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Biomolcules dorigine vgtale

dintrts industriels:
Les polyphnols

Cours ULBI 456 Licence L2


Second semestre 2009
Christian Jay-Allemand

Universit Montpellier 2
France
(Tl: 04 67143612, E-mail: jay-allemand@univ-montp2.fr)

Mtabolites secondaires ?

Plan gnral du cours

-Diversit des structures chimiques

Partie I- Introduction

-Proprits physico-chimiques

-Biodiversit vgtale, adaptation et


plantes comme source de biomolcules

-Principales techniques danalyse

-Sensibilisation aux !mtabolites


secondaires! produits par les plantes
-Alcalodes
-Saponines et sapognines
-Acides phnoliques et flavonodes

- Extraction, hydrolyses,
- Sparat, dtect, quantificat
- Histolocalisation
Partie III- Proprits!et rles des
composs phnoliques / Utilisations
-Couleur du bois

-Mtabolisme et voies mtaboliques

-Couleur des fleurs et des fruits

-Importance des composs phnoliques


utiliss par lhomme / Historique

-Brunissement des tissus

Partie II- Biochimie des phnols et


techniques danalyses

-Proprits antioxydantes

-Quest-ce quun phnol ?


-Rseaux mtaboliques

-Qualits organoleptiques

-Proprits pharmacologiques
Partie IV- Conclusion et perspectives

PARTIE II-2
Biochimie des phnols et
techniques danalyses

- Intrts industriels et agronomiques (colorants, bois,


papier, amlioration gntique des varits, identification des
cultivars, couleur des fleurs, )

- Utilisations des composs phnoliques comme marqueurs


gntiques, marqueurs physiologiques et marqueurs des effets des
conditions environnementales sur les vgtaux utiliss par
lhomme
- Intrts et limites de leurs utilisations en biotraabilit
(marqueurs) et en biodtection (fluorescence naturelle ou
intensifie laide de ractifs chimiques, coloration spcifique
dans le visible en bleu ou en rouge et traceurs radioactifs)

II-3 Techniques danalyse


des composs phnoliques

Protines
(Enzymes)

Histolocalisation

ARN
ADN

Caractrisation et localisation de la zone


de transition (ZT)
Rondelle de bois
de noyer

UV light

Visible light

(Juglans nigra)
ZT

! Changements drastiques entre laubier (A) et le duramen (D)


Physique (UV fluorescence, teneur en eau, contrainte mcanique)
Biochemique (accumulation de composs phnoliques)

! UV fluorescence est un marqueur de ZT (Magel et al, 2001)

Localisation of cells containing flavanols in different zones of wood

RAYS

HEARTWOOD

SAPWOOD

Flavanols colored in blue by DMACA reagent in walnut wood

(after Andary C. and Mondolot-Cosson L., Montpellier Univ., France)

Mutant sin1

Type sauvage At

Lumire UV

Voie des acides hydroxycinnamiques et


biosynthse des lignines

Biodtection
Planches A & B- Accumulation de
naringnine chalcone (A, fluorescence
jaune clair) et de querctine (B,
fluorescence orange) lors de la formation
des racines latrales le long dune racine
primaire de jeunes plants dArabidopsis
thaliana g de 5 7 jours aprs
germination. Les jeunes racines sont
observes directement en microscopie
pifluorescence

Voies de
biosynthse
des
flavonodes
(tt 3, 4, 5, =
mutants
chimiques ou
dinsertion dAt
disponibles)

Les flavonols sont synthtiss dans le cortex et saccumulent la fois dans le


cortex et la stle de la racine dArabidopsis thaliana
Racine
primaire

Figure : Visualisation en microscopie


confocale des flavonodes (flavonols) par
fluorescence amplifie et stabilise par le
ractif de Neu dans la zone dlongation des
cellules du cortex (flche) et de lpiderme
dune racine.

Figure : Immunolocalisation de la chacone


synthase (CHS) et la chalcone isomrase (CHI)
dans les cellules de racines. La flche indique
une zone dintense fluorescence de CHS et CHI
localise dans la partie apicale des cellules du
cortex dune racine.

Myricitrine (mol g-1 MS)

Stratgie ARN antisens chalcone synthase


Planches - Modifications de la
teneur en composs phnoliques de
jeunes tiges de noyers (Juglans sp.)
transforms avec le gne antisens
CHS ( chalcone synthase)

A
8
6
4
2
0
T1 T2 1

9 10 11 12 13

Souches non transforme (T1) ou transformes

T1

Souche 9

A- Teneurs en un glycoside de flavonol,


la
myricitrine.
Chaque
valeur
correspond la moyenne de 6 mesures.
effectues sur 6 tiges diffrentes pour
chacune des souches (T1, T2, 1, 2, )
de noyer produites in vitro aprs 3
semaines de culture (4me repiquage).
Les barres indiquent les erreurs
standards.. T1: souche non transforme;
T2: souche transforme par le gne
GUS-INTRON + le gne NPTII; les
souches 1, 2, 3, sont transformes
avec le gne antisens CHS + GUSINTRON + NPTII.
B et C- Rvlation des flavanes par la
vanilline chlorhydrique (couleur rouge)
dans des coupes
transversales semifines. Les flavanes sont localiss dans
lpiderme et le parenchyme cortical
des tiges des souches non transforme
(B) et transforme n 9 (C). On notera
la trs forte diffrence de teneurs entre
les deux souches.

Production de plants partir


dembryons somatiques
chez le noyer (Juglans regia)

Matriel vgtal

Extraction

(Protection / purification)
Sparation
Dtection
Caractrisation & quantification
Identification

Calculs / Std

2D
CMC

Solvant 2: AFE

HJG

MYR

1D
Solvant 1: MFE
Dpt de

20 L dextrait

Figure : Carte phnolique dun extrait de jeunes feuilles de noyer


(Juglans sp.) obtenue par chromatographie sur couche mince de cellulose

Sparation par CMC dextraits


phnoliques de diffrentes espces
dignames (Dioscorea sp.)
rcoltes en Guyane

Rvlation avec le ractif DMACA et


observation en lumire visible

Rvlation avec le ractif de Neu et


observation sous UV

Appareil de
chromatographie liquide
haute performance
(CLHP ou HPLC)

Solvants

Pompes

Colonne
!HPLC!

Dtecteur
UV/Visible =
Barette de diode

Injecteur
automatique

Hydrojuglone glucoside (HJG)

SM 1

Im.E.
176

338

I.C.-CH4
61

52

177

Myricitrine (MYR)

339

I.C.-NH3

177 180

339 356

Rhm

u.m.a.

2D

I.C.-NH3

CMC
129 146 164

HJG
MYR

1D
Solvant 1: MFE

Dpt de
20 L dextrait

Absorbance 340 nm

Solvant 2: AFE

SM 2

CLHP

248

MYR

HJG

STDi

10
20
30
Temps de rtention (min)

319

465

u.m.a.

Planche I- Principales techniques d'analyse des composs phnoliques permettant leur quantification et leur identification
chimique partir d'extraits aqueux, alcoolique ou actonique de tissus vgtaux. titre d'exemple, sont prsentes ici la sparation
par chromatographie sur couche mince de cellulose (CMC) et par chromatographie liquide haute performance (CLHP) d'un extrait
actonique de feuilles de noyer (Juglans sp.) et l'identification par spectromtrie de masse (SM 1 et SM 2) de deux polyphnols
glycosyls majeurs, l'hydrojuglone glucoside (HJG) et la myricitrine (MYR) (daprs rf. 14, Chap . I et daprs G. Kravis,
communication personnelle).
La sparation bidimensionnelle [1re dimension -1D- avec le solvant MFE (mthyl-iso-butyl ctone / acide formique / eau, 3/1/2) et 2e
dimension -2D- avec le solvant AFE (eau 5% d'acide formique)] sur couche mince de cellulose se rvle trs utile pour visualiser en
lumire visible, sous forme de tches jaune vif, diffrents glycosides de flavonols dont la myricitrine. La tche centrale brune
correspondant l'hydrojuglone glucoside est apparue aprs oxydation l'air. Lobservation du mme chromatogramme sous UV
permettrait de rvler dautres composs phnoliques par leur fluorescence.
HJG et MYR ont t spars par CLHP l'aide d'une colonne Licrospher RP 18 de dimension 250 x 4 mm dans laquelle un gradient,
rsultant du mlange progressif d'un solvant aqueux acidifi (1% d'acide actique) et d'un solvant organique (actonitrile / mthanol, 1/1),
a t appliqu pendant 35 min. Noter l'excellente rsolution des pics ainsi que la prsence d'un compos tmoin appel standard interne
(STDi) qui est ici la 6-mthoxyflavone. Les composs ont t dtects 340 nm et leur concentration, directement corrle la surface de
chaque pic, est calcule laide des coefficients dextinction molaire caractristiques lorsquils sont connus. Le standard interne (STDi)
permet de s'assurer que toutes les tapes, de l'extraction la dtection, se sont bien droules et aussi de calculer les teneurs relatives des
pics inconnus. La sparation en CLHP peut tre couple l'analyse en SM pour confirmer l'identification d'un compos donn. L'analyse
en RMN peut galement s'avrer indispensable pour identifier une structure chimique nouvelle.
Les analyses en spectromtrie de masse de HJG (SM 1) ont t effectues en impact lectronique (Im.E.), en ionisation chimique au
mthane (I.C.-CH4) ou encore en ionisation chimique l'ammoniac (I.C.-NH4). En Im.E., l'ion molculaire M+. = 338 u.m.a. (units de
masse atomique) est peu visible alors que l'ion fragment F+ = 176 majeur correspond la perte d'une partie du glucose (-163) avec un
transfert d'hydrogne sur le reste de la molcule donnant un [F+H]+. Par contre l'ionisation chimique l'ammoniac, plus douce, permet de
visualiser nettement le [M+H]+ = 339 et le [M+NH4]+ = 356. L'ion F+ = 180 est caractristique du glucose. La masse de l'ion molculaire
M+. est alors confirme en I.C.-CH4 (ionisation de force intermdiaire) par l'obtention de l'ion [M+H]+ = 339, d'o M = 338.
L'analyse en spectromtrie de masse de la MYR (SM 2) a t ralise en I.C.-NH3. On obtient en particulier le [M+H]+ = 465. La masse
de la MYR est de 464. L'identification du pic obtenu en CLHP correspondant la MYR a t ainsi confirme par simple comparaison des
spectres de masse entre celui de la MYR du commerce et celui de la fraction collecte aprs sparation en CLHP.

Analyse CLHP dun extrait de


feuilles de merisier (Prunus avium)

Comment calculer les teneurs en


composs phnoliques
spars et dtects par
Chromatographie
liquide haute performance
(CLHP ou HPLC) ?

Merci pour votre attention

Et un peu de lecture

Pour en savoir plus

Hommage J.J. Macheix