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Cianobacterias PDF
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de antibiticos
Alejandra Torres-Ario*
cepas. La mayor actividad se present against any of the strains. The montr d'activit antimicrobienne
en extractos con metanol de muestras greatest activity was presented by the contre aucunes des cpes : Le majeur
liofilizadas y con diclorometano se extracts with methanol from freeze- activit s'est prsent dans les
obtuvieron los mayores halos de dried samples. Extracts obtained with extraits avec mthanol d'chantillons
inhibicin. Candida albicans fue la dichloromethane created the largest liofiliss ; avec dicloromthane on a
Palabras clave: Actividad antimi- Key words: Antimicrobial activity, Mots cls: Activit
crobiana, cianobacterias, cyanobacteria, Crassostrea gigas, antimicrobienne, cyanobactries,
Crassostrea gigas, probitico. probiotics. Crassostrea gigas, probiotique.
Introduccin
A
El uso indiscriminado de los antibiticos o
medicamentos comerciales ha provocado que su
actividad se vea limitada por la resistencia de los
microorganismos causantes de las diversas
patologas presentes sobretodo en las salas
nosocomiales de los hospitales. Dicha resistencia
es debido a que han sido capaces de desarrollar 10
defensas ms efectivas contra los antibiticos
comerciales. El problema se complica cuando una B
bacteria o microorganismo resistente a uno o
varios antibiticos es expuesta a otro medicamen-
to, pues crea la oportunidad de generar un
mutante que resista al nuevo antibitico. An as
se hace necesario continuar el escrutinio o pros-
peccin con otros organismos y microorganismos
que presenten molculas bioactivas con potencial 10
biomdico.
Los microorganismos han probado ser Figura 1. Cianobacterias filamentosas marinas de tapete
una de las fuentes de produccin de metabolitos microbiano (40X). (A) Lyngbya sp. (B) Spirulina sp.
biolgicamente activos. Una de las estrategias (flecha) posible Phormidium sp. Foto: Alejandra Torres
Ario.
actuales de estudio en estos campos, es la investi-
gacin o bioprospeccin de grupos que han sido
poco estudiados en el pasado. Entre los microor- presentan como organismos simples dada su
ganismos con gran potencial para la obtencin de ultra-estructura por lo que estn clasificados
sustancias bioactivas con nuevas propiedades se como procariotas, de ah su semejanza con las
encuentran las cianobacterias (Torres-Ario, bacterias. Tambin se les conoce como algas
2001). verde-azules por la coloracin que las identifica y
Las cianobacterias (fig. 1) son microorga- por su capacidad de llevar a cabo la fotosntesis
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nismos fotosintticos que al igual que las microal- con produccin de oxgeno, por lo que se incluyen
gas y las plantas superiores utilizan la luz, CO2, dentro de la categora de las algas. Su nombre lo
reciben del prefijo griego cyanos que significa
agua y otros nutrimentos en la obtencin de su
azul, aludiendo a su coloracin verde oliva a
energa necesaria para desarrollarse y crecer. Se
azulada, mas sin embargo podemos encontrarlas
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de varias tonalidades (Lpez-Corts, 1990). (Ostensvik et al. 1998; Torres-Ario, 2001), as
Los estudios bioprospectivos con ciano- como lipoflicos e hidroflicos (Patterson et al.
bacterias comenzaron en 1970, pero debido a las 1994). Dicha gama de naturaleza qumica utiliza-
dificultades de colecta y a la no reproducibilidad da ha conducido a la obtencin de molculas con
de las muestras en laboratorio, los esfuerzos en actividades interesantes en varios rubros, desde
este campo se vieron truncados y por tal motivo la industrial, farmacutica, biomdica, cosmeto-
han recibido poca atencin (Patterson et al. 1991). lgica y alimenticia, entre otras.
No fue sino hasta la dcada de los 80s, que los Los mtodos comnmente utilizados
programas biofarmacuticos identificaron a las para la determinacin de la actividad antimicro-
cianobacterias como uno de los grupos ms biana estn basados en el principio de difusin de
prominentes de microorganismos capaces de la capa de agar. Los efectos de inhibicin que
generar nuevos productos potencialmente infieren en la actividad antimicrobiana, se visua-
bioactivos. lizan como zonas claras o formacin de halos
Uno de los usos potenciales de la actividad alrededor de los sensidiscos donde va impregna-
biolgica de los compuestos obtenidos de las do el extracto a probar. Los microorganismos
cianobacterias es su capacidad de producir comnmente utilizados comprenden tanto
sustancias antibiticas (Carmichael, 1992; organismos aislados de pacientes que presentan
Patterson et al. 1994; Ostensvik et al. 1998 y Torres- algn cuadro clnico como el uso de microoganis-
Ario, 2001). Las propiedades antibiticas de los mos tipo, obtenidos de colecciones reconocidas.
metabolitos secundarios de las cianobacterias en Por lo anteriormente expuesto, este
la naturaleza no estn completamente entendi- estudio se presenta como una primera instancia
das, mas sin embargo, se ha observado que tienen de la evaluacin, observacin y cuantificacin del
influencia con otros organismos cercanos y la efecto antimicrobiano de extractos de cianobacte-
actividad antimicrobiana mostrada involucra rias. Lo que pretende es describir las tcnicas
diferentes microorganismos tanto procariotas utilizadas para la obtencin de los extractos y el
como eucariotas. De hecho, se ha observado que desarrollo de los bioensayos, adems de resaltar
las bacterias Gram (+) como Gram (-), algunos la importancia de dichos microorganismos como
protozoarios, microalgas y otras cianobacterias productores de sustancias antibiticas.
son sensibles a extractos obtenidos de cianobacte-
rias marinas y dulceacucolas. Material y mtodos
Las cianobacterias de ambientes terrestres
y dulceacucolas han sido las ms estudiadas e Microorganismos
investigadas para la obtencin de productos
naturales bioactivos; sin embargo, algunos Las cianobacterias utilizadas en este
compuestos de gran inters ya han sido obtenidos estudio se obtuvieron de muestras de tapetes
de cianobacterias marinas. Se ha observado que microbianos y de cultivos de ostin Crassostrea
ciertas cianobacterias producen toxinas y excre- gigas (Thunberg, 1795) de la empresa Sol Azul,
tan al medio de cultivo o a los reservorios de agua S.A. de C.V. en el Estero El Cardn, B.C.S.,
donde se encuentren, una amplia variedad de Mxico (fig. 2).
sustancias orgnicas biolgicamente activas
(Flores y Wolk, 1986). De ah que los metabolitos Aislamiento de cianobacterias
secundarios de dichos microorganismos esten
asociados a efectos txicos, hormonales, antineo- El material colectado en campo se resus-
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de las cianobacterias filamentosas mediante las
tcnicas de sembrado en placa, transferencia por
bloque invertido, el mtodo de la gota , por la
tcnica de diluciones seriadas y el uso combinado
Medio LB de los antibiticos. El empleo de cefoxitina result
en la eliminacin de bacterias hetertrofas
asociadas a las cianobacterias, mientras que el uso
Inoculacin
del tienam se restringi a exposiciones de 2 horas
microorganismo ya que exposiciones prolongadas (24 h) mostra-
ron patrones de desintegracin de los tricomas.
La utilizacin de ciclohexamida, result efectiva
en el aislamiento y limpieza de las cianobacterias,
Sensidiscos con aunque ms tarde, esto favoreci la aparicin de
extracto bacterias hetertrofas.
En las muestras de C. gigas se aislaron
cianobacterias filamentosas de los gneros
Oscillatoria sp. (ECBCSCG0010-I), Phormidium sp.
(ECBCSCG0010-II) y Spirulina subsalsa
Medicin Incubacin: (ECBCSCG0010-II). Por otra parte, de los tapetes
de halos 24 h a 37C microbianos se lograron aislar las cianobacterias
filamentosas Lyngbya sp. (ECBCSTM0010-1) y
Limnothrix sp. (ECBCSTM0010-2) (fig. 4). Entre
parntesis se presenta la clave en donde se indica
la procedencia de las muestras EC (Estero El
Cardn), BCS (Baja California Sur); el tipo de
Figura 3. Determinacin de la actividad antimicrobiana muestra colectado como CG (C. gigas) y TM
por el mtodo de difusin en placa (Kirby-Bauer). La (tapete microbiano), el ao y mes de colecta 00
forma de accin se mide por la formacin de halos de
(2000) y 10 (octubre). Por ltimo se les dio el orden
inhibicin del crecimiento.
Resultados
S. aureus S S/I R R I/R S
Aislamiento de cianobacterias
R=Resistente; I= Intermedio; S=Sensible; Blanco=Dato
Se logr un mejor aislamiento del grupo no disponible o antibitico no aconsejable.
Oscillatoria sp.(1)
18 m
Lyngbya sp.(2)
25 m
Phormidium sp.(1)
1.5 m
Figura 4. Cianobacterias marinas asiladas y utilizadas en la determinacin de la actividad antimicrobiana. (1) Aisladas de
muestras de ostin (C. gigas); (2) Aisladas de tapete microbiano. Dibujo: Paulina Hernndez Moreno.
en el cual estn depositados dentro de la coleccin positivo. De los 6 antibiticos comerciales proba-
(Laboratorio de Biotecnologa de Microalgas de la dos, se seleccion al tienam por ser el antibitico
Universidad del Mar, Campus Puerto ngel), que mostr halos de inhibicin en todas las cepas
donde los nmeros romanos y arbigos indican utilizadas.
tambin el tipo de muestra. Los valores del halo de inhibicin del
efecto antimicrobiano de los extractos se mues-
Obtencin del extracto orgnico tran en la Tabla III. Los extractos de cianobacte-
rias de biomasa fresca y liofilizada obtenidos con
Se utilizaron cinco cepas de cianobacte- la mezcla de diclorometano:metanol (1:1) no
rias de las cuales se obtuvieron tres rplicas de mostraron actividad antimicrobiana contra
cada extracto -diclorometano, metanol y mezcla ninguna de las cepas bacterianas utilizadas en
de diclorometano:metanol (1:1)-. Se obtuvieron 9 este estudio. C. albicans fue la nica cepa que no
extractos para biomasa fresca y liofilizada por mostr sensibilidad a los extractos de las ciano-
cianobacteria, haciendo un total de 90 extractos a bacterias de biomasa en fresco ni liofilizada. En
probar dentro del estudio los extractos de cianobacterias de muestras
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Tabla II. Antibiticos probados para la seleccin del control positivo en los ensayos de actividad antimicrobiana en
cianobacterias amikacina (Am), ampicilina (Amp), cloramfenicol (Clo), gentamicina (Ge), tienam (Imi) y penicilina sdica
G (PeG).
Antibiticos
Nombre comercial amikacina ampicilina cloramfenicol gentamicina tienam penicilina G
Laboratorio Sector salud GRX Sector salud Schering-Plough MSD PISA
Concentracin 100 g/2 mL 250 mg 500 mg 120 mg/1.5 mL 500 mg/500 mg 5 MUI
Presentacin ampolleta cpsulas cpsulas sol. Inyectable suspensin inyectable sol. Inyectable
Principio activo sulfato de amikacina - westenicol garamicina imipenem/cilastatina penicilina G sdica
Tipo de antibitico penicilnicos-ndice penicilnicos-ndice a base de aminoglucosido otros antibiticos penicilnicos-ndice
teraputico teraputico cloranfenicol teraputico
fue la nica cianobacteria que produjo un efecto Los extractos de Limnothrix sp. (D), Lyngbya sp.
inhibitorio en E. coli; por otra parte, P. aeruginosa (D) y S. subsalsa (D-M) inhibieron el crecimiento
fue sensible a extractos de metanol en las ciano- de S. aureus, siendo sta ltima cianobacteria la
bacterias Oscillatoria sp. y Phormidium sp., S. que causo efecto en P. vulgaris en su extracto con
aureus fue sensible a Lyngbya sp. (D), Limnothrix diclorometano. Por otra parte, Oscillatoria sp. y
sp. (D) y a S. subsalsa (D-M), siendo sta ltima la Phormidium sp. fueron las nicas cianobacterias
que mostr un efecto inhibitorio en el crecimiento que en su extracto metanlico inhibieron el
de P. vulgaris en su extracto de diclorometano (D). crecimiento de P. aeruginosa, siendo Phormidium
En los extractos de cianobacterias de sp. (M), el nico extracto de cianobacterias que
muestras liofilizadas (ver Tabla III) , se observan form halo de inhibicin de crecimiento en E. coli.
halos de inhibicin mayores con respecto a los
extractos de muestras frescas. K. pneumoniae fue la Discusiones
cepa que mostr ms sensibilidad a extractos de
varias cianobacterias, Limnothrix sp. y Oscillatoria Aislamiento de cianobacterias
sp., en su extracto con diclorometano; y en mayor
grado a los extractos con metanol de Limnothrix Para el crecimiento de las cianobacterias
sp., Oscillatoria sp., Phormidium sp. y S. subsalsa. aisladas en ste estudio, se seleccion al medio de
Tabla III. Halos de inhibicin (dimetro en mm) del efecto antimicrobiano de extractos de cianobacterias de biomasa
fresca y liofilizada del ostin (C. gigas) del Estero El Cardn, B.C.S., Mxico.
Limnothrix sp. -. - - - . ND - -. - 8 -. - - -. - - -. 7 -
Lyngbya sp. -. - - -. - - -. - - -. - - -. - - -. - -
Oscillatoria sp. -. - - -. - - -. 7 7 ND ND 7 -. - - -. - -
Phormidium sp. - . - 6.5 -. - - -. - 6 -. - 8 -. - - -. - -
Spirulina subsalsa -. - - -. - - - . - 6.5 -. - - -. 8 - -. 6 -
1997). Por otra parte, la combinacin de las tado, esto es, que es efectiva para extraer un
tcnicas de dilucin seriada y el vaciado en placa, amplio intervalo de metabolitos secundarios de
permiti el aislamiento y desarrollo de las ciano- naturaleza polar (Newbold et al. 1999). Los
bacterias unicelulares, que por presentar un extractos preparados de muestras frescas (1.5 g)
desarrollo ms lento y aunque se sabe que las mostraron insignificante actividad antimicrobia-
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na en comparacin con los extractos crudos actividad antimicrobiana se encontr en los
obtenidos de biomasa liofilizada (1 g). Posible- extractos de biomasa en fresco y mayormente en
mente esto se deba, dado el alto contenido de biomasa liofilizada extrada con metanol, al igual
agua en las muestras frescas y menor cantidad de que en el trabajo de Torres-Ario (2001), donde se
biomasa real, las sustancias activas fueron dilui- observ inhibicin de crecimiento en P. aeruginosa
das y por tal mostraron baja actividad. Sin embar- y K. pneumoniae de biomasa liofilizada. De igual
go, tambin se ha observado que extractos meta- manera se ha observado que extractos de ciano-
blicos de biomasa en fresco han mostrado bacterias que han mostrado actividad antimicro-
ausencia de actividad antimicrobiana (Grupta y biana, tambin han inhibido el crecimiento y
Shrivastava, 1965). desarrollo de nauplios de Artemia sp. en ensayos
de toxicidad; y a su vez, stos mismos extractos
Bioensayos antimicrobianos mostraron un hombro caracterstico de toxinas
presentes en grupos de cianobacterias txicas,
La actividad antimicrobiana fue poco como se indica en Torres-Ario (2001) y que abre
representativa en este estudio, en cuanto al la pauta para posteriores estudios con cianobacte-
tamao de los halos de inhibicin; sin embargo se rias de diversos ambientes.
obtuvieron resultados preliminares que mues-
tran el potencial de dichos organismos y sto se Conclusiones
corrobora al presentar inhibicin en cepas como
K. pneumoniae, P. aeruginosa y S. aureus. Una de las Los resultados indican que la mayor
posibles causas para esta observacin es la poca actividad antimicrobiana se present en los
cantidad de biomasa usada en la extraccin, lo extractos obtenidos a partir de muestras liofiliza-
que ocasionara una baja concentracin del das con el metanol como disolvente, aunque los
principio activo. No obstante, s se observ mayor mayores halos de inhibicin se obtuvieron con
espectro de accin en comparacin con un trabajo extractos de diclorometano. Estos estudios
anterior (Torres-Ario, 2001), en donde slo se preliminares indican que los miembros de las
utilizaron muestras liofilizadas (0.4 g). Por otra cianobacterias pudieran actuar como organismos
parte, si se compara con trabajos como el de Ishida probiticos en cultivos de ostin del cual fueron
et al. (1997), quienes detectaron actividad en aisladas.
contra de S. aureus, la cantidad de biomasa de la A partir de los resultados encontrados, se
cianobacteria M. aeruginosa fue exageradamente vislumbra la posibilidad de que las cianobacterias
alta (120 g) en relacin a la cantidad de biomasa aisladas en este trabajo, presenten mayor activi-
empleada en este trabajo. En estudios como los dad antimicrobiana, empleando otros disolven-
de Mason et al. (1982) y Patterson et al. (1994), tes y cambiando las estrategias de extraccin.
utilizaron cantidades bajas de biomasa (menores
de 1 g) y encontraron actividad antibacteriana. Agradecimientos
Como se mencion anteriormente, la capacidad
del disolvente utilizado en la extraccin (y sus Agradezco a la Dra. Graciela Guerra Rivas
caractersticas qumicas), tiene que tomarse (Laboratorio de Farmacognosia y Toxicologa
mucho en cuenta. La seleccin de la mezcla de Marina) y a la Dra. Elizabeth Orellana C. (Labora-
diclorometano:metanol (1:1) se bas en el proce- torio de Fitoplancton Marino) de la Universidad
dimiento descrito por Newbold et al. (1999) en Autnoma de Baja California, por las facilidades
donde encontraron actividad antibacteriana de otorgadas para la realizacin del presente trabajo.
Ciencia y Mar
metabolitos secundarios con naturaleza polar. A la alumna de servicio social Paulina Hernndez
Por su parte, Grupta y Shrivastava (1965) repor- Moreno por la realizacin de los dibujos y al Prof.
tan ausencia de actividad antimicrobiana al Derek Joe Brockett y al M. en C. Carlos G.
utilizar metanol como disolvente, siendo contra- Argelles Arredondo por la traduccin del
rio a lo encontrado en ste trabajo, en donde la resumen (UMAR-Campus Puerto ngel). Dicho
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