Gntique bactrienne

Les plasmides bactriens

Stphane CORVEC, Laboratoire de Bactriologie, UFR de Mdecine - Nantes, 2009

1- Plasmides : gnralits et fonctions

1.1- Gnralits- dfinition :

Molcules dADN bicatnaire, circulaires en gnral

Facultatifs (1 3% de lADN total)

Extra-chromosomiques le plus souvent

Capacit de rplication autonome (rplicons)

Transmission stable au cours des gnrations

Codent pour des fonctions de meilleure adaptation de
la bactrie hte lenvironnement

Maintien dautant mieux quil procure
un avantage slectif

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1- Plasmides : gnralits et fonctions

1.2- Fonctions diverses non indispensables mais utiles
ladaptation de lhte lenvironnement :

Fertilit, mobilisation dautres lments gntiques

Rsistance aux antibiotiques

Chanes dgradatives et mtaboliques particulires
supplmentaires

Facteurs de virulence : toxines, adhsines

SC 2009 3

1- Plasmides : gnralits et fonctions

1.2- Fonctions diverses :
Plasmides conjugatifs : pili sexuel facteur F
Plasmides de Rsistance : facteur R rsistance aux
antibiotiques et mtaux lourds
Plasmides mtaboliques : gnes permettant lutilisation de
certains nutriments (citrate, soufre, ure)
Plasmides de virulence : E. coli enterotoxinogne (tourista)
- plasmide : facteur de colonisation
- plasmide : toxine

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2- Plasmides : structure et organisation

2.1- Structure (plasmides circulaires)

Taille trs variable de 1 400 kb ou plus

Form dADN double brin : 3 formes
Forme I : circulaire covalente ferme
Forme II : circulaire, relche, un des 2 brins est coup
Forme III : forme linaire (deux brins coups)

Techniques
dtude
SC 2009 5

2- Plasmides : structure et organisation

Forme II : forme relache

OC  Open Circle

Forme I : Forme normale

surenroule
CCC Covalent Close
Circle

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2- Plasmides : structure et organisation

2.2- Organisation des plasmides

Flexible et variable suivant le plasmide

Comporte une zone obligatoire de rplication
 Rplicon

Peut comporter aussi :
Une rgion de transfert (opron tra) chez les
plasmides conjugatifs : pili et conjugaison
Des lments gntiques mobiles ou non (IS, Tn, Int)
Gnes divers (rsistance aux antibiotiques, etc)
Plasmides conjugatifs : mme espce ou
diffrentes, consquences et implication
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2- Plasmides : structure et organisation

Facteur F
Operon tra
IS, Tn
Rplication

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2- Plasmides : structure et organisation

Dissmination de
linformation
gntique
= gnes de rsistance

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3- Plasmides : mthodes dtude

3.1- Mthodes gntiques :

La (les) fonction(s) est (sont) lies au plasmide
porteur:
Transferts plasmidiques
Cure plasmidique
Couplage des 2 mthodes
3.2- Mthodes physiques :

Isolement et purification de plasmide

Ultracentrifugation lquilibre de densit
(CsCl + bromure dethidium) - colonne

Electrophorse en gel (avec ou sans enzymes de
restriction)

Hybridation ADN-ADN (Southern blot)
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3- Plasmides : mthodes dtude

3.1- Mthodes gntiques :
Transferts plasmidiques

Hmolysine

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3- Plasmides : mthodes dtude

3.1- Mthodes gntiques :
Cure plasmidique

Elimination du plasmide par croissance dans des conditions

inhibant spcifiquement sa rplication
Plasmide perdu et perte de fonction
Ex. : rsistance aux antibiotiques, marqueur de virulence
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3- Plasmides : mthodes dtude

Pouvoir pathogne : Bacillus anthracis repose principalement
sur la prsence d'une capsule et sur la synthse de toxines.
Plasmides de Bacillus anthracis
pXO1
174 kb portent les gnes codant
Le facteur oedmatiant (cya)I
Le facteur lthal (lef)III
Lantigne protecteur (pag)II
pXO2
90 kb portant les gnes codant
La synthse de la capsule (capA, capB, capC)

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3- Plasmides : mthodes dtude

3.2- Mthodes physiques :
3.2.1- Isoler et visualiser le plasmide : extraction dADN
1- Rupture intgrit paroi bact.
2- Dgradation des protines et prcipitation
3- Rcupration ADN et purification
=> Sparer le chromosome du plasmide
Nombreuses techniques => lyse alcaline
Lyse : altration des enveloppes bactriennes
Alcaline : dnaturation ADN
Forme surenroule, circulaire, double brin :
moins de rupture et renaturation possible

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3.2.2- Techniques dextraction

Ultracentrifugation lquilibre de densit : CsCl + bromure
dethidium

Techniques modernes :
- lyse
- colonnes : rapide
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3.2.3- Electrophorse conventionnelle

Confection du gel (Agarose, Acrylamide)

Chargement des chantillons dADN
Migration dans un champ lectrique constant
Coloration au BET (Bromure dthidium)
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3.2.3- Electrophorse aprs restriction

Collection de fragments de nombre et tailles dfinis

Fonction des GC% (site de lenzyme et ADN)

Grande spcificit  Grande reproductibilit (RFLP)

Linariser le plasmide
Comparaison
du contenu plasmidique

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Typage molculaire :
profils de bande par restriction

Profil plasmidique brut

Profil plasmidique aprs restriction

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4- Plasmides : rplication (1)

4.1- Gnralits :

Rplication de type uni ou bidirectionnelle (oriV)

Rplication de type rolling circle  ouverture dun
brin, synthse 5-3 et dplacement du brin coup

Le plasmide fait largement appel pour sa synthse
lquipement enzymatique de la bactrie hte

Diversit des rgulations du nombre de copies

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4.2- Plasmides : rplication de type

Monodirectionnelle

Bidirectionnelle
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4.3- Rplication de type rolling circle

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4.3- Rplication de type rolling circle

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4.5- Plasmides : rplication

Les fonctions de la rgion oriV

Spectre dhte : une ou plusieurs espces

Rgulation du nombre de copies (1 des centaines) :
stringente ou rlche

Rpartition des copies entre les bactries filles (par)

Incompatibilit des plasmides

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5- Plasmides : classifications (1)

Selon la taille ou le phnotype

Peu de valeur, car ne tient pas compte de la plasticit
du plasmide
Selon la taille, conjugatif ou non, nombres de copies

Petits plasmides, non conjugatifs, nombre lev de
copies, rplication relache (peu contrle)

Gros plasmides, conjugatifs, faible nombre de copies :
rplication stricte

Phnomne de mobilisation (un petit plasmide non
conjugatif est mobilis et transfr par un plasmide
conjugatif)

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5- Plasmides : classifications (2)

5.1- Groupes dIncompatibilit :

Certains plasmides ne cohabitent pas durablement dans
la mme bactrie (Fgal et Flac), culture en milieux
non slectifs (glucose)  Elimination de lun des
plasmides => comptition

Lincompatibilit est un phnomne gnral

Deux plasmides incompatibles ont un anctre commun
et des systmes de rplication ou de rpartition
semblables

Leurs ADN sont fortement homologues (rplication)

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5- Plasmides : classifications (3)

5.2- Types piliaires :

Plasmides conjugatifs : pili sexuels rcepteurs de
phages

Pili identiques  Sensibilit aux mmes phages

Moins discriminants que les groupes dincompatibilit :
groupe piliaire F comprend diffrents groupes

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6- Plasmides : quelque plasmides clbres

Facteur F

Prototype du gros plasmide conjugatif petit nombre de
copies (dcouverte de la conjugaison)
Facteurs R

Plasmides de rsistance aux antibiotiques (conjugatifs le
plus souvent)
pBR322

Vecteur de clonage trs utilis aux premier temps du
clonage et du gnie gntique

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6- Plasmides

Gnes de
rplication
et
rpartition

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7- Plasmides : clonage gntique

Intrts :
Biotechnologies production
de mdicaments (plasmides
recombinants)
Application pour le
squenage
Etc

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