les
objets de phase, c'est à dire : des objets fins qui n'absorbent que très peu la lumière. D’autre
part, le contraste de phase peut être la cause d’une perte de résolution. En effet, l'anneau de
phase dans le condenseur limite "l'angle d'admission" en dessous de l'angle maximum que
l'objectif utilise.

Pour des objectifs de 10x, 20x et 40x d'un système à contraste de phase, cette réduction est la
plupart du temps imperceptible ou acceptable, il arrive que l'anneau du plateau de phase
d’objectifs 100x, avec lesquels on souhaite avoir la plus grande résolution possible est
beaucoup trop petit dans bien des microscopes de routine. De tels objectifs ne résolvent plus
une diatomée du type Surirella gemma, qui est facilement résolue en champ clair (sans le
contraste de phase), même avec des objectifs d'ouverture numérique plus petite. On trouve
33
cependant des objectifs 100x à contraste de phase avec un anneau correspondant à une
ouverture numérique d'environ 0,9 qui procurent à la fois une bonne résolution et un bon
contraste. La figure 2.9 compare une image obtenue en microscopie en fond clair avec celle
réalisée en contraste de phase.



Figure 2.9 : Images en microscopie à fond clair à gauche et à contraste de phase à droite avec un objectif
ordinaire 20x 0,45 de cristaux de chlorure de strontium.


2.4- Microscopie en lumière polarisée

La microscopie en lumière polarisée est surtout une méthode analytique qui permet de
déterminer diverses propriétés optiques des cristaux. Dans un microscope polarisant, l’objet
est placé entre deux polariseurs croisés.

La microscopie en lumière polarisée permet l'observation d'objets biréfringents anisotropes.
Un filtre polariseur polarise la lumière issue du condenseur, c’est le polariseur, un second
polariseur croisé avec le précédent sélectionne la lumière polarisée dans une direction
perpendiculaire, c’est l'analyseur.

Un objet biréfringent caractérisé par ces deux indices optiques, respectivement indice
ordinaire et indice extraordinaire, partage un faisceau de lumière incident en deux faisceaux,
l’un le faisceau ordinaire suivant le chemin défini par l’indice ordinaire, l’autre, le faisceau
extraordinaire suivant le chemin défini par l’indice extraordinaire. Ces deux faisceaux sont
polarisés selon des directions perpendiculaires.

Comme ces deux rayons ont chacun une vitesse de propagation propre, une différence de
marche apparaît entre les deux rayons, induisant une différence de phase qui varie avec la
longueur d'onde. L’interférence des deux rayons génère une onde elliptique dont l’état de
polarisation dépend de la différence de marche.

Des structures biréfringentes en forme de bâtonnet placées entre deux filtres de polarisation
croisés apparaîtront quatre fois sous forme lumineuse lorsqu'on les fait tourner de 360°. Des
objets présentant une symétrie sphérique, comme les grains d'amidon ou les ponctuations
34
aréolées, font apparaître la croix sphérique caractéristique (Fig. 2.10). Les structures qui ne
sont pas biréfringentes restent invisibles.



Figure 2.10 : A gauche, images de grains d’amidon en microscopie de polarisation. A droite, on compare les
images de ponctuation aréolées dans du bois de pin observées en fond clair et entre polariseurs croisés.

Placée entre polariseur et analyseur croisés, une substance biréfringente peut aussi donner
naissance à l’apparition de colorations dépendant du déphasage entre les deux rayons et
conduire à des observations spectaculaires (Fig. 2.11).



Figure 2.11 : Observation de cristaux de bichromate de potassium en lumière polarisée.

Dans un domaine particulier de couleur, de très petits déphasages produisent une différence
marquée de couleur. Ce domaine se situe dans le rouge, à une longueur d'onde appelée
"premier ordre rouge".

Un filtre de premier ordre rouge placé entre le polariseur et l'analyseur augmente fortement
les différences de couleurs comme montré dans la figure 2.12.

Comme la microscopie à contraste de phase, la lumière polarisée permet de révéler des détails
normalement invisibles en fond clair.

35


Figure 2.12 : Structures vasculaires et microcristaux dans une peau d’oignon révélés en lumière polarisée et
par l’utilisation d’un filtre de premier ordre rouge.


2.5- Microscopie à contraste interférentiel différentiel « Nomarski »

Plusieurs types de microscopes à contraste interférentiel furent imaginés dans les années
1940-1950. Les microscopes conçus par F. Smith furent les premiers à utiliser des prismes de
Wollaston pour la séparation et la recombinaison des faisceaux. Un problème lié à l’utilisation
de prismes Wollaston conventionnels était que le prisme utilisé pour la recombinaison des
faisceaux devait être dans le plan focal de l’objectif, c’est à dire généralement dans l’objectif.

Biographie de Georges Nomarski

Georges (Jerzy) Nomarski est né en Pologne en 1919. Après des études à
l’Ecole Polytechnique de Varsovie, il se passionne pour l’optique et décide de
mener toute sa carrière dans cette voie. Il participa à la résistance polonaise et fut
fait prisonnier de guerre jusqu’en mars 1945. Nomarski entre ensuite à l’Université
de Louvain en Belgique où il sollicita le statut de réfugié politique en 1945. En
1947, il choisi la France comme résidence permanente.
Nomarski fut diplômé de l’Ecole Supérieure d'Optique (ESO) de Paris en 1949.
En 1950, il créa le Laboratoire de Microscopie Optique de l’Institut d’Optique
d’Orsay) et débuta comme Professeur de Microscopie à l’ESO à partir de 1953. Il
fut embauché comme chercheur au CNRS où il fut promu Directeur de Recherche
en 1965. Il est à l’origine de nombreuses inventions et auteur de plusieurs brevets à
son nom, dont le plus connu est celui du système DIC de microscopie à contraste
interférentiel différentiel qu’il développa dans les années 1950.
Sa carrière a été jalonnée de multiples récompenses. Il a reçu le prix du Duc d’Aumale décerné par
l’Académie des Sciences en 1952, le prix Gaumont de la Société d’Encouragement pour l’Industrie Nationale en
1963, le prix de la Société Microscopie de Chicago en 1970, le prix le plus prestigieux de la Société new-
yorkaise de Microscopie décerné à la mémoire d’Ernst Abbe en 1973.
En 1995, il a été récompensé pour toute sa carrière scientifique par la Médaille d’Or de la SPIE (Society of
Photo-optical Instrumentation Engineers) en hommage à l’importance et à l’impact de ses découvertes dans des
disciplines très différentes. Georges Nomarski prit sa retraite en 1980 et vécut à Antony, au sud de Paris où il
mourut le 17 février 1997.

La découverte décisive de G. Nomarski a été d’imaginer comment modifier le prisme de
Wollaston standard en sorte qu’il puisse être facilement placé à l’extérieur de l’objectif. Dans
36
un prisme de Wollaston modifié par Nomarski, les cristaux sont taillés obliquement à l’axe
optique ce qui permet au plan de localisation des franges d’être à l’extérieur du prisme et
donc, de pouvoir être placé dans le plan focal arrière de l’objectif.

Ainsi, le prisme de recombinaison peut être installé dans la tourelle porte-objectifs et le
dispositif de Nomarski est simple. Les premiers microscopes à contraste interférentiel
différentiel ont été produits et commercialisés par Carl Zeiss en 1965.

Le contraste interférentiel différentiel (DIC) également appelé contraste «Nomarski» est aussi
utilisé pour l'observation de préparations non colorées. Le principe repose sur la division d'un
rayon lumineux polarisé en deux rayons de même longueur d'onde, mais polarisés
orthogonalement et séparés spatialement d'une distance très courte (une fraction de la
longueur d'onde). La séparation en deux rayons est réalisée par un Wollaston (assemblage
particulier de deux cristaux biréfringents) comme montré sur la figure 2.13.

Ces deux rayons (nommés respectivement ordinaire et extraordinaire) traversent les
spécimens en deux points différents mais très proches. Suivant les milieux traversés par
chacun des deux rayons, par exemple cytoplasme pour le rayon ordinaire et la membrane
cytoplasmique pour l'extraordinaire, ceux-ci subissent un déphasage différent. Après
collection par l'objectif, les deux rayons sont re-combinés par un second Wollaston et
viennent interférer sur un filtre polariseur. Suivant la différence de phase entre les rayons, un
contraste positif ou négatif sera créé révélant ainsi les structures cellulaires.



Figure 2.13 : Microscope à contraste Nomarski. Le condenseur contient un filtre polariseur suivi d'un Wollaston
qui sépare le rayon ordinaire (trait plein) du rayon extraordinaire (trait pointillé). Après l'objectif, les deux
rayons sont superposés par un second Wollaston et un filtre polariseur croisé analyse la différence de phase
entre les deux rayons.

Comme le microscope à contraste de phase, le microscope interférentiel rend visibles les
petites différences d’indice optique présentes dans un objet optiquement mince, sous forme de
différences de couleur ou d’intensité.

Il existe plusieurs techniques pour réaliser un microscope interférentiel. A la différence du
microscope à contraste de phase mais comme le microscope en lumière polarisé, la
microscopie interférentielle fut d’abord développée comme une méthode analytique
permettant des mesures de grande sensibilité des propriétés optiques d’un objet. D’ailleurs, un
microscope polarisant est en réalité une forme de microscope interférentiel.

37
3- Microscopies optiques confocales

L'invention des méthodes de microscopie confocale photonique a été faite au milieu des
années 1950. A cette époque, Marvin Minsky se trouvait devant la nécessité d'observer des
cellules neuronales dans des coupes épaisses de tissus nerveux. En 1957, il mit alors au point
un prototype de microscope avec platine de balayage et doté de ce qui fut nommé à l'époque
un système de focalisation double. Ce dispositif fut rapidement baptisé système confocal.
Cette technique cependant resta longtemps inutilisée, car elle nécessitait l'emploi d'une source
ponctuelle délivrant une grande intensité lumineuse et l'image devait être formée sur un écran
à haute rémanence. En fait, il faudra attendre le début des années1980 où la production de
sources lasers à bas coût et le développement exponentiel de l'informatique permit que cette
technique innovante de microscopie trouve la place qu'elle occupe désormais dans le domaine
de la biologie.


3.1- Principe

La microscopie conventionnelle par épi-fluorescence, largement utilisée de nos jours en
biologie cellulaire, délivre des images qui malheureusement souffrent d'une résolution limitée
et apparaissent comme vues au travers d'une brume diffuse. En effet, le champ du microscope
est fortement éclairé par la source lumineuse et les fluorochromes sont excités au travers de
toute l'épaisseur de la préparation (Fig. 3.lA). Il en résulte que l'image formée par le
microscope est contaminée par de la lumière provenant de points situés hors du plan focal et
apparaît peu contrastée.



Figure 3.1 : Principes comparés de la microscopie conventionnelle par épi-fluorescence (A) et de la
microscopie confocale (B).

Le secret de l'imagerie confocale consiste à éliminer la lumière parasite hors focale. Dans le
plus simple des cas (Fig. 3.1B), ceci est obtenu en illuminant la préparation au moyen d'un
point lumineux dont le diamètre est limité par les lois de la diffraction de la lumière. Ainsi à
un instant donné, seule une infime partie du spécimen est fortement illuminée et va émettre de
la fluorescence. Les photons émis par les fluorochromes vont être détectés point par point
avec un tube photomultiplicateur durant le balayage de la préparation. Un trou d’aiguille
(appelé « pinhole ») placé devant le photodétecteur et centré au niveau du foyer arrière de
l'objectif rejette la lumière parasite provenant des points situés hors du plan focal. Le nom
'confocal' provient de la mise en correspondance de trois points: la source lumineuse
ponctuelle (en général une source laser), le point illuminé situé au foyer avant (ou foyer
'objet') de l'objectif et le pinhole situé au foyer arrière (ou foyer 'image').
38

Le rôle du trou d’aiguille est déterminant pour garantir la résolution et le contraste de
l’instrument comme illustré sur la figure 3.2.



Figure 3.2 : Illustration du rôle du diaphragme de détection dans la résolution du microscope confocal.

Le diaphragme de détection peut être un diaphragme à iris permettant d'ajuster le volume
élémentaire analysé par la sonde laser. Outre le respect des conditions d'optique classique
(choix de la longueur d'onde, ouverture numérique maximale de l'objectif), la résolution
spatiale maximale est obtenue par l'ajustement du diamètre du pinhole à la limite de
diffraction, c’est à dire lorsqu’il est égal au diamètre de la tache d'Airy.


3.2- Formation de l'image confocale

Comme dans tout instrument d’optique, le microscope confocal obéit aux limitations
imposées par les lois de la diffraction lumineuse. Cependant, la configuration confocale
procure un gain en termes de résolution axiale et radiale par rapport à la microscopie
conventionnelle, comme illustré sur la figure 3.3.



Figure 3.3 : Comparaison entre les fonctions d'étalement du point (PSF) en microscopie conventionnelle (à
gauche) et en microscopie confocale (à droite). Les intensités sont en négatif pour une meilleure lisibilité.

39
Rappelons que la PSF dans le plan focal, notée h
i
(x,y), décrit la façon dont la lumière qui
idéalement devrait rester concentrée en un point est étalée par diffraction autour de ce point.
En théorie du signal, on dirait que la PSF est la fonction de transfert du système optique
(« Optical Transfer Function », OTF). Appliquée à une source ponctuelle o(x,y), l’image
i(x',y') après traversée d’un système optique sans aberration s'exprime sous la forme :

i(x',y') = o(x,y)⊗h
i
(x,y) (3.1)

où le symbole ⊗ est l'opérateur de convolution.

De même, on peut introduire la PSF de défocalisation, h
0
(x,y), qui décrit la façon dont la tache
d’Airy est altérée lorsque déplace l'objet le long de l'axe optique Z. L’image « complète » en
3D s’exprime alors sous la par la relation :

i(x',y') = o(x,y)⊗h
i
(x,y)⊗h
0
(x,y,∆z) (3.2)

où ∆z représente l'éloignement de l’objet par rapport au foyer de la lentille. Les deux PSF,
axiale et radiale, peuvent être fusionnées en une seule h(x,y,z), représentant la PSF
tridimensionnelle de l'objectif :

i(x',y',z') = o(x,y,z)⊗h(x,y,z) (3.3)

3.2.1 Amélioration de la résolution en microscopie confocale

Résolution axiale en x,y

L’adjonction d’un pinhole entraîne une amélioration de la résolution latérale. La formule du
pouvoir séparateur latéral devient dans le cas du microscope confocal :

d
min
≈ 0,46.
NA
λ
(3.4)

à comparer avec la relation 1.24 obtenue pour un microscope conventionnel. On remarque
cependant que l'amélioration de la résolution latérale n'est pas spectaculaire.

C'est plutôt au niveau de la résolution axiale et du pouvoir de sectionnement que se situe
l'avantage de la microscopie confocale.

Résolution radiale en z

On évalue la résolution axiale d’un microscope confocal en mesurant la décroissance en
intensité le long de l'axe Z pour un objet idéalement ponctuel. La profondeur de champ (ou
résolution axiale) sera définie comme la largeur à mi-hauteur du profil d'intensité (en Z).
Ainsi on constate que la profondeur de champ en microscopie confocale, est diminuée d'un
facteur 1,4 par rapport à la microscopie conventionnelle. La résolution axiale d
z
en
microscopie confocale s'exprime par la relation :

d
z
= 1,77.
2
) (NA
λ

(3.5)
40

On note que la résolution axiale est inversement proportionnelle au carré de l'ouverture
numérique de l'objectif. Il est donc impératif d'utiliser des objectifs à grande ouverture
numérique pour obtenir le meilleur sectionnement optique.

On notera que la résolution spatiale d’un microscope confocal est anisotrope, en ce sens que
la résolution latérale (d
xy
) et la résolution axiale (d
z
) ont des valeurs différentes pour une
même longueur d'onde λ, un même indice de réfraction n et une même ouverture numérique
NA.

En pratique, et selon l'ouverture numérique de l'objectif, la résolution est 2,5 à 4 fois moins
fine dans la direction axiale que latéralement.

Le sectionnement optique se définit comme la décroissance de la quantité totale de lumière
présente dans le plan focal à mesure que l'on s'éloigne d'un objet lumineux ponctuel.
Autrement dit, cela consiste à intégrer pour chaque position z la PSF de défocalisation.



Figure 3.4 : Propriété de sectionnement optique en microscopie conventionnelle (pointillés) et microscopie
confocale (continu). Les courbes représentent les valeurs de l'intensité de la lumière intégrée (c'est-à-dire
sommée) dans des plans parallèles xy en s'éloignant graduellement du plan focal. Les images sont présentées en
contraste négatif.

La figure 3.4 représente les courbes de sectionnement optique obtenues en intégrant la
lumière dans les plans (xy) successifs. Dans le cas de la microscopie conventionnelle,
l'intensité lumineuse intégrée reste constante quelque soit la défocalisation. Au contraire, dans
le cas de la microscopie confocale, on observe une chute rapide de l'intensité intégrée à
mesure que l'on s'éloigne du point source. Le pinhole remplit donc parfaitement son rôle
sélectif en rejetant la lumière "hors focale".

Cette propriété de sectionnement optique du microscope confocal est parfaitement illustrée
par la figure 3.5A. Sur cette figure sont représentées des coupes optiques sériées réalisées au
travers d'une cellule vivante en culture dont les mitochondries ont été colorées au moyen d'un
fluorochrome spécifique(rhodamine 123). Les coupes optiques sont obtenues en montant la
platine porte-objet d'un pas de 2 µm entre l'enregistrement de chaque plan.
41


Figure 3.5 : Comparaison entre microscopie confocale (rangée du haut) et microscopie conventionnelle (rangée
du bas). A : Quatre sections optiques transversales (xy) séparées de 2 µm au travers d'une cellule in vitro dont
les mitochondries ont été colorées par la rhodamine 123. B : Section optique axiale (xz), la ligne en pointillé
indique la position du support en verre. Le contraste a été inversé pour faciliter la visualisation des images.

La rangée supérieure présente les coupes acquises en mode confocal et la rangée inférieure
montre les coupes correspondantes acquises en mode conventionnel. La différence entre les
deux modes apparaît très évidente.

Dans les coupes confocales, les mitochondries sont très bien résolues, elles s'amassent dans le
cytoplasme tout autour du noyau cellulaire qui est vide de tout marquage. Chacune des coupes
apporte une information différente de celle de ses voisines.

En mode conventionnel, les mitochondries sont plus difficiles à distinguer. Elles apparaissent
comme noyées dans une brume diffuse due au fond de fluorescence émis par les plans
adjacents. La figure 3.5B illustre une autre possibilité de sectionnement conférée par le mode
confocal. En effet, il est possible de réaliser un sectionnement axial, c'est-à-dire d'effectuer
une coupe optique selon un plan parallèle à l'axe optique du microscope. Là encore, le mode
confocal se montre très supérieur au mode conventionnel. Cependant, on notera que l'image
obtenue présente un léger flou dans la direction axiale.

Qu'en est-il de la résolution réelle? Elle est toujours altérée par différents facteurs liés au
système optique réel et les constructeurs fournissent généralement une information sur les
résolutions maximales possible selon la configuration utilisée. En pratique, il est souvent
nécessaire de contrôler ces valeurs du constructeur à l'aide de tests optiques relativement
simples.

Ainsi avec λ = 488 nm et NA = 1,4, la résolution maximale théorique d’un microscope
confocal serait de 160 nm dans le plan (xy). En fait, elle est moins bonne que la valeur donnée
par le constructeur : 212 nm pour un objectif 100x/NA1,4.

Notons que l'épaisseur d’une membrane plasmique est d'environ 10 nm selon les types
cellulaires, ce qui veut dire que l’on est bien en deçà de la résolution maximale du microscope
confocal le plus performant soit-il !

Un dernier paramètre à prendre en compte dans le domaine de la résolution est l'épaisseur des
structures que l'on observe. Il est communément admis qu'une épaisseur maximale d'environ
50 µm constitue la limite pour la microscopie confocale mono-photonique. Au-delà de cette
valeur la dispersion de la lumière par le milieu traversé devient trop importante pour pouvoir
assurer une bonne résolution. D'autre part la dégradation du rapport signal sur bruit devient
42
également prohibitive. Par contre, en mode multi-photonique, du fait de l'illumination infra-
rouge, cette épaisseur peut atteindre 400µm.

3.2.2 Traitement et déconvolution de l’image confocale

Nous avons vu que l’objectif du microscope comme toute lentille effectue instantanément une
opération de convolution (éq. 3.3). En principe, par une opération de déconvolution de
l’image, il pourrait être possible de restituer l’objet et d’éliminer les effets de diffraction dus à
l’objectif comme symboliquement représenté sur la figure 3.6.



Figure 3.6 : L'image d'un point n'est pas un point, mais une tache dite d'Airy. Est-il possible par un procédé
inverse de reconstituer l’objet par déconvolution ?

En connaissant la fonction de restitution des fréquences spatiales d'un objet ponctuel, c’est à
dire la « Point Spread Function », PSF ou ce qui est équivalent, la « Optical Transfer
Function », OTF caractéristique d'un système optique donné, on doit pouvoir réassigner
chaque photon détecté à son point objet-source. C'est le sens des calculs de déconvolution en
3D symbolisés par la flèche retournant vers la droite dans la figure 3.6. Cette idée est à
l’origine de ce que l’on appelle parfois la super-résolution directement relié à l’optique dite de
Fourier qui n’est autre que la transposition à l’optique de méthodes d’analyse fréquentielle
utilisée en électrique. On parle aussi de problème de la diffraction inverse.

Il existe de nombreux algorithmes, souvent appelés algorithmes de restauration d’images, qui
permettent d’effectuer ces calculs de déconvolution. On peut citer par exemple :
• L’algorithme d’estimation du maximum de ressemblance (« Maximum Likelihood
Estimation », MLE),
• L’algorithme de itératif avec contraintes de restauration de Tikhonov-Miller
(« Iterative Constrained Tikhonov-Miller Restoration », ICTM),
• L’algorithme non-itératif de Tikhonov-Miller (« Non-iterative Tikhonov-Miller
Algorithm », QTM).

En fait, il importe surtout de savoir que cette opération se heurte à deux types de problèmes
fondamentaux et en principe quasiment insurmontables.

43
Le premier problème est d’ordre mathématique. Si une transformée de Fourier inverse est tout
à fait légitime, il faut rappeler que l’opération de convolution est associée à la transformée de
Laplace et non à la transformés de Fourier. Il a été démontré qu’en toute rigueur, sans
hypothèses à priori, la transformé de Laplace inverse n’est pas possible. Bien sûr, en pratique,
on peut souvent justifier de remplacer Laplace par Fourier et résoudre ainsi la déconvolution.

L’autre problème est dû aux bruits de toute nature qui perturbent l’acquisition d’une image.
Ces bruits toujours présents sont difficiles à éliminer et sont sources d’instabilités dans le
traitement des données par des moyens informatiques.


3.3- Réalisation d’un microscope confocal

Les microscopes confocaux sont conçus pour travailler en réflexion ou en épi-fluorescence.
Ces modes et plus particulièrement l'épi-fluorescence constituent la voie la plus facile pour
réaliser la confocalité dans un microscope puisque l'optique d'illumination est la même que
celle d'observation.

De plus, en utilisant la fluorescence, comme les longueurs d'onde des lumières d'excitation et
d'émission sont toujours décalées à cause du déplacement de Stokes, on peut les séparer à
l'aide d'un miroir dichroïque. Ces miroirs réfléchissent la lumière d’une longueur d’onde
inférieure ou égale à une certaine longueur d'onde mais laissent passer la lumière de longueur
d'onde supérieure. Cela permet d'obtenir un très bon rapport signal/bruit puisqu'en épi-
fluorescence il sera relativement facile d’obtenir des taux élevés de réjection de la lumière
d'excitation.

La conjugaison d’un point source dans l’échantillon illuminé par au point focal d’un faisceau
laser avec le diaphragme de détection situé dans le plan focal de l’objectif définit un plan de
coupe optique dans l’échantillon. Le passage du faisceau lumineux par un diaphragme de
taille très inférieure au champ d'observation oblige à effectuer un balayage de la surface du
champ pour reconstruire une image de l’objet étudié.

La microscopie confocale est une microscopie à balayage. De manière très générale, on peut
considérer qu’il existe deux types d'imagerie à balayage :

Imagerie à balayage dans le plan image : l'image de l’objet est focalisée directement
sur la surface sensible du capteur. Ce capteur qui peut être soit un tube vidéo type VIDICON
ou une matrice à éléments CCD analyse l'image formée en la parcourant ligne par ligne et de
haut en bas.

Imagerie à balayage dans le plan objet : dans ce cas, c'est la préparation elle-même
qui est parcourue par un point lumineux (tache de lumière focalisée). L'interaction de ce point
lumineux avec le spécimen est enregistrée au vol par un détecteur soit un tube
photomultiplicateur ou une photodiode à avalanche. L'image du champ analysé point par
point est recomposée électroniquement point par point sur l'écran d'un oscilloscope (ou sur un
moniteur vidéo) ou numériquement dans la mémoire d'un ordinateur. Le balayage de l'objet
est obtenu soit en utilisant un point lumineux fixe et en déplaçant l'objet sous l'objectif du
microscope, soit en gardant l'objet fixe et en déviant le point lumineux.

44


Figure 3.7 : Schéma de principe d’un microscope confocal.

Dans un microscope confocal tel que celui schématisé sur la figure 3.7, ce balayage peut se
faire de plusieurs façons.

Le faisceau laser d’excitation étant fixe, on peut simplement déplacer la platine supportant la
préparation d’abord en (X,Y) pour réaliser une première coupe optique, puis la déplacer selon
Z pour accéder à un plan voisin. Cette technique est trop lente pour la reconstruction d’une
image et elle n’est pas utilisée dans les instruments commerciaux.

Il est bien préférable de reconstruire l’image de l’objet point à point par balayage du champ
analysé dans le plan (X,Y) à l'aide de miroirs de déflection de la source lumineuse. Cette
technique est bien plus rapide pour l’obtention d’une image. Une platine motorisée sert
seulement à déplacer la préparation suivant l'axe Z permettant la saisie de différents plans
optiques dans l'épaisseur de l'objet. Les images ainsi formées sont stockées sur la mémoire de
masse d'un ordinateur pour servir ensuite à la reconstruction d’une image en 3 dimensions.

Commercialement, il existe deux types principaux de microscopes confocaux à balayage : les
microscopes à balayage laser et les microscopes à disque de Nipkow.

3.3.1 Microscope confocal à balayage laser (MCB)

Le dispositif le plus courant de microscope confocal à balayage laser est décrit sur la
figure 3.8. Il s'agit d'un système d'épi-illumination où la source de lumière est constituée par
un rayon laser. La lumière est envoyée vers un objectif à grande ouverture numérique
(NA>1,0) par réflexion sur un miroir dichroïque.

45


Figure 3.8 : Principe d'un microscope confocal à balayage laser.

Avant l'objectif le rayon passe par un couple de miroirs de déflexion montés sur des axes de
bascule orthogonaux, non représentés sur la figure 3.8. Les angles formés par ces miroirs
déterminent la position en X et Y du point lumineux après la traversée de l'objectif. Le
spécimen peut être balayé point par point en faisant varier ces angles somme schématisé sur la
figure 3.9.



Figure 3.9 : Principe du balayage en X,Y du spot laser pour exciter tout un plan de l’échantillon.

Le signal de fluorescence émis par chaque point à une longueur d’onde différente de la
longueur d’onde d’excitation passe à travers le miroir dichroïque et est détecté à travers le
diaphragme de détection par le photomultiplicateur.

46


Figure 3.10 : Schéma complet d’un microscope confocal à balayage laser.

L'image est ensuite reconstruite par des moyens de calcul informatique en additionnant tous
les signaux obtenus après le balayage du plan. Un système complet tel celui représenté sur la
figure 3.10 est ainsi équipé d’un ordinateur puissant ou d’une station de travail pour contrôler
les différentes fonctions de balayage et réaliser rapidement les opérations nécessaires de
reconstruction et de traitement d’image. Un tel microscope permet la reconstitution d’images
tri-dimensionnelles.

3.3.2 Microscope confocal à disque de Nipkow

Dans cette approche, on réalise un balayage quasi instantané de tout le champ grâce à la
rotation rapide à plus de 300 tours/sec d'un disque de Nipkow placé dans le champ image de
l'objectif. Un disque de Nipkow est percé d'un grand nombre de micro-diaphragmes disposés
de façon à recouvrir la totalité du champ à chaque rotation (Fig. 3.11).



Figure 3.11 : Représentation schématique d’un disque de Nipkow.
47

Dans ce type de microscope, l’illumination est effectuée au travers de ce disque en lumière
blanche par une source de lumière étendue couvrant un rayon du disque de Nipkow. La
récupération du signal "confocal" est effectuée par une caméra d'acquisition classique
permettant l’obtention d’une image quasiment en temps réel (Fig. 3.12). Cette stratégie
permet l'acquisition en mode confocal d'événements rapides sans compromettre la haute
résolution du mode confocal. Un disque de Nipkow peut être équipé d'une micro-lentille sur
chacun des diaphragmes pour mieux récupérer la lumière émise par le point source et
augmenter ainsi la sensibilité de l’instrument.



Figure 3.12 : Principe d'un microscope confocal à balayage du type Tandem (tandem scanning). L'exploration
du spécimen est obtenue par la rotation d'un disque de Nipkow (à droite) percé de milliers de trous disposés
selon des spirales d'Archimède imbriquées.

D'autres dispositifs apparentés existent qui font appel à des circuits intégrés à micro-miroirs,
une technologie développée à l’origine pour les systèmes de vidéo projection.

3.3.3 Description d’un microscope confocal inversé commercial

Il s’agit du microscope confocal inversé modèle SP2 de Leica (Fig. 3.13). La configuration
retenue comprend plusieurs sources laser pour permettre d'analyser simultanément 2 ou 3
fluorochromes différents, sans interférences, et un analyseur spectral qui permet d’offrir
également une souplesse sur la définition des fenêtres pour la détection de la fluorescence.

Ce microscope permet de cerner les propriétés in situ de fluorophores naturels ou extrinsèques
(comme la fameuse « Green Fluorescent Protein » ou GFP par exemple) et de développer une
imagerie ratiométrique, permettant notamment la lecture de flux ioniques au sein de systèmes
vivants. Ce dispositif est particulièrement apprécié en biologie végétale étant donné
l'importance de la fluorescence intrinsèque dans de nombreux cas.

48


Figure 3.13 : Vue éclatée du microscope confocal Leica SP2.

49
L'équipement comprend également des objectifs à eau (entre autres), facilitant le travail sur
des tissus épais et sur des tissus perfusés, le photo-blanchiment de zones amorphes pour
l'expérimentation en FRAP
?
et FLIP
?
concernant la communication entre cellules, entre
compartiments et mouvements d'organites, et une platine électronique à mémorisation de
points permettant le suivi de différentes cellules ou zones sur une cinétique longue (études en
multiplex). Des logiciels 3D et d'analyses cinétiques sont disponibles avec cet appareil.


3.3- Exemples d’applications

La microscopie confocale possède de nombreux avantages par rapport à la microscopie
conventionnelle. Tout d'abord la faible profondeur de champ (0,5 - 1,5 µm) du microscope
permet d'obtenir une image d'un plan focal, réalisant ainsi une coupe optique avec une
définition bien supérieure à celle obtenue avec un microscope conventionnel. En outre le bruit
de fluorescence dû au fond de l’échantillon est pratiquement éliminé. Il en résulte une très
bonne sensibilité de détection, une augmentation du contraste et une "clarification" des
images.

Un autre avantage du microscope confocal est que l'on peut obtenir des coupes optiques non
seulement dans le plan X,Y mais également suivant un plan parallèle à l'axe optique (plan
X,Z) qui peuvent ainsi permettre de réaliser des reconstructions tridimensionnelles. Ces
coupes optiques n'affectent en rien l'intégrité de l'échantillon biologique contrairement aux
coupes physiques nécessaires en microscopie photonique et électronique. En outre,
l'acquisition numérisée des images permet sur station de traitement d'images, d'accroître les
possibilités d'analyse et de quantification.

Les applications principales de la microscopie confocale concernent la biologie. La
configuration la plus communément adoptée est celle du microscope confocal à balayage laser
(Laser Scanning Confocal Microscope) travaillant en épi-fluorescence.

En principe rien n'oblige à l'utilisation de la fluorescence et certaines applications en science
des matériaux utilisent de la lumière blanche réfléchie mais c'est au détriment de la résolution.
Pour ce qui concerne les biologistes, c'est l’épi-fluorescence qui constitue la voie d'approche
privilégiée, surtout parce que des techniques comme l'immunofluorescence offrent par nature
une très grande précision dans le positionnement des marquages sur les structures biologiques.

Les longueurs d'ondes d'excitations sont généralement multiples soit en utilisant des lasers
multi raies, soit en utilisant plusieurs lasers. En combinant les propriétés des miroirs, des
filtres dichroïques et des filtres d'émission, on peut sélectionner telle ou telle bande
d'excitation, séparer les longueurs d'ondes émises et récupérer la lumière dans telle ou telle
zone spectrale.

L'utilisation de traceurs fluorescents très spécifiques permet de localiser in situ avec une
résolution spatiale de l'ordre quelques centaines de nanomètres, des composants
macromoléculaires tels qu’acides nucléiques ou protéines, mais également des petites
molécules telles que des peptides, des lipides et même des ions. Les figures 3.14 et 3.15
montrent deux exemples de marquage par des marqueurs fluorescents de couleurs différentes.


?
Voir la signification de FRAP et FLIP dans le glossaire en annexe.
50


Figure 3.14 : Images stéréoscopique d’une préparation soumise à un triple marquage en Actine (rouge),
Clathrine (vert) et Tubuline (bleu). Vous pouvez faire apparaître la sensation de relief en en louchant
légèrement pour superposer visuellement les deux images.




Figure 3.15 : Images obtenues en microscopies confocales où l’usage de marqueurs fluorescents et de filtres
appropriés permet de séparer les différents constituants d’une structure complexe.

Malgré ses avantages, la microscopie confocale a aussi ses limites et ses désavantages. Tout
d’abord, le faisceau laser pouvant être absorbé dans l’échantillon, on peut avoir une perte de
signal en pénétrant dans les couches plus profondes de l’échantillon. D’autre part, l’excitation
de la totalité de l’épaisseur de l’échantillon à chaque balayage pour reconstruire une image en
3 dimensions peut conduire au photo-blanchiment des fluorochromes utilisés comme
marqueur sous l’effet de la densité d’irradiation présente au point focal du faisceau laser.
Enfin dans le cadre de l’examen de tissus biologiques vivants, les densités d’irradiation
nécessaires peuvent aussi être cause de cytotoxicité, c’est à dire d’une activité toxique capable
de tuer certaines cellules.

51
52
4- Microscopies optiques en champ proche

Le microscope «à champ proche» dit encore «microscope tunnel optique» est issu de la
longue histoire de l’onde évanescente de Fresnel. Certains précurseurs, comme A.E. Synge
dès 1928, J.A. O'Keefe en 1956 puis E.A. Ash et G. Nicholls en 1972 avaient imaginé la
possibilité de franchir la «limite» de Rayleigh. Ils avaient aussi proposé des dispositifs
capables de récupérer quelques informations concernant des objets sub-longueur d'onde.

Il est ainsi très intéressant de rappeler les spéculations de Synge qui entretint une
correspondance avec A. Einstein sur la possibilité d’utiliser des dispositifs avec des colloïdes
d’or, des cônes de quartz métallisés comme sondes locales (Fig. 4.1).



Figure 4.1 : Trois idées spéculatives émises dans le débat entre Synge et Einstein pour accroître la résolution
spatiale d’un microscope optique.

Ce n'est cependant qu'au début des années 80, grâce aux travaux de D.W. Pohl et al. et U.
Fischer en Europe, de G.A. Massey et E. Betzig aux Etats-Unis, de D. Courjon et al. à
Besançon, puis de bien d’autres groupes que se sont vraiment développées les techniques
permettant de franchir ce qui, de simple "critère" à l'origine, était devenu une "limite
infranchissable".

Ce glissement de vocabulaire, qui avait fini par stériliser toute idée de recherche d'une
meilleure résolution, est d'autant plus intéressant à souligner que E. Abbe, qui est à l'origine
de la formulation du critère de Rayleigh, n'a lui-même jamais considéré qu'il puisse s'agir
d'une limite définitive. Il écrivait ainsi en 1876 : "Il se peut que dans l'avenir, l'esprit humain
découvre des processus et des forces permettant de franchir ce mur qui nous parait
actuellement infranchissable. Je pense personnellement que cela se fera. Mais en même
temps, je crois que quel qu'il soit, l'outil qui nous permettra d'étudier l'infiniment petit de
manière plus efficace que notre microscope actuel n'aura en commun avec lui que le nom". Il
est inutile de souligner la pertinence de cette remarque : le microscope à champ proche n'a
rien à voir avec les microscopes classiques.


4.1- Ondes évanescentes

L'imagerie optique classique trouve une limite dans l'impossibilité de séparer les images de
deux objets éloignés d'une distance inférieure à la demi-longueur d'onde du rayonnement
utilisé. En effet, le critère de Rayleigh stipule que deux points ne sont vus séparément que si
la distance qui les sépare est supérieure à λ/(2nsinθ), où λ est la longueur d'onde du
rayonnement utilisé, n est l'indice optique du milieu ambiant et θ est le demi-angle d'ouverture
53
du système optique imageur. Ce résultat, exprimé sous la forme d'un critère, se retrouve dans
le principe d'indétermination de Heisenberg.

Pour cette raison, les microscopistes ont longtemps pensé qu'il ne serait jamais possible de
descendre en dessous de la limite imposée par le critère de Rayleigh et donc d'observer des
objets de dimension sub-longueur d'onde. En fait, les relations d'incertitude ne limitent en
rien la résolution théorique d'un instrument ; elles nous indiquent seulement quelle précision
nous pouvons espérer sur la position d'un objet pour une valeur donnée du vecteur d'onde. Si
le vecteur d'onde utilisé pouvait être infini, la résolution serait infinie. On voit donc où se
situe le paradoxe d'une super-résolution : les ondes progressives vérifient toujours la relation
d'indétermination ; elles ne peuvent donc conduire qu'à une résolution vérifiant le critère de
Rayleigh. Rien n'interdit pourtant de dépasser ce critère.

4.1.1 Introduction

Le phénomène de réflexion totale frustrée est bien connu. Il s’observe lorsque la lumière se
propage dans un milieu d’indice de réfraction n
1
pour se réfléchir sur un milieu d’indice
n
2
<n
1
, dès que l’angle d’incidence θ
1
du faisceau est supérieur à une valeur critique θ
c
définie
par la relation n
1
sinθ
c
= n
2
. Dans un tel cas, toute l’énergie incidente se trouve réfléchie vers
le premier milieu et on parle alors de «réflexion totale». Malgré cette «réflexion totale» de la
lumière, on peut constater néanmoins l’existence d’une perturbation électromagnétique dans
le second milieu où il est malgré tout possible de détecter une onde.

A cause de sa structure particulière qui lui impose de ne se propager qu’au voisinage
immédiat de la surface de séparation des deux milieux, cette onde est dite «évanescente». La
figure 4.2 indique la manière de générer une onde évanescente soit propagative le long de la
surface, soit stationnaire.



Figure 4.2 : Champs évanescents utilisés pour générer localement une source non-radiative. A gauche, l’onde
évanescente se déplace selon la direction x. A droite, l’onde évanescente est stationnaire.

La première vérification expérimentale de l’existence de ce type d’onde est attribuée à
Newton. Cette expérience se répète aisément avec les moyens actuels. Envoyons un faisceau
laser sous un angle d’incidence supérieur à l’angle critique θ
c
dans un prisme «à réflexion
totale» et approchons de sa surface une lentille plan convexe dont la courbure est tournée du
coté du prisme. Dès que la distance qui sépare la lentille et le prisme est inférieure à
l’équivalent d’une demi-longueur d’onde, donc avant le contact des deux milieux, une partie
de la lumière jusque là totalement réfléchie dans le prisme, est maintenant transmise dans la
lentille. On dit que la réflexion totale est «frustrée».
54

Lorsque la lentille est posée sur le dioptre, une tache de lumière peut être observable sur un
écran placé au-delà de la lentille. Si au lieu d’un laser monochromatique, on utilise un
faisceau de lumière blanche, on observe alors que cette tache est irisée : son centre est blanc
alors que ses bords sont rouges. Cette zone périphérique correspondant à celle où la distance
dioptre-lentille est la plus grande, cette observation indique que la lumière rouge est capable
de franchir une couche d’air plus épaisse que les autres couleurs du spectre : le phénomène de
«frustration» de la réflexion totale dépend de la longueur d’onde et peut se réaliser sur des
épaisseurs d’autant plus importantes que la longueur d’onde est grande.

Après Newton, l’onde évanescente a été étudiée en détail par Fresnel. Depuis, la seule
découverte importante fut faite en 1947 par Goos et Hanchen qui avaient mis en évidence un
déplacement longitudinal du faisceau lors de la réflexion totale. Aujourd’hui, elles sont à la
base d’un domaine à part entière de l’optique appelée «optique du champ proche». Ce
domaine qui concerne des phénomènes lumineux observables sur des zones spatiales très
inférieures à la longueur d’onde s’inscrit tout naturellement dans le champ de la physique
mésoscopique, des nanosciences et des nanotechnologies.

4.1.2 Les ondes évanescentes de Fresnel

La description ondulatoire de la lumière permet une description du phénomène. Rappelons
tout d’abord qu’une onde qui remplit les conditions de propagation dans l’air est dite
progressive ou homogène. Par contre, une onde qui ne remplit pas ces conditions ne peut se
propager dans l’air et reste confinée sur la surface, elle est dite alors évanescente. Comme
toute onde, l’onde évanescente est définie par son vecteur d’onde et sa polarisation.

Le vecteur d'onde de l'onde évanescente

Soient deux milieux diélectriques d’indices respectif n
1
et n
2
<n
1
et Oxyz un système de
référence dans lequel le dioptre séparant les deux milieux correspond au plan Oxy. Le plan
d’incidence est le plan Oxz. Les composantes du vecteur d’onde de la partie transmise d’une
onde plane qui se propage initialement dans le milieu n
1
et qui se réfléchit sur le dioptre avec
un angle d’incidence θ
1
s’écrivent :

1
2 2
1
2
2 z
y
1 1 2 2 x
T
sin n n
c
K
0 K
sin n
c
sin n
c
K
k K
θ −
ω
=
=
θ
ω
= θ
ω
=
≡ ≡
r r

(4.1)

La structure de l'onde transmise dans n
2
dépend donc du caractère réel ou imaginaire de K
z
.
Ce terme est réel lorsque 0<n
1
sinθ
1
<n
2
mais il devient imaginaire pur dès que n
1
sinθ
1
>n
2
. Il y
a alors réflexion totale de la lumière sur le dioptre et l’onde transmise dans le second milieu
est évanescente. Pour simplifier, nous nous limitons dans la suite au cas particulier où n
2
=1.
Dans ce cas, les composantes du vecteur d’onde de l’onde évanescente s’écrivent :

55
K
~
1 sin n
c
K
0 K
c
sin n
c
sin
c
K
k K
1
2 2
1 z
y
1 1 2 x
T
i i ≡ − θ
ω
=
=
ω
> θ
ω
= θ
ω
=
≡ ≡
r r

(4.2)

En utilisant ces valeurs, on notera que le module du vecteur d’onde est :
c / 1 sin n 2 ) c / ( k
1
2 2
1
T
ω > − θ ω =
r
,
Bien qu’il soit plus grand que ω/c, le produit scalaire du vecteur d’onde avec lui-même reste
bien égal à ω/c : c / k . k
T T
ω =
r r
, comme c’est le cas pour toute onde électromagnétique se
propageant dans le vide.

En résumé :

- le vecteur d’onde de l’onde évanescente est complexe ;

- sa composante parallèle au dioptre K
x
vérifie la propriété inhabituelle d’être en
module supérieure à ω/c dans le vide (alors que pour une onde progressive
homogène aucune des composantes du vecteur d’onde ne peut y être supérieure à
cette valeur) ;

- sa composante perpendiculaire au dioptre K
z
est imaginaire pure.

A cause de cette dernière propriété, l’amplitude de l’onde évanescente décroît
exponentiellement en fonction de z. En effet, si on porte l’éq. 4.2 dans l’expression usuelle
d’une onde plane, on obtient l’équation générale d’une onde évanescente d’amplitude
T
E
r
:

) t x K ( exp ) z K
~
exp( E ) t z K x K ( exp E E
x
T
z x
T
ω − − = ω − + = i i
r r r
(4.3)

Ainsi l’onde évanescente, qui a une structure progressive dans la direction Ox, voit-elle son
amplitude décroître exponentiellement dans la direction Oz (Fig. 4.3).



Figure 4.3 : Schéma de réflexion totale interne et structure de l’onde évanescente.

56
C’est à cause de cette décroissance exponentielle que l’onde évanescente n’est détectable qu’à
une distance très faible de la surface de séparation des deux milieux. Par convention sa
«profondeur de pénétration» δ dans le second milieu (ici l’air) est définie comme la distance
pour laquelle son amplitude ) z K
~
exp( E
T

r
devient égale à e / E
T
r
soit :

1 sin n 2
K
~
1
1
2 2
1
− θ π
λ
= = δ
(4.4)

La polarisation de l'onde évanescente

Dans le cas d'une onde transverse électrique (TE), la polarisation de l’onde évanescente ne
présente pas de caractéristique particulière. Tel n’est plus le cas pour une onde transverse
magnétique (TM). Dans le système de référence Oxyz, le vecteur polarisation de l’onde
incidente sur le dioptre s’écrit dans le premier milieu ε ) sin , 0 , cos (
1 1
I
θ θ − =
r
. La polarisation
de l’onde transmise dans le second milieu s’obtient à partir de cette expression en utilisant les
lois de Snell-Descartes. On obtient ) sin n , 0 ,
1 1 1
2
θ θ sin n 1 (
2
1
T
TM
− − = ε
r
. Quand n
1
sinθ
1
>n
2
= 1,
c’est à dire dans le cas d’une onde évanescente, cette expression devient :

1 sin n
0
1 sin n
1 1 z
y
1
2 2
1 x
T
TM
> θ = ε
= ε
− θ − = ε
= ε
i
r

(4.5)

On notera qu’alors que la polarisation de l’onde incidente sur le dioptre était rectiligne
(polarisation TM) :

- la polarisation de l’onde évanescente est elliptique, puisque les deux composantes
E
x
et E
z
du vecteur polarisation ont une longueur différente et qu’elles sont
déphasées de π/2;

- cette ellipse est située dans le plan d'incidence Oxz (alors qu’usuellement
l’extrémité du vecteur polarisation d’une onde plane tourne dans un plan qui lui est
perpendiculaire)

- le grand axe de l'ellipse est supérieur à 1 ce qui n’est jamais le cas avec une onde
progressive.

La connaissance du champ électromagnétique au voisinage de la surface permet d’étudier le
flux d’énergie dans l’onde évanescente. En calculant le flux du vecteur de Poynting, on trouve
que ce flux d’énergie est nul en moyenne dans la direction Oz alors qu’il ne l’est pas le long
de la surface.

4.1.3 Conséquences de ces propriétés inhabituelles

Les éq. 4.2 et 4.5 du vecteur d’onde et de la polarisation de l’onde évanescente sont
totalement inhabituelles. Quelques conséquences peuvent être considérées.

57
Retour sur le problème de la résolution d’un instrument d’optique

Nous avons vu que le critère de Rayleigh détermine l'ordre de grandeur de la résolution d’un
instrument d’optique. En bref, on ne peut pas discerner d'objet de dimension inférieure à une
demi-longueur d'onde du rayonnement utilisé pour l'observer. Dans le domaine optique, où la
longueur d'onde utilisable est de l’ordre de 600 nanomètres, cela correspond à une limite de
visibilité située aux alentours de 300 nanomètres. Pour observer des objets de dimension
inférieure, il semble donc indispensable d’utiliser des longueurs d'ondes inférieures aux
longueurs d'ondes lumineuses. C’est la raison pour laquelle la microscopie électronique a
historiquement pris le relais de la microscopie optique pour observer de toutes petites
structures.

Une étude détaillée du problème permet cependant de comprendre l’origine de ces résultats et
d’imaginer une façon de franchir ce «mur de résolution». Si l’on appelle Oxy le plan d’un
écran diffractant, on peut montrer que le pouvoir résolvant d’un instrument d’optique est
inversement proportionnel à la composante k
//
(parallèle au plan de l’objet) du vecteur d’onde
du rayonnement utilisé. Sachant que cette composante est plus grande dans une onde
évanescente qu’elle ne l’est dans une onde progressive, on peut entrevoir une façon
d’améliorer la résolution.

Cette possibilité d'obtenir des résolutions ∆x au delà de la résolution limite indiquée par le
critère de Rayleigh peut surprendre. Cela ne correspondrait-il pas à violer les inégalités de
Heisenberg ? On peut souligner tout d’abord que les relations de Heisenberg n'imposent
aucune limite à la mesure de la position x d'un objet, mais seulement au produit ∆x.∆p
x
des
incertitudes obtenues sur des mesures simultanées de la position et de la quantité de
mouvement d’un objet. Si l'on ne cherche pas à mesurer simultanément ces deux grandeurs,
rien n'interdit a priori d'obtenir un ∆x aussi petit que l'on veut. Ainsi, plutôt que d'interdire de
franchir le mur de Rayleigh, les inégalités de Heisenberg nous montrent au contraire comment
procéder pour s'en affranchir : appliquée dans la direction Ox, et transposée au couple
position-vecteur d'onde, cette relation d’inégalité s'écrit :

∆x.∆k
x
> 2π (4.6)

Elle montre que pour obtenir une grande résolution (∆x petit), il faut que l'intervalle ∆k
x
des
valeurs de k
x
captée soit le plus grand possible. Lorsque l'on ne capte que les ondes
progressives, l'intervalle des valeurs de k
x
est [−ω/c,+ω/c] = [−2π/λ,+2π/λ] d’où l’on déduit
l’expression de l’intervalle total ∆k
x
= 4π/λ. En portant cette valeur dans l'éq. 4.6, on en
déduit :

∆x ≥ 2π/∆k
x
= λ/2 (4.7)

Les ondes progressives dans le vide ne peuvent donc permettre au mieux qu'une résolution de
λ/2 conformément au critère de Rayleigh.

Si l'on veut obtenir une résolution supérieure à λ/2, l’inégalité 4.6 indique qu’il faut utiliser un
intervalle de valeurs de k
x
supérieur à l’intervalle [−ω/c,+ω/c] = [−2π/λ,+2π/λ] et donc
considérer des ondes pouvant avoir des composantes k
x
supérieure à ω/c. De telles ondes sont
des ondes évanescentes qui offrent ainsi un moyen d’augmenter la résolution d’un système
optique.
58

Les limites de l’onde évanescente de Fresnel

Malheureusement, il y a des limites. Dans l’onde évanescente de Fresnel, le vecteur d’onde
parallèle à la surface est certes supérieur à ω/c, mais il reste bien peu supérieur à cette valeur
puisque son expression K
x
= nω/c sinθ (éq. 4.2) montre qu’il ne peut être au mieux qu’égal à
nω/c. En ce qui concerne cette composante, la seule différence entre une onde homogène et
l’onde évanescente de Fresnel provient ainsi de la présence de l’indice de réfraction n.
Sachant que dans le domaine optique cet indice n’est jamais très supérieur à 2, le seul gain
que l’on puisse espérer serait au mieux un facteur 2.

Exprimé par la relation ∆x ≥ 2π/∆k
x
(éq. 4.6), le critère de Rayleigh devient en utilisant la
valeur k
x
= nω/c sinθ = n(2π/λ) sinθ de l’onde évanescente de Fresnel :

n 2 sin n 2
x
λ

θ
λ
≥ ∆ (4.8)

C’est la même expression de la résolution axiale que celle que l’on peut espérer obtenir avec
un microscope à immersion !

Dans l’approche précédente, nous n’avons considéré que l’onde évanescente de Fresnel
obtenue par réflexion totale. Pour obtenir des effets plus spectaculaires, il faut des types
d’ondes évanescentes avec des vecteurs d’onde k
//
plus grands. De telles ondes évanescentes
ne sont pas obtenues par réflexion totale mais par diffraction.

4.1.4 La diffraction évanescente

Pour mesurer l'effet des petits détails d’un objet sur le comportement d’une onde évanescente,
on doit tenir compte de la diffraction de la lumière par ces objets. Considérons le cas d'une
onde plane monochromatique éclairant un écran plat percé d'un trou de diamètre variable
comme représenté sur la figure 4.4.

Lorsque le trou est assez grand, la plus grande partie de la lumière traverse le trou sans subir
aucune modification et seule une faible partie due à la diffraction de la lumière par les bords
du trou, va émerger en s'éloignant de la direction de l'onde incidente d'un angle α. Plus le
diamètre du trou devient petit, plus l'angle α devient grand, c’est à dire que la composante
tangentielle du vecteur d'onde augmente. Quand le trou aura un diamètre équivalent à la limite
de Rayleigh, l'angle α atteindra 90° et la lumière, à la sortie du trou, diffractera dans tout un
demi-espace. Si la dimension du trou continue à diminuer, la lumière ne peut pas être
diffractée au-delà de 90°, mais la composante tangentielle du vecteur d'onde continue, quant à
elle, à augmenter au-delà de ω/c conduisant ainsi à la génération d'ondes évanescentes de
grand vecteur k
//
.

Pour un trou de dimension infiniment petite, la composante tangentielle du vecteur d'onde
sera infiniment grande et l'onde évanescente correspondante sera caractérisée par une
décroissance exponentielle, suivant la direction transversale, beaucoup plus rapide que dans le
cas de la réflexion totale.

59


Figure 4.4 : Diffraction de la lumière par une ouverture dont les dimensions peuvent être bien plus petites que
la longueur d’onde de la lumière.

D’un point de vue plus mathématique, considérons la diffraction d'une onde plane par une
fente de largeur 2L (le problème est restreint au plan Oxy). Avant la fente, le champ
électromagnétique se propage selon Oz :

) t z k ( exp E ) z ( E
z 0 0
ω − = i
r r
(4.9)

Juste derrière la fente, il peut s'écrire en première approximation :

) L , L , x ( C ) 0 z ( E ) 0 z ( E
0 1
− = = =
+
(4.10)

où C est la fonction rectangle : C(x,−a,+a) = 1 si | | a , a x + − ∈ et C(x,−a,+a) = 0 si x est à
l'extérieur de [−a,+a].

Pour calculer le champ en z = Z, il faut propager chaque onde plane de sa transformée de
Fourier. La transformée de Fourier E(k
x
,0
+
) du champ juste derrière la fente donné par l’éq.
4.10 s’écrit :

| |
L k
L k sin
L E 2
k
e e
E dxe E
) L , L , x ( C ) 0 z ( E dxe ) 0 , k ( E
x
x
0
x
L k L k
0
L
L
X k
0
0
x k
x
x x
x
x
=


= =
+ − = =
+ −
+


+∞
∞ −
− +


i
i i
i
i

(4.11)

Le champ au point X sur un écran placé à la distance Z de la fente s’obtient alors en
propageant chacune des composantes de Fourier du spectre jusqu’en (X,Z). On obtient :

x
X k
k
c
ω
z
x
x
0 x
X k
x
dk e e
L k
L k sin
L E 2
2
1
dk e ) Z , k ( E
2
1
) Z , X ( E
x
2
x
2
2
x
i
i
i −
− −
∞ +
∞ −

∫ ∫
π
=
π
=
(4.12)
60

où ( )
2
x
2
z y x
k k k , 0 k , k k − = = =
r
vérifie la condition de propagation k
2

2
/c
2
.

Comme le montre l’intervalle d’intégration de l’éq. 4.12, ce champ contient deux
contributions :
- une partie homogène correspondant à l’intégration de k
x
sur l’intervalle [−ω/c,+ω/c].
- une partie évanescente correspondant au reste de l’intégration.

Le point essentiel en ce qui nous concerne est de noter que les valeurs de k
x
évanescentes ne
sont plus limitées à :

c
n k
c
x
ω
≤ ≤
ω
(4.13)

comme dans l’onde évanescente de Fresnel associée à la réflexion totale de la lumière, mais
occupent théoriquement tout l'intervalle :

+∞ ≤ ≤
ω
x
k
c
(4.14)

En pratique cependant, la fonction sinus cardinal sin
c
=
L k
L k sin
x
x
réduit cet intervalle en
ramenant l’intégration dans un intervalle dont les bornes sont définies par :

L
k L k
x x
π
= ⇒ π = (4.15)

On en déduit :

- que des ondes évanescentes diffractées apparaissent dès que k
x
= π/L > ω/c = 2π/λ.
⇒ nous retrouvons là le critère de Rayleigh L < λ/2.
- que plus L est petit plus la partie évanescente du spectre est importante et surtout,
- que plus L est petit plus les valeurs de k
x
sont grandes.

Ainsi chaque "objet" sur la surface diffracte à la fois des ondes homogènes et des ondes
évanescentes, la partie évanescente de son spectre de diffraction étant d'autant plus importante
que ses dimensions sont petites. Comme les ondes évanescentes ne vérifient pas la condition
de propagation, ces ondes restent en quelque sorte «piégées» sur la surface.

Ces ondes auront une profondeur de pénétration beaucoup plus faible que l'onde de Fresnel et
leur détection nécessitera l'emploi d'une sonde capable d'aller les capter presque en contact
avec la surface de l'objet. De façon plus précise, nous avons vu que l’amplitude d’une onde
évanescente décroît de façon exponentielle lorsqu’on s’éloigne de l’objet. L’écriture de leur
composante k
z
permet de déterminer la distance à laquelle le détecteur va devoir s’approcher :

2
2
2
x
2
x 2
2
z
c
k k
c
k
ω
− = −
ω
= i (4.16)

61
Ainsi, d’après l’éq. 4.16, k
z
est d'autant plus grand que k
x
est grand ce qui signifie que
l’amplitude des ondes associées à chaque fréquence "évanescente" décroît donc d'autant plus
rapidement que k
x
est grand. Les informations concernant les détails les plus fins restent donc
confinées le plus près de la surface et la résolution pourra être d’autant plus grande que le
détecteur pourra s’approcher plus près de l’objet. C'est sur le principe de la détection de ces
ondes qu'est basée la microscopie tunnel optique (STOM), mais on conçoit aussi la difficulté
de réaliser un microscope optique à champ proche.

La microscopie optique en champ proche

Les développements technologiques ont cependant permis de telles réalisations. Une question
pourrait se pose cependant : si l’onde évanescente ne vérifie pas les conditions de
propagation, comment peut-elle être récupérée par une fibre optique ? La réponse à cette
question tient dans le principe du retour inverse de la lumière : si un objet sub-longueur
d'onde peut transformer par diffraction une onde progressive en ondes évanescentes, il peut,
de la même façon, transformer par diffraction des ondes évanescentes en ondes progressives.

Ainsi, en plongeant une pointe sub-longueur d'onde dans le champ proche de l'objet observé,
les ondes évanescentes présentes sur sa surface vont être partiellement transformées en ondes
progressives. Le signal résultant de ce processus de double diffraction sera constitué, en
grande partie, d'ondes homogènes porteuses d'informations et pouvant se propager, dans l'air
ou dans tout autre guide diélectrique, jusqu'au détecteur.

Comme l’amplitude de ces ondes décroît exponentiellement avec la distance d'analyse, les
informations qu'elles contiennent ne peuvent pas être détectées en champ lointain. Les
informations relatives aux détails de l'objet devant être captées sur leurs lieux d'existence, le
détecteur doit avoir une dimension nanométrique et pouvoir détecter les photons. Cette
dernière remarque montre que la résolution d’un tel microscope, qui dépend de la distance
pointe-objet, dépend aussi de la dimension de l’extrémité de la fibre optique : plus celle-ci
sera petite, plus son pouvoir de récupération d’ondes évanescentes de très grands vecteurs
d’onde sera grand et plus la résolution pourra donc être importante. Elle ne sera plus limitée
que par la dimension de la sonde.


4.2- Principales configurations

Les différents types de microscopes optiques en champ proche à balayage se
distinguent par les modes opératoires utilisés pour réaliser l’illumination ou de collecte de la
lumière très près de la surface de l’échantillon.

La technique la plus commune consiste à utiliser des sondes à ouverture (trou ou fibre
optique) pour amener ou collecter la lumière sur la surface. Les principales configurations
sont résumées sur la figure 4.5.

62


Figure 4.5 : Différentes configurations pour une microscopie optique en champ proche.

La sonde à ouverture pour une microscopie en transmission peut être utilisée soit pour
l’illumination (Fig. 4.5a), soit pour la collection (Fig. 4.5b) de lumière. Cependant, cette
méthode ne peut s’utiliser avec des échantillons opaques pour lesquels il faut travailler en
réflexion (Fig. 4.5c). La lumière réfléchie peut être collectée par une optique proche de la
sonde ou par la fibre elle-même, auquel cas, ce sont des fibres non métallisées qui sont
utilisées.

Une approche différente est choisie avec la configuration 4.5d où des ondes évanescentes sont
créées sur la surface de l’échantillon par une illumination oblique en champ lointain. La
pointe de la sonde agit alors comme un élément diffuseur du champ évanescent, conduisant à
la formation d’ondes homogènes qui peuvent être détectées. Si cette configuration est
relativement facile à mettre en œuvre, l’interprétation des signaux n’est cependant pas
évidente. L’arrangement dans lequel le chemin de la lumière est inversé est d’un grand intérêt.
Comme dans le cas précédent, la lumière peut être diffusée du champ évanescent par une
autre pointe de sonde comme la pointe d’un microscope à force atomique (Fig. 4.5e). Enfin,
dans la dernière configuration 4.5f, un film métallique est déposé sur la surface de
l’échantillon et des plasmons de surface sont générés par la pointe d’une sonde. Ces deux
dernières approches constituent des techniques de microscopie à champ proche optique sans
ouverture.

La figure 4.6 résume les caractéristiques d’un microscope optique à sonde locale.

63


Figure 4.6 : Les différents types de microscopes optiques à sonde locale.

L'éclairage de l'objet pouvant être réalisé de plusieurs façons, chaque type d'éclairage (Fig.
4.6 a, b, c ou d) va définir une variante de ce microscope dont nous indiquons les
dénominations habituellement utilisées :

* le STOM (« Scanning Tunneling Optical Microscope ») aussi appelé PSTM
(« Photon Scanning Tunneling Microscope ») est caractérisé par un éclairage en réflexion
totale par transmission (Fig. 4.6a). Destiné aux objets optiquement transparents, il s'est
imposé dans les laboratoires en raison de la décroissance exponentielle de l'intensité
lumineuse au-dessus de l'objet avec la distance qui le sépare de la sonde. Le rapport signal sur
bruit en est positivement affecté.

* le SNOM (« Scanning Near-field Optical Microscope ») peut fonctionner soit avec
un éclairage en réflexion externe où la sonde joue le rôle de pointe détectrice et émettrice à la
fois (Fig. 4.6b), soit en éclairant directement l'objet en réflexion sous incidence oblique (Fig.
4.6c). Il permet d'analyser tout type d'objet, transparent ou non, et il présente l'avantage d'un
éclairage isotrope par comparaison au STOM.

* le NSOM (« Near-field Scanning Optical Microscope ») travaille en transmission, la
pointe éclaire l'objet, elle joue ici le rôle d'émetteur seulement (Fig. 4.6d). Dans ce cas la
détection s'effectue en champ lointain en utilisant une lentille collectrice.

De par le retour inverse de la lumière, tous ces microscopes peuvent travailler en inversant le
sens d'éclairage. Seul le SNOM est parfaitement symétrique.

On peut aussi citer deux techniques de microscopie en champ proche sans ouverture. Il s’agit
du i-PSTM ou Tunnel Near-Field Optical Microscope (TNOM) ou encore du microscope à
champ proche optique en lumière interdite. Citons enfin, le Plasmon Near-Field Microscope
64
dans lequel les ondes de surface sont exacerbées par le dépôt d’un film métallique et la
génération de plasmons de surface.

L'élément essentiel d'un microscope en champ proche est la sonde. Le type de sonde le plus
couramment utilisé est une fibre optique taillée en pointe fine.

Le déplacement de la sonde au-dessus de l'objet est assuré à l'aide de translateurs piézo-
électriques. Des surfaces de balayage allant de quelques nanomètres carrés à quelques
centaines de microns carrés sont ainsi obtenues. Les vitesses de balayage peuvent être assez
importantes : une image de 128x128 points correspondant à une surface de l'objet de quelques
nanomètres est régulièrement effectuée en moins d'une minute. L'incertitude en z du
déplacement de la fibre qui doit être de quelques picomètres seulement dépend
essentiellement de la qualité de l'électronique de commande.

Deux modes de détection sont utilisés en microscopie optique en champ proche. Le premier,
dit à altitude constante, consiste à balayer la surface de l'objet en gardant la pointe à distance
constante d'un plan de référence. La sonde détecte la distribution de l'intensité lumineuse dans
le plan de référence au-dessus de l'objet. Le second, dit à intensité constante, consiste à
asservir, par voie électronique, l'intensité du signal lumineux détecté sur une valeur de
référence. Le signal enregistré est, dans ce cas, la tension électrique de commande du piézo
qui est directement liée à la position en z de la sonde détectrice. Ce mode de détection fournit
une topographie des lignes d'iso-intensité lumineuse au-dessus de l'objet.

Nous allons détailler ces différentes configurations et modes opératoires en classant les
microscopes optiques en champ proche en quatre catégories principales :
• Les microscopes en transmission travaillant en émission ou collection
• Les microscopes en réflexion
• Les microscopes en effet tunnel photonique
• Les microscopes hybrides

4.2.1 Microscopes en transmission

La figure 4.7 schématise la configuration de base d’un microscope en transmission.



Figure 4.7 : Configuration de base d’un microscope à champ proche fonctionnant en transmission.

65
Les microscopes en champ proche en transmission peuvent travailler avec une sonde soit
émettrice de lumière, soit collectrice de lumière. En fait les deux configurations ne sont pas
tout à fait similaire.

La figure 4.8 résume les différentes approches utilisées en microscopie en champ proche par
transmission.



Figure 4.8 : Différents types de microscopes en champ proche optique en transmission.

En émission, la pointe de la fibre est utilisée comme une nano-source et le champ transmis est
collecté en champ lointain. L’avantage de cette méthode est que le champ illuminé a une aire
très réduite, ce qui élimine un grand nombre d’effets parasites. Cette aire est donnée par
l’enveloppe de la distribution du champ autour de la pointe. Ce champ est limité à quelques
centaines de nanomètres autour de l’apex de la pointe et tombe à zéro dès que la pointe est
éloignée de la surface.

A la différence, dans les microscopes où la fibre est utilisée pour collecter la lumière
transmise, l’échantillon est intensément illuminé par un faisceau de lumière fortement
focalisé. Dans ce cas, l’aire illuminée est celle résultant de la distribution d’un champ de type
gaussien et couvre une extension de quelques dizaine de microns. Pour des objets de taille
sub-micrométrique, on en déduit qu’ils sont uniformément illuminés. La conséquence d cette
66
illumination non parfaitement locale est le risque d’effets non-locaux liés à des phénomènes
de propagation sur de longues distances comme par exemple la propagation de plasmons.

Pour des raisons similaires, les deux méthodes ne sont pas équivalentes en ce qui concerne les
problèmes de polarisation. En mode collection, il est très facile de polariser le faisceau de
lumière incidente et la lumière peut être collectée dans une fibre mono-mode classique. Par
contre, en mode émission, l’état de polarisation à l’apex de la fibre n’est pas simple à
déterminer.

4.2.2 Microscopes en réflexion

Les premiers exemples de microscopes en champ proche travaillant en réflexion utilisaient
une petite ouverture dans une film métallique ou une nano-sphère de polystyrène métallisée
violemment illuminée (Fig. 4.9). Dans cette configuration, la particule de polystyrène
remplace la nano-ouverture et joue le rôle d’une nano-antenne.



Figure 4.9 : Exemples de microscopes en champ proche utilisant soit une petite ouverture, soit une petite bille
comme émetteur-collecteur. A gauche, le microscope en réflexion utilise la diffraction à travers un petit trou
d’un faisceau totalement réfléchi à l’intérieur d’une lame de verre. A droite, le microscope utilise la réflexion
sur une bille de polystyrène métallisée.

Une autre technique consiste à illuminée la surface à étudier en réflexion et détecter le champ
évanescent à l’aide d’une sonde (Fig. 4.10b). Inversement, il est possible d’illuminer à travers
la fibre et de détecter au moyen d’un collecteur approprié (Fig. 4.10c). Le principal défaut de
la méthode est dû à l’ombre produite par la pointe.

On peut aussi utiliser la fibre pour illuminer l’échantillon et collecter la lumière réfléchie (Fig.
4.10a). Cette technique a quelque ressemblance avec la microscopie confocale. Son principal
avantage est de combiner l’illumination locale avec une collection locale de la lumière,
favorisant les rayons se propageant le long de l’axe de la pointe.

Une autre configuration consiste à détecter le champ proche généré en illuminant l’échantillon
en réflexion et en détectant le champ diffusé par l’excitation d’une pointe au moyen d’un
collecteur adapté (Fig. 4.10d). La pointe joue le rôle d’un élément perturbateur du champ
évanescent et ces microscopes sont appelés microscopes sans ouverture.

D’autres configurations similaires sont montrées sur les figures 4.10e et 4.10f. Utilisant des
pointes métalliques ou en tous cas opaques puis qu’elle ne servent pas à véhiculer la lumière,
ces microscopes sans ouverture peuvent utiliser les mêmes technologies que celles
67
développées pour les microscopes à effet tunnel électronique (STM) ou à force atomique
(AFM). Par cette approche, les meilleures résolutions spatiales ont pu être démontrées.


Figure 4.10 : Différents types de microscopes en champ proche optique en réflexion.

4.2.3 Microscopes à effet tunnel photonique

En fait, c’est la technique la plus ancienne expérimentée dans les années 1960. Son principe
est présenté dans la figure 4.11.



Figure 4.11 : Frustration de la réflexion totale interne à l’intérieur d’un prisme par une surface ondulée
(expérience des deux prismes de Newton).

68
De l’étude des ondes évanescentes, nous savons que la frustration de la réflexion totale est
fortement dépendante de la distance à la surface. En conséquence, si la surface d’un
échantillon est ondulée, les parties les plus hautes frustreront la réflexion totale alors que les
parties les plus basses ne pourront pas le faire. Le champ résultant sera comme une sorte
d’empreinte de la topographie de la surface.

La configuration de Guerra décrite sur la figure 4.12 est une variante moderne des premiers
microscopes à effet tunnel photonique.



Figure 4.12 : Configuration de Guerra. Une lentille hémisphérique (généralement la lentille frontale d’un
objectif de microscope) remplace le prisme habituel.

Microscopes à effet tunnel optique à balayage STOM ou PSTM

Cette technique exploite le fait qu’un faisceau tombant sur un prisme peut être totalement
réfléchi à l’intérieur, générant une onde évanescente. Cette réflexion interne est utilisée
comme un moyen particulier d’illumination comme montré sur la figure 4.13.



Figure 4.13 : Différentes configurations de montages en champ proche utilisant la réflexion interne.
69
On remarquera la ressemblance du dispositif utilisé en (a) avec le montage imaginé par A. Cotton pour son
ultramicroscope en 1905.

L’intérêt de cette approche est que le champ évanescent ne se propageant pas, il ne peut
perturber le signal utile pendant l’enregistrement. En plus, elle offre une possibilité de
contrôler la position de la pointe par rapport à la surface en utilisant la décroissance
exponentielle du champ évanescent. Malheureusement, en travaillant de cette façon, à la
manière d’un microscope a effet tunnel électronique, il est difficile de maintenir une
résolution sub-longueur d’onde comme espéré.

La figure 4.14 montre quelques variantes de configurations STOM/PSTM. La figure 4.14c
montre une version où un éclairage isotrope à symétrie de révolution autour d’un axe vertical
améliore l’illumination oblique.



Figure 4.14 : Quelques configurations de microscopes STOM/PSTM.


Microscopes STOM/PSTM inversé : le i-PSTM ou TNOM

Une nouvelle configuration a été imaginée où l’on inverse le sens de cheminement de la
lumière par rapport à la configuration STOM. Elle peut être considérée comme une variante
de la microscopie en champ proche en transmission. Son intérêt réside dans sa capacité à
70
détecter ce que certains auteurs appellent la « lumière interdite » qui correspond à la lumière
diffusée par les protubérances d’un petit objet.


4.2.4 Microscopes en champ proche à plasmons de surface

Les plasmons de surface sont les modes propres d'une interface métallique. Optiquement,
l'excitation d'un plasmon de surface peut être obtenue par différentes configurations.

La première configuration dite de Kretschmann-Raether consiste à déposer un film métallique
sur un diélectrique et à éclairer l'interface avec une lumière polarisée TM (transverse
magnétique) en réflexion totale comme représenté sur la figure 4.15.



Figure 4.15 : Principe de la détection de plasmons de surface en combinant le STOM avec la configuration de
Kretschmann-Raether. Le film métallique est souvent un film d’argent ou d’or.

Le plasmon de surface est obtenu lorsque la composante tangentielle du vecteur d'onde
associé au faisceau incident est égale à celle du mode propre du plasmon. L'intensité du
plasmon décroît exponentiellement lorsqu'on s'éloigne de l'interface. La lumière est confinée
sur l'interface et la présence d'un défaut (topographique ou d'indice) peut fortement modifier
sa distribution d'intensité. La détection en champ proche de ces plasmons de surface apparaît
donc comme un moyen potentiel d'imagerie super-résolvante.

La détection de tels plasmons de surface générés par un faisceau gaussien "quasiment
polarisé" peut être modélisée en considérant un faisceau gaussien 3D et une détection en
champ proche. Le faisceau gaussien incident est décomposé en ondes planes et le calcul des
champs transmis et réfléchis est effectué à l'aide d'une méthode matricielle.

71


Figure 4.16 : Schéma du montage utilisé pour la modélisation de la détection de plasmons.

On considère un faisceau gaussien incident sur une interface séparant un diélectrique d'indice
n = 2,123 d'une couche d'aluminium d’indice n = -17,9 + i.0,7 et d'épaisseur 53 nm (Fig.
4.16). Le faisceau de longueur d'onde égale à 632,8 nm (laser HeNe) est focalisé sur
l’interface où son « waist » est de 7,9 µm. L'angle d'incidence à 44,97° est celui qui
correspond à la génération du plasmon de surface à la même longueur d'onde.

Le résultat de la simulation est montré sur la figure 4.17.



Figure 4.17 : Simulation en 3D du comportement de plasmons dans différentes situations. A gauche, la face du
prisme est nue. Au milieu, la face du prisme est recouverte d’un film d’argent et on considère le mode TM. A
droite, la face du prisme est métallisée et on considère le mode TE.

Le faisceau incident est supposé polarisé TM et la figure 4.17a montre l'intensité lumineuse
détectée en champ proche dans le cas où le métal est absent. La figure 4.17b présente la
distribution de l'intensité lumineuse dans le cas où la surface du prisme est métallisée et où le
plasmon de surface est excité par une onde incidente polarisée TM. Dans le cas d'un faisceau
incident polarisé TE (Fig. 4.17c), deux faibles résonances plasmons existent sur les ailes du
faisceau. Ceci est dû au fait qu'un faisceau gaussien ne peut pas être strictement polarisé et
que des termes TM apparaissent sur les ailes et conduisent à une faible résonance. On notera
la différence entre les valeurs des maximums d'intensité dans les trois cas.

La figure 4.18 présente l'intensité du champ électromagnétique dans chaque couche. Z<0 est
le diélectrique (faisceaux incident et réfléchi), le métal est situé entre Z=0 et Z=53 nm et le
vide pour Z>53 nm. A gauche, le faisceau incident est polarisé en TM et la résonance
plasmon apparaît clairement à l'interface diélectrique-métal, le faisceau réfléchi est très faible
par rapport au faisceau incident. A droite, le faisceau incident est polarisé en TE et le faisceau
72
réfléchi est aussi intense que le faisceau incident. On note que les échelles de l'axe Z et de
l'intensité ne sont pas les mêmes dans les trois milieux.



Figure 4.18 : Simulation de la génération de plasmons en mode TM à gauche et en mode TE à droite. On note
sue la résonance est forte seulement en mode TM.

Une deuxième configuration consiste à exciter le plasmon de surface directement en champ
proche : la sonde d'un microscope optique en champ proche éclaire l'objet et le plasmon de
surface est excité, localement, par l'onde évanescente dont le vecteur d'onde correspond à
celui de la résonance plasmon. La figure 4.19 présente le schéma de principe : un mince film
d'aluminium est déposé sur la surface d'une lentille hémisphérique alors qu'une sonde de
microscope optique en champ proche travaillant en émission, éclaire la surface métallique. La
détection s'effectue en champ lointain (le détecteur balaye le plan xy).



Figure 4.19 : Excitation du plasmon de surface par une sonde en champ proche. La figure de droite montre la
distribution d’intensité.

La partie droite de la figure 4.19 représente la distribution d'intensité lumineuse dans ce plan
calculée dans le cadre du modèle. Ce résultat est accord avec ce qui a été obtenu
expérimentalement.

4.2.5 Microscopes hybrides

73
Le fait de combiner différentes technique d’observation peut avoir deux intérêts : d’abord,
répondre à la nécessité de contrôler la distance entre la sonde et la surface plus soigneusement
et précisément, ensuite, permettre d’obtenir des informations complémentaires facilitant
l’interprétation des images obtenues en champ proche optique.

Microscopes avec contrôle de la force de cisaillement (« shear-force control »)

La méthode utilisant la force de cisaillement (« shear-force ») sera vue plus en détail plus
loin. Elle consiste à faire osciller la pointe à une fréquence proche de sa fréquence de
résonance. L’amortissement de la vibration lorsque la pointe s’approche de la surface peut
être facilement détecté et utilisé pour maintenir la pointe à une distance constante de la
surface. C’est une technique de contrôle purement électronique qui peut être adaptée à la
plupart des configurations. La plupart des microscopes en champ proche utilisent cette
méthode pour le contrôle de la distance.

Microscopes en champ proche avec contact

C’est une solution complètement différente puisque la pointe touche la surface. Pour éviter ou
limiter le risque d’éraflures, la pointe est montée sur un micro-cantilever dont la raideur est
suffisamment petite pour garantir un contact très doux. Cette technique de contact peut être
convertie en mode avec tapotement (« tapping mode ») avec laquelle le risque d’endommager
la surface de l’objet est grandement réduit. L’avantage est que l’on peut utiliser toute la
technologie et l’électronique développée pour les microscopes à force atomique.


4.3- Structure de base d’un microscope SNOM

La figure 4.20 décrit les trois classes de composants constituant n'importe quel microscope à
champ proche.

• Les composants optiques sont la source de lumière, généralement un laser, un
ensemble de composants tels que miroirs, lentilles, objectifs, fibres, polariseurs et un photo-
détecteur (photomultiplicateur ou photodiode à avalanche).

• Les éléments mécaniques sont les différents supports pour l'objet, la fibre, les
modules de translation. On dot aussi, rajouter une table anti-vibratoire et ses dispositifs
d'amortissement.

• Les composants électroniques sont constitués par les étages de détection à la fois
pour le signal optique et les signaux de contrôle de la distance de la pointe à la surface,
l'électronique de commande du balayage des modules de translation (généralement des tubes
piézo-électriques) ou d'autres transducteurs piézo ou mécaniques plus sophistiqués et l'étage
de contrôle de la distance composé d'un ensemble d'amplificateurs associé à un dispositif
d'asservissement PID (Proportionnel-Différentiel-Intégral).

74


Figure 4.20 : Structure typique d’un microscope optique en champ proche optique.

4.3.1 Partie mécanique

L'étage de translation

Il existe aujourd'hui des étages de translation en xy ou xyz qui combinent des dispositifs à
base de système vis-écrou différentiel et des modules piézo-électriques. Cependant, la
technique reposant sur l'utilisation d'un simple tube piézo-électrique demeure une excellente
solution, à la fois bon marché, efficace et précise.

L'effet piézo-électrique est la capacité de certains matériaux de se contracter ou de se dilater
sous l'influence d’un champ électrique. L'effet piézo-électrique est réversible ce qui signifie
que, lorsque une partie d'un matériau piézo-électrique est courbée, comprimé ou étirée, des
charges apparaissent à sa surface générant un champ électrique appréciable (on connaît
l'application aux allumes-gaz ou aux briquets). Remarquons que bien que la relation entre le
champ et la déformation ne soit pas linéaire, il est possible de générer des déplaceme,nts sub-
nanométriques en appliquant simplement des champs électriques tout à fait modestes.
Finalement, les temps de réponse sont généralement de loin bien plus rap^de que les temps
nécessaires à un balayage. Ainsi, ce sont des matériaux idéaux pour le déplacement aux
précisions nanométriques nécessaire pour n'importe quel microscope à champ proche.

La plupart des cristaux piézo-électriques sont des matériaux ferro-électriques comme par
exemple le titanate de baryum (BaTiO
3
) et plusieurs autres sels (titanates, zirconates,
stannates) avec la structure cristalline de la pérovskite. Le composé le plus connu est
75
certainement le PZT (titanate zirconate de plomb, PbTiO
3
ZrO
4
). Il est caractérisé par 4
constantes qui sont interdépendantes. La plus importante (pour la réalisation d'étage de
translation est la constante de charge d
ji
qui est le rapport de la densité de charge ρ
charge
sur
l'électrode normale à l'axe i à la contrainte appliquée le long de l'axe j sous champ E
0

constant.

(
(
¸
(

¸

σ
ρ
=
0
E
j
e arg ch
ij
d en Cb.N
-1

(4.17)

On peut aussi définir le rapport inverse entre la contrainte relative σ
j
le long de l'axe j au
champ électrique E
i
le long de l'axe i à contrainte σ
0
constante.

(
(
¸
(

¸

σ
=
σ
0
i
j
ij
E
d en mV
-1

(4.18)

La tableau 4.1 rassemble les paramètres utiles pour une céramique PZT P160 de la société
« Quartz & Silice ».

Paramètres Symboles Unités Valeurs typiques
Modules d’Young Y
D
33
10
9
Nm
-2
90
Coefficient de Poisson σE - 0,3
Température de Curie - °C 340
Résistivité - 10
10
Ωm 1
Constante de charge
d
33

d
31

10
-12
mV
-1

10
-12
mV
-1

400
-175
Champ électrique
maximal
- Vmm
-1
800

Tableau 4.1 : Caractéristiques de la céramique piézo-électrique P160 de Quartz & Silice.

Les tubes piézo-électriques

Les tubes piézo-électriques ont généralement quelques centimètres de long. Leur épaisseur est
entre 0,6 et 1 mm et leur diamètre varie de 5 mm à quelques centimètres. Les composants
piézo-électriques sont métallisés à l'intérieur et à l'extérieur du tube. Le paramètre responsable
de l'expansion du tube est d
31
. Ainsi, l'élongation ∆L d'un tube de longueur L et d'épaisseur e
auquel on applique une tension V sera donné par :

e
VL
d L
31
= ∆ (4.19)

76
Par exemple, si V= -50 V, e = 1 mm, L = 3 cm et d31=-175, l'élongation peut atteindre DL =
262 nm.

Les électrodes métalliques déposées sur les tubes piézo-électriques utilisés en champ proche
sont divisées en 4 secteurs le long de l’axe de symétrie du tube. Des tensions différentes
peuvent être appliquées à chacune d’elles. La figure 4.21 montre ce qui se passe dans ce cas.



Figure 4.21 : Courbure de tubes PZT selon les tensions appliquées aux quatre segments. La dilatation
dépendant de la longueur du tube, elles peuvent être combinées et excitées comme montré en (c) et (d).

Par exemple, sur la figure 4.21a, quand deux tensions différentes sont appliquées à deux
électrodes opposées, le tube va se contracter d’un côté et se dilater de l’autre. Le résultat
global sera une courbure du tube.

Le problème des modules piézo-électriques est qu’ils ne sont pas exempts d’hystérésis et que
ce défaut doit être corrigé par un contrôle électronique sophistiqué.


4.4- Nano-collecteurs et nano-émetteurs

Il est désormais clair que les hautes fréquences spatiales de l’objet sont codées dans la partie
non rayonnante du champ proche. Le nano-collecteur ou le nano-émetteur est donc la partie
cruciale d’un microscope en champ proche. Cependant, la conception et la réalisation de ces
nano-sondes sont loin d’être standardisées.

4.4.1 Différents concepts de nano-collecteurs

La figure 4.22 illustre différents concepts de nano-sondes où le nano-collecteur/émeteur peut
être un élément diffusant, un cône métallique ou diélectrique ou une minuscule ouverture de
quelques dizaine e nanomètres percée à l’extrémité d’une fibre métallisée.

77


Figure 4.22 : Trois concepts de nano-collecteurs. A gauche, avec un centre diffuseur, au milieu, avec une pointe
diélectrique, à droite avec une ouverture à l’extrémité d’une fibre métallisée.

L’idée d’utiliser une molécule fluorescente unique fixée à l’extrémité d’une fibre été émise
mais n’a pas encore abouti. Les structures dendrimères sont envisagées pour réussir une telle
performance.

4.4.2 Fabrication des pointes

Deux méthodes sont préférentiellement utilisées pour mettre en forme l’extrémité des fibres
utilisée dans les microscopes en champ proche : la méthode chimique et la méthode thermo-
mécanique.

La méthode chimique utilise l’érosion chimique par attaque acide de l’extrémité de la fibre.
La fibre plonge dans une solution d’acide fluorhydrique dont la concentration, la température,
le temps d’exposition ont été préalablement définis (Fig. 4.23).


(a) (b) (c)

Figure 4.23 : Réalisation d’une pointe par érosion chimique de l’extrémité de la fibre de verre dans une solution
d’acide fluorhydrique. (a) L’acide peut monter le long de la fibre par capillarité. (b) L’utilisation d’un film
d’huile empêche la capillarité. (c) Un tube de céramique protège la fibre.

La méthode thermo-mécanique consiste à chauffer la fibre jusqu’à une température proche de
la température de transition vitreuse où la fibre est ramollie et à l’étirer progressivement
jusqu’à sa rupture. Le chauffage peut être réalisé par un chalumeau ou par un faisceau laser. A
cet usage, on utilise souvent un faisceau de laser à CO
2
à 10,6 µm.

La figure 4.24 montre les différences que l’on peut observer entre deux fibres produit par
l’une ou l’autre méthode. On remarque que l’extrémité de la fibre mise en forme par
chauffage/étirage est bien plus sphérique que dans le cas de l’attaque chimique, ce qui peut
78
être attribué à la réorganisation des atomes à l’extrémité après la cassure alors que la fibre est
encore chaude.


(a) (b)

Figure 4.24 : Mise en forma de l’extrémité d’une fibre par érosion chimique à l’acide fluorhydrique en (a) ou
par chauffage/tirage en (b).

L’avantage de la méthode chimique est de ne pas affecter le cœur de la fibre par où la lumière
est guidée. En outre, elle permet de réaliser des extrémités (apex) extrêmement fines. Par
contre, la réalisation d’une pointe peut être longue et la méthode manque aussi de fiabilité
dans la répétition de pointes identiques.


(a) (b)

Figure 4.25 : Forme typique d’une pointe de fibre obtenue en combinant le préformage par chauffage/étirage et
une brève étape d’érosion chimique en (a). On notera l’illumination de la pointe sur l’image (b).

La combinaison des deux méthodes est souvent une bonne idée comme illustré dans la figure
4.25 où un préformage est effectué par chauffage étirage, puis une mise en forme finale par
attaque chimique.

Selon la configuration du microscope, la fibre doit être métallisée. La figure 4.26 résume
l’ensemble des étapes à réaliser. La métallisation de la fibre peut se faire par des méthodes
conventionnelles de dépôt sous vide. L’épaisseur de la couche métallique, le plus souvent
d’argent, d’or, d’aluminium ou de chrome n’excède pas 50 nm. L’étape finale délicate
consiste à percer une ouverture aussi petite que possible à l’extrémité de la fibre pour
permettre le passage de la lumière.

79


Figure 4.26 : A gauche, le principe de la méthode par chauffage/étirage est schématisé. A droite, on détaille la
méthode par attaque chimique et de métallisation par dépôt sous vide.

Une vue de dessus de l’ouverture percée dans le film métallique d’une fibre métallisée est
montrée sur la figure 4.27.



Figure 4.27 : Vue de dessus de l’ouverture de 100 nm percée à l’extrémité d’une fibre métallisée.

Il va sans dire que ces fibres sont fragiles et que la maîtrise de leur fabrication est un atout
important pour garantir la qualité d’observation et la résolution d’un microscope en champ
proche.

4.4.3 Contrôle de la distance à la surface

Après la technique de fabrication de pointes de fibre, c’est l’autre problème crucial à résoudre
pour maîtriser la microscopie en champ proche.

Les deux techniques principales de contrôle de la distance sont le contrôle optique et le
contrôle par la force de cisaillement (« shear-force » en anglais).

Contrôle optique

80
Cette technique est utilisable dans les microscopes du type STOM/PSTM parce que dans cette
configuration, le champ moyen évanescent décroît exponentiellement. Elle est cependant
limitée aux matériaux qui n’ont que de petites irrégularités topographiques et/ou variations de
réflectivité.



Figure 4.28 : Contrôle optique de la distance. (a) dans la configuration d’un STOM/PSTM. (b) dans un
microscope en réflexion utilisant une cavité ente la pointe et la surface. (c) En utilisant la réflexion sur
l’échantillon.

Technique « shear-force »

C’est le procédé le plus utilisé pour contrôler la distance. Il fut proposé la première fois par
Betzig et al. et par Toledo-Crow et al. en 1992 (Fig. 4.29). Ils ont observé la sensibilité de
l’amortissement de l’amplitude de vibration de la fibre excitée à une fréquence voisine de sa
fréquence de résonance lorsque la fibre s’approche à quelques nanomètres de la surface.



Figure 4.29 : Les deux premières méthodes de contrôle par « shear-force ».

81
La méthode actuelle est purement électronique. Elle exploite l’oscillation d’un composant
piézo-électrique résonnant comme un bilame ou un diapason. Le diapason est généralement
collé à la fibre (Fig. 4.30).



Figure 4.30 : Mesures électroniques d la force de cisaillement en utilisant un diapason commercial ou artisanal.
Le diapason peut servir de détecteur seulement ou de générateur/détecteur. La photographie de droite montre la
fibre illuminée collée au diapason.

La fibre est excitée soit de façon externe par un petit composant piézo-électrique, soit en
intégrant le diapason dans un dispositif électronique résonnant. L’intérêt principal est de
pouvoir fabriquer des têtes de microscopes très compactes et autonomes.


4.5- Traitement des images

L’acquisition d’une image à l’aide d’un microscope à champ proche optique est soumise à de
nombreuses perturbations qui peuvent venir des imperfections de l’instrument comme les
défauts de linéarité dans les déplacements de la pointe ou plus généralement des bruits
électroniques et/ou optiques.

Les distorsions linéaires sont généralement faciles à corriger dès lors qu’elles auront été
correctement identifiées. L’enregistrement d’échantillons tests constitué de réseaux de traits
peut aider à identifier le problème et à introduire les corrections nécessaires par un traitement
informatique approprié.

4.5.1 Filtrage par transformation de Fourier

C’est une technique bien connue en traitement du signal ou d’images. Elle permet la réduction
ou l’élimination de bruits périodiques. En calculant le spectre transformée de Fourier de
l’image, un bruit périodique s’identifiera par une bande de fréquence parasite étroite (Fig.
4.31).
82


Figure 4.31 : Principe du filtrage de Fourier. Le spectre de l’image polluée par un bruit périodique fait
apparaître des bandes latérales symétriques qui peuvent être éliminées par un procédé de masquage.

La figure 4.33 montre la puissance de la méthode de filtrage de Fourier à éliminer un bruit
périodique. Un tel procédé n’est cependant vraiment efficace que dans le cas de bruits additifs
qui n’impliquent pas une interaction forte avec l’information à extraire.


(a) (b)

(c) (d)

Figure 4.32 : Autre illustration du filtrage de Fourier. (a) Image brute de la surface d’un CDROM perturbée
par du bruit. (b) Spectre de Fourier de l’image brute. (c) Multiplication du spectre de Fourier par un masque
rectangulaire. (d) Image obtenue après traitement et transformée de Fourier inverse.

Au-delà des méthodes de traitement d’images qui, grâce aux développement des moyens
informatiques existent en grand nombre, la question importante de ce type de microscopie
reste l’interprétation correcte des images.


83
84
5- Développements actuels

Les développements actuels de la microscopie moderne vont de pair avec celui des nano-
sciences et des nano-technologies. C’est là un vaste champ de recherches qui ne peut être
abordé dans ce cours. Nous nous limitons volontairement à deux aspects qui concernent les
applications à la biologie et à l’étude du comportement de molécules individuelles.

5.1- Microscopie de fluorescence multi-photonique

La microscopie de fluorescence permet d'examiner des préparations qui sont fluorescentes par
elles-mêmes ou qui ont été imprégnées (on dit marquées) avec des colorants fluorescents. De
nombreuses préparations soumises à une radiation ultraviolette re-émettent de la lumière à des
longueurs d’onde plus grande dans le visible du violet au rouge. Avec les microscopes actuels
travaillant en épi-fluorescence, la lumière d'excitation arrive sur la préparation par l'objectif.
Dans cette configuration, l'objectif joue également la fonction du condenseur (Fig. 5.1).




Figure 5.1 : Schéma d’un microscope de fluorescence par épi-illumination. La source lumineuse est déportée
sur le côté et est constituée par une lampe offrant un spectre de longueur d'onde étendu vers les UV. Un filtre
d'excitation permet de sélectionner une bande de longueur d'onde adaptée au fluorochrome à visualiser. Un
miroir dichroïque réfléchit la lumière d'excitation vers l'objectif qui joue ici le rôle de condenseur. La
fluorescence émise est collectée par l'objectif et va traverser le miroir dichroïque. Un filtre d'arrêt permet de
sélectionner la longueur d'onde d'émission du fluorochrome.

Un miroir dichroïque dirige la lumière excitatrice de courte longueur d'onde sur la préparation
à travers l'objectif. La lumière émise, de longueur d'onde plus élevée (fluorescence) n'est pas
réfléchie par le miroir dichroïque. Des filtres d'arrêt empêchent la lumière excitatrice de
pénétrer dans l'oculaire ou d’atteindre le détecteur.

La microscopie de fluorescence occupe une place de choix depuis quelques années dans le
diagnostic médical et il est probable qu'elle va se développer pour l'analyse des denrées
alimentaires. C'est ainsi que l'on recherche des protéines spécifiques et d'autres substances par
immunofluorescence. C'est la méthode dite "indirecte" qui est la plus employée. Un anticorps
spécifique non fluorescent, par exemple de lapin, réagit tout d'abord avec les sites
85
antigéniques de la préparation puis est révélé avec des anticorps anti-immunoglobuline
fluorescents de lapin. Les applications possibles dans l'analyse des denrées alimentaires
permettent l'identification immunologique des microorganismes et des farines basée sur les
protéines spécifiques. L'immunofluorescence est une méthode relativement simple pour la
détection de faibles quantités de substances.

Les développements récents utilisent l’excitation bi-photonique et plus généralement multi-
photonique. Les avantages sont que l’intensité se fait à une grande longueur d’onde, le plus
souvent voisine de 800 nm (laser d’excitation à saphir dopé au titane). A cette longueur
d’onde, la lumière pénètre facilement les préparations biologiques, sans avoir de
conséquences cytotoxiques ou de blanchiment. L’absorption bi-photonique étant
proportionnelle au carré de l’intensité d’excitation, le volume d’excitation est bien mieux
défini qu’en excitation à un seul photon (Fig. 5.2).



Figure 5.2 : Illustration de l’excitation en mode à 1 photon avec un laser à argon à 514 nm et en mode à 2
photons avec un laser à saphir dopé titane à 800 nm.

En mode bi-photonique, le microscope de fluorescence se comporte comme un microscope
confocal dans lequel l’iris confocal n’est plus nécessaire.

L’efficacité de l’absorption multiphotonique est accrue avec l’utilisation d’impulsions lasers
ultra brèves, et de ce point de vue le laser femtoseconde à saphir dopé au titane constitue la
source d’excitation de choix. La technique de microscopie multiphotonique se prête donc
aussi à la mesure des durées de vie de fluorescence de fluorochromes dans différents
environnements.

On visitera avec intérêt le site :

http://confocal.medecine.uhp-nancy.fr/bouton2/microscopie-multiphoton.html

ou des sites similaires pour y rechercher des exemples d’application en biologie végétale,
animale et humaine notamment.


5.2- Microscopie d’objets individuels

86
Nous nous limitons à montrer un exemple particulier où l’on combine de l’optique non-
linéaire, l’utilisation de sources lasers ultra-brèves et la microscopie confocale.

L’optique non linéaire s’introduit ici avec le phénomène Raman stimulé exacerbé par les
effets de surface (Surface Enhanced Raman Scattering SERS).

Ce phénomène a été observé par hasard en 1974 par Fleischman, Hendra et McQuillan sur des
signaux Raman de pyridine adsorbée sur des électrodes grossières d’argent. Ils attribuèrent
l’effet d’augmentation de l’intensité Raman à un effet de surface. En réalité, on démontra
ensuite que bien plus qu’un effet de surface, le SERS est un effet associé à des nano-objets
essentiellement métalliques comme des particules colloïdales d’or ou d’argent, dans lesquelles
l’excitation de modes de résonance plasmon contribuent efficacement.

Le résultat remarquable est qu’alors que le phénomène Raman spontané est un effet non-
linéaire du troisième ordre, donc de faible efficacité avec des sections efficaces de l’ordre de
10
-30
cm
2
, le gain associé au SERS peut atteindre 10
10
à 10
14
, permettant la détection Raman
et du spectre Raman complet de molécules ou de nano-objets individuels.

La figure 5.3 représente le schéma d’une expérience de spectroscopie Raman utilisant un
microscope confocal associé à un spectromètre.



Figure 5.3 : Schéma d’une expérience de spectroscopie Raman sur des nano-particules.

Pour les applications concernant la biologie, on a recourt à des marqueurs non-fluorescent
adsorbé sur des particules métalliques de taille nanométrique. Ces particules peuvent être
introduites ou ingérées par des cellules vivantes et il sera possible de les localiser très
précisément grâce au signal SERS. Pour cet effet, les particules colloïdales d’or ou d’argent
sont quasiment équivalentes.

87


Figure 5.4 : Spectroscopie Raman à haute sensibilité à l’intérieur de cellules vivantes. A gauche, on montre
l’image en microscopie à contraste de phase de deux cellules vivantes contenant des particules d’or colloïdal. A
droite, l’image SERS des mêmes cellules est présentée qui permet de localiser précisément les particules d’or.





Figure 5.5 : Spectres Raman d’un chromophore adsorbé sur des particules d’or à l’intérieur d’une cellule. On
note les changements du spectre selon la localisation des particules.


5.3- Microscopie Raman
5.3.1 Raman de résonance
5.3.2 Raman exacerbé de surface (SERS « Surface Enhanced Raman Scattering »)

Voir le cours de Spectroscopie Raman.
88
6- Annexe

GLOSSAIRE DE MICROSCOPIE PHOTONIQUE
adapté par S Brown et C Talbot, de Gérard Géraud, Institut Jacques Monod

Aberration :
Phénomène d’un système optique qui produit une image floue. Un point image est
représenté par une tache plus ou moins géométrique suivant le type d’aberration.

Aberration chromatique :
Phénomène dans lequel les rayons de lumière passant au travers d’une lentille
focalisent en différents points dépendant des longueurs d’ondes. Il existe deux types
d’aberration chromatique : a) axiale, caractérisée par une variation de focale suivant la
longueur d’onde utilisée; b) latérale, caractérisée par une variation de grandissement
suivant la longueur d’onde utilisée.

Aberration sphérique :
Erreur de convergence des rayons lumineux entre la zone axiale et latérale de la
lentille ou du milieu traversé.

Achromatique :
Correction d’aberration d’un système optique, pour deux longueurs d’ondes.

Airy :
Image d’une source ponctuelle, composée d’un disque d’intensité maximale (la
première tâche d’Airy), entouré par une succession d’anneaux d’intensité dégressives.
C’est la représentation de la fonction d’étalement d’un point, « Point Spread
Function » ou PSF en anglais.

Aliasing :
Motif d’une image numérique dont l’échantillonnage n’est pas correct. Les hautes
fréquences spatiales plus grande que la fréquence de Nyquist sont progressivement
«imagées» comme des basses fréquences. L’aliasing introduit un indésirable motif
moiré quand les fréquences spatiales du signal excèdent le taux de numérisation du
capteur. Communement, on le constate quand une grande image numérique est
affichée sur un moniteur, un vidéoprojecteur…etc.

AOBS : Acousto Optical Beam Splitter (filtre dichroïque opto-acoustique accordable)
Système électro-optique utilisé comme un miroir dichroïque dans un microscope
permettant l’entrée d’un faisceau laser et en retour la transmission de signaux émis par
l’échantillon vers les détecteurs.

AOTF : Acousto Optical Tunable Filter (filtre opto-acoustique accordable)
Système électro-optique qui permet de sélectionner une raie laser et d’en ajuster
l’intensité. Ce composant comprend un cristal biréfringent de dioxyde de Tellurium
modulé par des ondes acoustiques, auquel on a attaché un transducteur piézo-
électrique qui envoie dans le cristal des vibrations acoustiques.

Aplanétique :
Système de lentilles dont la sphéricité est corrigée pour donner une image plane.
89

Apochromatique :
Système de lentilles dont la chromaticité et la sphéricité sont respectivement corrigées
pour trois et deux longueurs d’ondes (et pas forcément pour tout le spectre visible).

Bertrand : (Lentille de Bertrand)
La lentille de Bertrand placée dans le tube du microscope ou à la place d’un oculaire,
permet d’observer l’image formée dans le plan focal arrière de l’objectif.

BiFC : Bimolecular Fluorescence Complementation
Technique basée sur la complémentation de deux fragments non fluorescents d’une
protéine fluorescente, par exemple de la YFP (« Yellow Fluorescent Protein ») avec un
peptide espaceur à libre rotation. Chaque fragment est rapporteur d’une protéine
distincte. Si ces protéines interagissent, les deux fragments de la YFP se
complémentent par auto-assemblage et l’ensemble fluoresce.

Bleaching : (photo-blanchiment)
Destruction irréversible des fluorochromes par une illumination très intense. En
microcopie confocale, les fluorochromes sont excités par un laser à un niveau élevé
d’énergie, l’état singulet. Quand les molécules retournent à leur état normal d’énergie,
un signal fluorescent est émis. Si l’intensité d’excitation est trop élevée, les molécules
excitées passent d’un état singulet à un état triplet et peuvent intéragir entre elles
(excimères). La durée de vie des molécules dans l’état triplet étant significativement
plus longue, elles peuvent interagir avec des triplets-oxide et perdent ainsi
définitivement leur capacité de fluorescence.

CALI : Chromophore-Assisted Laser Inactivation
Photo-ablation assistée par chromophore : technique mettant en œuvre un anticorps
couplé à un chromophore telle que la Malachite Green pour reconnaître une protéine
spécifique. Suite à l’effet d’un laser, des radicaux libres produits par ce chromophore
inactivent par peroxydation toute protéine dans un rayon de quelques dizaines de nm.

Cercle de moindre confusion :
Zone d’erreurs de focalisation des rayons entraînée par les différents types
d’aberrations.

Colocalisation :
Deux objets présentant des coordonées spatiales identiques, dans la limite du pouvoir
résolutif du système utilisé. Notons que des positions sont résolues avec plus de
précision que des volumes.

Confocal :
Un microscope est dit «confocal» lorsque un point de l’échantillon est vu sous le
même angle par le condenseur et l’objectif.

Contraste de phase :
Technique qui transforme les différences d’ordre de marche (phase) des ondes
électromagnétiques introduites par l’échantillon en une différence d’amplitudes
(intensité).

90
Contraste interférentiel : (Differential Interference Contrast, DIC, Nomarski ou Hoffman)
Technique qui consiste à introduire et à analyser une différence de marche de deux
trains d’ondes polarisés et qui est proportionnelle à l’épaisseur et aux indices de
réfractions de l’échantillon. Il en résulte un contraste pseudo-topographique ou
pseudo-relief.

Cross-Talk :
Passage d’une émission de fluorescence dans un canal de détection non approprié.

Diaphragme de champ :
Contrôle la zone d’illumination de l’échantillon. Son image doit être située, selon les
principes de Köhler, dans le plan focal avant de l’objectif.

Déplacement de Stokes : (Stokes’shift)
Différence spectrale entre le maximum d’excitation ou d’absorption et le maximun
d’émission d’un fluorochrome.

Epimicroscope : (microscope à épi-illumination)
L'objectif d’un tel microscope sert à la fois à illuminer et à observer la préparation.
(épi signifie ‘par dessus’).

FCS : Fluorescence Correlation Spectroscopy
Technique de spectroscopie mesurant les temps de diffusion des particules
fluorescentes en solution ou dans un volume minime et la corrélation (association) des
différentes particules.

Filtres :
- bloc filtre d’épi-fluorescence
Jeu de filtres composé typiquement de trois filtres : un filtre d’excitation, un miroir
dichroïque diviseur de faisceaux à 45° et un filtre d’émission.

- filtre d’excitation (orthogonal)
Transmet sélectivement une portion du spectre de la source (typiquement d’une lampe
à mercure) ou supprime quelques raies d’un laser.

- miroir dichroïque
Séparateur interférentiel de spectre, conçu généralement pour couper le faisceau
incident à 45°. Il réfléchit une lumière et en transmet une autre. Par exemple, dans un
microscope à épi-fluorescence, il réfléchit la lumière à ondes courtes sélectionnée par
le filtre d’excitation et l’envoie sur l’échantillon. En retour, il transmet la fluorescence
(à ondes plus longues) émise par l’échantillon vers le filtre d’émission.

- filtre d’émission (orthogonal)
Arrête sélectivement toutes les lumières dues à des réflexions parasites ou à d’autres
fluorophores et laisse passer une sélection de la lumière émise par l’échantillon.

- filtre Band-Pass BP (filtre passe-bande)
Transmet une bande spectrale particulière de la lumière, utilisé dans les cas où une
discrimination spectrale est nécessaire. Les filtres passes-bandes à caractéristique
91
spectrale large sont utilisés pour obtenir une image d’intensité et de contraste maximal
tout en maintenant un isolement correct.

- filtre DD (Double Dichroïque)
Laisse passer spécifiquement 2 longueurs d’onde d’excitation.

- filtre TD (Triple Dichroïque)
Laisse passer spécifiquement 3 longueurs d’onde d’excitation.

- filtre Long-Pass LP (filtre passe-haut)
Transmet une large bande de longueurs d’onde supérieure à une valeur spécifiée (et si
le filtre est interférentiel, réfléchit les longueurs inférieures vers un autre canal du
système optique). Utilisé quand l’application requiert la collection du maximum
d’émission lorsque la discrimination spectrale n’est pas recherchée comme dans le cas
de la détection d’un seul signal de fluorescence ou dans le cas de multi-fluorescences
très bien séparées.

- filtre Short-Pass SP (filtre passe-bas)
Transmet une large bande de longueur d’onde inférieure à une valeur spécifiée.
Quelquefois utilisé en combinaison avec un filtre long-pass (ou passe-haut) pour isoler
une région spectrale.

- filtre de discrimination DF (Discriminating Filter)
Filtre d'excitation ou d’émission de type passe-bande avec une transition très raide en
marches d’escalier comportant une atténuation spéciale d’énergie près de la bande
spectrale de transmission.

- KG
Filtre passe-bas d’absorption colorimétrique, transmet une bande spectrale et atténue
les énergies des longueurs d’ondes inférieures ou supérieures à la bande de
transmission.

- MB: Multiband Filter Set
Composition de filtres requits pour exciter et détecter simultanément, deux, trois et
même quatre fluorochromes.

- NB : Narrow-Band filter
Désigné pour optimiser le rapport signal sur bruit dans des applications où l’isolement
du spectre est plus important que l’intensité du signal.

- ND : Neutral Density filter
Filtre d’atténuation de l’intensité de lumière dans un domaine spectral plat. Le niveau
d’atténuation d’un filtre est exprimé en densité optique (de 0,4 à 4 DO).

- OG : Orange Glass
Filtre passe-haut, absorbe 99,999% de la lumière bleue.

- RG : Red Glass
Filtre passe-haut, absorbe 99,999% de la lumière bleue + verte.

92
FLIP : Fluorescence Loss In Photobleaching
Technique dérivée du FRAP à la différence que le rayonnement laser devant éteindre
la fluorescence est émis en continu et non pas sur une courte période. En conséquence
toute particule fluorescente qui entre dans le champ de rayonnement est éteinte,
jusqu'à extinction complète du compartiment contigu. Cela permet en particulier de
mesurer le volume d’un compartiment.

FLIM : Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
Technique d’imagerie consistant à mesurer sur une échelle de temps variant de la
picoseconde à quelques dizaines de nanosecondes la durée de vie de fluorescence (τ)
des molécules. Cette durée de vie ou durée de vie de l’état excité singulet, est un
paramètre caractéristique de l’état physico-chimique de la sonde fluorescente étudiée.

FRAP : Fluorescent Recovery (Redistribution) After Photobleaching
Après photodestruction du fluorophore, suivi de la réapparition de la fluorescence
grâce à la communication cellulaire ou à la diffusion qui ramène de nouvelles
molécules fluorescentes vers la zone photoblanchie.

FRET : Fluorescence Resonant Energy Transfer
(voir Transfert d’Energie par Résonance (RET))

Fluorite :
Les objectifs en fluorite sont corrigés au moins pour 3 longueurs d’ondes pour la
sphéricité et pour 3 et plus pour la chromaticité.

Grandissement : (magnification)
Rapport qui définit la distance réelle entre deux points dans le plan focal de l’objectif
et la distance observée dans l’oculaire.

FWHMT : Full Width at Half Maximum Transmission
Définit la largeur de la bande spectrale transmise par le système optique. Pour un filtre
passe-bande, elle est référencée par rapport à la transmission prise à demi-hauteur du
maximum.

Iris condenseur :
Diaphragme condenseur, placé dans plan focal avant du condenseur. Visible par la
lentille de Bertrand dans le plan arrière de l’objectif. Il ajuste l’ouverture numérique et
la profondeur de champ de la lentille.

Illumination Köhler :
Méthode d’illumination décrite par A. Köhler, pour laquelle une image de la source est
focalisée dans le plan focal avant du condenseur et le diaphragme de champ est
focalisé dans le plan de l’objet. Cela permet de minimiser les aberrations, réflections
parasites, l’éblouissement et l’échauffement.

Image intermédiaire :
Située dans le tube entre les oculaires et le plan arrière de l’objectif.

Immersion : (liquide d’immersion)
93
Liquide occupant l’espace entre l’objectif et l’échantillon. Un tel liquide est requis
pour des objectifs avec une focale de 3 mm ou moins afin de limiter l’incidence des
interfaces entre l’échantillon et l’objectif.

Index de réfraction, n :
L’index ou l’indice de réfraction n est la constante de proportionnalité qui est définie
par le rapport entre la vitesse de propagation de la lumière dans le vide c et la vitesse
de propagation de la lumière dans un milieu transparent v : n = c / v.Quelques indices :
n
air
≈ 1, n
eau
= 1,33, n
verre
= 1,518, n
huile
= 1,515, n
milieu de montage
= 1,3 - 1,5

Iris objectif :
Diaphragme objectif, ajuste l’ouverture numérique et la profondeur de champ de la
lentille.

Longueur de tube : (Optical tube-length)
La distance est mesurée entre le plan focal arrière de l’objectif et le plan focal avant
d’un oculaire. Typiquement cette distance vaut 160 mm, avant l’introduction
d’optiques corrigés à l’infini ∞.

Moyennage à l’aquisition :
Permet d’améliorer le rapport signal/bruit : entre 2 et 4 en général
- Moyennage par ligne : rapide pour un point donné et donc convient pour les études
de vivant, favorise le photo-blanchiment.
- Moyennage par sections : convient pour les études de matériel fixé.

NLO : Non Linear Optics
Systèmes faisant appel à d’autres ordres de la lumière incidente tels que la
modulation/démodulation de fréquence ou surtout aux lasers impulsionnels pour la
microscopie bi-photonique.

Nyquist : (théorme de Shannon)
Loi d’échantillonnage d’une image : d/2,3. La taille du pixel doit être plus petit ou
égale à la distance séparant deux points à résoudre d, divisée par 2,3.

OD : Optical Density
Unité mesurant la transmission T de la lumière. Conversion : OD = -log
10
(T)
Par exemple, 1% Transmission, 0,01 absolu, ainsi -log
10
(0.01) = OD 2.

ON : Ouverture Numérique (NA, Numerical Aperture)
Ouverture numérique d’une lentille. Défini comme le produit de l’indice de réfraction
n du milieu dans lequel est placé l’échantillon, par le sinus du demi-angle d’ouverture
α de l’objectif : ON = NA = n.sin α

Ondes évanescentes : (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence)
A l’interface entre deux milieux d’indices de réfraction différents, un rayon laser
oblique incident sous un angle critique entraîne une réflexion totale mais son champ
électromagnétique (ondes évanescentes) peut exciter des fluorochromes sur 100 nm
dans le second milieu.

OTF : Optical Transfer Function (Point Spread Function, PSF)
94
Caractérise pour un système optique, la fonction de restitution des fréquences spatiales
d’un objet.

Overlap : (recouvrement)
Chevauchement de deux spectres d’émission ou d’excitation de fluorochromes.

Pinhole : (trou d’aiguille)
Diaphragme de détection : diaphragme à iris sur la plupart des appareils qui permet
d’ajuster le volume analysé. Il joue un rôle essentiel dans la résolution spatiale. Il est
réglé sur la valeur de la tâche d’Airy pour un objectif donné.

Pixel : (de l’anglais Picture Element)
Elément de base du format d’une image numérisée. Chaque pixel exprime un niveau
de gris. Pour un champ donné (x,y) le nombre de pixels détermine la définition de
l’image (typiquement 514 x 514 ou 1024 x 1024). Par extension, une série d’images
sur un volume (x,y,z) est constitué de voxels (Volume Element).

Plan-Apochromatique :
Objectif avec corrections de planéité et d’aberration chromatique poussées.

Plan de champ : (Field plane)
Dans un microscope ajusté selon Köhler, les différents plans de champ sont conjugués
avec l’échantillon focalisé. Ils incluent donc le plan de l’échantillon, le diaphragme de
champ, le plan image intermédiaire et l’image sur la rétine ou le capteur.

Profondeur de focalisation : (Depth of focus)
Se réfère à la zone en avant et arrière du plan focal image où un point image flou est
plus petit que le cercle de confusion.

Profondeur de champ : (Depth of field)
C’est la distance qui sépare, de part et d’autre du plan focal objet de la lentille, les
objets qui apparaissent nets. La profondeur de champ varie avec la longueur focale de
la lentille, NA et λ.

PSF : Point Spread Function (Optical Transfer Function, OTF)
Caractérise pour un système optique la fonction de restitution des fréquences spatiales
d’un objet.

Quenching : (désexcitation)
Tout phénomène qui diminue le rendement quantique d’un fluorophore. En termes
électroniques, on parlera de quenching dynamique (collisions), ou statiques
(complexes), ou à distance (résonance). En termes chimiques, on observe la
photodégradation avec formation d’excimer, transfert de H
+
… Inversement la
photostabilité correspond au nombre d’excitations que peut subir une molécule
fluorescente avant d’être détruite.

Réfraction :
Déviation d’un rayon lumineux qui franchit la surface de séparation de deux milieux,
dans lesquels les vitesses de propagation sont différentes.

95
Rendement quantique :
Rapport du nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de
fluorescence au nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale
d'excitation.

Resel :
On appelle ainsi l’unité de résolution pour « resolution element ».

Résolution :
La résolution correspond au pouvoir séparateur, c’est-à-dire à la capacité d’un système
optique à distinguer deux points distincts. Ernst Abbe (1840-1905) a défini la
résolution à la limite de diffraction. Deux détails d'un échantillon séparé d’une
distance δ sont résolus quand l’ouverture numérique (ON) de l’objectif est
suffisamment grande pour capturer le premier ordre de diffraction produit par ces
détails à la longueur d’onde utilisée. La résolution ou pouvoir séparateur, δ, d’un
objectif de microscope dépend de l’ouverture numérique et se définit par : résolution =
δ = 0.61 λ / ON où λ est la longueur d’onde. Donc, la résolution δ est meilleure (la
plus petite) si λ est faible et si l’Ouverture Numérique est grande. Les limites
théoriques du pouvoir séparateur d’un microscope se situent autour d’une demi-
longueur d’onde (250 nm) et son grandissement à 1000 fois l’ouverture numérique.

Shannon :
(voir Nyquist).

Spectromètre optique :
Système optique qui transmet une bande spécifique du spectre électromagnétique. La
dispersion des différentes longueurs d’ondes est obtenue par la capacité d’un prisme à
diffracter la lumière. Système utilisé chez les microscopes confocaux LEICA SP.

TC-SPC : Time Correlated- Single Photon Counting
Imagerie par enregistrement x,y,t de la position et du temps de détection de chaque
photon. A posteriori, on peut ainsi rejouer les données avec des régions d’intérêt, des
fenêtres de temps et des temps d’intégration modulés d’après la réactivité observée.

Transfert d’énergie par résonance : Förster Resonant Energy Transfert (RET)
Deux chromophores rapprochés (≤ 7 nm) ayant un chevauchement du spectre
d’émission d’un donneur d’énergie et du spectre d’absorption d’un accepteur d’énergie
peuvent, en fonction de l’orientation de leurs dipôles, produire un transfert non radiatif
par résonance. Dans le cas de fluorophores, Fluorescence Resonant Energy Transfert
(FRET) : on excite le donneur et on observe l’émission de l’accepteur. Egalement dans
ce cas, la durée de vie du donneur (τ
f
) diminue. Le FRET permet d’estimer la distance
entre deux molécules.

Wide-field :
Microscopie à champ large, microscopie conventionnelle.

WD : Working distance (distance de travail)
Distance entre la lentille et l’objet focalisé, moins l’épaisseur de la lame couvre-objet
(normalement de 170 µm d’épaisseur).

96
Bibliographie

[1] M. Born et E. Wolf, Principles of Optics, 6
ème
édidition, Pergamon Press, Oxford (1995).

[2] B. Rossi, Optics, Addison-Wesley (1957).

[3] J. Surrel, Optique instrumentale, optique de Fourier, Ellipses (1996).

[4] J.W. Goodman, Introduction to Fourier Optics, 2
ème
édition, Mc Graw-Hill International
Editions (1996).

[5] The Handbook of Biological Confocal Microscopy, J. Pawley Ed., 2
ème
édition, Plenum
Press, New York (1995).

[6] D. Courjon, Near-Field Microscopy and Near-Field Optics, Imperial College Press
(2003).

[7] D. Courjon et C. Bainier, Le champ proche optique : théorie et applications, Springer
(2001).

[8] Biomedical Photonics Handbook, Tuan Vo-Dinh Ed., CRC Press, 2003.

[9] Visitez les sites :
http://www.olympusmicro.com/primer/java/index.html
http://confocal.medecine.uhp-nancy.fr/bouton2/microscopie-multiphoton.html

97

2

Plan du cours
1- Introduction
1.1- Histoire de la microscopie 1.2- Principe de la formation des images
1.2.1 Optique géométrique 1.2.2 Diffraction de Fraunhofer 1.2.3 Théorie d’Abbe

1.3- Limite de résolution d’un microscope
1.3.1 Critère de Rayleigh 1.3.2 Ouverture numérique 1.3.3 Aberrations géométriques et chromatiques 1.3.4 Rôle du condenseur

1.4- Performances comparées des microscopies optiques

2- Microscopies photoniques classiques
2.1- Microscopie à fond clair
2.1.1 Conditions d’une bonne observation La contribution du condenseur Eclairage de Köhler Quel grossissement?

2.2- Microscopie à fond noir – Ultramicroscopie
2.2.1 Microscopie à fond noir 2.2.2 Ultramicroscopie

2.3- Microscopie à contraste de phase 2.4- Microscopie en lumière polarisée 2.5- Microscopie à contraste interférentiel différentiel « Nomarski »

3- Microscopies optiques confocales
3.1- Principe 3.2- Formation de l'image confocale
3.2.1 Amélioration de la résolution en microscopie confocale Résolution axiale en x,y Résolution radiale en z 3.2.2 Traitement et déconvolution de l’image confocale

3.3- Réalisation d’un microscope confocal
3.3.1 Microscope confocal à balayage laser 3.3.2 Microscope confocal à disque de Nipkow 3.3.3 Description d’un microscope confocal inversé commercial

3.4- Exemples d’applications

4- Microscopies optiques en champ proche
4.1- Ondes évanescentes
4.1.1 Introduction 4.1.2 Les ondes évanescentes de Fresnel Le vecteur d’onde de l’onde évanescente

3

1 Microscopes en transmission 4.2 Fabrication des pointes 4.1 Raman de résonance 5.4.2 Microscopes en réflexion 4.2.2.3.Nano-collecteurs et nano-émetteurs 4.3 Quelques conséquences de ces propriétés inhabituelles Retour sur le problème de la résolution d’un instrument d’optique Les limites de l’onde évanescente de Fresnel 4.3 Contrôle de la distance à la surface Contrôle optique Technique « shear-force » 4.2 Raman exacerbé de surface (SERS « Surface Enhanced Raman Scattering ») 6.3.4 Microscopes en champ proche à plasmons de surface 4.Principales configurations 4.Microscopie de fluorescence multi-photonique 5.1.3 Microscopes à effet tunnel photonique Microscopes à effet tunnel optique à balayage STOM ou PSTM Microscopes STOM/PSTM inversé : le i-PSTM ou TNOM 4.Développements actuels 5.3.5 Microscopes hybrides Microscopes avec contrôle de la force de cisaillement (« shear-force control ») Microscopes en champ proche avec contact 4.Annexe : Glossaire de microscopie photonique Bibliographie 4 .3.5.4.2.La polarisation de l'onde évanescente 4.5.1 Différents concepts de nano-collecteurs 4.Microscopie Raman 5.2.2.4 La diffraction évanescente La diffraction d’une onde plane La microscopie optique en champ proche 4.1 Partie mécanique L’étage de translation Les tubes piézo-électriques 4.1.2.4.1.Structure de base d’un microscope SNOM 4.Traitement des images 4.4.3.1 Filtrage par transformation de Fourier 5.2.Microscopie d’objets individuels 5.

Les performances d’un microscope dépendent des qualités de son optique (Fig. elles ne se comparent pas toutefois aux observations réalisées en microscopie électronique. 5 . des conditions d’observations utilisées (Fig.1.Introduction Depuis son invention au XVIIème siècle. 1.3) Figure 1. Figure 1. le microscope optique est devenu un instrument d’usage courant indispensable dans beaucoup de domaines de la métallurgie à la biologie et à la médecine. C’est un instrument simple qui accroît considérablement les capacités de perception du monde à l’échelle micrométrique par l’œil humain.2 : Comparaison entre deux observations faites avec un même microscope mais avec un éclairage incorrect (à gauche) et un éclairage correct (à droite). 1. seule technique permettant d’atteindre des résolutions sub-nanométriques (Fig. mais jusqu’à présent.1 : Performances comparées d’un microscope type jouet (à gauche) avec un microscope de laboratoire (à droite). 1.1).2).

1608 : Z. un point source parfait ne peut donner une image également ponctuelle. permet une qualité d’image inégalée et la possibilité de reconstituer en 3 dimensions l’image d’un objet.4). Le problème de la finesse des détails observables et de leur résolution constitue le problème majeur de la microscopie. La révolution dans ce domaine est venue du développement des techniques de microscopie en champ proche où l’utilisation des ondes évanescentes qui n’existent que très près de la surface d’un objet. 1665 : Robert Hooke (Freshwater 1635-Londres 1703) publie Micrographia. mais seulement une tache de diffraction d’autant plus grande que l’ouverture sera limitée et le grandissement recherché élevé. on peut reconstituer une image de l’objet avec une résolution largement sub-longueur d’onde et seulement dépendante de la dimension de la sonde. La barre représente une distance de 1 µm. mécanicien et astronome. Les développements récents ont conduit à rechercher d’autres moyens pour dépasser cette limite imposée par la diffraction de la lumière et améliorer les conditions d’observations d’objets particuliers. si elle n’accroît pas considérablement la résolution instrumentale. 1. paléontologue.Histoire de la microscopie Quelques dates. Tout à la fois biologiste. des microscopies à contraste de phase ou interférentielles.. d’où les développements de la microscopie sur fond noir ou ultramicroscopie. Jansen construit un microscope à deux lentilles convergentes. météorologiste. Hooke fut un des plus brillants expérimentateurs de son 6 . JC : Néron utilisait le chaton de sa bague comme loupe.1. Le progrès le plus notable dans le domaine e la microscopie photonique en champ lointain est celui de la microscopie dite confocale qui. A cause de la diffraction de la lumière par l’ouverture limitée de l’objectif. • • • • IIème siècle av.3 : Observation comparée de Gyrosigma sinense en microscopie optique (à gauche) et en microscopie électronique (à droite). 1633 : René Descartes (1596-1650) établit les lois de l'optique. En « captant » ces ondes évanescentes par une sonde optique placée à quelques nanomètres de l’objet.. le premier recueil de micrographies décrivant des lames minces de bois et où apparaît le terme cellule (Fig.Figure 1. 1.

les travailleurs et l'université d'Iéna.. • • • • 1746 : J. 1828 : W.Iéna 1905). Leeuwenhoek était drapier et commença à polir des «lentilles» après la lecture du Micrographia de Hooke. protozoaires. Figure 1.5). 1. Nicol développe la microscopie en lumière polarisée. il dût faire appel à un illustrateur pour ses planches. En 1896..6). Son nom est resté associé aux lois de déformations élastiques des corps (loi de Hooke).4 : Microscope de Hooke et micrographie d’une lame de liège prise par Hooke. dont les profits sont dès lors répartis entre la direction. cellules sanguines. 7 . il réforme la société Carl Zeiss. 1695 : Antonie Van Leeuwenhoek (1632-Delft 1723) construisit près de 500 microscopes qui lui permirent d'observer et de décrire pour la première fois des microorganismes tels que : bactéries. Adams adapte un barillet porte-objectifs. Figure 1. 1849 : J. • • 1669 : Isaac Newton (1642-1727) découvre la décomposition de la lumière blanche. physicien. (Fig. spermatozoïdes. Quekett publie un traité pratique sur l'usage du microscope. Ami intime du peintre Vermeer dont il n'avait pas les dons. En 1866 il rejoint le mécanicien Carl Zeiss avec qui il conçoit des lentilles aux aberrations très faibles (objectif apochromatique et à immersion). il établit les bases de la formation des images dans le microscope et élabore la théorie de la résolution des instruments (Fig. 1. 1890 : Ernst Abbe (Eisenach 1840 .temps.5 : Leeuwenhoek et son fameux microscope à une seule lentille.

1985 : Mise au point de la microscopie confocale à balayage laser.Figure 1. D’après les lois de l’optique géométrique. 1982 : G. Cotton). Zernike (1888-1966) obtient le prix Nobel en 1953 pour la microscopie à contraste de phase. Il recevra le prix Nobel de Chimie en 1925 pour son travail sur les colloïdes. le « Scanning Tunneling Microscope » (STM).6 : Portrait d’Ernst Abbe. on a la relation : 1 1 1 + = p p' f (1. 1. L'image agrandie se construit dans un plan image situé bien au-delà du foyer image Fi de la lentille (Fig. 1984 : Les premiers équivalents optiques du STM apparaissent ouvrant la voie à la microscopie optique en champ proche. Nomarski imagine le microscope interférentiel différentiel.7).2. Bernard détectent des molécules uniques par fluorescence. L'objet à observer est placé au voisinage du foyer objet Fo de la lentille. On note que l’image est inversée par rapport à l’objet.1 Optique géométrique Dans un microscope l'image agrandie de l'objet est formée par la lentille de l'objectif.1) où p et p’ sont respectivement les distances de l’objet et de l’image au centre de la lentille et f est la distance focale de la lentille. 1. 8 . Binning et H. pour un objectif assimilé à une lentille mince. L’objectif est l’élément crucial du microscope qui conditionne généralement les performances globales de l’instrument. 1908 : Köhler et Siedentopf réalisent le microscope à fluorescence. 1928 : E. Orrit et J. 1942 : F. Rohrer décrivent le premier microscope à pointe utilisant le courant tunnel électronique. Zsigmondy invente l’ultra-microscope (perfectionné par A.Principe de la formation des images 1. • • • • • • • • • 1903 : R. Synge suggère un nouveau concept pour vaincre la limite de diffraction et introduit la notion de super-résolution.2. 1952 : G. 1990 : M.

2. Fo est le foyer objet. s)]dS 2λ A rs (1. La traduction mathématique de ce principe est l’intégrale de Fresnel-Kirchhoff qui s’écrit : iA eik ( r + s ) U(P) = − ∫∫ [cos(n. si p → f. on en déduit que l’image sera d’autant plus grande que l’objet sera près du foyer Fo et que la focale de la lentille sera courte. Fi est le foyer image de l’objectif.2 du grandissement.7 : Agrandissement par un objectif de microscope. 1. 1. ce qui signifie que si l’objet est au foyer de la lentille.2) D’après l’éq. r ) − cos(n. La théorie la diffraction repose sur le principe de Huygens-Fresnel qui indique que la perturbation lumineuse en un point P résulte de la superposition d’ondes secondaires émises par tous les points d’une surface située entre ce point et la source de lumière. 1. Si (x0.2 Diffraction de Fraunhofer Les phénomènes de diffraction sont normalement étudiés dans un cours d’optique ondulatoire.z0) et 9 . l’image est envoyée à l’infini.1.y0. il n'est pas possible d'agrandir infiniment un objet en réduisant la distance au foyer et la focale de l’objectif. Cependant. Fi axe optique p’ Le grandissement linéaire est évalué par : γ=− p' p (1. alors p’ → ∞. Le grandissement est la conséquence directe de la courte focale de l’objectif. l’image formée dans le plan image de l’objectif est reprise par l’oculaire et le grandissement total s’obtient en multipliant celui de l’objectif par celui de l’oculaire. k est le vecteur d’onde = 2π/λ.8). 1.3) dans le cas où on considère le passage de la lumière à travers une ouverture de forme quelconque A percée dans un écran (Fig.objet Fo p objectif image agrandie Figure 1. Dans un microscope composé. Compte tenu de l’éq. De plus. l’optique géométrique ne prend pas en compte le caractère ondulatoire de la lumière et les phénomènes de diffraction vont limiter le grandissement linéaire d’un objectif à des valeurs qui ne dépasseront guère l00x.

y. η) = − x 0ξ + y 0η xξ + yη ξ 2 + η2 ξ 2 + η2 ( x 0ξ + y 0η) 2 ( xξ + yη) 2 − + + − − . La diffraction de Fresnel est observée lorsque la source et l’écran sont très proches. x Q r r’ y P0 s s’ P O z Figure 1. En utilisant les coordonnées polaires (ρ. 1.(x. le cas plus simple de la diffraction de Fraunhofer est celui de plus grande importance en optique. Quand les termes quadratiques ne peuvent pas être négligés. Strictement parlant. on parle de la diffraction de Fraunhofer. les termes quadratiques et ceux d’ordres plus élevés disparaissent seulement quand r’ et s’ tendent vers l’infini.8 : Diffraction par une ouverture de forme quelconque dans un écran plan.. on parle aussi de diffraction à l’infini (ou en champ lointain) dans le cas de la diffraction de Fraunhofer. C’est pourquoi..z) sont les coordonnées des poins P0 et P respectivement et (ξ.η) les coordonnées du point Q dans l’ouverture. Dans les conditions de la diffraction de Fraunhofer. Du point de vue de la théorie.4) où : f (ξ. c’est à dire quand à la fois le point source et le point d’observation sont à l’infini. la diffraction de Fresnel est plus générale et elle inclut la diffraction de Fraunhofer comme un cas particulier. Dans ce cas.4 est plus simple lorsque les termes quadratiques et ceux d’ordres plus élevés en ξ et η peuvent être négligés.θ) pour le point Q dans l’ouverture circulaire : ρcosθ = ξ et ρsinθ = η et les coordonnées (w. η ) dξdη (1.3 peut s’écrire : U(P) = − i cos δA Aeik ( r '+ s ') λ r ' s' ∫∫A e ikf ( ξ . on parle alors de la diffraction de Fresnel.ψ) pour le point P dans le plan de diffraction : wcosψ = p 10 et wsinψ = q .5) L’évaluation de l’intégrale 1. r' s' 2r ' 2s' 2r '3 2s'3 (1. nous pouvons évaluer la tache de diffraction produite par une ouverture circulaire interposée entre une source ponctuelle et un écran « renvoyé » à l’infini à l’aide d’une lentille. Heureusement. on peut montrer que l’éq.

E étant l’énergie totale incidente.610 λ a 1.6) Cette forme fait apparaître la représentation intégrale des fonctions de Bessel Jn(x) : i -n 2 π ix cos α inα J n (x) = e dα ∫ e 2π 0 (1. 2. « Point Spread Function » en anglais ou PSF.238π… d’où l’on déduit que le rayons des anneaux sombres sont : w = p 2 + q 2 = 0. L’intégrale de Fresnel-Kirchhoff se met alors sous la forme : U ( P) = C ∫ a 2π 0 0 ∫ e.ikρw cos( θ − ψ )ρdρdθ (1. On dit aussi que I(P) est la fonction d’étalement d’un point. 3.116 λ a 1.7) L’intégrale 1.9) (1. l’équation correspondante fait intervenir le sinus sin( x ) cardinal sin c = et s’écrit : x 11 .6 s’écrit alors : U(P) = 2πC ∫ J 0 (kρw )ρdρ 0 a (1.q) fait avec la direction centrale p = q = 0.De cette définition de p et q.619 λ a (1. I0 est l’intensité au centre de la tache : I0 = πa2E/λ2.10) C’est la célèbre formule d’Airy.11) Dans le cas d’une fente de largeur 2a. il s’ensuit que w = p 2 + q 2 est le sinus de l’angle que la direction (p.22π. établie pour une ouverture circulaire.233π. Les minima de la fonction de Bessel J1(x) avec x = kaw = 2πaw/λ sont obtenus pour x = 1.8) En utilisant la relation de récurrence : d n +1 x J n +1 ( x ) = x n +1J n ( x ) qui donne par intégration pour n=0 : dx on obtient :  2J (kaw )  U(P) = Cπa 2  1  kaw   d’où l’on déduit l’intensité de la tache de diffraction :  2J (kaw )  I0 I( P ) = U ( P ) =  1   kaw  2 2 { } ∫ x 0 x ' J 0 ( x ' )dx ' = xJ1 ( x ) (1.

Illumination incohérente Considérons un objet lumineux par lui-même comme par exemple. la lumière est diffractée. tous les ordres de diffraction passent par l’objectif et l’image reconstitue l’objet. 1. A droite. En conséquence. Nous allons décrire ce processus de formation de l’image plus en détail. Figure 1. Les structures diffractant fortement la lumière. Soit P le point de l’objet situé sur l’axe optique et Q un point voisin à une distance y de P dans le plan objet Π.9 : Illustration de la théorie d’Abbe. L’ouverture de l’objectif limite le nombre d’ordres de diffraction susceptibles d’être collectés à travers lui (Fig. 12 . le filament incandescent d’une lampe électrique. l’image ne reconstitue que partiellement.3 Théorie d’Abbe La théorie de la formation de l'image dans un microscope a été formulée par Ernst Abbe à la fin du XIXème siècle. Appelons P’ et Q’ les images de ces points séparées de la distance y’ dans le plan image Π’ (Fig. Le cas d’une illumination seulement partiellement cohérente n’est pas traité. l’objet est un réseau à faible nombre de traits. reconstruction fidèle de l’objet.12) 1. nous limiterons notre attention aux deux cas extrêmes d’une illumination complètement incohérente d’une part et d’une illumination parfaitement cohérente d’autre part. donneront des rayons avec des angles de diffraction élevés qui ne pourront être collectés par l’objectif. c’est à dire correspondant à des fréquences spatiales élevées équivalentes à un réseau de diffraction avec un très grand nombre de traits au millimètre. 1. l’objet est fortement diffractant et pas tous les ordres de diffraction sont collectés par l’objectif. Par passage au travers d’un réseau. Abbe traita l'objet comme un fin réseau de diffraction et bien que ce ne soit pas une description exacte de la section de plantes. Π et Π’ sont des plans conjugués. A gauche.9). c'est une très bonne approximation de la structure régulière des diatomées par exemple. Leur absence ne permettra pas la formation d’une image. voire pas du tout les structures fines de l’objet.10). Appelons θ et θ’ les angles que font les rayons marginaux passant par le diaphragme avec l’axe optique. de part et d’autre et selon les ordres de diffraction successifs : -1 et +1. … Tous ces ordres contiennent une part d’information sur l’objet étudié. sin(kpa )  2 I( P ) = U ( P ) =   I 0 = I 0 sin c ( x )  kpa  2 2 (1. Au rayon non dévié d’ordre 0 s’ajoutent des rayons diffractés. -2 et +2.2. Dans cette présentation de la théorie de la formation des images dans un microscope. -3 et +3.

alors. on déduit : Y ≈ 0. le premier minimum de la figure de diffraction de P est donné par w = 0.61λ’/a’. c’est à dire le sinus de l’angle sous lequel les deux points sont vus du centre de l’ouverture. λ et λ’ les longueurs d’onde respectivement dans les espaces objet et image et λ0 la longueur d’onde dans le vide. puisque d’après le résultat 1.14) Soient n et n’ les indices de réfraction. 1.10 : Schéma illustrant la théorie du pouvoir de résolution du microscope.61 = 0. alors nous avons avec une bonne approximation : Y’ = wD’ (1.61λ D' λ' λ = 0. puisque θ’ est petit : θ' = a' D' (1.16 donne la distance entre deux points objets qu’un microscope peut juste résoudre lorsque l’illumination est incohérente et que l’ouverture est circulaire.15 et en assimilant sinθ’ à θ’. 13 . Soit a’ le rayon de la zone supposée circulaire dans laquelle le faisceau de lumière convergent vers P’ coupe le plan focal arrière F’ et appelons D’ la distance entre la pupille de sortie et le plan image.13) Si w = p 2 + q 2 est la séparation entre Q’ et P’.16) L’équation 1. nous avons à la limite de résolution : Y' = 0. alors.Q’ P θ a’ y’ Y’ θ’ D’ P’ y QY Π F’ Π’ Figure 1.61 λ0 n sin θ (1.11.15) En utilisant la relation des sinus : nYsinθ = −n’Y’sinθ’.61 0 n ' θ' θ' a' (1. on substitue Y’ par Y dans l’éq.

S-1.η) S0 S-1 S-2 S-3 (x’. l’objet agit à la manière d’un réseau de diffraction. Selon Abbe. S2. Pour obtenir une image fidèle. si bien que non seulement chaque élément de l’ouverture de l’objectif. 1.q’) D’ Π’ F’ Figure 1. Dans la théorie d’Abbe. Chaque point dans le plan focal peut alors être considéré comme le centre d’une émission cohérente secondaire dont la contribution sera proportionnelle à l’amplitude en chaque point. Cette situation est approximativement réalisée lorsqu’un objet mince avec une structure relativement simple est illuminé par de la lumière issue d’une source suffisamment petite à travers un condenseur à faible ouverture. Les maxima correspondant aux spectres d’ordre successif de cette figure de diffraction sont notés …S-3. Sous forme mathématique. S0. S-2.11).11 : Schéma illustrant la théorie d’Abbe de la formation de l’image dans un microscope sous illumination cohérente. Abbe en 1873. La première théorie satisfaisante de la résolution d’un microscope sous illumination cohérente a été formulée et aussi illustrée par de belles expériences par E. il est nécessaire que tous les spectres (tous les ordres de diffraction) contribuent à la formation de l’image. Ceci n’est jamais possible strictement à cause de l’ouverture finie de l’objectif. S3… (x. Elle doit être grande pour un meilleur pouvoir de résolution. considérons la formation de l’image d’un objet en forme de réseau de diffraction illuminé par une onde plane incident normalement sur le plan objet selon le principe de l’illumination centrale de Köhler. la transition du plan objet au plan image implique deux intégrations : l’une est étendue sur le plan objet. l’autre est étendue sur l’ouverture. la diffraction par l’objet est considérée d’abord et l’effet de l’ouverture est pris en compte dans un deuxième temps.La quantité nsinθ qui intervient dans cette équation est l’ouverture numérique. il est suffisant que 14 . Pour illustrer la théorie d’Abbe.y’) (p’.q) f Π S3 S2 S1 (ξ.y) (p. mais aussi chaque élément de l’objet doit être pris en considération dans la détermination de la perturbation complexe qui intervient en n’importe quel point particulier du plan image. aussi appelé plan de Fourier. L’onde est diffractée par l’objet et donne naissance à une figure de diffraction de Fraunhofer du réseau dans le plan focal arrière F’ de l’objectif (Fig. Les ondes lumineuses issues de chacun de ces points sources secondaires interfèreront entreelles et donneront naissance à l’image de l’objet dans le plan image Π’ de l’objectif. Illumination cohérente (théorie d’Abbe) Considérons l’autre cas extrême où la lumière émergeant de l’objet peut être traitée comme strictement cohérente. S1. D’un point de vue pratique cependant.

1.η=qf) du plan F’ est donnée par la formule de Fraunhofer :  η  ξ U(ξ. on obtient : V( x ' .y) est définie comme nulle pour tous les points du plan objet qui se trouvent à l’extérieur de l’objet lui même. Dans ces conditions.y) les coordonnées d’un point typique du plan objet et f la distance du plan focal F’ à la lentille objectif. y) exp − ik x + y  dxdy A f  f  (1. la perturbation due à la diffraction de Fraunhofer par une ouverture B située dans le plan F’ sera :  y'   x' V( x ' .18) A ∫∫ B  k  f   f   F( x .19) Si on suppose que F(x.18 donne : V( x ' . les angles de diffraction dus à ces structures seront très grands et seuls un nombre très limité d’ordres de diffraction. y' ) = C 2 ∫∫ U(ξ.17) où F est la fonction décrivant la transmission de l’objet.17 dans l’éq. c’est à dire de A. y) M M (1. équivalentes donc à un réseau gravé très fin. Considérons maintenant la transition du plan focal F’ au plan image Π’. Ces considérations peuvent être exprimées d’une manière précise sans se restreindre au cas d’objets assimilés à des réseaux de diffraction. défini par : M=− D' f ou f 1 =− D' M (1. si l’ouverture B est suffisamment grande pour que U(ξ. pourra passer à travers l’objectif.l’ouverture soit suffisamment grande pour admettre tous les ordres qui transportent une quantité appréciable d’énergie. ) = CF( x. D’ étant la distance entre ces deux plans. y) exp − i   x + x ' ξ +  y + y' η  dxdydξdη  D'   D'      f  (1. y' ) = C1C 2 ∫∫ (1. la perturbation au point (ξ=pf. C1 une constante et l’intégration est effectuée sur l’aire A du plan objet Π couverte par l’objet. η) exp − ik ξ + η  dξdη B D'    D'  La substitution de l’éq. Appelons M (<0) le grandissement entre les plans Π et Π’. l’objet ne pourra pas être reconstitué avec toute la finesse nécessaire et on aura atteint la limite de résolution de l’instrument.20) En utilisant le théorème de l’intégrale de Fourier. η) soit négligeable pour les points du plan focal F’ qui se trouvent en dehors de B. η) = C1 ∫∫ F( x. voire à la limite un seul.21) 15 . y' ) = CF( x ' y' . au point typique (x’=p’D’. Soient (x. De même.y’=q’D’) du plan image. alors les intégrations par rapport à ξ et η peuvent également être étendues de –∞ à +∞. 1. On remarquera que si l’objet possède des structures de grande finesse. alors l’intégration par rapport à x et y peut formellement être étendue de –∞ à +∞.

23) A part la valeur du facteur numérique qui est en réalité quelque peu arbitraire. la résolution conférée par un objectif est limitée par la diffraction. Elle résulte des interférences au niveau du plan image.y) est le point objet dont l’image est en (x’. aussi bien en amplitude qu’en phase.3. Ainsi.Limite de résolution d’un microscope La notion de résolution est certainement la notion la plus importante en imagerie. on peut montrer que la limite de résolution est : Y ≈ 0. On parle aussi de pouvoir de résolution. cette limite est pratiquement identique à celle obtenue dans le cas d’une illumination incohérente. 16 . Elle décrit la capacité d’un système à résoudre les plus petits détails d’un objet.où (x. si l’ouverture est suffisamment large. l’image est strictement similaire à l’objet.3.y’) et la quantité définie par : C=C1C2λ2f2 (1. mais inversée.12). Dans le cas d’une illumination cohérente. 1.22) est constante. Différents critères ont été proposés pour définir de façon simple la résolution d’un système d’imagerie. 1. Le plus connu et utilisé est sans aucun doute le critère de Rayleigh qui est une forme concise du principe d’Abbe.1 Critère de Rayleigh Comme on vient de le voir. des ondes lumineuses diffractées le long du trajet des rayons (Fig. 1.77 λ0 n sin θ (1.

L'image d'un point est en fait une tache de diffraction (disque d'Airy) ou fonction d'étalement du point résultant de l'interférence entre les ondes diffractées ayant parcouru des trajets distincts jusqu’au plan image. il faut tenir compte de deux fonctions de répartition de la lumière: -la fonction d'étalement du point dans le plan focal. l’intensité dans le creux situé entre les deux maxima est égale à 81% de l’intensité du maximum de l’image individuelle de chaque point. Cette relation qui définit le pouvoir séparateur de l’instrument n’est en toute rigueur valable que si l'objectif collecte de la lumière provenant d'un condenseur ayant la même ouverture numérique que celle de l’objectif. la résolution théorique est égale à : dmin = 0.13. c’est à dire la tache d’Airy ou plus généralement.13 : Définition de la résolution ou pouvoir séparateur par le critère de Rayleigh qui précise les conditions pour permettre de discriminer deux disques d'Airy.24) où NA est l’ouverture numérique (« Numerical Aperture »). on note que dans ces conditions idéales.61. cette condition est parfaitement remplie puisque l'objectif lui-même joue également le rôle de condenseur.3. c’est à dire nsinθ.12 : Formation de l'image dans un microscope. Fort heureusement. la PSF qui conditionne la résolution latérale (en X et en Y). En fait. Selon ce critère de Rayleigh. dans la formation de l’image dans un microscope. Comme représenté sur la figure 1. Figure 1. c’est à dire lorsqu’on collecte la lumière de fluorescence ou de la lumière diffusée sur fond noir. -la fonction de défocalisation qui conditionne le résolution axiale (profondeur de champ) le long de l’axe optique (en Z).Figure 1. 1. en épi-illumination. λ NA (1.2 Ouverture numérique 17 . La résolution telle qu'elle a été définie par Rayleigh correspond à la distance minimale dmin entre deux points objets qui seront considérés comme séparés (résolus) si le maximum d'intensité du disque d'Airy du premier point correspond au premier minimum d'intensité du disque d'Airy du second point.

14 illustre les changements provoqués sur la fonction d’étalement du point PSF et sur la profondeur de champ.45) ce qui a comme conséquence une distance de travail limitée (90 à 180 µm) et une profondeur de champ réduite (effet de sectionnement optique). plus la PSF est fine et la profondeur de champ ∆z petite. Le cône de lumière entre le foyer et la lentille de demi-angle au sommet θ définit l'ouverture numérique NA = nsinθ de l'objectif.Expérimentalement.25) 18 . La figure 1. Elle résulte de l'incapacité de la lentille à collecter la lumière dispersée au-delà d'un angle donné θ (demi angle d'ouverture du cône de lumière entre le foyer et la lentille). iris α ∆z D ∆z α D iris α ∆z D PSF PSF PSF Figure 1. Plus l’ouverture numérique est grande. C'est elle qui est directement responsable de la luminosité et de la résolution d'un objectif. la fonction d'étalement du point (PSF pour « Point Spread Function ») s’obtient en observant un point lumineux idéal (infiniment petit) au travers d'un objectif.14 : L’ouverture numérique est caractérisée par l'angle α et elle détermine la distance de travail D et la profondeur de champ ∆z. Deux autres caractéristiques de l'objectif dépendent de l'ouverture numérique: ce sont la distance de travail D et la profondeur de champ ∆z. Un iris placé devant la lentille permet de faire varier l'ouverture numérique sans changer le grandissement et d'augmenter ainsi la profondeur de champ. L'ouverture numérique NA est une caractéristique essentielle d'un objectif. Sous l’image familière du disque d’Airy. On peut établir la relation suivante entre la profondeur de champ ∆z et l’ouverture numérique : ∆z = λ   NA2   4 n 1 − 1 − 2   n       (1. la PSF apparaît sous la forme d’un maximum d'intensité entouré d'anneaux de plus en plus sombres.0<NA<1. Un objectif de haute qualité sera caractérisé par une grande ouverture numérique (1.

la résolution maximale du microscope peut atteindre environ 260 nm. Les objectifs de grandissement supérieur (40x à l00x) ont une NA supérieure à 0. Les rayons les plus externes seront perdus.3 Aberrations géométriques et chromatiques 19 .40 au lieu de 0. 1. C B A n2 n1 C B A n3 n1 Objectif à immersion n1 ≈ n 3 Objectif à sec n1 ≠ n2 Figure 1. A gauche la différence entre les indices de réfraction n2 et n1 est grande. les objectifs de faible grossissement (5x à 20x) ont une faible ouverture numérique NA (0. c’est à dire dans l’air (n = 1).15). B et C sont déviés vers l'extérieur lors du passage du milieu de l’objet dans l'air.75 et procurent une excellente résolution mais une faible profondeur de champ.3. On peut de même utiliser des condenseurs à immersion.2. Les avantages d'un objectif à immersion sont triples : • Augmentation de l’ouverture numérique de l’objectif. A droite.9 pour le même objectif à sec.95 (c’est à dire un condenseur "sec"). • Elimination de l’aberration sphérique due au couvre-objet. L’ouverture numérique est alors augmentée.3 et NAcond = 0.15 : Ouverture numérique et immersion de l’objectif. Certains objectifs disposent d'un diaphragme à iris qui permet de régler l'ouverture numérique de l’objectif. La formule permet de déterminer que pour une lumière à 500 nm.515) ayant un demi-angle θ de 67. pour un objectif à immersion dans 1'huile (n = 1.75) mais offrent une grande distance de travail et une grande profondeur de champ. les rayons lumineux A. on utilise un liquide d'immersion d'indice n3 très proche de n1.De manière générale. on peut calculer que le gain en résolution que l’on obtient par immersion du condenseur n'est que marginal.5° on obtient une ouverture numérique de 1.75 les objectifs doivent être à immersion. c’est à dire que l’on interpose entre l’objet et l’objectif un liquide adaptateur d’indice (Fig. 1. NAobj = 1. Les rayons ne sont plus déviés et sont tous collectés par la lentille.5 à 0. NAcond ne passant que de 0. Par exemple. Pour obtenir une ouverture numérique effective supérieure à 0. Ceci permet d'augmenter la profondeur de champ en réduisant l'ouverture de l'iris. Bien entendu. C'est une limite que l'on peut atteindre en routine. cela entraîne une dégradation de la finesse de l'image. • Elimination de la réflexion totale à la surface supérieure du couvre-objet. cependant. cependant on constatera qu’une diminution du diamètre de l’iris à environ 80% de son ouverture complète ne diminue que légèrement le pouvoir de résolution mais améliore beaucoup le contraste.95 à 1.

Ce défaut s'appelle l'aberration chromatique. Selon la correction effectuée. l'angle de réfraction varie en fonction de la longueur d'onde. Le dispositif le plus courant est le condenseur de Köhler. l'image subit une déformation sphérique telle que les détails situés au pourtour de l'image deviennent flous si la mise au point est faite sur le centre. Sur la moitié inférieure. Associés à un filtre vert. Cependant. Une correction partielle peut souvent être suffisante et donc plus économique. Il est constitué d'une source lumineuse. Tous sont maintenant focalisés au même point. Dans les objectifs de microscope. Pour la photographie couleur. Ils sont employés pour examiner les structures fines et colorées. si la correction de l'aberration sphérique est aussi réalisée. Autrement dit.La réalisation d'un objectif de microscope est extrêmement complexe et doit prendre en compte toutes sortes de défauts. les objectifs achromatiques peuvent parfaitement être employés pour la photographie noir et blanc. Les objectifs apochromatiques sont ceux qui offrent la meilleure correction chromatique et un contraste d'image particulièrement bon. l’objectif est corrigé par l'adjonction d'une lentille divergente pour compenser la dispersion des rayons de longueur d'onde différente. l'objectif comporte la mention "aplanétique" (par exemple. il est préférable d'utiliser des objectifs semi-apochromatiques ou apochromatiques afin de garantir la fidélité des couleurs et un bon contraste. suivie d'un diaphragme de champ (limitant 20 .3. vertes ou bleues comme représenté sur la figure 1. on distingue des objectifs achromatiques.16 : Aberration chromatique. semi-apochromatiques et apochromatiques.16. et inversement. verts et bleus convergent en des points différents le long de l'axe optique. Une correction importante de l'objectif concerne l'aberration sphérique. à cause de la dispersion de l’indice. Les aberrations chromatiques des objectifs achromatiques bon marché ne sont généralement pas perceptibles. un objectif sera aplanétique-apochromatique). Par construction. on corrige ce défaut en fabriquant des objectifs composés constitués de plusieurs lentilles avec des lois de dispersions d’indice différentes afin de se corriger mutuellement. pour un objet éclairé par de la lumière blanche. une lentille est un dioptre à courbure variable qui doit assurer la convergence des rayons lumineux par réfraction. Sur la moitié supérieure. l’objectif est non corrigé. 1.4 Rôle du condenseur Le rôle du condenseur dans un microscope est essentiel en permettant d'éclairer de façon homogène le champ du microscope. la lumière blanche est décomposée et les rayons rouges. rayon “blanc” Fo Sans correction Bleu Rouge Fo axe optique Avec correction Figure 1. mais cette aberration chromatique des objectifs est corrigée de façon très différente selon les fabricants. Les objectifs aplanétiques corrigent totalement l'aberration sphérique. on obtient une mise au point différente suivant que les parties observées sont rouges. En outre. Avec les systèmes de lentilles qui ne sont pas corrigés.

En particulier. La lumière transmise.1 comparatif. 1. et enfin la lentille condenseur proprement dite focalise l'illumination sur le spécimen. on prend en compte : 1) le type de détection : la première condition pour former une image d’un objet dépend de la capacité de l’instrument à détecter la présence de cet objet et donc à collecter suffisamment de photons portant une information pertinente sur l’objet. un diaphragme d'ouverture permet d'ajuster l'ouverture numérique du condenseur en fonction de celle de l'objectif utilisé. plus la profondeur de netteté est réduite. 1. Les microscopies classique et confocale sont dites en champ lointain. réfléchie ou émise par l’objet est collectée par un objectif situé à une relativement grande distance de l’échantillon. Une lentille collectrice récupère la lumière de la source. le centrage et la focalisation du condenseur doivent être ajustés chaque fois que l'on change d'objectif. Le réglage des différents constituants du dispositif condenseur est capital pour l'obtention d'une image résolue et d’un bon contraste (Fig. L'image de droite même si elle paraît plus contrastée.17). à droite.l'illumination au champ microscopique visible).Performances comparées des microscopies optiques On compare les performances entre les trois principales familles de microscopies optiques. généralement une fibre optique de forme très affinée qui vient collecter l’information au voisinage immédiat. le diaphragme du condenseur est trop fermé. Figure 1. Les nouvelles microscopies en champ proche utilisent une sonde locale. Un critère de 21 . Plus le grossissement global est élevé.4. c’est à dire à quelques nanomètres de la surface de l’échantillon. Les structures fines de la diatomée ne sont visibles que sur l'image de gauche obtenue avec un réglage correct du diaphragme du condenseur. Dans le tableau 1. De même l'ouverture des deux diaphragmes doit toujours être ajustée à la dimension du champ du microscope. La profondeur de netteté est déterminée par le grossissement global et l'ouverture du condenseur. est néanmoins mauvaise au plan de la résolution. le diaphragme du condenseur est réglé correctement.17 : Influence du diaphragme du condenseur sur la résolution au sein de l'image microscopique d’une diatomée: à gauche. La diminution de l'ouverture du condenseur permet d'augmenter quelque peu la profondeur de netteté mais aux dépens du pouvoir séparateur.

Si δdet est le seuil de détection. Ce n’est pas le cas pour les autres techniques qui nécessitent le balayage d’un élément. on considère le problème de artéfacts. Remarquons que le contraste est parfois confondu avec la résolution parce qu’une image bien contrastée est souvent considérée comme une bonne image selon les critères de la perception visuelle humaine. cela est possible si l’image de l’objet conserve toujours la même forme dans son déplacement. on précise aussi le type de détection. 4) Enfin. c’est la dimension de la sonde qui est déterminante. peuvent conduire à une représentation erronée de l’objet.26) où np est le nombre de photons. 22 . Ceci peut être un inconvénient majeur pour l’observation de cellules vivantes ou d’objets mobiles. l’image est collectée directement par l’œil. s le signal et n le niveau moyen de bruit en énergie. Par exemple. l’élément peut être localisé avec une précision bien plus grande que la longueur d’onde.détection peut être défini comme la capacité à détecter un nombre minimal de photons tel que le rapport signal/bruit soit plus grand que 1. 2) la localisation : après avoir extrait le signal du bruit. L’image est acquise point par point. d’une sonde locale ou de l’objet lui-même : il s’agit alors d’une détection séquentielle. la prochaine étape est de localiser l’élément émetteur ou diffractant de l’objet. le mouvement erratique d’une bactérie d’un diamètre de 1 µm peut être suivi avec une précision de quelques nanomètres ou moins bien que le diamètre de l’image puisse être d’environ 2 µm. Même si la tache de diffraction est plus grande que λ/2. par exemple du faisceau laser. Bien sûr. Selon les modes d’interactions de la sonde avec la surface de l’échantillon. elles sont susceptibles de générer des signaux qui. Dans le cas des microscopes en champ proche. Elle est mesurée en comparant les fonctions d’étalement du point (PSF) de chaque instrument. mal interprétés. Dans un microscope classique. 3) Résolution : nous avons examiné ce point en détail précédemment. une plaque photographique ou une caméra CCD : il s’agit d’une détection en parallèle de tous les éléments de l’image. C’est la critique la plus forte concernant les techniques de champ proche qui travaillent « en aveugle ». il doit vérifier l’inégalité : s = n p hν > δdet avec δdet>n (1. Dans le tableau.

électronique ou mécanique)  2J ( v )  h= 1   v   2J ( v )  h= 1   v  cohérente Faible 4 Cohérence de la lumière Cohérente.Type de microscopie Type de détection Niveau de signal (converti en courant) Rapport signal/bruit Détection Localisation Fonction d’étalement du point (PSF) Classique Parallèle (formation d’une image) Quelques mA à quelques µA Bon Facile Facile Confocale Séquentielle (à balayage) Quelques mA à quelques µA Bon Facile Facile à difficile 2 Champ proche Séquentielle (à balayage) Quelques µA à quelques nA Faible Difficile Délicate à difficile Elevée.1 : Comparaison des trois microscopies optiques de base. au-delà de λ/2 Dépendante du diamètre de la pointe Toujours cohérente Important (optique. partiellement cohérente ou incohérente Faible (optique) Risque d’artéfacts (optique ou électronique) Tableau 1. Si chaque instrument possède ses avantages et inconvénients en fonction de ce à quoi on le destine. 23 . optique et traitement d’images. on notera que les microscopies à champ proche sont des instruments délicats qui nécessitent de l’expérience à la fois en électronique.

24 .

nous avons admis que l'échantillon était éclairé par un faisceau étroit de lumière parallèle. La microscopie à contraste de phase est détaillée et nous mentionnons brièvement deux autres techniques : l'observation en lumière polarisée et la microscopie interférentielle DIC Nomarski.1. Eclairage de Köhler 25 . des cristaux. Seuls les objectifs apochromatiques les plus récents permettent l'éclairage complet de leur ouverture. C'est exactement ce que le condenseur fait.2. A partir de la théorie d'Abbe. Notons que pour collecter complètement la lumière avec un objectif à immersion. c’est à dire par un cône de lumière ayant un angle égal à l'angle d'admission de l'objectif. où l'image formée par la lumière déviée est vue sur un fond de lumière non déviée. 2. Ce fait est très contraignant. Il est représentatif du réseau et porte juste suffisamment d'information pour créer une image lorsqu'il interfère seul avec le rayon non dévié. les bulles d'air. Notons aussi que le diaphragme du condenseur n'est presque jamais ouvert complètement quel que soit l'objectif et son ouverture numérique car cela réduit le contraste. mais même avec ces objectifs. un seul maximum de premier ordre suffit.Microscopie à fond clair C'est le procédé le plus classique et commun qui convient particulièrement à l'examen d'objets colorés ou contrastés. le condenseur doit aussi lui aussi être huilé à la lame. Il peut s'agir d'objets déjà colorés ou qui le deviennent à la suite d'un traitement approprié ou encore d'objets incolores qui possèdent un indice de réfraction très différent de celui de l'eau comme des gouttes d'huile. 2. les grains d'amidon. nous discutons de techniques d'observation plus sophistiquées complémentaires ou alternatives : la microscopie à fond noir et 3 méthodes permettant l’accroissement du contraste des images.1 Conditions d’une bonne observation La contribution du condenseur En exposant la théorie de la formation des images. à la fois un maximum de premier ordre et le faisceau non dévié peuvent être collectés par l'objectif. C'est la forme la plus courante de la microscopie. on obtient un meilleur contraste lorsque le diaphragme du condenseur est légèrement fermé.Microscopies photoniques classiques Nous traitons d’abord brièvement de ce qu'il est convenu d'appeler la microscopie à fond clair. pour laquelle nous rappelons les conditions à remplir pour une bonne observation.1. on a déduit qu'une image se forme lorsque les deux maxima de premier ordre de diffraction peuvent interférer avec la lumière non déviée. les parois cellulaires. En fait. Dans la suite du chapitre. On a donc avantage à utiliser un éclairage conique. etc. augmente la diffusion et peut tellement réduire le contraste que le bénéfice d'augmentation de la résolution peut être perdu. Cela veut dire que si on éclaire l'échantillon avec un faisceau oblique.

Si les défauts chromatiques du condenseur et de l'objectif ne sont pas parfaitement corrigés. ce qui signifie qu’on ne peut espérer montrer le détail d'une copie photographique au même grossissement sur l'écran.5 mm. Moniteurs vidéo. 26 . c'est-à-dire au fond clair. un liseré bleu et rouge peut apparaître au bord du diaphragme de la source lumineuse. Un grandissement de 1000x est suffisant pour certains. Le choix du grossissement dépend de la méthode d’observation : Observation visuelle : à une distance de lecture confortable de 25 cm (qui est ce que nous avons approximativement en microscopie). il est absolument crucial d'assurer une grande ouverture numérique. on enlève un oculaire puis on ferme le diaphragme jusqu'à ce qu’un tiers du champ soit obscurci. d’autres de seulement 0. par exemple 60 µm. La procédure à suivre pour réaliser un bon éclairage de Köhler est détaillée ci-dessous : • Mettre en place la préparation et effectuer la mise au point avec un objectif de grossissement moyen (par exemple 10x). Microphotographie : les films de documentation utilisés en microphotographie peuvent avoir un pouvoir de résolution de 100 lignes/mm.3 µm. Ce réglage ne doit plus être modifié ensuite.3 mm. un grossissement de 200x sera suffisant pour enregistrer un détail de 0. Le diaphragme est parfaitement focalisé lorsque la couleur passe du rouge au bleu. Avec des films de moins bonne résolution. • Monter ou descendre le condenseur jusqu'à ce que le bord du diaphragme de la source lumineuse devienne très net. les personnes ayant une excellente vue peuvent résoudre des détails de 0. c'est à dire 10 µm. • Centrer le diaphragme de 1a source lumineuse.Cette méthode de réglage due à Köhler s'applique à toutes les techniques microscopiques par transparence. ordinateurs : la trame de l’image de télévision où la structure pixélisée de l’écran d’ordinateur sera le facteur limitant. Il faut cependant assurer qu'aucune information de l'image ne sera perdue. alors que 1500x est mieux pour d’autres. Pour un réglage optimal du diaphragme du condenseur. Le grossissement d’un microscope se calcule par le produit du grandissement de l’objectif (par exemple 100x) par celui de l’oculaire (par exemple 10x) d’où un grossissement de1000x. Pour la plupart des microscopes ce réglage se fait à l'aide de deux vis de centrage placées sur le condenseur. Quel grossissement? Pour une bonne résolution. au contraste de phase et à la polarisation. • Terminer le réglage en ouvrant le diaphragme de la source lumineuse jusqu'à ce qu'il disparaisse du champ optique. mais le grossissement ne dit rien sur le contenu de l’image et c’est souvent une question de convenance de l’observateur. • Diaphragmer la source lumineuse et ajuster correctement le diaphragme du condenseur.

Figure 2.1) est vue par l'objectif. la lumière déviée produit l'image. selon les propriétés du condenseur du microscope. les fines particules de poussière autrement invisibles apparaissent sur le fond noir car elles diffusent la lumière. Le diaphragme de champ peut être ouvert complètement puisqu'il n'y a pas grande différence entre un éclairement de Köhler et un éclairage critique dans cette situation. des condenseurs spéciaux de type "cardioïdes" à fond noir utilisant des miroirs (Fig.2.1 Microscopie à fond noir Lorsque le soleil entre dans une chambre obscurcie à travers une fente des volets. Pour les fonds noirs à des ouvertures numériques plus grandes.5 d'ouverture numérique.1 : L’échantillon n’est éclairé que par des rayons très obliques et seule la lumière diffusée par l’objet (en clair sur le schéma) pénètre à travers l’objectif. Ils sont huilés à la lame (on peut pour des raisons pratiques utiliser de l'eau) et exigent une mise au point et un centrage exacts. Ce cache opaque est collé au centre d'un disque transparent ajusté sur le support du filtre du condenseur (Fig.2. La lumière non déviée est exclue.2) sont fabriqués.Ultramicroscopie 2. Ce cache central arrête la lumière directe et seuls les rayons formant un angle plus grand que "l'angle d'admission" de l'objectif utilisé peuvent atteindre l'objet. Le fond est noir et la lumière diffusée (déviée) par l'objet (dessiné en bleu clair dans la figure 2. 2. 2. Une façon simple d'obtenir un éclairage en fond noir est de placer un cache central dans le support à filtre du condenseur.1). Un cache central d'environ 15 mm de diamètre suffit généralement pour donner un fond noir avec un objectif d’environ 0. La grandeur du cache central dépend de l'ouverture numérique de l'objectif.Microscopie à fond noir . 27 . La hauteur du condenseur doit être ajustée pour un maximum de luminosité au centre du champ. Un cache central de 20 mm permettra généralement de donner un fond noir à un objectif de 40x/NA 0.65.2.

Le cône de lumière restant est ainsi limité entre NA 1. Les limitations du fond noir sont les suivantes : tout d’abord.3 au moins. Ensuite.2 ou supérieure. C'est spécialement 28 . et NA 1.3.Même ces condenseurs spéciaux ne peuvent pas être utilisés avec des objectifs à ouverture numérique de 1. Figure 2.3) car il rend visibles les cils et les flagelles. Le fond noir est spectaculaire pour l'observation des protozoaires vivants ou des bactéries (Fig.25. des objets épais.4). les erreurs résiduelles des objectifs (notamment les aberrations sphériques) deviennent visibles au maximum. il faut arrêter toute la lumière jusqu’à l'ouverture numérique 1.2 : Schéma d’un condenseur type cardioïde. Le contraste en fond noir est extrême et la résolution est aussi bonne que peut le donner l'objectif utilisé. Figure 2.4. et pour les diatomées.0 ce qui est adapté à des objectifs à immersion d'huile de puissance moyenne 40x à 60x. L'ouverture numérique interne limite atteignable avec les condenseurs à fond noir actuels est aux alentours de NA 1. Pour un objectif NA 1. La raison est qu'il faut considérer deux ouvertures numériques pour ces condenseurs à fond noir : l'ouverture numérique interne (c'est-à-dire la portion de lumière bloquée) et l'ouverture numérique externe (qui pour des raisons techniques est limitée à 1. 2. Ce n'est tout simplement pas assez pour produire un fond noir utilisable.3 : Image sur fond noir de bactéries. étendus ou trop diffusants sont inexploitables en fond noir.

Ce microscope devint l’instrument de référence jusqu’à l’arrivée du microscope électronique en 1939 pour observer les colloïdes. l’échantillon est violemment éclairé latéralement et non en transmission. échantillon dilué et "propre". il inventât et construisit l’ultramicroscope qui exploite l’effet Tyndall. Lorsqu’il arriva à Iéna. Il faut donc disposer d’une chaîne d’éclairage méticuleusement propre : lentilles supérieures du condenseur. Cotton et H. 2.2. Biographie de Richard Adolf Zsigmondy Richard Adolf Zsigmondy fut un chimiste allemand né à Vienne en 1865 et décédé à Göttingen en 1929. il travailla pour Schott à Iéna. A Berlin. il étudia les verres colorés. Note sur les colloïdes : On ne peut observer correctement au microscope classique que des objets dont la taille est supérieure à la longueur d’onde de la lumière visible. Zsigmondy. ce qui le conduisit à l’étude des colloïdes. Il obtint le prix Nobel de chimie en 1925 "pour son explication de la nature hétérogène des solutions colloïdales et pour les méthodes appliquées au cours de ses recherches qui ont une importance fondamentale dans la chimie moderne des colloïdes". un objectif 40x à immersion d'eau est idéal. Les colloïdes sont constitués de particules plus petite que cette longueur d’onde mais pouvant diffuser de la lumière par effet Tyndall. avec un de ses collaborateurs.le cas avec des objectifs 40x et forme la raison principale d'utilisation d'objectifs 40x à immersion. Dans le livre écrit en 1906 par Cotton et Mouton (Fig. 29 . Enfin. De 1897 à 1900. Il fit ses études à Vienne puis à Munich où il obtint son doctorat en 1889. Inventé par R. tous les grains de poussière ou les traces de graisse deviennent également visibles au maximum. Même si cette technique n’a plus qu’un intérêt historique aujourd’hui. sans graisse. Mouton. notamment le dispositif à ondes évanescentes de Cotton et Mouton que l’on retrouve dans certains montages de microscopie en champ proche. beaucoup plus avantageux dans ce cas. avec la lumière solaire du milieu d’une belle journée d’été  sont de 3 à 6 nm ». les deux surfaces de la lame. Cette technique est particulièrement adaptée pour détecter des particules de dimensions très inférieures à la longueur d’onde. Il fut assistant à l’Université de Berlin puis devient en 1893 maître de conférence à l’Ecole Polytechnique de Graz en Autriche. L’ultramicroscopie utilise les capacités de diffusion des particules (effet Tyndall) et est particulièrement adaptée à la détection de particules métalliques (colloïdes d’or ou d’argent). Il devint ensuite professeur et directeur de l’Institut de Chimie à Göttingen. 2. il s’intéressa aux couleurs produites par des solutions colloïdales d’or appliquées sur de la porcelaine.2 Ultramicroscopie L’ultramicroscopie est une technique de microscopie en fond noir mais à l’origine et à la différence de la technique précédente. il est important de remarquer que certains des montages utilisés sont d’une grande actualité.A. Pour l'examen de spécimens vivants en fond noir. il est rapporté que « les plus petites dimensions estimées ainsi  dans les conditions les plus favorables. En 1903. l’ultramicroscope a été perfectionné par A.4).

L'anneau de phase permet de créer une illumination de forme annulaire qui sera totalement stoppée par l'anneau opaque de la plaque de phase. 30 . A droite.Figure 2. Cotton et H. organites. Les rayons lumineux diffractés par les structures fines (membranes cellulaires. Ces rayons retardés vont interférer avec ceux transmis sans retard sur la périphérie..Microscopie à contraste de phase Le microscope à contraste de phase est un dispositif permettant d'observer des préparations qui n'ont pas été colorées. le dispositif à ondes évanescentes imaginé par Cotton et Mouton 2. Il est donc particulièrement bien adapté à l'observation de cellules vivantes.5).3.. En dessous. Mouton écrit en 1906 sur l’ultra-microscopie.) traversent la plaque de phase soit dans la zone périphérique. Pour cela. 2. soit dans la zone centrale. Le principe repose sur la formation d'un contraste d'intensité créé par l'interférence de rayons lumineux auquel on fait subir un déphasage différentiel : le microscope à contraste de phase transforme les différences de phase inapparentes en zones visibles claires et sombres. La zone centrale est constituée d'une lame biréfringente λ/4 dont le rôle est de retarder légèrement les rayons diffractés qui la traversent. un montage d’ultramicroscopie tel qu’utilisé à l’époque. on place un anneau de phase (un diaphragme annulaire) dans le condenseur et une lame de phase annulaire dans l'objectif du microscope (Fig. Cet anneau opaque arrête la transmission directe de la lumière et évite l'éblouissement de l'observateur.4 : Page de couverture du livre de A.

Cet effet peut être accentué lorsque l’onde "B" est atténuée de telle sorte que son amplitude devienne identique mais en opposition de phase avec celle de l’onde "D". et une plaque de phase située dans l'objectif. Le dispositif repose sur un anneau de phase placé dans le condenseur. mais à cause de la différence d’indice (ou épaisseur). Ainsi. mais avec une plus petite amplitude que "B". la différence de phase normalement invisible a été convertie en différence d'amplitude visible. ces deux ondes ont la même amplitude. "O" est l'onde passant à travers l'objet. Pour une petite différence de phase. Si on décale artificiellement l’onde "D" d'un ¼ de longueur d’onde supplémentaire et qu’on la fasse interférer avec "B". On peut rendre compte de manière simple du principe du contraste de phase en considérant l’interférence de deux ondes. ce qui équivaut à un assombrissement 31 . alors une nouvelle onde "O" en résulte. L’onde "B" qui a traversé l’objet de phase est retardée par rapport à l’onde "O". Le résultat de l’interférence est l’onde "D" qui représente la différence entre le fond et l'objet. L’onde « différence » "D" est déphasée de λ/4 par rapport à "B". créé le contraste et permet de mettre en évidence les structures cellulaires. L'objet apparaît donc plus foncé que le fond. L’objet de phase n’absorbant pas. l’onde "D" est toujours déphasée d'environ ¼ de longueur d'onde. l’onde "B" retardée. L'onde "O" est alors proche de zéro. La plaque de phase est une lame de verre avec un anneau opaque qui enserre une lame biréfringente quart d'onde. Dans la figure 2. deux ondes de lumière sont représentées :"B" est l'onde passant en dehors de l'objet de phase (c'est-à-dire qu’elle provient directement de l'éclairage du fond).6 : Schéma simplifié du contraste de phase. Figure 2. Figure 2.Le déphasage différentiel entre ces rayons. La différence de phase est donc de λ/4.5 : Microscope à contraste de phase.6.

(par exemple des vacuoles. mais avancé en phase.maximal.7 : Schéma décrivant le cheminement des faisceaux de lumière dans un microscope à contraste de phase.7 montre comment cela est réalisé en pratique. 32 . Si ce n'est pas le cas. La condition essentielle pour obtenir un bon contraste de phase est que le déphasage par rapport à la longueur d'onde de la lumière utilisée soit très faible (faible épaisseur des détails à observer et différence minime entre les indices de réfraction). une membrane plasmique) les objets apparaissent en clair sur fond sombre. Le contraste de phase est dit positif si l’objet (par exemple des bactéries dans une solution nutritive) d'indice de réfraction plus élevé apparaît plus sombre que le milieu qui l’entoure. La lumière venant du condenseur est divisée en deux par l'objet. dans ce cas "O" devient plus clair que le fond plutôt que plus foncé. Ainsi. dont l'image est à l'infini : un faisceau de lumière parallèle sort du condenseur. La figure 2. Notons cependant que le contraste de phase ne distingue pas entre une différence d’indice optique et une différence d’épaisseur. Le cache annulaire est placé dans le plan focal avant du condenseur. Figure 2. le microscope à contraste de phase renseigne sur l'indice de réfraction des objets et sur leurs détails. un faisceau non dévié et un faisceau dévié. Dans le cas contraire. Ce raisonnement est également valide si "D" n'est pas retardé. des anneaux de diffraction gênants peuvent apparaître.

Formation de l'image du faisceau dévié (à droite sur la figure 2. En effet. avec lesquels on souhaite avoir la plus grande résolution possible est beaucoup trop petit dans bien des microscopes de routine. il arrive que l'anneau du plateau de phase d’objectifs 100x. D’autre part. B Diaphragme annulaire clair masqué par l'anneau de phase sombre.Formation de l'image du faisceau non dévié (à gauche sur la figure 2.7) : le faisceau de lumière non dévié "B" continue son chemin parallèle et forme une image sur le plan focal arrière de l'objectif. De tels objectifs ne résolvent plus une diatomée du type Surirella gemma. il n'est utile que pour les objets de phase. Sur ce plateau de phase.8. comme indiqué sur le plateau du condenseur). C Diaphragme annulaire et anneau de phase centrés mais diaphragme annulaire flou car le condenseur est réglé trop bas et les conditions de l'éclairage de Köhler ne sont pas réalisées. On ajuste d’abord l'éclairage selon Köhler. Parce que ces deux images sont autant séparées. En premier. L'objectif possède un plateau de phase annulaire spécial dans son plan focal arrière. Pour des objectifs de 10x. On trouve 33 .7) : le faisceau de lumière dévié "D" sort de l'objet et forme une image à l'intérieur de l'oculaire. qui est facilement résolue en champ clair (sans le contraste de phase). 20x. Le diaphragme du condenseur doit aussi être complètement ouvert. cette réduction est la plupart du temps imperceptible ou acceptable. dont la grandeur correspond à l'image de l'anneau de phase du condenseur. On sélectionne l'anneau de phase correct pour l'objectif utilisé (10x. on peut laisser le diaphragme de champ ouvert car il n'est pas très effectif ici. En fait. Le centrage des anneaux de phase est crucial comme rappelé sur la figure 2. Pour l’observation. Figure 2. etc. le contraste de phase peut être la cause d’une perte de résolution.8 : Centrage pour le contraste de phase : A Diaphragme annulaire et anneau de phase centrés. l'anneau de phase dans le condenseur limite "l'angle d'admission" en dessous de l'angle maximum que l'objectif utilise. on insère le télescope de centrage et on centre l'anneau. 20x et 40x d'un système à contraste de phase. Le contraste de phase possède également des limitations. environ 160 mm audessus de l'objectif. c'est à dire : des objets fins qui n'absorbent que très peu la lumière. le faisceau "B" peut être utilisé en laissant le faisceau "D" seul. même avec des objectifs d'ouverture numérique plus petite. l’onde "B" acquiert le déphasage d’un ¼ de longueur d’onde supplémentaire et est également atténué (l'anneau peut être observé en regardant à travers l'objectif). on procède comme suit.

Des structures biréfringentes en forme de bâtonnet placées entre deux filtres de polarisation croisés apparaîtront quatre fois sous forme lumineuse lorsqu'on les fait tourner de 360°.9 qui procurent à la fois une bonne résolution et un bon contraste. une différence de marche apparaît entre les deux rayons. La figure 2. Comme ces deux rayons ont chacun une vitesse de propagation propre. Dans un microscope polarisant.45 de cristaux de chlorure de strontium.Microscopie en lumière polarisée La microscopie en lumière polarisée est surtout une méthode analytique qui permet de déterminer diverses propriétés optiques des cristaux.9 compare une image obtenue en microscopie en fond clair avec celle réalisée en contraste de phase. Un filtre polariseur polarise la lumière issue du condenseur.4. c’est le polariseur. partage un faisceau de lumière incident en deux faisceaux. induisant une différence de phase qui varie avec la longueur d'onde. un second polariseur croisé avec le précédent sélectionne la lumière polarisée dans une direction perpendiculaire. 2. Un objet biréfringent caractérisé par ces deux indices optiques. l’un le faisceau ordinaire suivant le chemin défini par l’indice ordinaire. Ces deux faisceaux sont polarisés selon des directions perpendiculaires. c’est l'analyseur. l’autre.9 : Images en microscopie à fond clair à gauche et à contraste de phase à droite avec un objectif ordinaire 20x 0.cependant des objectifs 100x à contraste de phase avec un anneau correspondant à une ouverture numérique d'environ 0. Figure 2. L’interférence des deux rayons génère une onde elliptique dont l’état de polarisation dépend de la différence de marche. La microscopie en lumière polarisée permet l'observation d'objets biréfringents anisotropes. le faisceau extraordinaire suivant le chemin défini par l’indice extraordinaire. respectivement indice ordinaire et indice extraordinaire. comme les grains d'amidon ou les ponctuations 34 . Des objets présentant une symétrie sphérique. l’objet est placé entre deux polariseurs croisés.

Un filtre de premier ordre rouge placé entre le polariseur et l'analyseur augmente fortement les différences de couleurs comme montré dans la figure 2. la lumière polarisée permet de révéler des détails normalement invisibles en fond clair.12. Les structures qui ne sont pas biréfringentes restent invisibles. images de grains d’amidon en microscopie de polarisation. Figure 2. Comme la microscopie à contraste de phase. Placée entre polariseur et analyseur croisés. 2. Figure 2.11 : Observation de cristaux de bichromate de potassium en lumière polarisée.11). on compare les images de ponctuation aréolées dans du bois de pin observées en fond clair et entre polariseurs croisés.10 : A gauche. font apparaître la croix sphérique caractéristique (Fig. 35 . de très petits déphasages produisent une différence marquée de couleur. Ce domaine se situe dans le rouge.aréolées. à une longueur d'onde appelée "premier ordre rouge". une substance biréfringente peut aussi donner naissance à l’apparition de colorations dépendant du déphasage entre les deux rayons et conduire à des observations spectaculaires (Fig. 2. Dans un domaine particulier de couleur.10). A droite.

il se passionne pour l’optique et décide de mener toute sa carrière dans cette voie. En 1950. il choisi la France comme résidence permanente.5. il créa le Laboratoire de Microscopie Optique de l’Institut d’Optique d’Orsay) et débuta comme Professeur de Microscopie à l’ESO à partir de 1953.12 : Structures vasculaires et microcristaux dans une peau d’oignon révélés en lumière polarisée et par l’utilisation d’un filtre de premier ordre rouge. Georges Nomarski prit sa retraite en 1980 et vécut à Antony. Il est à l’origine de nombreuses inventions et auteur de plusieurs brevets à son nom. Sa carrière a été jalonnée de multiples récompenses.Figure 2. dont le plus connu est celui du système DIC de microscopie à contraste interférentiel différentiel qu’il développa dans les années 1950. au sud de Paris où il mourut le 17 février 1997. Il a reçu le prix du Duc d’Aumale décerné par l’Académie des Sciences en 1952. Un problème lié à l’utilisation de prismes Wollaston conventionnels était que le prisme utilisé pour la recombinaison des faisceaux devait être dans le plan focal de l’objectif.Microscopie à contraste interférentiel différentiel « Nomarski » Plusieurs types de microscopes à contraste interférentiel furent imaginés dans les années 1940-1950. La découverte décisive de G. c’est à dire généralement dans l’objectif. Nomarski entre ensuite à l’Université de Louvain en Belgique où il sollicita le statut de réfugié politique en 1945. Il fut embauché comme chercheur au CNRS où il fut promu Directeur de Recherche en 1965. En 1995. Après des études à l’Ecole Polytechnique de Varsovie. 2. il a été récompensé pour toute sa carrière scientifique par la Médaille d’Or de la SPIE (Society of Photo-optical Instrumentation Engineers) en hommage à l’importance et à l’impact de ses découvertes dans des disciplines très différentes. Biographie de Georges Nomarski Georges (Jerzy) Nomarski est né en Pologne en 1919. le prix le plus prestigieux de la Société newyorkaise de Microscopie décerné à la mémoire d’Ernst Abbe en 1973. Smith furent les premiers à utiliser des prismes de Wollaston pour la séparation et la recombinaison des faisceaux. le prix de la Société Microscopie de Chicago en 1970. le prix Gaumont de la Société d’Encouragement pour l’Industrie Nationale en 1963. Il participa à la résistance polonaise et fut fait prisonnier de guerre jusqu’en mars 1945. Nomarski fut diplômé de l’Ecole Supérieure d'Optique (ESO) de Paris en 1949. Dans 36 . Les microscopes conçus par F. Nomarski a été d’imaginer comment modifier le prisme de Wollaston standard en sorte qu’il puisse être facilement placé à l’extérieur de l’objectif. En 1947.

les cristaux sont taillés obliquement à l’axe optique ce qui permet au plan de localisation des franges d’être à l’extérieur du prisme et donc.un prisme de Wollaston modifié par Nomarski. par exemple cytoplasme pour le rayon ordinaire et la membrane cytoplasmique pour l'extraordinaire. sous forme de différences de couleur ou d’intensité. Le condenseur contient un filtre polariseur suivi d'un Wollaston qui sépare le rayon ordinaire (trait plein) du rayon extraordinaire (trait pointillé). Ces deux rayons (nommés respectivement ordinaire et extraordinaire) traversent les spécimens en deux points différents mais très proches. La séparation en deux rayons est réalisée par un Wollaston (assemblage particulier de deux cristaux biréfringents) comme montré sur la figure 2. Le contraste interférentiel différentiel (DIC) également appelé contraste «Nomarski» est aussi utilisé pour l'observation de préparations non colorées. mais polarisés orthogonalement et séparés spatialement d'une distance très courte (une fraction de la longueur d'onde). les deux rayons sont superposés par un second Wollaston et un filtre polariseur croisé analyse la différence de phase entre les deux rayons. Les premiers microscopes à contraste interférentiel différentiel ont été produits et commercialisés par Carl Zeiss en 1965. Après collection par l'objectif. un contraste positif ou négatif sera créé révélant ainsi les structures cellulaires. un microscope polarisant est en réalité une forme de microscope interférentiel. Il existe plusieurs techniques pour réaliser un microscope interférentiel. Suivant la différence de phase entre les rayons. Ainsi.13. Figure 2. Suivant les milieux traversés par chacun des deux rayons. D’ailleurs. ceux-ci subissent un déphasage différent. Le principe repose sur la division d'un rayon lumineux polarisé en deux rayons de même longueur d'onde. le prisme de recombinaison peut être installé dans la tourelle porte-objectifs et le dispositif de Nomarski est simple. Après l'objectif. le microscope interférentiel rend visibles les petites différences d’indice optique présentes dans un objet optiquement mince. de pouvoir être placé dans le plan focal arrière de l’objectif. la microscopie interférentielle fut d’abord développée comme une méthode analytique permettant des mesures de grande sensibilité des propriétés optiques d’un objet. 37 .13 : Microscope à contraste Nomarski. Comme le microscope à contraste de phase. A la différence du microscope à contraste de phase mais comme le microscope en lumière polarisé. les deux rayons sont re-combinés par un second Wollaston et viennent interférer sur un filtre polariseur.

Principe La microscopie conventionnelle par épi-fluorescence. car elle nécessitait l'emploi d'une source ponctuelle délivrant une grande intensité lumineuse et l'image devait être formée sur un écran à haute rémanence. délivre des images qui malheureusement souffrent d'une résolution limitée et apparaissent comme vues au travers d'une brume diffuse.3. largement utilisée de nos jours en biologie cellulaire. Un trou d’aiguille (appelé « pinhole ») placé devant le photodétecteur et centré au niveau du foyer arrière de l'objectif rejette la lumière parasite provenant des points situés hors du plan focal.1 : Principes comparés de la microscopie conventionnelle par épi-fluorescence (A) et de la microscopie confocale (B). Cette technique cependant resta longtemps inutilisée. A cette époque. 38 . Marvin Minsky se trouvait devant la nécessité d'observer des cellules neuronales dans des coupes épaisses de tissus nerveux. ceci est obtenu en illuminant la préparation au moyen d'un point lumineux dont le diamètre est limité par les lois de la diffraction de la lumière. En effet. 3. Les photons émis par les fluorochromes vont être détectés point par point avec un tube photomultiplicateur durant le balayage de la préparation. En 1957.1B). Le secret de l'imagerie confocale consiste à éliminer la lumière parasite hors focale. Dans le plus simple des cas (Fig. le champ du microscope est fortement éclairé par la source lumineuse et les fluorochromes sont excités au travers de toute l'épaisseur de la préparation (Fig.lA). Ainsi à un instant donné. Il en résulte que l'image formée par le microscope est contaminée par de la lumière provenant de points situés hors du plan focal et apparaît peu contrastée.1. il faudra attendre le début des années1980 où la production de sources lasers à bas coût et le développement exponentiel de l'informatique permit que cette technique innovante de microscopie trouve la place qu'elle occupe désormais dans le domaine de la biologie. Figure 3.Microscopies optiques confocales L'invention des méthodes de microscopie confocale photonique a été faite au milieu des années 1950. 3. 3. En fait. Ce dispositif fut rapidement baptisé système confocal. il mit alors au point un prototype de microscope avec platine de balayage et doté de ce qui fut nommé à l'époque un système de focalisation double. le point illuminé situé au foyer avant (ou foyer 'objet') de l'objectif et le pinhole situé au foyer arrière (ou foyer 'image'). Le nom 'confocal' provient de la mise en correspondance de trois points: la source lumineuse ponctuelle (en général une source laser). seule une infime partie du spécimen est fortement illuminée et va émettre de la fluorescence.

Le rôle du trou d’aiguille est déterminant pour garantir la résolution et le contraste de l’instrument comme illustré sur la figure 3.2.

Figure 3.2 : Illustration du rôle du diaphragme de détection dans la résolution du microscope confocal.

Le diaphragme de détection peut être un diaphragme à iris permettant d'ajuster le volume élémentaire analysé par la sonde laser. Outre le respect des conditions d'optique classique (choix de la longueur d'onde, ouverture numérique maximale de l'objectif), la résolution spatiale maximale est obtenue par l'ajustement du diamètre du pinhole à la limite de diffraction, c’est à dire lorsqu’il est égal au diamètre de la tache d'Airy.

3.2- Formation de l'image confocale
Comme dans tout instrument d’optique, le microscope confocal obéit aux limitations imposées par les lois de la diffraction lumineuse. Cependant, la configuration confocale procure un gain en termes de résolution axiale et radiale par rapport à la microscopie conventionnelle, comme illustré sur la figure 3.3.

Figure 3.3 : Comparaison entre les fonctions d'étalement du point (PSF) en microscopie conventionnelle (à gauche) et en microscopie confocale (à droite). Les intensités sont en négatif pour une meilleure lisibilité.

39

Rappelons que la PSF dans le plan focal, notée hi(x,y), décrit la façon dont la lumière qui idéalement devrait rester concentrée en un point est étalée par diffraction autour de ce point. En théorie du signal, on dirait que la PSF est la fonction de transfert du système optique (« Optical Transfer Function », OTF). Appliquée à une source ponctuelle o(x,y), l’image i(x',y') après traversée d’un système optique sans aberration s'exprime sous la forme :

i(x',y') = o(x,y)⊗hi(x,y)
où le symbole ⊗ est l'opérateur de convolution.

(3.1)

De même, on peut introduire la PSF de défocalisation, h0(x,y), qui décrit la façon dont la tache d’Airy est altérée lorsque déplace l'objet le long de l'axe optique Z. L’image « complète » en 3D s’exprime alors sous la par la relation :

i(x',y') = o(x,y)⊗hi(x,y)⊗h0(x,y,∆z)

(3.2)

où ∆z représente l'éloignement de l’objet par rapport au foyer de la lentille. Les deux PSF, axiale et radiale, peuvent être fusionnées en une seule h(x,y,z), représentant la PSF tridimensionnelle de l'objectif :

i(x',y',z') = o(x,y,z)⊗h(x,y,z)
3.2.1 Amélioration de la résolution en microscopie confocale

(3.3)

Résolution axiale en x,y
L’adjonction d’un pinhole entraîne une amélioration de la résolution latérale. La formule du pouvoir séparateur latéral devient dans le cas du microscope confocal :

dmin ≈ 0,46.

λ NA

(3.4)

à comparer avec la relation 1.24 obtenue pour un microscope conventionnel. On remarque cependant que l'amélioration de la résolution latérale n'est pas spectaculaire. C'est plutôt au niveau de la résolution axiale et du pouvoir de sectionnement que se situe l'avantage de la microscopie confocale.

Résolution radiale en z
On évalue la résolution axiale d’un microscope confocal en mesurant la décroissance en intensité le long de l'axe Z pour un objet idéalement ponctuel. La profondeur de champ (ou résolution axiale) sera définie comme la largeur à mi-hauteur du profil d'intensité (en Z). Ainsi on constate que la profondeur de champ en microscopie confocale, est diminuée d'un facteur 1,4 par rapport à la microscopie conventionnelle. La résolution axiale dz en microscopie confocale s'exprime par la relation :

dz = 1,77.

λ ( NA) 2

(3.5)

40

On note que la résolution axiale est inversement proportionnelle au carré de l'ouverture numérique de l'objectif. Il est donc impératif d'utiliser des objectifs à grande ouverture numérique pour obtenir le meilleur sectionnement optique. On notera que la résolution spatiale d’un microscope confocal est anisotrope, en ce sens que la résolution latérale (dxy) et la résolution axiale (dz) ont des valeurs différentes pour une même longueur d'onde λ, un même indice de réfraction n et une même ouverture numérique NA. En pratique, et selon l'ouverture numérique de l'objectif, la résolution est 2,5 à 4 fois moins fine dans la direction axiale que latéralement. Le sectionnement optique se définit comme la décroissance de la quantité totale de lumière présente dans le plan focal à mesure que l'on s'éloigne d'un objet lumineux ponctuel. Autrement dit, cela consiste à intégrer pour chaque position z la PSF de défocalisation.

Figure 3.4 : Propriété de sectionnement optique en microscopie conventionnelle (pointillés) et microscopie confocale (continu). Les courbes représentent les valeurs de l'intensité de la lumière intégrée (c'est-à-dire sommée) dans des plans parallèles xy en s'éloignant graduellement du plan focal. Les images sont présentées en contraste négatif.

La figure 3.4 représente les courbes de sectionnement optique obtenues en intégrant la lumière dans les plans (xy) successifs. Dans le cas de la microscopie conventionnelle, l'intensité lumineuse intégrée reste constante quelque soit la défocalisation. Au contraire, dans le cas de la microscopie confocale, on observe une chute rapide de l'intensité intégrée à mesure que l'on s'éloigne du point source. Le pinhole remplit donc parfaitement son rôle sélectif en rejetant la lumière "hors focale". Cette propriété de sectionnement optique du microscope confocal est parfaitement illustrée par la figure 3.5A. Sur cette figure sont représentées des coupes optiques sériées réalisées au travers d'une cellule vivante en culture dont les mitochondries ont été colorées au moyen d'un fluorochrome spécifique(rhodamine 123). Les coupes optiques sont obtenues en montant la platine porte-objet d'un pas de 2 µm entre l'enregistrement de chaque plan.

41

elles s'amassent dans le cytoplasme tout autour du noyau cellulaire qui est vide de tout marquage. Dans les coupes confocales. La figure 3. B : Section optique axiale (xz).5B illustre une autre possibilité de sectionnement conférée par le mode confocal. le mode confocal se montre très supérieur au mode conventionnel. En pratique. les mitochondries sont plus difficiles à distinguer. les mitochondries sont très bien résolues.4.5 : Comparaison entre microscopie confocale (rangée du haut) et microscopie conventionnelle (rangée du bas). D'autre part la dégradation du rapport signal sur bruit devient 42 . Ainsi avec λ = 488 nm et NA = 1. En effet. Au-delà de cette valeur la dispersion de la lumière par le milieu traversé devient trop importante pour pouvoir assurer une bonne résolution. c'est-à-dire d'effectuer une coupe optique selon un plan parallèle à l'axe optique du microscope. la ligne en pointillé indique la position du support en verre.Figure 3. Là encore. Il est communément admis qu'une épaisseur maximale d'environ 50 µm constitue la limite pour la microscopie confocale mono-photonique. En fait. il est souvent nécessaire de contrôler ces valeurs du constructeur à l'aide de tests optiques relativement simples.4. A : Quatre sections optiques transversales (xy) séparées de 2 µm au travers d'une cellule in vitro dont les mitochondries ont été colorées par la rhodamine 123. la résolution maximale théorique d’un microscope confocal serait de 160 nm dans le plan (xy). Qu'en est-il de la résolution réelle? Elle est toujours altérée par différents facteurs liés au système optique réel et les constructeurs fournissent généralement une information sur les résolutions maximales possible selon la configuration utilisée. Chacune des coupes apporte une information différente de celle de ses voisines. elle est moins bonne que la valeur donnée par le constructeur : 212 nm pour un objectif 100x/NA1. La rangée supérieure présente les coupes acquises en mode confocal et la rangée inférieure montre les coupes correspondantes acquises en mode conventionnel. il est possible de réaliser un sectionnement axial. La différence entre les deux modes apparaît très évidente. En mode conventionnel. Cependant. on notera que l'image obtenue présente un léger flou dans la direction axiale. Le contraste a été inversé pour faciliter la visualisation des images. Elles apparaissent comme noyées dans une brume diffuse due au fond de fluorescence émis par les plans adjacents. Notons que l'épaisseur d’une membrane plasmique est d'environ 10 nm selon les types cellulaires. ce qui veut dire que l’on est bien en deçà de la résolution maximale du microscope confocal le plus performant soit-il ! Un dernier paramètre à prendre en compte dans le domaine de la résolution est l'épaisseur des structures que l'on observe.

c’est à dire la « Point Spread Function ». 3. En principe. il pourrait être possible de restituer l’objet et d’éliminer les effets de diffraction dus à l’objectif comme symboliquement représenté sur la figure 3. ICTM). PSF ou ce qui est équivalent. du fait de l'illumination infrarouge. Figure 3. par une opération de déconvolution de l’image. • L’algorithme non-itératif de Tikhonov-Miller (« Non-iterative Tikhonov-Miller Algorithm ». QTM).6. OTF caractéristique d'un système optique donné. la « Optical Transfer Function ». On parle aussi de problème de la diffraction inverse. MLE). En fait.6. 43 . • L’algorithme de itératif avec contraintes de restauration de Tikhonov-Miller (« Iterative Constrained Tikhonov-Miller Restoration ». qui permettent d’effectuer ces calculs de déconvolution. cette épaisseur peut atteindre 400µm.6 : L'image d'un point n'est pas un point. en mode multi-photonique. Cette idée est à l’origine de ce que l’on appelle parfois la super-résolution directement relié à l’optique dite de Fourier qui n’est autre que la transposition à l’optique de méthodes d’analyse fréquentielle utilisée en électrique. 3.2. Est-il possible par un procédé inverse de reconstituer l’objet par déconvolution ? En connaissant la fonction de restitution des fréquences spatiales d'un objet ponctuel.également prohibitive. On peut citer par exemple : • L’algorithme d’estimation du maximum de ressemblance (« Maximum Likelihood Estimation ». souvent appelés algorithmes de restauration d’images. mais une tache dite d'Airy. C'est le sens des calculs de déconvolution en 3D symbolisés par la flèche retournant vers la droite dans la figure 3. Par contre. il importe surtout de savoir que cette opération se heurte à deux types de problèmes fondamentaux et en principe quasiment insurmontables. Il existe de nombreux algorithmes.3). on doit pouvoir réassigner chaque photon détecté à son point objet-source.2 Traitement et déconvolution de l’image confocale Nous avons vu que l’objectif du microscope comme toute lentille effectue instantanément une opération de convolution (éq.

3.3. soit en gardant l'objet fixe et en déviant le point lumineux. en utilisant la fluorescence.Réalisation d’un microscope confocal Les microscopes confocaux sont conçus pour travailler en réflexion ou en épi-fluorescence. Ces bruits toujours présents sont difficiles à éliminer et sont sources d’instabilités dans le traitement des données par des moyens informatiques. La microscopie confocale est une microscopie à balayage. 44 . la transformé de Laplace inverse n’est pas possible. Ce capteur qui peut être soit un tube vidéo type VIDICON ou une matrice à éléments CCD analyse l'image formée en la parcourant ligne par ligne et de haut en bas. Il a été démontré qu’en toute rigueur. Le balayage de l'objet est obtenu soit en utilisant un point lumineux fixe et en déplaçant l'objet sous l'objectif du microscope. De plus. comme les longueurs d'onde des lumières d'excitation et d'émission sont toujours décalées à cause du déplacement de Stokes. La conjugaison d’un point source dans l’échantillon illuminé par au point focal d’un faisceau laser avec le diaphragme de détection situé dans le plan focal de l’objectif définit un plan de coupe optique dans l’échantillon. on peut les séparer à l'aide d'un miroir dichroïque. L’autre problème est dû aux bruits de toute nature qui perturbent l’acquisition d’une image. L'image du champ analysé point par point est recomposée électroniquement point par point sur l'écran d'un oscilloscope (ou sur un moniteur vidéo) ou numériquement dans la mémoire d'un ordinateur. en pratique. De manière très générale. Imagerie à balayage dans le plan objet : dans ce cas.Le premier problème est d’ordre mathématique. on peut considérer qu’il existe deux types d'imagerie à balayage : Imagerie à balayage dans le plan image : l'image de l’objet est focalisée directement sur la surface sensible du capteur. Le passage du faisceau lumineux par un diaphragme de taille très inférieure au champ d'observation oblige à effectuer un balayage de la surface du champ pour reconstruire une image de l’objet étudié. on peut souvent justifier de remplacer Laplace par Fourier et résoudre ainsi la déconvolution. Ces miroirs réfléchissent la lumière d’une longueur d’onde inférieure ou égale à une certaine longueur d'onde mais laissent passer la lumière de longueur d'onde supérieure. Ces modes et plus particulièrement l'épi-fluorescence constituent la voie la plus facile pour réaliser la confocalité dans un microscope puisque l'optique d'illumination est la même que celle d'observation. Bien sûr. il faut rappeler que l’opération de convolution est associée à la transformée de Laplace et non à la transformés de Fourier. c'est la préparation elle-même qui est parcourue par un point lumineux (tache de lumière focalisée). Si une transformée de Fourier inverse est tout à fait légitime. Cela permet d'obtenir un très bon rapport signal/bruit puisqu'en épifluorescence il sera relativement facile d’obtenir des taux élevés de réjection de la lumière d'excitation. sans hypothèses à priori. L'interaction de ce point lumineux avec le spécimen est enregistrée au vol par un détecteur soit un tube photomultiplicateur ou une photodiode à avalanche.

Commercialement. Une platine motorisée sert seulement à déplacer la préparation suivant l'axe Z permettant la saisie de différents plans optiques dans l'épaisseur de l'objet.Y) pour réaliser une première coupe optique. puis la déplacer selon Z pour accéder à un plan voisin. ce balayage peut se faire de plusieurs façons. Cette technique est bien plus rapide pour l’obtention d’une image. on peut simplement déplacer la platine supportant la préparation d’abord en (X.3.Y) à l'aide de miroirs de déflection de la source lumineuse. Il est bien préférable de reconstruire l’image de l’objet point à point par balayage du champ analysé dans le plan (X. Il s'agit d'un système d'épi-illumination où la source de lumière est constituée par un rayon laser. Le faisceau laser d’excitation étant fixe. il existe deux types principaux de microscopes confocaux à balayage : les microscopes à balayage laser et les microscopes à disque de Nipkow.Figure 3. La lumière est envoyée vers un objectif à grande ouverture numérique (NA>1. Cette technique est trop lente pour la reconstruction d’une image et elle n’est pas utilisée dans les instruments commerciaux.0) par réflexion sur un miroir dichroïque.7 : Schéma de principe d’un microscope confocal.8.7. 3. 45 . Les images ainsi formées sont stockées sur la mémoire de masse d'un ordinateur pour servir ensuite à la reconstruction d’une image en 3 dimensions. Dans un microscope confocal tel que celui schématisé sur la figure 3.1 Microscope confocal à balayage laser (MCB) Le dispositif le plus courant de microscope confocal à balayage laser est décrit sur la figure 3.

Le signal de fluorescence émis par chaque point à une longueur d’onde différente de la longueur d’onde d’excitation passe à travers le miroir dichroïque et est détecté à travers le diaphragme de détection par le photomultiplicateur.Y du spot laser pour exciter tout un plan de l’échantillon. non représentés sur la figure 3.9.8. Avant l'objectif le rayon passe par un couple de miroirs de déflexion montés sur des axes de bascule orthogonaux. 46 .8 : Principe d'un microscope confocal à balayage laser. Figure 3. Les angles formés par ces miroirs déterminent la position en X et Y du point lumineux après la traversée de l'objectif. Le spécimen peut être balayé point par point en faisant varier ces angles somme schématisé sur la figure 3.9 : Principe du balayage en X.Figure 3.

10 : Schéma complet d’un microscope confocal à balayage laser.3. Figure 3. 47 .11 : Représentation schématique d’un disque de Nipkow. Un tel microscope permet la reconstitution d’images tri-dimensionnelles. on réalise un balayage quasi instantané de tout le champ grâce à la rotation rapide à plus de 300 tours/sec d'un disque de Nipkow placé dans le champ image de l'objectif. Un disque de Nipkow est percé d'un grand nombre de micro-diaphragmes disposés de façon à recouvrir la totalité du champ à chaque rotation (Fig. 3. L'image est ensuite reconstruite par des moyens de calcul informatique en additionnant tous les signaux obtenus après le balayage du plan.2 Microscope confocal à disque de Nipkow Dans cette approche. 3.Figure 3. Un système complet tel celui représenté sur la figure 3.10 est ainsi équipé d’un ordinateur puissant ou d’une station de travail pour contrôler les différentes fonctions de balayage et réaliser rapidement les opérations nécessaires de reconstruction et de traitement d’image.11).

3. La configuration retenue comprend plusieurs sources laser pour permettre d'analyser simultanément 2 ou 3 fluorochromes différents. Cette stratégie permet l'acquisition en mode confocal d'événements rapides sans compromettre la haute résolution du mode confocal. La récupération du signal "confocal" est effectuée par une caméra d'acquisition classique permettant l’obtention d’une image quasiment en temps réel (Fig. L'exploration du spécimen est obtenue par la rotation d'un disque de Nipkow (à droite) percé de milliers de trous disposés selon des spirales d'Archimède imbriquées.Dans ce type de microscope. 48 . l’illumination est effectuée au travers de ce disque en lumière blanche par une source de lumière étendue couvrant un rayon du disque de Nipkow.3 Description d’un microscope confocal inversé commercial Il s’agit du microscope confocal inversé modèle SP2 de Leica (Fig. et un analyseur spectral qui permet d’offrir également une souplesse sur la définition des fenêtres pour la détection de la fluorescence. Ce dispositif est particulièrement apprécié en biologie végétale étant donné l'importance de la fluorescence intrinsèque dans de nombreux cas. 3.13).12 : Principe d'un microscope confocal à balayage du type Tandem (tandem scanning). sans interférences. permettant notamment la lecture de flux ioniques au sein de systèmes vivants. Figure 3. Ce microscope permet de cerner les propriétés in situ de fluorophores naturels ou extrinsèques (comme la fameuse « Green Fluorescent Protein » ou GFP par exemple) et de développer une imagerie ratiométrique. Un disque de Nipkow peut être équipé d'une micro-lentille sur chacun des diaphragmes pour mieux récupérer la lumière émise par le point source et augmenter ainsi la sensibilité de l’instrument.3.12). D'autres dispositifs apparentés existent qui font appel à des circuits intégrés à micro-miroirs. une technologie développée à l’origine pour les systèmes de vidéo projection. 3.

49 .13 : Vue éclatée du microscope confocal Leica SP2.Figure 3.

Exemples d’applications La microscopie confocale possède de nombreux avantages par rapport à la microscopie conventionnelle. Il en résulte une très bonne sensibilité de détection. 3.5 µm) du microscope permet d'obtenir une image d'un plan focal. mais également des petites molécules telles que des peptides. facilitant le travail sur des tissus épais et sur des tissus perfusés. Tout d'abord la faible profondeur de champ (0. c'est l’épi-fluorescence qui constitue la voie d'approche privilégiée.14 et 3. des composants macromoléculaires tels qu’acides nucléiques ou protéines. En combinant les propriétés des miroirs. 50 . l'acquisition numérisée des images permet sur station de traitement d'images. entre compartiments et mouvements d'organites. En outre le bruit de fluorescence dû au fond de l’échantillon est pratiquement éliminé. réalisant ainsi une coupe optique avec une définition bien supérieure à celle obtenue avec un microscope conventionnel. Les applications principales de la microscopie confocale concernent la biologie.Y mais également suivant un plan parallèle à l'axe optique (plan X. séparer les longueurs d'ondes émises et récupérer la lumière dans telle ou telle zone spectrale. Ces coupes optiques n'affectent en rien l'intégrité de l'échantillon biologique contrairement aux coupes physiques nécessaires en microscopie photonique et électronique. Les figures 3. surtout parce que des techniques comme l'immunofluorescence offrent par nature une très grande précision dans le positionnement des marquages sur les structures biologiques. En principe rien n'oblige à l'utilisation de la fluorescence et certaines applications en science des matériaux utilisent de la lumière blanche réfléchie mais c'est au détriment de la résolution. La configuration la plus communément adoptée est celle du microscope confocal à balayage laser (Laser Scanning Confocal Microscope) travaillant en épi-fluorescence. une augmentation du contraste et une "clarification" des images.3. Les longueurs d'ondes d'excitations sont généralement multiples soit en utilisant des lasers multi raies. d'accroître les possibilités d'analyse et de quantification. Des logiciels 3D et d'analyses cinétiques sont disponibles avec cet appareil. L'utilisation de traceurs fluorescents très spécifiques permet de localiser in situ avec une résolution spatiale de l'ordre quelques centaines de nanomètres. et une platine électronique à mémorisation de points permettant le suivi de différentes cellules ou zones sur une cinétique longue (études en multiplex).5 . Pour ce qui concerne les biologistes. des filtres dichroïques et des filtres d'émission.15 montrent deux exemples de marquage par des marqueurs fluorescents de couleurs différentes.1. le photo-blanchiment de zones amorphes pour l'expérimentation en FRAP ? et FLIP ? concernant la communication entre cellules.Z) qui peuvent ainsi permettre de réaliser des reconstructions tridimensionnelles.L'équipement comprend également des objectifs à eau (entre autres). En outre. soit en utilisant plusieurs lasers. des lipides et même des ions. ? Voir la signification de FRAP et FLIP dans le glossaire en annexe. Un autre avantage du microscope confocal est que l'on peut obtenir des coupes optiques non seulement dans le plan X. on peut sélectionner telle ou telle bande d'excitation.

Enfin dans le cadre de l’examen de tissus biologiques vivants. le faisceau laser pouvant être absorbé dans l’échantillon. Tout d’abord. c’est à dire d’une activité toxique capable de tuer certaines cellules. 51 . l’excitation de la totalité de l’épaisseur de l’échantillon à chaque balayage pour reconstruire une image en 3 dimensions peut conduire au photo-blanchiment des fluorochromes utilisés comme marqueur sous l’effet de la densité d’irradiation présente au point focal du faisceau laser. Malgré ses avantages. les densités d’irradiation nécessaires peuvent aussi être cause de cytotoxicité. la microscopie confocale a aussi ses limites et ses désavantages.15 : Images obtenues en microscopies confocales où l’usage de marqueurs fluorescents et de filtres appropriés permet de séparer les différents constituants d’une structure complexe.14 : Images stéréoscopique d’une préparation soumise à un triple marquage en Actine (rouge). Clathrine (vert) et Tubuline (bleu). Vous pouvez faire apparaître la sensation de relief en en louchant légèrement pour superposer visuellement les deux images. D’autre part.Figure 3. Figure 3. on peut avoir une perte de signal en pénétrant dans les couches plus profondes de l’échantillon.

52 .

Il est ainsi très intéressant de rappeler les spéculations de Synge qui entretint une correspondance avec A. comme A.E. Ce n'est cependant qu'au début des années 80.A. Il est inutile de souligner la pertinence de cette remarque : le microscope à champ proche n'a rien à voir avec les microscopes classiques. Einstein sur la possibilité d’utiliser des dispositifs avec des colloïdes d’or. n'a lui-même jamais considéré qu'il puisse s'agir d'une limite définitive. En effet.4. l'outil qui nous permettra d'étudier l'infiniment petit de manière plus efficace que notre microscope actuel n'aura en commun avec lui que le nom". Pohl et al. grâce aux travaux de D. Courjon et al. je crois que quel qu'il soit. l'esprit humain découvre des processus et des forces permettant de franchir ce mur qui nous parait actuellement infranchissable.1.Microscopies optiques en champ proche Le microscope «à champ proche» dit encore «microscope tunnel optique» est issu de la longue histoire de l’onde évanescente de Fresnel. était devenu une "limite infranchissable". qui est à l'origine de la formulation du critère de Rayleigh. J. des cônes de quartz métallisés comme sondes locales (Fig. 4. Abbe. puis de bien d’autres groupes que se sont vraiment développées les techniques permettant de franchir ce qui.W. Betzig aux Etats-Unis. Ils avaient aussi proposé des dispositifs capables de récupérer quelques informations concernant des objets sub-longueur d'onde. Il écrivait ainsi en 1876 : "Il se peut que dans l'avenir. Nicholls en 1972 avaient imaginé la possibilité de franchir la «limite» de Rayleigh.1 : Trois idées spéculatives émises dans le débat entre Synge et Einstein pour accroître la résolution spatiale d’un microscope optique. Massey et E. Certains précurseurs. où λ est la longueur d'onde du rayonnement utilisé. Fischer en Europe. Ash et G. 4.1).Ondes évanescentes L'imagerie optique classique trouve une limite dans l'impossibilité de séparer les images de deux objets éloignés d'une distance inférieure à la demi-longueur d'onde du rayonnement utilisé. le critère de Rayleigh stipule que deux points ne sont vus séparément que si la distance qui les sépare est supérieure à λ/(2nsinθ).A. Ce glissement de vocabulaire. Mais en même temps. de simple "critère" à l'origine. O'Keefe en 1956 puis E. Figure 4. et U. est d'autant plus intéressant à souligner que E. Je pense personnellement que cela se fera. de G. de D. Synge dès 1928. qui avait fini par stériliser toute idée de recherche d'une meilleure résolution. à Besançon.A. n est l'indice optique du milieu ambiant et θ est le demi-angle d'ouverture 53 .

La première vérification expérimentale de l’existence de ce type d’onde est attribuée à Newton. Si le vecteur d'onde utilisé pouvait être infini. se retrouve dans le principe d'indétermination de Heisenberg. A gauche. exprimé sous la forme d'un critère. on peut constater néanmoins l’existence d’une perturbation électromagnétique dans le second milieu où il est malgré tout possible de détecter une onde. La figure 4. Cette expérience se répète aisément avec les moyens actuels. Dès que la distance qui sépare la lentille et le prisme est inférieure à l’équivalent d’une demi-longueur d’onde. donc avant le contact des deux milieux. Pour cette raison. Rien n'interdit pourtant de dépasser ce critère. Ce résultat. 4. une partie de la lumière jusque là totalement réfléchie dans le prisme. A cause de sa structure particulière qui lui impose de ne se propager qu’au voisinage immédiat de la surface de séparation des deux milieux. Dans un tel cas. soit stationnaire. On voit donc où se situe le paradoxe d'une super-résolution : les ondes progressives vérifient toujours la relation d'indétermination .du système optique imageur. cette onde est dite «évanescente». Il s’observe lorsque la lumière se propage dans un milieu d’indice de réfraction n1 pour se réfléchir sur un milieu d’indice n2<n1.1 Introduction Le phénomène de réflexion totale frustrée est bien connu.2 indique la manière de générer une onde évanescente soit propagative le long de la surface. Figure 4.1. dès que l’angle d’incidence θ1 du faisceau est supérieur à une valeur critique θc définie par la relation n1sinθc = n2. les microscopistes ont longtemps pensé qu'il ne serait jamais possible de descendre en dessous de la limite imposée par le critère de Rayleigh et donc d'observer des objets de dimension sub-longueur d'onde. A droite. On dit que la réflexion totale est «frustrée». elles nous indiquent seulement quelle précision nous pouvons espérer sur la position d'un objet pour une valeur donnée du vecteur d'onde. elles ne peuvent donc conduire qu'à une résolution vérifiant le critère de Rayleigh. Envoyons un faisceau laser sous un angle d’incidence supérieur à l’angle critique θc dans un prisme «à réflexion totale» et approchons de sa surface une lentille plan convexe dont la courbure est tournée du coté du prisme. 54 . est maintenant transmise dans la lentille. la résolution serait infinie. En fait. les relations d'incertitude ne limitent en rien la résolution théorique d'un instrument . toute l’énergie incidente se trouve réfléchie vers le premier milieu et on parle alors de «réflexion totale».2 : Champs évanescents utilisés pour générer localement une source non-radiative. l’onde évanescente est stationnaire. Malgré cette «réflexion totale» de la lumière. l’onde évanescente se déplace selon la direction x.

l’onde évanescente a été étudiée en détail par Fresnel. Les composantes du vecteur d’onde de la partie transmise d’une onde plane qui se propage initialement dans le milieu n1 et qui se réfléchit sur le dioptre avec un angle d’incidence θ1 s’écrivent : ω ω n 2 sin θ2 = n1 sin θ1 c c r rT K ≡ k ≡ Ky = 0 Kx = Kz = ω 2 2 n 2 − n1 sin 2 θ1 c (4. Après Newton. les composantes du vecteur d’onde de l’onde évanescente s’écrivent : 55 . une onde qui ne remplit pas ces conditions ne peut se propager dans l’air et reste confinée sur la surface.Lorsque la lentille est posée sur le dioptre. Pour simplifier. des nanosciences et des nanotechnologies.1) La structure de l'onde transmise dans n2 dépend donc du caractère réel ou imaginaire de Kz. Il y a alors réflexion totale de la lumière sur le dioptre et l’onde transmise dans le second milieu est évanescente. Ce terme est réel lorsque 0<n1sinθ1<n2 mais il devient imaginaire pur dès que n1sinθ1>n2.1. nous nous limitons dans la suite au cas particulier où n2=1. on utilise un faisceau de lumière blanche. Le vecteur d'onde de l'onde évanescente Soient deux milieux diélectriques d’indices respectif n1 et n2<n1 et Oxyz un système de référence dans lequel le dioptre séparant les deux milieux correspond au plan Oxy. Rappelons tout d’abord qu’une onde qui remplit les conditions de propagation dans l’air est dite progressive ou homogène. Le plan d’incidence est le plan Oxz. Dans ce cas. Comme toute onde. 4. elle est dite alors évanescente. Ce domaine qui concerne des phénomènes lumineux observables sur des zones spatiales très inférieures à la longueur d’onde s’inscrit tout naturellement dans le champ de la physique mésoscopique. l’onde évanescente est définie par son vecteur d’onde et sa polarisation. Par contre. Cette zone périphérique correspondant à celle où la distance dioptre-lentille est la plus grande. Depuis. une tache de lumière peut être observable sur un écran placé au-delà de la lentille. elles sont à la base d’un domaine à part entière de l’optique appelée «optique du champ proche». on observe alors que cette tache est irisée : son centre est blanc alors que ses bords sont rouges.2 Les ondes évanescentes de Fresnel La description ondulatoire de la lumière permet une description du phénomène. cette observation indique que la lumière rouge est capable de franchir une couche d’air plus épaisse que les autres couleurs du spectre : le phénomène de «frustration» de la réflexion totale dépend de la longueur d’onde et peut se réaliser sur des épaisseurs d’autant plus importantes que la longueur d’onde est grande. Si au lieu d’un laser monochromatique. Aujourd’hui. la seule découverte importante fut faite en 1947 par Goos et Hanchen qui avaient mis en évidence un déplacement longitudinal du faisceau lors de la réflexion totale.

voit-elle son amplitude décroître exponentiellement dans la direction Oz (Fig. on notera que le module du vecteur d’onde est : r 2 k T = (ω / c) 2n1 sin 2 θ1 − 1 > ω / c . 56 . A cause de cette dernière propriété. En résumé : . le produit scalaire du vecteur d’onde avec lui-même reste r r bien égal à ω/c : k T .2 dans l’expression usuelle r d’une onde plane. on obtient l’équation générale d’une onde évanescente d’amplitude E T : r r r ~ E = E T exp i (K x x + K z z − ωt ) = E T exp(− Kz) exp i (K x x − ωt ) (4. . qui a une structure progressive dans la direction Ox.k T = ω / c .3) Ainsi l’onde évanescente. Bien qu’il soit plus grand que ω/c.2) En utilisant ces valeurs.sa composante parallèle au dioptre Kx vérifie la propriété inhabituelle d’être en module supérieure à ω/c dans le vide (alors que pour une onde progressive homogène aucune des composantes du vecteur d’onde ne peut y être supérieure à cette valeur) .sa composante perpendiculaire au dioptre Kz est imaginaire pure.3).3 : Schéma de réflexion totale interne et structure de l’onde évanescente.ω ω ω sin θ2 = n1 sin θ1 > c c c r rT K ≡ k ≡ Ky = 0 Kx = Kz = i ω 2 2 ~ n1 sin θ1 − 1 ≡ iK c (4. Figure 4. comme c’est le cas pour toute onde électromagnétique se propageant dans le vide. 4. En effet. 4. si on porte l’éq.le vecteur d’onde de l’onde évanescente est complexe . . l’amplitude de l’onde évanescente décroît exponentiellement en fonction de z.

. Tel n’est plus le cas pour une onde transverse magnétique (TM). Quand n1sinθ1>n2 = 1.5) ε z = n1 sin θ1 > 1 On notera qu’alors que la polarisation de l’onde incidente sur le dioptre était rectiligne (polarisation TM) : .2 et 4. la polarisation de l’onde évanescente ne présente pas de caractéristique particulière. En calculant le flux du vecteur de Poynting. le vecteur polarisation de l’onde r incidente sur le dioptre s’écrit dans le premier milieu ε I = (− cos θ1 .4) rT εTM = ε y = 0 (4. c’est à dire dans le cas d’une onde évanescente.3 Conséquences de ces propriétés inhabituelles Les éq. La polarisation de l’onde transmise dans le second milieu s’obtient à partir de cette expression en utilisant les rT 2 lois de Snell-Descartes. Par convention sa «profondeur de pénétration» δ dans le second milieu (ici l’air) est définie comme la distance r r ~ pour laquelle son amplitude E T exp(−Kz) devient égale à E T / e soit : 1 λ δ= ~ = 2 K 2π n1 sin 2 θ1 − 1 La polarisation de l'onde évanescente Dans le cas d'une onde transverse électrique (TE).5 du vecteur d’onde et de la polarisation de l’onde évanescente sont totalement inhabituelles. 4.1. 57 . La connaissance du champ électromagnétique au voisinage de la surface permet d’étudier le flux d’énergie dans l’onde évanescente. Dans le système de référence Oxyz.C’est à cause de cette décroissance exponentielle que l’onde évanescente n’est détectable qu’à une distance très faible de la surface de séparation des deux milieux.le grand axe de l'ellipse est supérieur à 1 ce qui n’est jamais le cas avec une onde progressive. Quelques conséquences peuvent être considérées.0.la polarisation de l’onde évanescente est elliptique. on trouve que ce flux d’énergie est nul en moyenne dans la direction Oz alors qu’il ne l’est pas le long de la surface. n1 sin θ1 ) . On obtient εTM = (− 1 − n1 sin 2 θ1 . cette expression devient : 2 ε x = −i n1 sin 2 θ1 − 1 (4.cette ellipse est située dans le plan d'incidence Oxz (alors qu’usuellement l’extrémité du vecteur polarisation d’une onde plane tourne dans un plan qui lui est perpendiculaire) .0. puisque les deux composantes Ex et Ez du vecteur polarisation ont une longueur différente et qu’elles sont déphasées de π/2. 4. sin θ1 ) .

les inégalités de Heisenberg nous montrent au contraire comment procéder pour s'en affranchir : appliquée dans la direction Ox. l’inégalité 4. Si l'on veut obtenir une résolution supérieure à λ/2.∆px des incertitudes obtenues sur des mesures simultanées de la position et de la quantité de mouvement d’un objet.∆kx > 2π (4. plutôt que d'interdire de franchir le mur de Rayleigh. mais seulement au produit ∆x. 4. il semble donc indispensable d’utiliser des longueurs d'ondes inférieures aux longueurs d'ondes lumineuses. Ainsi.6 indique qu’il faut utiliser un intervalle de valeurs de kx supérieur à l’intervalle [−ω/c.6) Elle montre que pour obtenir une grande résolution (∆x petit). 58 .+ω/c] = [−2π/λ. on ne peut pas discerner d'objet de dimension inférieure à une demi-longueur d'onde du rayonnement utilisé pour l'observer.7) Les ondes progressives dans le vide ne peuvent donc permettre au mieux qu'une résolution de λ/2 conformément au critère de Rayleigh. Pour observer des objets de dimension inférieure. Si l'on ne cherche pas à mesurer simultanément ces deux grandeurs.+2π/λ] et donc considérer des ondes pouvant avoir des composantes kx supérieure à ω/c. En portant cette valeur dans l'éq. Si l’on appelle Oxy le plan d’un écran diffractant. De telles ondes sont des ondes évanescentes qui offrent ainsi un moyen d’augmenter la résolution d’un système optique. Sachant que cette composante est plus grande dans une onde évanescente qu’elle ne l’est dans une onde progressive.6. il faut que l'intervalle ∆kx des valeurs de kx captée soit le plus grand possible. Lorsque l'on ne capte que les ondes progressives. et transposée au couple position-vecteur d'onde. on peut entrevoir une façon d’améliorer la résolution. Dans le domaine optique.+2π/λ] d’où l’on déduit l’expression de l’intervalle total ∆kx = 4π/λ. Cette possibilité d'obtenir des résolutions ∆x au delà de la résolution limite indiquée par le critère de Rayleigh peut surprendre. cette relation d’inégalité s'écrit : ∆x. En bref.Retour sur le problème de la résolution d’un instrument d’optique Nous avons vu que le critère de Rayleigh détermine l'ordre de grandeur de la résolution d’un instrument d’optique. C’est la raison pour laquelle la microscopie électronique a historiquement pris le relais de la microscopie optique pour observer de toutes petites structures. Une étude détaillée du problème permet cependant de comprendre l’origine de ces résultats et d’imaginer une façon de franchir ce «mur de résolution». on en déduit : ∆x ≥ 2π/∆kx = λ/2 (4. rien n'interdit a priori d'obtenir un ∆x aussi petit que l'on veut. Cela ne correspondrait-il pas à violer les inégalités de Heisenberg ? On peut souligner tout d’abord que les relations de Heisenberg n'imposent aucune limite à la mesure de la position x d'un objet. on peut montrer que le pouvoir résolvant d’un instrument d’optique est inversement proportionnel à la composante k// (parallèle au plan de l’objet) du vecteur d’onde du rayonnement utilisé.+ω/c] = [−2π/λ. cela correspond à une limite de visibilité située aux alentours de 300 nanomètres. l'intervalle des valeurs de kx est [−ω/c. où la longueur d'onde utilisable est de l’ordre de 600 nanomètres.

De telles ondes évanescentes ne sont pas obtenues par réflexion totale mais par diffraction. mais la composante tangentielle du vecteur d'onde continue. 59 . à augmenter au-delà de ω/c conduisant ainsi à la génération d'ondes évanescentes de grand vecteur k//. suivant la direction transversale.Les limites de l’onde évanescente de Fresnel Malheureusement. la seule différence entre une onde homogène et l’onde évanescente de Fresnel provient ainsi de la présence de l’indice de réfraction n.4 La diffraction évanescente Pour mesurer l'effet des petits détails d’un objet sur le comportement d’une onde évanescente. la composante tangentielle du vecteur d'onde sera infiniment grande et l'onde évanescente correspondante sera caractérisée par une décroissance exponentielle. Quand le trou aura un diamètre équivalent à la limite de Rayleigh. le seul gain que l’on puisse espérer serait au mieux un facteur 2.1. mais il reste bien peu supérieur à cette valeur puisque son expression Kx = nω/c sinθ (éq. le vecteur d’onde parallèle à la surface est certes supérieur à ω/c.6). plus l'angle α devient grand. il faut des types d’ondes évanescentes avec des vecteurs d’onde k// plus grands. la lumière ne peut pas être diffractée au-delà de 90°. va émerger en s'éloignant de la direction de l'onde incidente d'un angle α. Plus le diamètre du trou devient petit. à la sortie du trou. le critère de Rayleigh devient en utilisant la valeur kx = nω/c sinθ = n(2π/λ) sinθ de l’onde évanescente de Fresnel : ∆x ≥ λ λ ≥ 2n sin θ 2n (4.8) C’est la même expression de la résolution axiale que celle que l’on peut espérer obtenir avec un microscope à immersion ! Dans l’approche précédente. l'angle α atteindra 90° et la lumière. on doit tenir compte de la diffraction de la lumière par ces objets.4. Exprimé par la relation ∆x ≥ 2π/∆kx (éq. c’est à dire que la composante tangentielle du vecteur d'onde augmente. Lorsque le trou est assez grand.2) montre qu’il ne peut être au mieux qu’égal à nω/c. Pour un trou de dimension infiniment petite. Considérons le cas d'une onde plane monochromatique éclairant un écran plat percé d'un trou de diamètre variable comme représenté sur la figure 4. il y a des limites. 4. Si la dimension du trou continue à diminuer. Sachant que dans le domaine optique cet indice n’est jamais très supérieur à 2. En ce qui concerne cette composante. beaucoup plus rapide que dans le cas de la réflexion totale. 4. nous n’avons considéré que l’onde évanescente de Fresnel obtenue par réflexion totale. Pour obtenir des effets plus spectaculaires. quant à elle. Dans l’onde évanescente de Fresnel. diffractera dans tout un demi-espace. 4. la plus grande partie de la lumière traverse le trou sans subir aucune modification et seule une faible partie due à la diffraction de la lumière par les bords du trou.

Z). D’un point de vue plus mathématique.−L. La transformée de Fourier E(kx.+ L)] −∞ +∞ = E 0 ∫ dxe −L +L −ik x X e −i k x L − e + i k x L sin k x L = E0 = 2E 0 L kxL − ik x (4.+a) = 0 si x est à l'extérieur de [−a. Z) = ∫ E(k x .−a.−a.Figure 4.+a) = 1 si x ∈ [− a . Z)e x dk x = 2π ∫ 2E 0 L k L e 2π −∞ x ω2 c2 −k 2 x e −ik x X dk x (4. il faut propager chaque onde plane de sa transformée de Fourier. Pour calculer le champ en z = Z. le champ électromagnétique se propage selon Oz : r r E 0 (z) = E 0 exp i (k z z − ωt ) (4.12) 60 . 4.10 s’écrit : E(k x . il peut s'écrire en première approximation : E1 (z = 0 + ) = E 0 (z = 0)C( x . Avant la fente.0 + ) = ∫ dxe −ik x x [E 0 (z = 0)C( x . L) (4.4 : Diffraction de la lumière par une ouverture dont les dimensions peuvent être bien plus petites que la longueur d’onde de la lumière.11) Le champ au point X sur un écran placé à la distance Z de la fente s’obtient alors en propageant chacune des composantes de Fourier du spectre jusqu’en (X.9) Juste derrière la fente.0+) du champ juste derrière la fente donné par l’éq.+a ] et C(x.+a].−L. considérons la diffraction d'une onde plane par une fente de largeur 2L (le problème est restreint au plan Oxy). On obtient : 1 1 +∞ sin k x L −iz −ik X E(X.10) où C est la fonction rectangle : C(x.

que plus L est petit plus la partie évanescente du spectre est importante et surtout. mais occupent théoriquement tout l'intervalle : ω ≤ k x ≤ +∞ c En pratique cependant. ce champ contient deux contributions : . Ainsi chaque "objet" sur la surface diffracte à la fois des ondes homogènes et des ondes évanescentes. De façon plus précise.13) comme dans l’onde évanescente de Fresnel associée à la réflexion totale de la lumière. Ces ondes auront une profondeur de pénétration beaucoup plus faible que l'onde de Fresnel et leur détection nécessitera l'emploi d'une sonde capable d'aller les capter presque en contact avec la surface de l'objet. la fonction sinus cardinal sinc = (4.15) 61 .+ω/c]. .12. Le point essentiel en ce qui nous concerne est de noter que les valeurs de kx évanescentes ne sont plus limitées à : ω ω ≤ kx ≤ n c c (4.une partie homogène correspondant à l’intégration de kx sur l’intervalle [−ω/c. k y = 0. k z = k 2 − k 2 vérifie la condition de propagation k2=ω2/c2. ces ondes restent en quelque sorte «piégées» sur la surface. 4.16) π L (4. .que des ondes évanescentes diffractées apparaissent dès que kx = π/L > ω/c = 2π/λ. x ( ) Comme le montre l’intervalle d’intégration de l’éq.que plus L est petit plus les valeurs de kx sont grandes. Comme les ondes évanescentes ne vérifient pas la condition de propagation.r où k = k x . . nous avons vu que l’amplitude d’une onde évanescente décroît de façon exponentielle lorsqu’on s’éloigne de l’objet. ⇒ nous retrouvons là le critère de Rayleigh L < λ/2.une partie évanescente correspondant au reste de l’intégration. la partie évanescente de son spectre de diffraction étant d'autant plus importante que ses dimensions sont petites. L’écriture de leur composante kz permet de déterminer la distance à laquelle le détecteur va devoir s’approcher : kz = ω2 ω2 − k2 = i k2 − 2 x x c2 c (4.14) sin k x L réduit cet intervalle en kxL ramenant l’intégration dans un intervalle dont les bornes sont définies par : kxL = π ⇒ kx = On en déduit : .

il peut. 62 . kz est d'autant plus grand que kx est grand ce qui signifie que l’amplitude des ondes associées à chaque fréquence "évanescente" décroît donc d'autant plus rapidement que kx est grand. dépend aussi de la dimension de l’extrémité de la fibre optique : plus celle-ci sera petite. comment peut-elle être récupérée par une fibre optique ? La réponse à cette question tient dans le principe du retour inverse de la lumière : si un objet sub-longueur d'onde peut transformer par diffraction une onde progressive en ondes évanescentes. 4.Principales configurations Les différents types de microscopes optiques en champ proche à balayage se distinguent par les modes opératoires utilisés pour réaliser l’illumination ou de collecte de la lumière très près de la surface de l’échantillon. Elle ne sera plus limitée que par la dimension de la sonde. de la même façon. Une question pourrait se pose cependant : si l’onde évanescente ne vérifie pas les conditions de propagation. en grande partie. le détecteur doit avoir une dimension nanométrique et pouvoir détecter les photons. Cette dernière remarque montre que la résolution d’un tel microscope. transformer par diffraction des ondes évanescentes en ondes progressives. jusqu'au détecteur. qui dépend de la distance pointe-objet. les ondes évanescentes présentes sur sa surface vont être partiellement transformées en ondes progressives.16. en plongeant une pointe sub-longueur d'onde dans le champ proche de l'objet observé.Ainsi. d'ondes homogènes porteuses d'informations et pouvant se propager. Le signal résultant de ce processus de double diffraction sera constitué. C'est sur le principe de la détection de ces ondes qu'est basée la microscopie tunnel optique (STOM).5.2. La technique la plus commune consiste à utiliser des sondes à ouverture (trou ou fibre optique) pour amener ou collecter la lumière sur la surface. Les principales configurations sont résumées sur la figure 4. plus son pouvoir de récupération d’ondes évanescentes de très grands vecteurs d’onde sera grand et plus la résolution pourra donc être importante. Ainsi. 4. mais on conçoit aussi la difficulté de réaliser un microscope optique à champ proche. les informations qu'elles contiennent ne peuvent pas être détectées en champ lointain. Comme l’amplitude de ces ondes décroît exponentiellement avec la distance d'analyse. dans l'air ou dans tout autre guide diélectrique. Les informations concernant les détails les plus fins restent donc confinées le plus près de la surface et la résolution pourra être d’autant plus grande que le détecteur pourra s’approcher plus près de l’objet. La microscopie optique en champ proche Les développements technologiques ont cependant permis de telles réalisations. Les informations relatives aux détails de l'objet devant être captées sur leurs lieux d'existence. d’après l’éq.

5e). la lumière peut être diffusée du champ évanescent par une autre pointe de sonde comme la pointe d’un microscope à force atomique (Fig. 4. conduisant à la formation d’ondes homogènes qui peuvent être détectées. 63 . l’interprétation des signaux n’est cependant pas évidente. dans la dernière configuration 4. 4. L’arrangement dans lequel le chemin de la lumière est inversé est d’un grand intérêt. 4. soit pour la collection (Fig.5d où des ondes évanescentes sont créées sur la surface de l’échantillon par une illumination oblique en champ lointain.5a). La sonde à ouverture pour une microscopie en transmission peut être utilisée soit pour l’illumination (Fig. un film métallique est déposé sur la surface de l’échantillon et des plasmons de surface sont générés par la pointe d’une sonde. La pointe de la sonde agit alors comme un élément diffuseur du champ évanescent.6 résume les caractéristiques d’un microscope optique à sonde locale. ce sont des fibres non métallisées qui sont utilisées. 4.5c). La figure 4. La lumière réfléchie peut être collectée par une optique proche de la sonde ou par la fibre elle-même.5b) de lumière.Figure 4. auquel cas. Comme dans le cas précédent. Si cette configuration est relativement facile à mettre en œuvre. Enfin.5 : Différentes configurations pour une microscopie optique en champ proche. cette méthode ne peut s’utiliser avec des échantillons opaques pour lesquels il faut travailler en réflexion (Fig.5f. Cependant. Ces deux dernières approches constituent des techniques de microscopie à champ proche optique sans ouverture. Une approche différente est choisie avec la configuration 4.

De par le retour inverse de la lumière.Figure 4. et il présente l'avantage d'un éclairage isotrope par comparaison au STOM. Il s’agit du i-PSTM ou Tunnel Near-Field Optical Microscope (TNOM) ou encore du microscope à champ proche optique en lumière interdite.6d). Citons enfin. il s'est imposé dans les laboratoires en raison de la décroissance exponentielle de l'intensité lumineuse au-dessus de l'objet avec la distance qui le sépare de la sonde. L'éclairage de l'objet pouvant être réalisé de plusieurs façons.6c). * le SNOM (« Scanning Near-field Optical Microscope ») peut fonctionner soit avec un éclairage en réflexion externe où la sonde joue le rôle de pointe détectrice et émettrice à la fois (Fig. soit en éclairant directement l'objet en réflexion sous incidence oblique (Fig. le Plasmon Near-Field Microscope 64 . 4. Le rapport signal sur bruit en est positivement affecté. c ou d) va définir une variante de ce microscope dont nous indiquons les dénominations habituellement utilisées : * le STOM (« Scanning Tunneling Optical Microscope ») aussi appelé PSTM (« Photon Scanning Tunneling Microscope ») est caractérisé par un éclairage en réflexion totale par transmission (Fig. 4. Il permet d'analyser tout type d'objet. On peut aussi citer deux techniques de microscopie en champ proche sans ouverture. 4. Seul le SNOM est parfaitement symétrique. 4.6b). 4.6a). la pointe éclaire l'objet.6 a. b. elle joue ici le rôle d'émetteur seulement (Fig. chaque type d'éclairage (Fig. Dans ce cas la détection s'effectue en champ lointain en utilisant une lentille collectrice. tous ces microscopes peuvent travailler en inversant le sens d'éclairage. Destiné aux objets optiquement transparents. * le NSOM (« Near-field Scanning Optical Microscope ») travaille en transmission.6 : Les différents types de microscopes optiques à sonde locale. transparent ou non.

la tension électrique de commande du piézo qui est directement liée à la position en z de la sonde détectrice. Le premier. l'intensité du signal lumineux détecté sur une valeur de référence. Le type de sonde le plus couramment utilisé est une fibre optique taillée en pointe fine.7 schématise la configuration de base d’un microscope en transmission. Le second.1 Microscopes en transmission La figure 4. Ce mode de détection fournit une topographie des lignes d'iso-intensité lumineuse au-dessus de l'objet. dit à altitude constante. Les vitesses de balayage peuvent être assez importantes : une image de 128x128 points correspondant à une surface de l'objet de quelques nanomètres est régulièrement effectuée en moins d'une minute.7 : Configuration de base d’un microscope à champ proche fonctionnant en transmission. La sonde détecte la distribution de l'intensité lumineuse dans le plan de référence au-dessus de l'objet. Deux modes de détection sont utilisés en microscopie optique en champ proche. dans ce cas. L'élément essentiel d'un microscope en champ proche est la sonde. L'incertitude en z du déplacement de la fibre qui doit être de quelques picomètres seulement dépend essentiellement de la qualité de l'électronique de commande. Le signal enregistré est.dans lequel les ondes de surface sont exacerbées par le dépôt d’un film métallique et la génération de plasmons de surface. consiste à asservir. par voie électronique. Nous allons détailler ces différentes configurations et modes opératoires en classant les microscopes optiques en champ proche en quatre catégories principales : • Les microscopes en transmission travaillant en émission ou collection • Les microscopes en réflexion • Les microscopes en effet tunnel photonique • Les microscopes hybrides 4. Figure 4. Le déplacement de la sonde au-dessus de l'objet est assuré à l'aide de translateurs piézoélectriques. 65 . dit à intensité constante. Des surfaces de balayage allant de quelques nanomètres carrés à quelques centaines de microns carrés sont ainsi obtenues.2. consiste à balayer la surface de l'objet en gardant la pointe à distance constante d'un plan de référence.

l’échantillon est intensément illuminé par un faisceau de lumière fortement focalisé. la pointe de la fibre est utilisée comme une nano-source et le champ transmis est collecté en champ lointain. Cette aire est donnée par l’enveloppe de la distribution du champ autour de la pointe. ce qui élimine un grand nombre d’effets parasites. En fait les deux configurations ne sont pas tout à fait similaire. L’avantage de cette méthode est que le champ illuminé a une aire très réduite. La figure 4. dans les microscopes où la fibre est utilisée pour collecter la lumière transmise. Figure 4.8 résume les différentes approches utilisées en microscopie en champ proche par transmission. l’aire illuminée est celle résultant de la distribution d’un champ de type gaussien et couvre une extension de quelques dizaine de microns.8 : Différents types de microscopes en champ proche optique en transmission.Les microscopes en champ proche en transmission peuvent travailler avec une sonde soit émettrice de lumière. Dans ce cas. A la différence. soit collectrice de lumière. En émission. Ce champ est limité à quelques centaines de nanomètres autour de l’apex de la pointe et tombe à zéro dès que la pointe est éloignée de la surface. Pour des objets de taille sub-micrométrique. on en déduit qu’ils sont uniformément illuminés. La conséquence d cette 66 .

les deux méthodes ne sont pas équivalentes en ce qui concerne les problèmes de polarisation. Utilisant des pointes métalliques ou en tous cas opaques puis qu’elle ne servent pas à véhiculer la lumière. En mode collection. Une autre configuration consiste à détecter le champ proche généré en illuminant l’échantillon en réflexion et en détectant le champ diffusé par l’excitation d’une pointe au moyen d’un collecteur adapté (Fig. il est très facile de polariser le faisceau de lumière incidente et la lumière peut être collectée dans une fibre mono-mode classique. Pour des raisons similaires. Cette technique a quelque ressemblance avec la microscopie confocale. 4.2. la particule de polystyrène remplace la nano-ouverture et joue le rôle d’une nano-antenne. 4. Par contre. le microscope en réflexion utilise la diffraction à travers un petit trou d’un faisceau totalement réfléchi à l’intérieur d’une lame de verre.2 Microscopes en réflexion Les premiers exemples de microscopes en champ proche travaillant en réflexion utilisaient une petite ouverture dans une film métallique ou une nano-sphère de polystyrène métallisée violemment illuminée (Fig.10f. Son principal avantage est de combiner l’illumination locale avec une collection locale de la lumière. le microscope utilise la réflexion sur une bille de polystyrène métallisée. Inversement.10a). On peut aussi utiliser la fibre pour illuminer l’échantillon et collecter la lumière réfléchie (Fig. Dans cette configuration. La pointe joue le rôle d’un élément perturbateur du champ évanescent et ces microscopes sont appelés microscopes sans ouverture. il est possible d’illuminer à travers la fibre et de détecter au moyen d’un collecteur approprié (Fig. Une autre technique consiste à illuminée la surface à étudier en réflexion et détecter le champ évanescent à l’aide d’une sonde (Fig. favorisant les rayons se propageant le long de l’axe de la pointe. l’état de polarisation à l’apex de la fibre n’est pas simple à déterminer. A droite. en mode émission.10c). 4.10b). A gauche. Figure 4. D’autres configurations similaires sont montrées sur les figures 4.10d). 4. Le principal défaut de la méthode est dû à l’ombre produite par la pointe. 4. ces microscopes sans ouverture peuvent utiliser les mêmes technologies que celles 67 .9 : Exemples de microscopes en champ proche utilisant soit une petite ouverture. soit une petite bille comme émetteur-collecteur.10e et 4.illumination non parfaitement locale est le risque d’effets non-locaux liés à des phénomènes de propagation sur de longues distances comme par exemple la propagation de plasmons.9). 4.

c’est la technique la plus ancienne expérimentée dans les années 1960. 68 . Son principe est présenté dans la figure 4.11.11 : Frustration de la réflexion totale interne à l’intérieur d’un prisme par une surface ondulée (expérience des deux prismes de Newton).3 Microscopes à effet tunnel photonique En fait. Figure 4.développées pour les microscopes à effet tunnel électronique (STM) ou à force atomique (AFM).2. 4. Figure 4.10 : Différents types de microscopes en champ proche optique en réflexion. les meilleures résolutions spatiales ont pu être démontrées. Par cette approche.

générant une onde évanescente. Figure 4.13 : Différentes configurations de montages en champ proche utilisant la réflexion interne. Une lentille hémisphérique (généralement la lentille frontale d’un objectif de microscope) remplace le prisme habituel. les parties les plus hautes frustreront la réflexion totale alors que les parties les plus basses ne pourront pas le faire.12 : Configuration de Guerra.12 est une variante moderne des premiers microscopes à effet tunnel photonique. Le champ résultant sera comme une sorte d’empreinte de la topographie de la surface.13. Figure 4. 69 . Cette réflexion interne est utilisée comme un moyen particulier d’illumination comme montré sur la figure 4. Microscopes à effet tunnel optique à balayage STOM ou PSTM Cette technique exploite le fait qu’un faisceau tombant sur un prisme peut être totalement réfléchi à l’intérieur.De l’étude des ondes évanescentes. si la surface d’un échantillon est ondulée. nous savons que la frustration de la réflexion totale est fortement dépendante de la distance à la surface. En conséquence. La configuration de Guerra décrite sur la figure 4.

Microscopes STOM/PSTM inversé : le i-PSTM ou TNOM Une nouvelle configuration a été imaginée où l’on inverse le sens de cheminement de la lumière par rapport à la configuration STOM. La figure 4.On remarquera la ressemblance du dispositif utilisé en (a) avec le montage imaginé par A. Figure 4. elle offre une possibilité de contrôler la position de la pointe par rapport à la surface en utilisant la décroissance exponentielle du champ évanescent. L’intérêt de cette approche est que le champ évanescent ne se propageant pas.14 : Quelques configurations de microscopes STOM/PSTM. il est difficile de maintenir une résolution sub-longueur d’onde comme espéré. il ne peut perturber le signal utile pendant l’enregistrement. à la manière d’un microscope a effet tunnel électronique. Son intérêt réside dans sa capacité à 70 .14c montre une version où un éclairage isotrope à symétrie de révolution autour d’un axe vertical améliore l’illumination oblique. En plus. Malheureusement. La figure 4. Elle peut être considérée comme une variante de la microscopie en champ proche en transmission.14 montre quelques variantes de configurations STOM/PSTM. en travaillant de cette façon. Cotton pour son ultramicroscope en 1905.

L'intensité du plasmon décroît exponentiellement lorsqu'on s'éloigne de l'interface. Le faisceau gaussien incident est décomposé en ondes planes et le calcul des champs transmis et réfléchis est effectué à l'aide d'une méthode matricielle. La première configuration dite de Kretschmann-Raether consiste à déposer un film métallique sur un diélectrique et à éclairer l'interface avec une lumière polarisée TM (transverse magnétique) en réflexion totale comme représenté sur la figure 4. La lumière est confinée sur l'interface et la présence d'un défaut (topographique ou d'indice) peut fortement modifier sa distribution d'intensité.15. Le film métallique est souvent un film d’argent ou d’or. Figure 4.4 Microscopes en champ proche à plasmons de surface Les plasmons de surface sont les modes propres d'une interface métallique.15 : Principe de la détection de plasmons de surface en combinant le STOM avec la configuration de Kretschmann-Raether. l'excitation d'un plasmon de surface peut être obtenue par différentes configurations. 4.détecter ce que certains auteurs appellent la « lumière interdite » qui correspond à la lumière diffusée par les protubérances d’un petit objet. Le plasmon de surface est obtenu lorsque la composante tangentielle du vecteur d'onde associé au faisceau incident est égale à celle du mode propre du plasmon.2. La détection en champ proche de ces plasmons de surface apparaît donc comme un moyen potentiel d'imagerie super-résolvante. Optiquement. 71 . La détection de tels plasmons de surface générés par un faisceau gaussien "quasiment polarisé" peut être modélisée en considérant un faisceau gaussien 3D et une détection en champ proche.

8 nm (laser HeNe) est focalisé sur l’interface où son « waist » est de 7.17c).97° est celui qui correspond à la génération du plasmon de surface à la même longueur d'onde. La figure 4.7 et d'épaisseur 53 nm (Fig.17b présente la distribution de l'intensité lumineuse dans le cas où la surface du prisme est métallisée et où le plasmon de surface est excité par une onde incidente polarisée TM. A gauche. le faisceau réfléchi est très faible par rapport au faisceau incident. L'angle d'incidence à 44.16). Le faisceau incident est supposé polarisé TM et la figure 4. Z<0 est le diélectrique (faisceaux incident et réfléchi). le faisceau incident est polarisé en TE et le faisceau 72 . la face du prisme est métallisée et on considère le mode TE.9 + i.17 : Simulation en 3D du comportement de plasmons dans différentes situations. La figure 4.9 µm. Figure 4. On notera la différence entre les valeurs des maximums d'intensité dans les trois cas.Figure 4.18 présente l'intensité du champ électromagnétique dans chaque couche. Au milieu. Ceci est dû au fait qu'un faisceau gaussien ne peut pas être strictement polarisé et que des termes TM apparaissent sur les ailes et conduisent à une faible résonance. Le faisceau de longueur d'onde égale à 632. la face du prisme est recouverte d’un film d’argent et on considère le mode TM.17a montre l'intensité lumineuse détectée en champ proche dans le cas où le métal est absent.17. Le résultat de la simulation est montré sur la figure 4. On considère un faisceau gaussien incident sur une interface séparant un diélectrique d'indice n = 2. Dans le cas d'un faisceau incident polarisé TE (Fig.123 d'une couche d'aluminium d’indice n = -17. deux faibles résonances plasmons existent sur les ailes du faisceau. A droite. A droite. A gauche. 4. la face du prisme est nue. le faisceau incident est polarisé en TM et la résonance plasmon apparaît clairement à l'interface diélectrique-métal.16 : Schéma du montage utilisé pour la modélisation de la détection de plasmons. le métal est situé entre Z=0 et Z=53 nm et le vide pour Z>53 nm.0. 4.

La partie droite de la figure 4.2. On note que les échelles de l'axe Z et de l'intensité ne sont pas les mêmes dans les trois milieux. 4. Figure 4.réfléchi est aussi intense que le faisceau incident. La détection s'effectue en champ lointain (le détecteur balaye le plan xy).19 présente le schéma de principe : un mince film d'aluminium est déposé sur la surface d'une lentille hémisphérique alors qu'une sonde de microscope optique en champ proche travaillant en émission. par l'onde évanescente dont le vecteur d'onde correspond à celui de la résonance plasmon. Ce résultat est accord avec ce qui a été obtenu expérimentalement. Figure 4.18 : Simulation de la génération de plasmons en mode TM à gauche et en mode TE à droite.19 représente la distribution d'intensité lumineuse dans ce plan calculée dans le cadre du modèle.5 Microscopes hybrides 73 . éclaire la surface métallique. Une deuxième configuration consiste à exciter le plasmon de surface directement en champ proche : la sonde d'un microscope optique en champ proche éclaire l'objet et le plasmon de surface est excité. On note sue la résonance est forte seulement en mode TM.19 : Excitation du plasmon de surface par une sonde en champ proche. La figure 4. La figure de droite montre la distribution d’intensité. localement.

les modules de translation. • Les composants électroniques sont constitués par les étages de détection à la fois pour le signal optique et les signaux de contrôle de la distance de la pointe à la surface. On dot aussi. Pour éviter ou limiter le risque d’éraflures. permettre d’obtenir des informations complémentaires facilitant l’interprétation des images obtenues en champ proche optique. généralement un laser. la fibre. L’amortissement de la vibration lorsque la pointe s’approche de la surface peut être facilement détecté et utilisé pour maintenir la pointe à une distance constante de la surface.3. Elle consiste à faire osciller la pointe à une fréquence proche de sa fréquence de résonance. Microscopes en champ proche avec contact C’est une solution complètement différente puisque la pointe touche la surface. rajouter une table anti-vibratoire et ses dispositifs d'amortissement. Cette technique de contact peut être convertie en mode avec tapotement (« tapping mode ») avec laquelle le risque d’endommager la surface de l’objet est grandement réduit. L’avantage est que l’on peut utiliser toute la technologie et l’électronique développée pour les microscopes à force atomique. Microscopes avec contrôle de la force de cisaillement (« shear-force control ») La méthode utilisant la force de cisaillement (« shear-force ») sera vue plus en détail plus loin. répondre à la nécessité de contrôler la distance entre la sonde et la surface plus soigneusement et précisément. 4. polariseurs et un photodétecteur (photomultiplicateur ou photodiode à avalanche). ensuite. C’est une technique de contrôle purement électronique qui peut être adaptée à la plupart des configurations. La plupart des microscopes en champ proche utilisent cette méthode pour le contrôle de la distance. la pointe est montée sur un micro-cantilever dont la raideur est suffisamment petite pour garantir un contact très doux. fibres. • Les éléments mécaniques sont les différents supports pour l'objet. lentilles. l'électronique de commande du balayage des modules de translation (généralement des tubes piézo-électriques) ou d'autres transducteurs piézo ou mécaniques plus sophistiqués et l'étage de contrôle de la distance composé d'un ensemble d'amplificateurs associé à un dispositif d'asservissement PID (Proportionnel-Différentiel-Intégral). 74 .Le fait de combiner différentes technique d’observation peut avoir deux intérêts : d’abord. objectifs. un ensemble de composants tels que miroirs. • Les composants optiques sont la source de lumière.20 décrit les trois classes de composants constituant n'importe quel microscope à champ proche.Structure de base d’un microscope SNOM La figure 4.

à la fois bon marché.20 : Structure typique d’un microscope optique en champ proche optique. L'effet piézo-électrique est réversible ce qui signifie que. 4. lorsque une partie d'un matériau piézo-électrique est courbée. comprimé ou étirée. la technique reposant sur l'utilisation d'un simple tube piézo-électrique demeure une excellente solution. ce sont des matériaux idéaux pour le déplacement aux précisions nanométriques nécessaire pour n'importe quel microscope à champ proche. Remarquons que bien que la relation entre le champ et la déformation ne soit pas linéaire.Figure 4. des charges apparaissent à sa surface générant un champ électrique appréciable (on connaît l'application aux allumes-gaz ou aux briquets). efficace et précise. Finalement.1 Partie mécanique L'étage de translation Il existe aujourd'hui des étages de translation en xy ou xyz qui combinent des dispositifs à base de système vis-écrou différentiel et des modules piézo-électriques. Cependant. zirconates. stannates) avec la structure cristalline de la pérovskite. Ainsi. Le composé le plus connu est 75 . L'effet piézo-électrique est la capacité de certains matériaux de se contracter ou de se dilater sous l'influence d’un champ électrique. les temps de réponse sont généralement de loin bien plus rap^de que les temps nécessaires à un balayage. La plupart des cristaux piézo-électriques sont des matériaux ferro-électriques comme par exemple le titanate de baryum (BaTiO3) et plusieurs autres sels (titanates.nts subnanométriques en appliquant simplement des champs électriques tout à fait modestes. il est possible de générer des déplaceme.3.

N-1 (4. Paramètres Modules d’Young Coefficient de Poisson Température de Curie Résistivité Constante de charge Champ électrique maximal Symboles YD33 σE d33 d31 Unités 109 Nm-2 °C 1010 Ωm 10-12 mV-1 10-12 mV-1 Vmm-1 Valeurs typiques 90 0.1 rassemble les paramètres utiles pour une céramique PZT P160 de la société « Quartz & Silice ». l'élongation ∆L d'un tube de longueur L et d'épaisseur e auquel on applique une tension V sera donné par : ∆L = d 31 VL e (4. La plus importante (pour la réalisation d'étage de translation est la constante de charge dji qui est le rapport de la densité de charge ρcharge sur l'électrode normale à l'axe i à la contrainte appliquée le long de l'axe j sous champ E0 constant.17) On peut aussi définir le rapport inverse entre la contrainte relative σj le long de l'axe j au champ électrique Ei le long de l'axe i à contrainte σ0 constante.19) 76 .1 : Caractéristiques de la céramique piézo-électrique P160 de Quartz & Silice. Il est caractérisé par 4 constantes qui sont interdépendantes.certainement le PZT (titanate zirconate de plomb. Leur épaisseur est entre 0.3 340 1 400 -175 800 Tableau 4.6 et 1 mm et leur diamètre varie de 5 mm à quelques centimètres.18) La tableau 4. PbTiO3ZrO4). Les tubes piézo-électriques Les tubes piézo-électriques ont généralement quelques centimètres de long.  σ  d ij =  j   Ei σ0    en mV-1 (4. Ainsi. Les composants piézo-électriques sont métallisés à l'intérieur et à l'extérieur du tube. Le paramètre responsable de l'expansion du tube est d31. ρ   ch arg e  d ij =  σj   E0  en Cb.

21 montre ce qui se passe dans ce cas.22 illustre différents concepts de nano-sondes où le nano-collecteur/émeteur peut être un élément diffusant. sur la figure 4. Le nano-collecteur ou le nano-émetteur est donc la partie cruciale d’un microscope en champ proche.21 : Courbure de tubes PZT selon les tensions appliquées aux quatre segments. Par exemple.1 Différents concepts de nano-collecteurs La figure 4. quand deux tensions différentes sont appliquées à deux électrodes opposées. 77 . la conception et la réalisation de ces nano-sondes sont loin d’être standardisées.21a. elles peuvent être combinées et excitées comme montré en (c) et (d). L = 3 cm et d31=-175. Des tensions différentes peuvent être appliquées à chacune d’elles. le tube va se contracter d’un côté et se dilater de l’autre.Nano-collecteurs et nano-émetteurs Il est désormais clair que les hautes fréquences spatiales de l’objet sont codées dans la partie non rayonnante du champ proche. si V= -50 V. un cône métallique ou diélectrique ou une minuscule ouverture de quelques dizaine e nanomètres percée à l’extrémité d’une fibre métallisée. La figure 4.4. La dilatation dépendant de la longueur du tube.4. Le résultat global sera une courbure du tube.Par exemple. Cependant. Les électrodes métalliques déposées sur les tubes piézo-électriques utilisés en champ proche sont divisées en 4 secteurs le long de l’axe de symétrie du tube. 4. 4. Figure 4. l'élongation peut atteindre DL = 262 nm. Le problème des modules piézo-électriques est qu’ils ne sont pas exempts d’hystérésis et que ce défaut doit être corrigé par un contrôle électronique sophistiqué. e = 1 mm.

4. L’idée d’utiliser une molécule fluorescente unique fixée à l’extrémité d’une fibre été émise mais n’a pas encore abouti. (c) Un tube de céramique protège la fibre. le temps d’exposition ont été préalablement définis (Fig. A gauche. La méthode thermo-mécanique consiste à chauffer la fibre jusqu’à une température proche de la température de transition vitreuse où la fibre est ramollie et à l’étirer progressivement jusqu’à sa rupture. (a) L’acide peut monter le long de la fibre par capillarité. on utilise souvent un faisceau de laser à CO2 à 10. avec un centre diffuseur.Figure 4.24 montre les différences que l’on peut observer entre deux fibres produit par l’une ou l’autre méthode.2 Fabrication des pointes Deux méthodes sont préférentiellement utilisées pour mettre en forme l’extrémité des fibres utilisée dans les microscopes en champ proche : la méthode chimique et la méthode thermomécanique. 4. (b) L’utilisation d’un film d’huile empêche la capillarité. On remarque que l’extrémité de la fibre mise en forme par chauffage/étirage est bien plus sphérique que dans le cas de l’attaque chimique.23 : Réalisation d’une pointe par érosion chimique de l’extrémité de la fibre de verre dans une solution d’acide fluorhydrique. avec une pointe diélectrique. La méthode chimique utilise l’érosion chimique par attaque acide de l’extrémité de la fibre.23). A cet usage. 4. au milieu. la température. Le chauffage peut être réalisé par un chalumeau ou par un faisceau laser. La figure 4. Les structures dendrimères sont envisagées pour réussir une telle performance. à droite avec une ouverture à l’extrémité d’une fibre métallisée. La fibre plonge dans une solution d’acide fluorhydrique dont la concentration.22 : Trois concepts de nano-collecteurs.6 µm. (a) (b) (c) Figure 4. ce qui peut 78 .

être attribué à la réorganisation des atomes à l’extrémité après la cassure alors que la fibre est encore chaude. d’or. Par contre. En outre.25 où un préformage est effectué par chauffage étirage. (a) (b) Figure 4. d’aluminium ou de chrome n’excède pas 50 nm. L’épaisseur de la couche métallique. L’étape finale délicate consiste à percer une ouverture aussi petite que possible à l’extrémité de la fibre pour permettre le passage de la lumière.26 résume l’ensemble des étapes à réaliser.24 : Mise en forma de l’extrémité d’une fibre par érosion chimique à l’acide fluorhydrique en (a) ou par chauffage/tirage en (b). L’avantage de la méthode chimique est de ne pas affecter le cœur de la fibre par où la lumière est guidée. La métallisation de la fibre peut se faire par des méthodes conventionnelles de dépôt sous vide. puis une mise en forme finale par attaque chimique. 79 . (a) (b) Figure 4.25 : Forme typique d’une pointe de fibre obtenue en combinant le préformage par chauffage/étirage et une brève étape d’érosion chimique en (a). la fibre doit être métallisée. La combinaison des deux méthodes est souvent une bonne idée comme illustré dans la figure 4. le plus souvent d’argent. elle permet de réaliser des extrémités (apex) extrêmement fines. On notera l’illumination de la pointe sur l’image (b). Selon la configuration du microscope. La figure 4. la réalisation d’une pointe peut être longue et la méthode manque aussi de fiabilité dans la répétition de pointes identiques.

26 : A gauche. Contrôle optique 80 . c’est l’autre problème crucial à résoudre pour maîtriser la microscopie en champ proche. le principe de la méthode par chauffage/étirage est schématisé.4.27 : Vue de dessus de l’ouverture de 100 nm percée à l’extrémité d’une fibre métallisée. Il va sans dire que ces fibres sont fragiles et que la maîtrise de leur fabrication est un atout important pour garantir la qualité d’observation et la résolution d’un microscope en champ proche. 4. Figure 4.3 Contrôle de la distance à la surface Après la technique de fabrication de pointes de fibre. on détaille la méthode par attaque chimique et de métallisation par dépôt sous vide.27. Une vue de dessus de l’ouverture percée dans le film métallique d’une fibre métallisée est montrée sur la figure 4.Figure 4. A droite. Les deux techniques principales de contrôle de la distance sont le contrôle optique et le contrôle par la force de cisaillement (« shear-force » en anglais).

Technique « shear-force » C’est le procédé le plus utilisé pour contrôler la distance. (c) En utilisant la réflexion sur l’échantillon. Ils ont observé la sensibilité de l’amortissement de l’amplitude de vibration de la fibre excitée à une fréquence voisine de sa fréquence de résonance lorsque la fibre s’approche à quelques nanomètres de la surface. Elle est cependant limitée aux matériaux qui n’ont que de petites irrégularités topographiques et/ou variations de réflectivité. (a) dans la configuration d’un STOM/PSTM. et par Toledo-Crow et al. Figure 4.29).Cette technique est utilisable dans les microscopes du type STOM/PSTM parce que dans cette configuration. 4. 81 . Figure 4. le champ moyen évanescent décroît exponentiellement.29 : Les deux premières méthodes de contrôle par « shear-force ». (b) dans un microscope en réflexion utilisant une cavité ente la pointe et la surface.28 : Contrôle optique de la distance. en 1992 (Fig. Il fut proposé la première fois par Betzig et al.

La photographie de droite montre la fibre illuminée collée au diapason. Les distorsions linéaires sont généralement faciles à corriger dès lors qu’elles auront été correctement identifiées. L’intérêt principal est de pouvoir fabriquer des têtes de microscopes très compactes et autonomes. L’enregistrement d’échantillons tests constitué de réseaux de traits peut aider à identifier le problème et à introduire les corrections nécessaires par un traitement informatique approprié. Le diapason est généralement collé à la fibre (Fig. En calculant le spectre transformée de Fourier de l’image.1 Filtrage par transformation de Fourier C’est une technique bien connue en traitement du signal ou d’images. soit en intégrant le diapason dans un dispositif électronique résonnant. Elle exploite l’oscillation d’un composant piézo-électrique résonnant comme un bilame ou un diapason.31). La fibre est excitée soit de façon externe par un petit composant piézo-électrique. 4. 82 .5.Traitement des images L’acquisition d’une image à l’aide d’un microscope à champ proche optique est soumise à de nombreuses perturbations qui peuvent venir des imperfections de l’instrument comme les défauts de linéarité dans les déplacements de la pointe ou plus généralement des bruits électroniques et/ou optiques. un bruit périodique s’identifiera par une bande de fréquence parasite étroite (Fig. 4.30 : Mesures électroniques d la force de cisaillement en utilisant un diapason commercial ou artisanal. Elle permet la réduction ou l’élimination de bruits périodiques. Le diapason peut servir de détecteur seulement ou de générateur/détecteur. 4.La méthode actuelle est purement électronique.5.30). Figure 4. 4.

(d) Image obtenue après traitement et transformée de Fourier inverse. Un tel procédé n’est cependant vraiment efficace que dans le cas de bruits additifs qui n’impliquent pas une interaction forte avec l’information à extraire. grâce aux développement des moyens informatiques existent en grand nombre. Le spectre de l’image polluée par un bruit périodique fait apparaître des bandes latérales symétriques qui peuvent être éliminées par un procédé de masquage. La figure 4. 83 . Au-delà des méthodes de traitement d’images qui. (a) (b) (c) (d) Figure 4. (a) Image brute de la surface d’un CDROM perturbée par du bruit. (b) Spectre de Fourier de l’image brute. (c) Multiplication du spectre de Fourier par un masque rectangulaire. la question importante de ce type de microscopie reste l’interprétation correcte des images.Figure 4.33 montre la puissance de la méthode de filtrage de Fourier à éliminer un bruit périodique.32 : Autre illustration du filtrage de Fourier.31 : Principe du filtrage de Fourier.

84 .

Un anticorps spécifique non fluorescent. 5.Microscopie de fluorescence multi-photonique La microscopie de fluorescence permet d'examiner des préparations qui sont fluorescentes par elles-mêmes ou qui ont été imprégnées (on dit marquées) avec des colorants fluorescents. de longueur d'onde plus élevée (fluorescence) n'est pas réfléchie par le miroir dichroïque. De nombreuses préparations soumises à une radiation ultraviolette re-émettent de la lumière à des longueurs d’onde plus grande dans le visible du violet au rouge. Nous nous limitons volontairement à deux aspects qui concernent les applications à la biologie et à l’étude du comportement de molécules individuelles. Dans cette configuration. réagit tout d'abord avec les sites 85 .1.Développements actuels Les développements actuels de la microscopie moderne vont de pair avec celui des nanosciences et des nano-technologies. C’est là un vaste champ de recherches qui ne peut être abordé dans ce cours. La fluorescence émise est collectée par l'objectif et va traverser le miroir dichroïque. par exemple de lapin. 5.1). Un miroir dichroïque réfléchit la lumière d'excitation vers l'objectif qui joue ici le rôle de condenseur. Figure 5.1 : Schéma d’un microscope de fluorescence par épi-illumination. C'est ainsi que l'on recherche des protéines spécifiques et d'autres substances par immunofluorescence. Un filtre d'excitation permet de sélectionner une bande de longueur d'onde adaptée au fluorochrome à visualiser.5. La microscopie de fluorescence occupe une place de choix depuis quelques années dans le diagnostic médical et il est probable qu'elle va se développer pour l'analyse des denrées alimentaires. La source lumineuse est déportée sur le côté et est constituée par une lampe offrant un spectre de longueur d'onde étendu vers les UV. Un filtre d'arrêt permet de sélectionner la longueur d'onde d'émission du fluorochrome. La lumière émise. l'objectif joue également la fonction du condenseur (Fig. Avec les microscopes actuels travaillant en épi-fluorescence. la lumière d'excitation arrive sur la préparation par l'objectif. C'est la méthode dite "indirecte" qui est la plus employée. Des filtres d'arrêt empêchent la lumière excitatrice de pénétrer dans l'oculaire ou d’atteindre le détecteur. Un miroir dichroïque dirige la lumière excitatrice de courte longueur d'onde sur la préparation à travers l'objectif.

5. le plus souvent voisine de 800 nm (laser d’excitation à saphir dopé au titane).2). le microscope de fluorescence se comporte comme un microscope confocal dans lequel l’iris confocal n’est plus nécessaire. le volume d’excitation est bien mieux défini qu’en excitation à un seul photon (Fig.fr/bouton2/microscopie-multiphoton. la lumière pénètre facilement les préparations biologiques.medecine. animale et humaine notamment.uhp-nancy. L’absorption bi-photonique étant proportionnelle au carré de l’intensité d’excitation. A cette longueur d’onde. 5. La technique de microscopie multiphotonique se prête donc aussi à la mesure des durées de vie de fluorescence de fluorochromes dans différents environnements.Microscopie d’objets individuels 86 . Les développements récents utilisent l’excitation bi-photonique et plus généralement multiphotonique. et de ce point de vue le laser femtoseconde à saphir dopé au titane constitue la source d’excitation de choix. Les applications possibles dans l'analyse des denrées alimentaires permettent l'identification immunologique des microorganismes et des farines basée sur les protéines spécifiques.html ou des sites similaires pour y rechercher des exemples d’application en biologie végétale.antigéniques de la préparation puis est révélé avec des anticorps anti-immunoglobuline fluorescents de lapin. On visitera avec intérêt le site : http://confocal. L’efficacité de l’absorption multiphotonique est accrue avec l’utilisation d’impulsions lasers ultra brèves. Les avantages sont que l’intensité se fait à une grande longueur d’onde.2.2 : Illustration de l’excitation en mode à 1 photon avec un laser à argon à 514 nm et en mode à 2 photons avec un laser à saphir dopé titane à 800 nm. Figure 5. L'immunofluorescence est une méthode relativement simple pour la détection de faibles quantités de substances. sans avoir de conséquences cytotoxiques ou de blanchiment. En mode bi-photonique.

Ils attribuèrent l’effet d’augmentation de l’intensité Raman à un effet de surface. L’optique non linéaire s’introduit ici avec le phénomène Raman stimulé exacerbé par les effets de surface (Surface Enhanced Raman Scattering SERS). Pour les applications concernant la biologie. donc de faible efficacité avec des sections efficaces de l’ordre de 10-30 cm2. Pour cet effet. le gain associé au SERS peut atteindre 1010 à 1014.3 : Schéma d’une expérience de spectroscopie Raman sur des nano-particules. l’utilisation de sources lasers ultra-brèves et la microscopie confocale. Hendra et McQuillan sur des signaux Raman de pyridine adsorbée sur des électrodes grossières d’argent. dans lesquelles l’excitation de modes de résonance plasmon contribuent efficacement. on démontra ensuite que bien plus qu’un effet de surface. En réalité.3 représente le schéma d’une expérience de spectroscopie Raman utilisant un microscope confocal associé à un spectromètre.Nous nous limitons à montrer un exemple particulier où l’on combine de l’optique nonlinéaire. les particules colloïdales d’or ou d’argent sont quasiment équivalentes. La figure 5. Figure 5. le SERS est un effet associé à des nano-objets essentiellement métalliques comme des particules colloïdales d’or ou d’argent. Ce phénomène a été observé par hasard en 1974 par Fleischman. permettant la détection Raman et du spectre Raman complet de molécules ou de nano-objets individuels. 87 . Ces particules peuvent être introduites ou ingérées par des cellules vivantes et il sera possible de les localiser très précisément grâce au signal SERS. Le résultat remarquable est qu’alors que le phénomène Raman spontané est un effet nonlinéaire du troisième ordre. on a recourt à des marqueurs non-fluorescent adsorbé sur des particules métalliques de taille nanométrique.

1 Raman de résonance 5. Figure 5. on montre l’image en microscopie à contraste de phase de deux cellules vivantes contenant des particules d’or colloïdal.4 : Spectroscopie Raman à haute sensibilité à l’intérieur de cellules vivantes.Microscopie Raman 5.Figure 5. A droite. 5.5 : Spectres Raman d’un chromophore adsorbé sur des particules d’or à l’intérieur d’une cellule.2 Raman exacerbé de surface (SERS « Surface Enhanced Raman Scattering ») Voir le cours de Spectroscopie Raman. 88 .3.3. l’image SERS des mêmes cellules est présentée qui permet de localiser précisément les particules d’or. A gauche.3. On note les changements du spectre selon la localisation des particules.

on le constate quand une grande image numérique est affichée sur un moniteur. auquel on a attaché un transducteur piézoélectrique qui envoie dans le cristal des vibrations acoustiques. entouré par une succession d’anneaux d’intensité dégressives. pour deux longueurs d’ondes. Un point image est représenté par une tache plus ou moins géométrique suivant le type d’aberration. Aberration chromatique : Phénomène dans lequel les rayons de lumière passant au travers d’une lentille focalisent en différents points dépendant des longueurs d’ondes. Aplanétique : Système de lentilles dont la sphéricité est corrigée pour donner une image plane. Les hautes fréquences spatiales plus grande que la fréquence de Nyquist sont progressivement «imagées» comme des basses fréquences. un vidéoprojecteur…etc. composée d’un disque d’intensité maximale (la première tâche d’Airy). « Point Spread Function » ou PSF en anglais.6. AOBS : Acousto Optical Beam Splitter (filtre dichroïque opto-acoustique accordable) Système électro-optique utilisé comme un miroir dichroïque dans un microscope permettant l’entrée d’un faisceau laser et en retour la transmission de signaux émis par l’échantillon vers les détecteurs. Institut Jacques Monod Aberration : Phénomène d’un système optique qui produit une image floue. Communement. Il existe deux types d’aberration chromatique : a) axiale. b) latérale. L’aliasing introduit un indésirable motif moiré quand les fréquences spatiales du signal excèdent le taux de numérisation du capteur. caractérisée par une variation de focale suivant la longueur d’onde utilisée. Achromatique : Correction d’aberration d’un système optique. caractérisée par une variation de grandissement suivant la longueur d’onde utilisée. Aberration sphérique : Erreur de convergence des rayons lumineux entre la zone axiale et latérale de la lentille ou du milieu traversé. 89 . AOTF : Acousto Optical Tunable Filter (filtre opto-acoustique accordable) Système électro-optique qui permet de sélectionner une raie laser et d’en ajuster l’intensité. C’est la représentation de la fonction d’étalement d’un point. de Gérard Géraud. Ce composant comprend un cristal biréfringent de dioxyde de Tellurium modulé par des ondes acoustiques. Airy : Image d’une source ponctuelle. Aliasing : Motif d’une image numérique dont l’échantillonnage n’est pas correct.Annexe GLOSSAIRE DE MICROSCOPIE PHOTONIQUE adapté par S Brown et C Talbot.

En microcopie confocale. l’état singulet. CALI : Chromophore-Assisted Laser Inactivation Photo-ablation assistée par chromophore : technique mettant en œuvre un anticorps couplé à un chromophore telle que la Malachite Green pour reconnaître une protéine spécifique. Si ces protéines interagissent. permet d’observer l’image formée dans le plan focal arrière de l’objectif. des radicaux libres produits par ce chromophore inactivent par peroxydation toute protéine dans un rayon de quelques dizaines de nm. Confocal : Un microscope est dit «confocal» lorsque un point de l’échantillon est vu sous le même angle par le condenseur et l’objectif. Notons que des positions sont résolues avec plus de précision que des volumes. un signal fluorescent est émis. Chaque fragment est rapporteur d’une protéine distincte. dans la limite du pouvoir résolutif du système utilisé. Contraste de phase : Technique qui transforme les différences d’ordre de marche (phase) des ondes électromagnétiques introduites par l’échantillon en une différence d’amplitudes (intensité). Quand les molécules retournent à leur état normal d’énergie. Si l’intensité d’excitation est trop élevée. 90 . Colocalisation : Deux objets présentant des coordonées spatiales identiques. Bleaching : (photo-blanchiment) Destruction irréversible des fluorochromes par une illumination très intense. les fluorochromes sont excités par un laser à un niveau élevé d’énergie.Apochromatique : Système de lentilles dont la chromaticité et la sphéricité sont respectivement corrigées pour trois et deux longueurs d’ondes (et pas forcément pour tout le spectre visible). elles peuvent interagir avec des triplets-oxide et perdent ainsi définitivement leur capacité de fluorescence. BiFC : Bimolecular Fluorescence Complementation Technique basée sur la complémentation de deux fragments non fluorescents d’une protéine fluorescente. Suite à l’effet d’un laser. Cercle de moindre confusion : Zone d’erreurs de focalisation des rayons entraînée par les différents types d’aberrations. par exemple de la YFP (« Yellow Fluorescent Protein ») avec un peptide espaceur à libre rotation. les deux fragments de la YFP se complémentent par auto-assemblage et l’ensemble fluoresce. les molécules excitées passent d’un état singulet à un état triplet et peuvent intéragir entre elles (excimères). Bertrand : (Lentille de Bertrand) La lentille de Bertrand placée dans le tube du microscope ou à la place d’un oculaire. La durée de vie des molécules dans l’état triplet étant significativement plus longue.

Filtres : . conçu généralement pour couper le faisceau incident à 45°. Il réfléchit une lumière et en transmet une autre. Déplacement de Stokes : (Stokes’shift) Différence spectrale entre le maximum d’excitation ou d’absorption et le maximun d’émission d’un fluorochrome. . un miroir dichroïque diviseur de faisceaux à 45° et un filtre d’émission. dans un microscope à épi-fluorescence. .bloc filtre d’épi-fluorescence Jeu de filtres composé typiquement de trois filtres : un filtre d’excitation. Cross-Talk : Passage d’une émission de fluorescence dans un canal de détection non approprié. Son image doit être située. En retour. il transmet la fluorescence (à ondes plus longues) émise par l’échantillon vers le filtre d’émission. FCS : Fluorescence Correlation Spectroscopy Technique de spectroscopie mesurant les temps de diffusion des particules fluorescentes en solution ou dans un volume minime et la corrélation (association) des différentes particules.filtre d’émission (orthogonal) Arrête sélectivement toutes les lumières dues à des réflexions parasites ou à d’autres fluorophores et laisse passer une sélection de la lumière émise par l’échantillon. Il en résulte un contraste pseudo-topographique ou pseudo-relief. (épi signifie ‘par dessus’). Les filtres passes-bandes à caractéristique 91 . utilisé dans les cas où une discrimination spectrale est nécessaire. DIC. selon les principes de Köhler.filtre Band-Pass BP (filtre passe-bande) Transmet une bande spectrale particulière de la lumière. . Diaphragme de champ : Contrôle la zone d’illumination de l’échantillon. Epimicroscope : (microscope à épi-illumination) L'objectif d’un tel microscope sert à la fois à illuminer et à observer la préparation. . Par exemple.filtre d’excitation (orthogonal) Transmet sélectivement une portion du spectre de la source (typiquement d’une lampe à mercure) ou supprime quelques raies d’un laser. dans le plan focal avant de l’objectif.miroir dichroïque Séparateur interférentiel de spectre.Contraste interférentiel : (Differential Interference Contrast. il réfléchit la lumière à ondes courtes sélectionnée par le filtre d’excitation et l’envoie sur l’échantillon. Nomarski ou Hoffman) Technique qui consiste à introduire et à analyser une différence de marche de deux trains d’ondes polarisés et qui est proportionnelle à l’épaisseur et aux indices de réfractions de l’échantillon.

absorbe 99. . trois et même quatre fluorochromes.filtre DD (Double Dichroïque) Laisse passer spécifiquement 2 longueurs d’onde d’excitation.RG : Red Glass Filtre passe-haut. . .OG : Orange Glass Filtre passe-haut.spectrale large sont utilisés pour obtenir une image d’intensité et de contraste maximal tout en maintenant un isolement correct. .4 à 4 DO). Le niveau d’atténuation d’un filtre est exprimé en densité optique (de 0. transmet une bande spectrale et atténue les énergies des longueurs d’ondes inférieures ou supérieures à la bande de transmission. Utilisé quand l’application requiert la collection du maximum d’émission lorsque la discrimination spectrale n’est pas recherchée comme dans le cas de la détection d’un seul signal de fluorescence ou dans le cas de multi-fluorescences très bien séparées. absorbe 99.MB: Multiband Filter Set Composition de filtres requits pour exciter et détecter simultanément. . Quelquefois utilisé en combinaison avec un filtre long-pass (ou passe-haut) pour isoler une région spectrale. . .ND : Neutral Density filter Filtre d’atténuation de l’intensité de lumière dans un domaine spectral plat.999% de la lumière bleue + verte. .KG Filtre passe-bas d’absorption colorimétrique.filtre TD (Triple Dichroïque) Laisse passer spécifiquement 3 longueurs d’onde d’excitation. réfléchit les longueurs inférieures vers un autre canal du système optique). 92 .filtre Long-Pass LP (filtre passe-haut) Transmet une large bande de longueurs d’onde supérieure à une valeur spécifiée (et si le filtre est interférentiel. .filtre de discrimination DF (Discriminating Filter) Filtre d'excitation ou d’émission de type passe-bande avec une transition très raide en marches d’escalier comportant une atténuation spéciale d’énergie près de la bande spectrale de transmission.NB : Narrow-Band filter Désigné pour optimiser le rapport signal sur bruit dans des applications où l’isolement du spectre est plus important que l’intensité du signal. .filtre Short-Pass SP (filtre passe-bas) Transmet une large bande de longueur d’onde inférieure à une valeur spécifiée. .999% de la lumière bleue. deux.

Image intermédiaire : Située dans le tube entre les oculaires et le plan arrière de l’objectif. FRAP : Fluorescent Recovery (Redistribution) After Photobleaching Après photodestruction du fluorophore. FLIM : Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Technique d’imagerie consistant à mesurer sur une échelle de temps variant de la picoseconde à quelques dizaines de nanosecondes la durée de vie de fluorescence (τ) des molécules. Pour un filtre passe-bande.FLIP : Fluorescence Loss In Photobleaching Technique dérivée du FRAP à la différence que le rayonnement laser devant éteindre la fluorescence est émis en continu et non pas sur une courte période. Immersion : (liquide d’immersion) 93 . placé dans plan focal avant du condenseur. FWHMT : Full Width at Half Maximum Transmission Définit la largeur de la bande spectrale transmise par le système optique. En conséquence toute particule fluorescente qui entre dans le champ de rayonnement est éteinte. Cette durée de vie ou durée de vie de l’état excité singulet. suivi de la réapparition de la fluorescence grâce à la communication cellulaire ou à la diffusion qui ramène de nouvelles molécules fluorescentes vers la zone photoblanchie. Iris condenseur : Diaphragme condenseur. est un paramètre caractéristique de l’état physico-chimique de la sonde fluorescente étudiée. réflections parasites. Il ajuste l’ouverture numérique et la profondeur de champ de la lentille. jusqu'à extinction complète du compartiment contigu. FRET : Fluorescence Resonant Energy Transfer (voir Transfert d’Energie par Résonance (RET)) Fluorite : Les objectifs en fluorite sont corrigés au moins pour 3 longueurs d’ondes pour la sphéricité et pour 3 et plus pour la chromaticité. pour laquelle une image de la source est focalisée dans le plan focal avant du condenseur et le diaphragme de champ est focalisé dans le plan de l’objet. Visible par la lentille de Bertrand dans le plan arrière de l’objectif. elle est référencée par rapport à la transmission prise à demi-hauteur du maximum. Grandissement : (magnification) Rapport qui définit la distance réelle entre deux points dans le plan focal de l’objectif et la distance observée dans l’oculaire. l’éblouissement et l’échauffement. Cela permet en particulier de mesurer le volume d’un compartiment. Cela permet de minimiser les aberrations. Illumination Köhler : Méthode d’illumination décrite par A. Köhler.

Liquide occupant l’espace entre l’objectif et l’échantillon. Un tel liquide est requis pour des objectifs avec une focale de 3 mm ou moins afin de limiter l’incidence des interfaces entre l’échantillon et l’objectif.
Index de réfraction, n : L’index ou l’indice de réfraction n est la constante de proportionnalité qui est définie par le rapport entre la vitesse de propagation de la lumière dans le vide c et la vitesse de propagation de la lumière dans un milieu transparent v : n = c / v.Quelques indices : nair ≈ 1, neau = 1,33, nverre = 1,518, nhuile = 1,515, nmilieu de montage = 1,3 - 1,5 Iris objectif : Diaphragme objectif, ajuste l’ouverture numérique et la profondeur de champ de la lentille. Longueur de tube : (Optical tube-length) La distance est mesurée entre le plan focal arrière de l’objectif et le plan focal avant d’un oculaire. Typiquement cette distance vaut 160 mm, avant l’introduction d’optiques corrigés à l’infini ∞. Moyennage à l’aquisition : Permet d’améliorer le rapport signal/bruit : entre 2 et 4 en général - Moyennage par ligne : rapide pour un point donné et donc convient pour les études de vivant, favorise le photo-blanchiment. - Moyennage par sections : convient pour les études de matériel fixé. NLO : Non Linear Optics Systèmes faisant appel à d’autres ordres de la lumière incidente tels que la modulation/démodulation de fréquence ou surtout aux lasers impulsionnels pour la microscopie bi-photonique. Nyquist : (théorme de Shannon) Loi d’échantillonnage d’une image : d/2,3. La taille du pixel doit être plus petit ou égale à la distance séparant deux points à résoudre d, divisée par 2,3. OD : Optical Density Unité mesurant la transmission T de la lumière. Conversion : OD = -log10(T) Par exemple, 1% Transmission, 0,01 absolu, ainsi -log10 (0.01) = OD 2. ON : Ouverture Numérique (NA, Numerical Aperture) Ouverture numérique d’une lentille. Défini comme le produit de l’indice de réfraction n du milieu dans lequel est placé l’échantillon, par le sinus du demi-angle d’ouverture α de l’objectif : ON = NA = n.sin α Ondes évanescentes : (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence) A l’interface entre deux milieux d’indices de réfraction différents, un rayon laser oblique incident sous un angle critique entraîne une réflexion totale mais son champ électromagnétique (ondes évanescentes) peut exciter des fluorochromes sur 100 nm dans le second milieu. OTF : Optical Transfer Function (Point Spread Function, PSF)

94

Caractérise pour un système optique, la fonction de restitution des fréquences spatiales d’un objet.
Overlap : (recouvrement) Chevauchement de deux spectres d’émission ou d’excitation de fluorochromes. Pinhole : (trou d’aiguille) Diaphragme de détection : diaphragme à iris sur la plupart des appareils qui permet d’ajuster le volume analysé. Il joue un rôle essentiel dans la résolution spatiale. Il est réglé sur la valeur de la tâche d’Airy pour un objectif donné. Pixel : (de l’anglais Picture Element) Elément de base du format d’une image numérisée. Chaque pixel exprime un niveau de gris. Pour un champ donné (x,y) le nombre de pixels détermine la définition de l’image (typiquement 514 x 514 ou 1024 x 1024). Par extension, une série d’images sur un volume (x,y,z) est constitué de voxels (Volume Element). Plan-Apochromatique : Objectif avec corrections de planéité et d’aberration chromatique poussées. Plan de champ : (Field plane) Dans un microscope ajusté selon Köhler, les différents plans de champ sont conjugués avec l’échantillon focalisé. Ils incluent donc le plan de l’échantillon, le diaphragme de champ, le plan image intermédiaire et l’image sur la rétine ou le capteur. Profondeur de focalisation : (Depth of focus) Se réfère à la zone en avant et arrière du plan focal image où un point image flou est plus petit que le cercle de confusion. Profondeur de champ : (Depth of field) C’est la distance qui sépare, de part et d’autre du plan focal objet de la lentille, les objets qui apparaissent nets. La profondeur de champ varie avec la longueur focale de la lentille, NA et λ. PSF : Point Spread Function (Optical Transfer Function, OTF) Caractérise pour un système optique la fonction de restitution des fréquences spatiales d’un objet. Quenching : (désexcitation) Tout phénomène qui diminue le rendement quantique d’un fluorophore. En termes électroniques, on parlera de quenching dynamique (collisions), ou statiques (complexes), ou à distance (résonance). En termes chimiques, on observe la photodégradation avec formation d’excimer, transfert de H+… Inversement la photostabilité correspond au nombre d’excitations que peut subir une molécule fluorescente avant d’être détruite. Réfraction : Déviation d’un rayon lumineux qui franchit la surface de séparation de deux milieux, dans lesquels les vitesses de propagation sont différentes.

95

Rendement quantique : Rapport du nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence au nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation. Resel :

On appelle ainsi l’unité de résolution pour « resolution element ».
Résolution : La résolution correspond au pouvoir séparateur, c’est-à-dire à la capacité d’un système optique à distinguer deux points distincts. Ernst Abbe (1840-1905) a défini la résolution à la limite de diffraction. Deux détails d'un échantillon séparé d’une distance δ sont résolus quand l’ouverture numérique (ON) de l’objectif est suffisamment grande pour capturer le premier ordre de diffraction produit par ces détails à la longueur d’onde utilisée. La résolution ou pouvoir séparateur, δ, d’un objectif de microscope dépend de l’ouverture numérique et se définit par : résolution = δ = 0.61 λ / ON où λ est la longueur d’onde. Donc, la résolution δ est meilleure (la plus petite) si λ est faible et si l’Ouverture Numérique est grande. Les limites théoriques du pouvoir séparateur d’un microscope se situent autour d’une demilongueur d’onde (250 nm) et son grandissement à 1000 fois l’ouverture numérique. Shannon : (voir Nyquist). Spectromètre optique : Système optique qui transmet une bande spécifique du spectre électromagnétique. La dispersion des différentes longueurs d’ondes est obtenue par la capacité d’un prisme à diffracter la lumière. Système utilisé chez les microscopes confocaux LEICA SP. TC-SPC : Time Correlated- Single Photon Counting Imagerie par enregistrement x,y,t de la position et du temps de détection de chaque photon. A posteriori, on peut ainsi rejouer les données avec des régions d’intérêt, des fenêtres de temps et des temps d’intégration modulés d’après la réactivité observée. Transfert d’énergie par résonance : Förster Resonant Energy Transfert (RET) Deux chromophores rapprochés (≤ 7 nm) ayant un chevauchement du spectre d’émission d’un donneur d’énergie et du spectre d’absorption d’un accepteur d’énergie peuvent, en fonction de l’orientation de leurs dipôles, produire un transfert non radiatif par résonance. Dans le cas de fluorophores, Fluorescence Resonant Energy Transfert (FRET) : on excite le donneur et on observe l’émission de l’accepteur. Egalement dans ce cas, la durée de vie du donneur (τf) diminue. Le FRET permet d’estimer la distance entre deux molécules. Wide-field : Microscopie à champ large, microscopie conventionnelle. WD : Working distance (distance de travail) Distance entre la lentille et l’objet focalisé, moins l’épaisseur de la lame couvre-objet (normalement de 170 µm d’épaisseur).

96

Introduction to Fourier Optics. 2ème édition. 2003. optique de Fourier. Imperial College Press (2003). [3] J. Pawley Ed. Rossi. [2] B.Bibliographie [1] M. Bainier. Springer (2001).uhp-nancy. [4] J. CRC Press. Optique instrumentale. Goodman. Born et E.olympusmicro.html http://confocal. New York (1995). Near-Field Microscopy and Near-Field Optics. Courjon. Ellipses (1996). 6ème édidition. [9] Visitez les sites : http://www. 2ème édition. Le champ proche optique : théorie et applications.html 97 .. [6] D. Optics. J. [8] Biomedical Photonics Handbook.medecine. [7] D.com/primer/java/index. Pergamon Press.. Courjon et C. Tuan Vo-Dinh Ed.fr/bouton2/microscopie-multiphoton. Mc Graw-Hill International Editions (1996). Oxford (1995). Wolf. Principles of Optics. [5] The Handbook of Biological Confocal Microscopy. Addison-Wesley (1957). Plenum Press.W. Surrel.