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Dnaturation et hybridation.

I\ Dnaturation.
On va retirer la structure secondaire ou primaire de lADN ou de lARN. On chauffe pour
que les deux brins se sparent ( la temprature de fusion ou Tm : melting). Le nombre de
liaisons H-H et la composition du milieu influencent ce Tm :
- Le nombre de liaisons H-H dpend de la longueur du fragment (jusqu 150 liaisons). Ce
nombre est important pour les petits fragments (50 60 bases).
- La composition en bases GC / AT.
- La prsence de mis-appariement.

- la composition du milieu : une augmentation de sels monovalents lve le Tm. Une


augmentation dure, de formamide permet de diminuer le Tm.
- Un pH extrme diminue le Tm.
Quand on dnature de lADN, on change ses proprits.

Sa densit augmente ; en centrifugation isopycnique, lADN simple brin est au niveau de


lARN.
- Les colonnes dhydroxyapatite (phosphate de calcium) retiennent lADN double brin et
laissent passer le simple brin.
- Les membranes de nylon ou de nitrocellulose retiennent le simple brin et laissent passer
le double brin.
Lhybridation dpend de la temprature, de la concentration et du temps.

II\ Hybridation.
A\ Hybridation en phase liquide.

LADN gnomique qui va tre clon est marqu radioactivement.

Cette lectrophorse permet de voir la taille des brins hybrids.


Remarque : Pour une mme concentration dADN, plus le gnome est petit (ou peu
complexe), plus la renaturation est rapide.
Dans un tube, on met 10g/mL dADN, on chauffe puis on laisse refroidir.

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On a une courbe en paliers : ce sont les trois populations diffrentes dADN dans le mme
gnome.

B\ Hybridation dune amorce.


Lamorce est un oligonuclotides synthtis chimiquement.

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C\ Hybridation sur phase fixe (support solide).


On fabrique un oligonuclotide polyT que lon fixe sur des billes.

D\ Fixation de lADN sur une membrane de nitrocellulose ou


de nylon.
Remarque : ces deux types de membranes retiennent les ADN simple brin et les ARN.

1\ Technique de Southern.
On fait digrer l'ADN (normal) par des enzymes de restriction (coupure en moyenne
toutes les 4000 bases). On travaille toujours Tm.

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L'ADN simple brin va se fixer sur le support soluble.

On prend un morceau d'ADN (d'1 kb) marqu radioactivement (une sonde) puis on va
regarder o la sonde s'hybride.

La sonde va alors s'hybrider sur le support solide. On lave ensuite la solution puis on fait une
rvlation par auto-radiographie.

Si la sonde est un oligonuclotide, on a deux cas:


- l'lectrophorse prsente une seule bande pour chaque enzyme de restriction: on est en
prsence d'un seul gne.
- l'lectrophorse prsente deux bandes pour chaque enzyme de restriction: on alors deux
gnes.

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2\ Technique de Northern.
On travail temprature proche de Tm avec hybridation sur milieu solide : gel sur lequel on
dpose des ARNm.

Le rsultat nous
permet de connatre la
taille de l'ARN.

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