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dintrts industriels:
Les polyphnols
Universit Montpellier 2
France
(Tl: 04 67143612, E-mail: jay-allemand@univ-montp2.fr)
Mtabolites secondaires ?
Partie I- Introduction
-Proprits physico-chimiques
- Extraction, hydrolyses,
- Sparat, dtect, quantificat
- Histolocalisation
Partie III- Proprits!et rles des
composs phnoliques / Utilisations
-Couleur du bois
-Proprits antioxydantes
-Qualits organoleptiques
-Proprits pharmacologiques
Partie IV- Conclusion et perspectives
PARTIE II-2
Biochimie des phnols et
techniques danalyses
Protines
(Enzymes)
Histolocalisation
ARN
ADN
UV light
Visible light
(Juglans nigra)
ZT
RAYS
HEARTWOOD
SAPWOOD
Mutant sin1
Type sauvage At
Lumire UV
Biodtection
Planches A & B- Accumulation de
naringnine chalcone (A, fluorescence
jaune clair) et de querctine (B,
fluorescence orange) lors de la formation
des racines latrales le long dune racine
primaire de jeunes plants dArabidopsis
thaliana g de 5 7 jours aprs
germination. Les jeunes racines sont
observes directement en microscopie
pifluorescence
Voies de
biosynthse
des
flavonodes
(tt 3, 4, 5, =
mutants
chimiques ou
dinsertion dAt
disponibles)
A
8
6
4
2
0
T1 T2 1
9 10 11 12 13
T1
Souche 9
Matriel vgtal
Extraction
(Protection / purification)
Sparation
Dtection
Caractrisation & quantification
Identification
Calculs / Std
2D
CMC
Solvant 2: AFE
HJG
MYR
1D
Solvant 1: MFE
Dpt de
20 L dextrait
Appareil de
chromatographie liquide
haute performance
(CLHP ou HPLC)
Solvants
Pompes
Colonne
!HPLC!
Dtecteur
UV/Visible =
Barette de diode
Injecteur
automatique
SM 1
Im.E.
176
338
I.C.-CH4
61
52
177
Myricitrine (MYR)
339
I.C.-NH3
177 180
339 356
Rhm
u.m.a.
2D
I.C.-NH3
CMC
129 146 164
HJG
MYR
1D
Solvant 1: MFE
Dpt de
20 L dextrait
Absorbance 340 nm
Solvant 2: AFE
SM 2
CLHP
248
MYR
HJG
STDi
10
20
30
Temps de rtention (min)
319
465
u.m.a.
Planche I- Principales techniques d'analyse des composs phnoliques permettant leur quantification et leur identification
chimique partir d'extraits aqueux, alcoolique ou actonique de tissus vgtaux. titre d'exemple, sont prsentes ici la sparation
par chromatographie sur couche mince de cellulose (CMC) et par chromatographie liquide haute performance (CLHP) d'un extrait
actonique de feuilles de noyer (Juglans sp.) et l'identification par spectromtrie de masse (SM 1 et SM 2) de deux polyphnols
glycosyls majeurs, l'hydrojuglone glucoside (HJG) et la myricitrine (MYR) (daprs rf. 14, Chap . I et daprs G. Kravis,
communication personnelle).
La sparation bidimensionnelle [1re dimension -1D- avec le solvant MFE (mthyl-iso-butyl ctone / acide formique / eau, 3/1/2) et 2e
dimension -2D- avec le solvant AFE (eau 5% d'acide formique)] sur couche mince de cellulose se rvle trs utile pour visualiser en
lumire visible, sous forme de tches jaune vif, diffrents glycosides de flavonols dont la myricitrine. La tche centrale brune
correspondant l'hydrojuglone glucoside est apparue aprs oxydation l'air. Lobservation du mme chromatogramme sous UV
permettrait de rvler dautres composs phnoliques par leur fluorescence.
HJG et MYR ont t spars par CLHP l'aide d'une colonne Licrospher RP 18 de dimension 250 x 4 mm dans laquelle un gradient,
rsultant du mlange progressif d'un solvant aqueux acidifi (1% d'acide actique) et d'un solvant organique (actonitrile / mthanol, 1/1),
a t appliqu pendant 35 min. Noter l'excellente rsolution des pics ainsi que la prsence d'un compos tmoin appel standard interne
(STDi) qui est ici la 6-mthoxyflavone. Les composs ont t dtects 340 nm et leur concentration, directement corrle la surface de
chaque pic, est calcule laide des coefficients dextinction molaire caractristiques lorsquils sont connus. Le standard interne (STDi)
permet de s'assurer que toutes les tapes, de l'extraction la dtection, se sont bien droules et aussi de calculer les teneurs relatives des
pics inconnus. La sparation en CLHP peut tre couple l'analyse en SM pour confirmer l'identification d'un compos donn. L'analyse
en RMN peut galement s'avrer indispensable pour identifier une structure chimique nouvelle.
Les analyses en spectromtrie de masse de HJG (SM 1) ont t effectues en impact lectronique (Im.E.), en ionisation chimique au
mthane (I.C.-CH4) ou encore en ionisation chimique l'ammoniac (I.C.-NH4). En Im.E., l'ion molculaire M+. = 338 u.m.a. (units de
masse atomique) est peu visible alors que l'ion fragment F+ = 176 majeur correspond la perte d'une partie du glucose (-163) avec un
transfert d'hydrogne sur le reste de la molcule donnant un [F+H]+. Par contre l'ionisation chimique l'ammoniac, plus douce, permet de
visualiser nettement le [M+H]+ = 339 et le [M+NH4]+ = 356. L'ion F+ = 180 est caractristique du glucose. La masse de l'ion molculaire
M+. est alors confirme en I.C.-CH4 (ionisation de force intermdiaire) par l'obtention de l'ion [M+H]+ = 339, d'o M = 338.
L'analyse en spectromtrie de masse de la MYR (SM 2) a t ralise en I.C.-NH3. On obtient en particulier le [M+H]+ = 465. La masse
de la MYR est de 464. L'identification du pic obtenu en CLHP correspondant la MYR a t ainsi confirme par simple comparaison des
spectres de masse entre celui de la MYR du commerce et celui de la fraction collecte aprs sparation en CLHP.
Et un peu de lecture