Purification et caractrisation de la phosphatase acide de la luzerne

Par:
Ludwig Hotz (HOTL25119601) ludwighotz@gmail.com - **
Tommy Malaret (MALT26099605) - tommy.malaret@gmail.com - **

**Pavillon des SB, 141 Avenue du Prsident-Kennedy, Montral, Canada, H2X 1Y4
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BIA3020 Travail prsent

Mthodologie biochimique Franois Ouellet

Purification et caractrisation de la phosphatase acide de germes de

luzernes (Medicago sativa)

Par :
Ludwig Hotz (HOTL25119601)
Tommy Malaret (MALT26099605)

Universit du Qubec Montral

Dpartement des Sciences biologiques
09 Juin 2017
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Rsum :

Dans cette tude, la purification et la caractrisation de la phosphatase acide de germes de

luzerne (Medicago sativa) ont t effectues. La purification comprenait la prcipitation
fractionnelle au sulfate dammonium et deux chromatographies, une chromatographie
dhydrophobicit (Tert-Butyl) et daffinit (ConcavalineA). Lenzyme a t purifi jusqu un
facteur 4.516 avec une activit spcifique de 12.623 U/mg de protines. Le pH optimal est de
5.5 et la temprature optimale pour la fraction la plus pure de 50C. Le coefficient de
dnaturation thermique est -0.032 min-1 et lnergie dactivation de 55.105 kJ.mol-1. Le Km et
Vmax pour le pNPP est de 0.412 M et 76.336 U/mg. Le poids molculaire, selon le gradient
de glycrol, est de 104.604 kDa.
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Introduction :

Les phosphatases sont des enzymes trs importantes dans la plupart des processus de rgulation
cellulaire. Elles inversent laction des protines kinases en catalysant une raction hydrolytique
afin denlever les groupements phosphates des chanes latrales de la protine. Certaines
peuvent tre des protines transmembranaires alors que dautres sont totalement intracellulaires
(Pratt et Cornely, 2012 ; Ingebritsen et Cohen, 1983).

Selon le milieu dans lequel elles oprent, il est possible de catgoriser les phosphatases en deux
groupes : les phosphatases alcalines, qui agissent dans un milieu basique, et les phosphatases
acides (Apase), qui agissent en milieu acide (Duff et aL, 1994).

Ces dernires jouent un rle trs important chez les plantes. Elles diffrent de celles retrouves
chez les animaux car elles prsentent une activit pyrophosphate phosphohydrolase. Plusieurs
formes de lenzyme ont t trouves selon lespce de plante tudie (Baker et Takeo, 1973).
Elles interviennent, sous certaines conditions, dans la mobilisation des rserves nutritives, le
transport actif des sucres ou dautres lments, travers les membranes, la diffrenciation des
plastides et dans le dbut et le dveloppement de la snescence (Baker et Takeo, 1973). Mais
le processus le plus important dans lequel ces protines sont impliques est celui concernant
lacquisition du phosphore. Ce dernier est lun des nutriments les plus important et prsent
intervenant dans la croissance des plantes. Il joue un rle dans les transferts dnergie, la
rgulation mtabolique, et est un important constituant de nombreuses biomolcules. Son
assimilation, stockage et utilisation sont donc essentiels pour la plante (Duff et aL, 1994). Ce
sont les phosphatases qui permettent lhydrolyse du phosphore (Duff et aL, 1994). Les
phosphatases alcalines sont gnralement trs spcifiques dun substrat, ce qui nest
normalement pas le cas des phosphatases acides. On retrouve alors deux catgories pour ces
dernires : celles prsentant une activit non spcifique, et les spcialises. Les premires
agissent pour une large varit despce et de tissus et prsentent une grande diversit
concernant leurs proprits physiologiques. Elles semblent cependant trs importantes dans la
production, le transport et le recyclage du phosphore. Tandis que celles plus spcialises
prsentent une certaine spcifi pour un substrat et interviennent plus pour des fonctions
mtaboliques (Duff et aL, 1994). De par leur grande diversit, il est difficile de dterminer
leur(s) rle(s) physiologique prcis. Les APases extracellulaires sont localises dans les parois
membranaires, et/ou scrtes par les racines dans la rhizosphre environnante. Elles sont
impliques dans lhydrolisation et la mobilisation du phosphore (forme Pi), partir du
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phosphate organique, dans le sol afin de nourrir la plante (Duff et aL, 1994). Les phosphatases
acides jouent ce rle car lextrmit des racines est acidifie (Duff et aL, 1994). Les APases
intracellulaires, quant elles, sont retrouves dans diffrents stades de dveloppement des
graines : durant la dormance, leur dveloppement et leur germination, ainsi que dans les
feuilles, tiges, racines, fleurs et dans les tubercules (Duff et aL, 1994). Elles sont prsentes
presque intgralement dans les vacuoles cellulaires. En effet, tant donn que le phosphore en
excs peut tre stock dans ces vacuoles sous forme de Pi, lenzyme peut donc compartimenter
ce phosphore afin dviter des dommages cellulaires induits par une catalyse incontrle ou par
une accumulation des concentrations trop leves pouvant se rvles toxiques (Duff et aL,
1994)

Le but de cette exprience est dextraire, purifier et de caractriser une protine phosphatase
acide provenant dune plante, ici la luzerne.
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Rsultats :

1. Extraction et purification de la phosphatase acide de la luzerne

Le tableau 1 prsente un sommaire de la purification de la phosphatase acide de la luzerne. Il
montre que la quantit de protine diminue, de 246.645 mg 4.219 mg, au fur et mesure que
la purification avance. Lactivit spcifique augmente quant elle au cours de la purification,
avec 2.795 U/mg 12.623 U/mg de protines. la fin de a purification, aprs la dernire
chromatographie, le facteur de purification tait de 4.516.

a. 1re tape chromatographique : Ter-butyl spharose

2.5

2
Absorbance

1.5

0.5

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Nombre de tubes
Chargement Lavage lution

Figure 1 : Profil chromatographique de la fraction F2 sur colonne Tert-Butyl pour la purification

de la phosphatase acide de la luzerne (Medicago sativa)
Lajout de la fraction F2 sest fait au tube 1, puis le lavage a dbut lajout du tampon actate 0,1 M pH 5 au
tube 48. Llution a commenc au tube 108 avec un gradient de sulfate dammonium de 1.5 M 0 au tube 166. Le
gradient fut ralis avec la solution de sulfate dammonium 1.5 M avec du tampon actate 100 mM ph 5. Le
volume total de rsine tait de 10 ml pour une capacit de la colonne 15 mg/ml. Le volume de fraction tait de
29.7 ml pour une concentration protique de 6.55 mg/ml. Le dbit dlution tait de 2 ml/min. Le dosage de
lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5, du pNP 5 mM et 25 l de solution enzymatique, pour un
volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-
incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 minutes de raction 37C. Labsorbance fut
dtermine 405 nm. Le dosage protique sest fait par absorption 280 nm. Les points carrs reprsentent le
dosage protique alors que les points ronds reprsentent le dosage enzymatique.
La chromatographie dinteraction hydrophobe spare les protines en fonction de leur caractre
hydrophobe. En effet ces dernires cherchent plutt sassocier entre elles quaux molcules
deau. Les protines sont lies une phase stationnaire (ici la rsine Ter-butyl spharose) dans
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un tampon de force ionique lev et sont lues avec un gradient de sel la baisse (Ritchie,
2012).

La figure 1 montre le profil chromatographique de lchantillon F2 sur la colonne Tert-Butyl.

Il est possible dobserver une lgre activit enzymatique ainsi quune augmentation de la
concentration en protine lors du chargement de lchantillon sur la colonne. Cette
concentration protique est conserve lors du lavage contrairement lactivit enzymatique qui
est nulle. Enfin lors de llution, il est possible dobserver une augmentation massive de la
concentration protique et de lactivit enzymatique, jusqu mme saturation de labsorbance
3.

b. 2e tape chromatographique : Concanavaline A (ConA)

3
2.8
2.6
2.4
2.2
2
1.8
Absorbance

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Nombres de tubes
Chargement Lavage lution

Figure 2 : Profil chromatographique de la fraction F3 sur colonne ConcavalineA pour la

purification de la phosphatase acide de la luzerne (Medicago sativa)
Lajout de la fraction F3 sest fait au tube 1, puis le lavage a dbut lajout du tampon actate 0,1 M pH 5
contenant du NaCl 500 mM, du MgCl2 1 mM et du CaCl2 1 mM, au tube 21. Llution a commenc au tube 50
avec 25 ml de -D-mthylmannoside 200 mM. Le volume total de rsine tait de 1,5 ml pour une capacit de la
colonne 20 mg/ml. Le volume de fraction tait de 27 ml pour une concentration protique de 0,92 mg/ml. Le
dbit dlution tait de 2 ml/min. Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5, du pNP
5 mM et 25 l de solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na 2CO3 0.2 M.
Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10
minutes de raction 37C. Labsorbance fut dtermine 405 nm. Le dosage protique sest fait par absorption
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280 nm. Les points carrs reprsentent le dosage protique alors que les points ronds reprsentent le dosage
enzymatique.
La chromatographie daffinit repose sur une des proprits des protines qui est leur capacit
lier des molcules spcifiques de manire troite mais de faon non covalente. On utilise alors
un ligand qui peut se lier spcifiquement une protine dintrt. Celui-ci est fix sur une
matrice inerte et poreuse. Donc lorsquun chantillon passe travers la colonne, la protine
dsire se lie au ligand qui est immobilis tandis que le reste nest pas retenu et sen va avec le
tampon. La protine peut ensuite tre rcupre sous une forme purifie en changeant les
conditions dlution (pH, force ionique ) afin quelle soit relche de la matrice (Voet et
Voet, 2005). Dans le cas prsent la matrice utilise est la Concanavalin A (ConA), une lectine
capable de lier les sucres et certaines glycoprotines. Si la protine prsente ces lments elle
sera retenue par la matrice (Neilson Boyd et Morrison, 1976).
La figure 2 montre le profil chromatographique de lchantillon F3 sur la colonne ConA. Il est
possible dobserver, encore, une lgre activit enzymatique ainsi quune augmentation
importante de la concentration en protine lors du chargement de lchantillon sur la colonne.
Cette concentration protique diminue au fur et mesure du lavage et lactivit enzymatique
quant elle reste proche du 0 jusqu la fin du lavage o elle latteint. Enfin lors de llution, il
est possible dobserver une augmentation massive de lactivit enzymatique, jusqu mme
saturation de labsorbance 3 et une augmentation de la concentration protique faible
comparativement celle observ dans la figure 1.

2. Caractrisation de la phosphatase acide de la luzerne pour F1 et F4

a. La temprature optimale
La figure 3 montre lactivit enzymatique des deux fractions en fonction de la temprature. Il
est possible dobserver une augmentation de lactivit progressive jusqu une temprature de
55C pour F1 et 50C pour F4, cela correspond leurs temprature optimale. Pass la
temprature optimale, lactivit chute jusqu presque devenir nulle.

b. Le pH optimal
La figure 4 montre lactivit enzymatique des deux fractions en fonction du pH. Comme pour
la figure 3, il est possible dobserver une augmentation de lactivit jusqu un pH de 5 pour les
deux fractions, cela correspond leurs pH optimal. Pass ce pH, lactivit chute
vertigineusement. Deux tampons furent utiliss pour couvrir la gamme de pH et le point
commun tait 5.5 qui ne prsentaient pas de diffrence significative entre les tampons.
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c. La linarit en conditions optimales

La figure 5 permet dapprcier la linarit en conditions optimales des fractions avec une pente
plus importante pour F4.

d. Le coefficient de dnaturation thermique

La figure 6 permet dobserver lactivit relative rsiduelle aprs la pr-incubation des fractions
temprature dnaturante. Daprs le graphique, le coefficient de dnaturation thermique de F1
est -0.0224 min-1 et celui de F4 est de -0.032 min-1.

e. Km et Vmax
La figure 7 correspondant la reprsentation de Lineweaver-Burk permet dobtenir le Km et
Vmax des fractions F1 et F4. Il est possible de voir que la pente de F1 est suprieure celle de
F4 et cela se traduit donc par un Km et Vmax infrieur avec 0.223 M et 6.010 U/mg contre
0.412 M et 76.336 U/mg pour la fraction F4.

f. nergie dactivation
La figure 8 reprsentant le graphique dArrhenius permet la dtermination de lnergie
dactivation. Et grce la pente des courbes de tendances, on obtient lnergie dactivation de
F1 qui est de 46.390 kJ.mol-1 et de F4 qui est de 55.105 kJ.mol-1.

g. Ki des inhibiteurs (Fructose-6-phosphate et Chlorure de mercure)

La figure 9 est une reprsentation de Lineweaver-Burk du dosage de F1 sans inhibiteurs et avec
lun des deux inhibiteurs, concentration I50. Selon lquation de la courbe de tendance, le Ki
obtenu pour le chlorure de mercure (II) est de 8.777 M et celui du fructose-6-phosphate 57.694
mM. La figure 10 est une reprsentation de Lineweaver-Burk du dosage de F1 sans inhibiteurs
et avec lun des deux inhibiteurs, concentration I50. Selon lquation de la courbe de tendance,
le Ki obtenu pour le chlorure de mercure (II) est de 0.5 M et celui du fructose-6-phosphate
177.9 mM.

Il est possible de remarquer que selon la fraction, les deux inhibiteurs passent de incomptitifs
non-comptitifs.

h. Gradient de glycrol
Le gradient de glycrol permet de dterminer le poids molculaire de la phosphatase acide afin
de lidentifier. Daprs le tableau 2, le poids molculaire de la phosphatase acide est 104.604
kDa.
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Discussion :
Les phosphatases acides dorigine vgtale sont impliques dans le mtabolisme du phosphate
en convertissant le phosphore organique en phosphore assimilable par la plante (Duff et aL,
1994).

Le prsent rapport portera sur les rsultats obtenus pour lextraction, la purification et la
caractrisation de la phosphatase acide extraite de la luzerne (Medicago sativa).

Tout dabord, lenzyme est extraite (fraction F1) et purifie par prcipitation fractionne au
sulfate dammonium [(NH4)SO4]. Cette technique permet la sparation de la protine dintrt
des autres protines dans un une solution. Elle repose sur la solubilit diffrentielle des
protines. En effet, ces dernires ont tendance prcipiter plus ou moins rapidement lorsque la
force ionique de la solution, o elles sont contenues, varie. Dans le cas prsent, on utilise un
gradient descendant, avec une concentration initiale en sel leve, afin de faire prcipiter les
protines en dshydratant celles-ci. Cela rduit leur solubilit permettant alors la prcipitation
(Wingfield, 2001). Suite ce processus, on obtient la fraction F2.

La premire chromatographie est une chromatographie dinteraction hydrophobe avec Ter-

butyl spharose. Elle spare les protines en fonction de leur caractre hydrophobe. En effet,
ces dernires cherchent plutt sassocier entre elles quaux molcules deau. Les protines
sont lies une phase stationnaire (ici, la rsine Ter-butyl spharose) dans un tampon de force
ionique lev et sont lues avec un gradient de sel la baisse (Ritchie, 2012). Figure 1 permet
dobserver le profil de cette chromatographie pour la fraction F2. Le premier pic correspond au
passage de toutes les protines qui ne sont pas spcifiques la rsine. De plus pour confirmer
cela, il est possible de voir que pour ce mme pic il na aucune activit enzymatique, ce qui
veut bien dire que la protine dintrt nest pas prsente. La phosphatase acide se situe dans
le pic dlution. De mme, il est possible de confirmer cela grce au pic dactivit enzymatique
correspondant au pic dlution, ce que montre que lon est bien en prsence de la phosphatase
acide. La fraction obtenue correspond ici la F3.

La seconde chromatographie est une chromatographie daffinit. Elle repose sur une des
proprits des protines qui est leur capacit lier des molcules spcifiques de manire troite,
mais de faon non covalente. On utilise alors un ligand qui peut se lier spcifiquement une
protine dintrt. Celui-ci est fix sur une matrice inerte et poreuse. Donc lorsquun chantillon
passe travers la colonne, la protine dsire se lie au ligand qui est immobilis tandis que le
reste nest pas retenu et sen va avec le tampon. La protine peut ensuite tre rcupre sous
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une forme purifie en changeant les conditions dlution (pH, force ionique ) afin quelle soit
relche de la matrice (Voet et Voet, 2005). La figure 2 permet galement de voir, comme pour
la premire figure, que la protine a correctement t retenue par la membrane et est rcupre
sous forme purifie lors de llution. Cest donc la fraction finale, la F4.

Le tableau 1 prsente les rsultats obtenus pour les diffrentes tapes de la purification. Afin de
juger des rsultats obtenus et de lactivit de la phosphatase acide prsente pour chaque fraction,
une comparaison avec la littrature a t ralise.

De manire gnrale, la tendance est similaire, mais la quantit de protine obtenue est plus
faible que dans la littrature ainsi que lactivit totale et spcifique. Par exemple, larticle
dOlczak et al prsente une activit spcifique, pour la fraction finale, 75 fois suprieure celle
obtenue lors de lexprience. De plus selon les articles le taux de purification est de 40 4000
fois plus lev. Cependant concernant le pourcentage de rendement, les rsultats obtenus
semblent suivre ceux de la littrature (Olczak et al, 1997 ; Verjee, 1969 ; Roknabadi et al,
1999 ; Duff et al, 1994). Cependant, il faut noter que le matriel vgtal utilis nest pas le
mme, que les conditions dexprimentations varient entre chaque article ainsi que la quantit
dchantillons utiliss. Il est aussi possible de remarquer que le rendement augmente entre la
fraction F1 et F2, ce qui devrait normalement tre le contraire au vu de la littrature. Cela peut
sexpliquer par le fait que la fraction F1 est la fraction brute et que lactivit de lenzyme est
peut tre inhibe par dautres protines ou composants prsent dans la solution brute, mais
absente de la fraction F2, do un rendement plus lev. Dans le cas prsent, lactivit
enzymatique augmente bien au fur et mesure que la fraction est purifie. Le choix de la
prcipitation au sulfate dammonium tait galement celui recommand par la littrature dans
le cas dun matriel vgtal semblable la luzerne, car elle permet une meilleure purification
de la phosphatase acide prsente dans des parties vgtales qui contiennent une grande quantit
de lipides, comme les graines (Greiner and Jany, 2003).

Les rsultats obtenus pour la caractrisation sont semblables ceux trouvs dans la littrature.
Pour la temprature optimale, elle est de 55C pour la F1 et 50C pour la F4. Cela concorde
bien avec les articles qui montrent un pic dactivit variant entre 45 et 55C (Hegeman and
Grabau, 2001 ; Verjee, 1969). La diffrence de 5C entre les tempratures optimales obtenues
pour la F1 et la F4 peut sexpliquer par la prsence dautres protines dans la fraction F1. Par
exemple de protines de choc thermique. Ces dernires sont impliques dans la stabilisation des
protines lorsque la temprature augmente (Vierling, 1991), ce qui expliquerait pourquoi la
temprature optimale de la F1 est plus leve. Ceci peut tre appuy par le fait que sur la figure
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3, il est possible de voir que lors des tests raliss 65 et 70C, lactivit enzymatique est plus
leve pour la F1, que pour la F4 (respectivement 40% contre 5 % dactivit enzymatique
65C et 20% contre 0% dactivit enzymatique 70C), surement cause de la prsence de
protines de choc thermique qui stabiliseraient lactivit de la phosphatase acide.

Concernant le pH optimal, il est de presque 5.5 pour la F1 et 5.5 pour la F4 (on retiendra 5.5
pour les deux fractions). Cela concorde aussi avec la littrature qui montre bien que lactivit
enzymatique optimale de la phosphatase acide se situe pour un pH variant entre 5 et 6 C
(Hegeman and Grabau, 2001 ; Verjee, 1969 ; Joyce and Grisolia, 1960). La petite diffrence de
pH optimal entre les deux fractions peut sexpliquer par le fait que les phosphatases acides
possdent des isoformes. Or ces derniers se ressemblent troitement, tant donn que ce ne sont
que des variantes (Greiner et Jany, 2003). Cela peut galement tre une hypothse afin
dexpliquer la diffrence de temprature optimale entre les deux fractions. Les isoformes
possdent une activit enzymatique optimale pour un pH et une temprature diffrents. Cest
dailleurs ce quil est possible de voir grce la figure 6 qui prsente le coefficient de
dnaturation thermique. Il est possible de voir que les courbes diffrent entre F1 et F4. En effet,
lactivit enzymatique prsente dans la fraction F1 supporte bien mieux la chaleur, et ce pour
une plus longue dure, que la fraction F4, ce qui laisse deux possibilits : la prsence de
protines de choc thermique comme dit plus haut, ou la prsence de deux isoformes diffrents
dans les deux fractions.

La figure 5 reprsente la linarit en conditions optimales de la phosphatase acide. Cela sert

vrifier, durant lexprience, que lactivit enzymatique au cours du temps. Au vu des droites
et des R il est tout fait possible de dire que les activits enzymatiques sont bien linaires pour
les deux fractions.

Concernant la cinmatique enzymatique, les paramtres tels que le Km et Vmax ont t calculs
grce lhydrolyse dun compos phosphoryle, le pNPP. Le Km reprsente laffinit de
lenzyme pour son substrat, tandis que la Vmax, reprsente la vitesse maximale atteinte par
lenzyme dans des conditions donnes (Voet et Voet, 2005). Demble, il est possible de voir
que les valeurs obtenues pour F1 sont bien plus faibles que celles obtenues pour F4. Cela veut
donc dire que lensemble protique prsent dans la fraction F1 est peu compatible avec le pNPP
et que la vitesse maximale est atteinte trs rapidement. Tandis que pour la fraction purifie, les
rsultats sont beaucoup plus levs, ce qui dnote une forte affinit avec le substrat. De plus, la
Vmax met plus de temps tre atteinte, prouvant une bonne compatibilit entre lenzyme et le
substrat. Les rsultats obtenus pour la fraction purifie correspondent bien avec la littrature.
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Par exemple dans larticle de Gonnety et al de 2006 le Km obtenu pour lune des phosphatases
acides, avec pour le substrat le pNPP, est de 0.49 M et la Vmax de 58.84 U/mg, ce qui est trs
proche des rsultats obtenus, savoir 0.412 M et 76.336 U/mg.

La figure 8 concerne lnergie dactivation, soit le niveau dnergie minimal ncessaire pour
dbuter une raction chimique, ici lhydrolyse du pNPP. La fraction F1 ncessite moins
dnergie que la F4 afin damorcer lhydrolyse du pNPP. Mais au vu de la diffrence, celle-ci
est ngligeable. De manire gnrale, cela correspond bien avec la littrature. En effet, larticle
de Waymack et Etten (1991), montre que pour un pH de 5, comme dans le cas prsent, lnergie
dactivation quils ont calcul est de 12.3 kcal-mol-1, soit 51.5 kJ-mol-1, ce qui se rapproche
bien des valeurs obtenues. Afin de renforcer cet exemple, il est galement possible de citer
larticle de Roknabadi et al, 1999. En effet, lnergie dactivation quils ont calcul pour leur
phosphatase acide est de 9.8 kcal mol-1, soit 41 kJ-mol-1.

Le tableau 2 prsente le poids molculaire calcul partir dun gradient de glycrol. Le poids
obtenu est de 104.6 kDa. Au vu de la littrature, il sagit bien dune phosphatase acide. En effet
car dans larticle de Olczak et al, datant de 1997, ils ont purifi un extrait de lupin jaune, une
plante appartenant la mme famille que la luzerne, et ils ont identifis plusieurs phosphatases
acides, dont le poids molculaire tourne aux alentours de 95-100 kDa.

Et enfin pour finir, les figures 9 et 10 reprsentent le Ki de chaque fraction pour les 2 substances
testes, savoir le fructose-6-phosphate (F6P) et le chlorure de mercure II (HgCl2). Au vu des
deux figures, il semble que les deux substances possdent un effet inhibiteur comptitif. Soit
lorsquun inhibiteur se lie une enzyme et empche le substrat de cette dernire de sy lier, le
substrat et linhibiteur sont alors en comptition pour le site actif de lenzyme. Pour les deux
fractions, le chlorure de mercure possde leffet inhibiteur le plus fort. En effet selon la
littrature le chlorure de mercure est un puissant inhibiteur (Olczak et al, 1997 ; Greiner and
Jany, 2003), pouvant avoir de forts effets ds lordre de 10-3 et 10-4 M. Concernant le F6P, il
na pas t trouv dexprience ou un rel effet inhibiteur a t prouv. Dans toute la littrature
trouve, il sagit dun substrat de la phosphatase acide. Ce qui semble logique, car la
concentration de F6P quil a fallu pour atteindre le IC50 tait beaucoup plus leve que celle
ncessaire pour le chlorure de mercure (Olczak et al, 1997).

En conclusion, la plupart des rsultats obtenus suivent la littrature existante, lexprience fut
un succs tant donn que lenzyme purifie est bien une phosphatase acide. Cependant, les
tests des substances nont pas pu tre ralis cause dun manque de temps.
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Matriel et mthode :
1. Courbes standard du dosage enzymatique et protique
a. Dosage enzymatique

Le substrat utilis pour le dosage enzymatique est le pNP. La courbe standard du pNP a t
tablie en utilisant du tampon actate 100 mM pH 5 et une concentration de pNP variant de 0
195 M pour un volume final de 1 ml. La solution darrt tait le Na2CO3 0.2 M. Les
absorbances furent mesures 405 nm.
b. Dosage protique

La courbe standard du dosage protique fut tablit selon la mthode de Lowry et al. partir de
BSA 100 g/ml.

2. Extraction et purification de la phosphatase acide de la luzerne (Medicago sativa)

Toutes les tapes impliquant la manipulation de lextrait enzymatique ou du matriel vgtal

furent effectues sur glace.

a. Extraction de la phosphatase acide : fraction F1

Lextraction de la phosphatase acide de luzerne dbuta par la production du tampon dextraction

(tampon actate 100 mM pH 5, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM et du PVPP 0.5%
(p/v)). Dans un homognisateur, il fallut ajouter la luzerne et le tampon dextraction selon un
ratio 1:2 (p/v). Aprs lhomognisation, lhomognat fut filtr travers une couche de
Miracloth et le filtrat fut centrifug 10000 rpm pendant 20 min. Le surnageant obtenu
constitue la fraction F1 soit lextrait enzymatique brut.
Une fraction de cet extrait fut conserve pour la caractrisation, une autre fraction fut conserve
pour les dosages enzymatique et protique et le reste fut purifi.
Le dosage de lactivit enzymatique fut effectu avec du tampon actate 0,1 M pH 5, du pNP
5 mM et 50 l de solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait
Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout
de la solution enzymatique, et entre 0 25 minutes de temps de raction 37C. Labsorbance
fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la moyenne des duplicatas.
Le dosage protique fut effectu selon les recommandations de Lowry et al.

b. Prcipitation fractionne au sulfate dammonium : fraction F2

Une prcipitation fractionne de la F1 a t effectue un pourcentage de saturation final de

40% de sulfate dammonium. Le mlange sest fait grce un agitateur magntique pendant 30
 15

minutes avant dtre centrifuge 10000 rpm pendant 30 min. Le surnageant obtenu a t
ensuite satur une seconde fois pour un pourcentage de saturation final de 80% de sulfate
dammonium. Le culot fut ensuite resuspendu dans du tampon actate 100 mM pH 5. La
solution a t recentrifuge 10000 rpm pendant 30 min, puis le culot fut resuspendu dans 20
ml de tampon de chromatographie, tampon actate 100 mM pH 5 et (NH4)SO4 1.5 M. Le culot
resuspendu constitue la fraction F2. Une fraction de cet extrait subit les dosages enzymatiques
et protiques selon les tapes du dosage de F1 et le reste subit une chromatographie.

c. Premire chromatographie, chromatographie dhydrophobicit Tert-butyl : fraction F3

La fraction F2 fut purifie par chromatographie, pour cela, la colonne fut prpare avec lajout
de 10 ml de rsine de Tert-Butyl pour une capacit de la colonne 15 mg/ml. Le dosage de
lactivit enzymatique se fit tous les 4 tubes selon la mme mthode que prcdemment mais
avec un temps de raction de 5 min pour 25 l de solution enzymatique. Le dosage protique
fut effectu par la mthode des absorbances 280 nm de Warburg et Christian. La fraction F2
fut alors charge contre la rsine avec un dbit de 2 ml/min. Lorsque lchantillon fut pass
compltement et que les dosages dactivit enzymatique et dosage protiques montraient que
la phosphatase ne stait bien accroche la colonne, le lavage a dbut par lajout du tampon
actate 0,1 M pH 5. Aprs les dosages dactivit enzymatique et dosage protiques montraient
que la phosphatase tait toujours accroche la colonne, llution commena avec un gradient
descendant de sulfate dammonium de 1.5 M 0. Le gradient fut ralis avec la solution de
sulfate dammonium 1.5 M avec du tampon actate 100 mM ph 5. Aprs confirmation que
tout lextrait tait purifi, les tubes slectionns ayant une bonne activit enzymatique furent
runis pour former F3.

d. Dyalise

La fraction F3 fut dyalis avant de passer la seconde chromatographie. Pour cela, la membrane
fut hydrate, en la faisant bouillir dans une solution de sodium bicarbonate 2% (p/v) et 1 mM
EDTA pH 8 dans 4 litres deau distille. F3 fut charg dans la membrane hydrate et le sac
dyalise fut plac dans un bcher avec agitateur magntique pendant 1 heure.

e. Seconde chromatographie, chromatographie affinit Concanavaline A : fraction F4

Par la suite, la fraction F3 fut purifie par chromatographie ConA. La colonne fut quilibre
avec 1.5 ml de rsine ConA pour une capacit de la colonne de 20 mg/ml. Les dosages
correspondent ceux effectus la premire chromatographie. Le tampon utilis pour cette
chromatographie tait du tampon actate de sodium 100 mM pH 5 avec 100 mM de NaCl, de
 16

CaCl2 et de MgCl2. Lchantillon fut charg sur la colonne avec un dbit de 2 ml/min. Lorsque
le lavage arriva, du tampon actate 0,1 M pH 5 contenant du NaCl 500 mM, du MgCl2 1 mM
et du CaCl2 1 mM fut ajout. Llution commena avec lajout de 25 ml de -D-
mthylmannoside 200 mM.

3. Caractrisation de la phosphatase acide de la luzerne pour F1 et F4

a. Dtermination de la temprature optimale et nergie dactivation

La temprature optimale a t dtermine en faisant le dosage enzymatique selon diffrentes

tempratures, de 30C 75C. Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min,
avant lajout de la solution enzymatique, et 10 min de raction leurs tempratures respectives
et labsorbance fut dtermine 405 nm.

b. Dtermination du pH optimal

Le pH optimal a t dtermin en faisant le dosage enzymatique selon diffrents pH, de 3.5

7.5, temprature optimale pour chaque fraction. La gamme de pH fut couverte avec les
tampons actate 100 mM et Tris-Malate 100 mM. Les diffrents chantillons ont subi une pr-
incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 min de raction leurs
tempratures optimales respectives et labsorbance fut dtermine 405 nm.

c. Dtermination de de la linarit en conditions optimales

Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP 5 mM et 50
l de solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3
0.2 M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la
solution enzymatique, et entre 0 25 minutes de raction 55C pour F1 et 50C pour F4.
Labsorbance fut dtermine 405 nm.

d. Dtermination du Km et Vmax

Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP une
concentration variant entre 0 et 1.2 mM et 50 l de solution enzymatique, pour un volume finale
de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-
incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 minutes de raction 55C
pour F1 et 50C pour F4. Labsorbance fut dtermine 405 nm.
 17

e. Dtermination du coefficient de dnaturation thermique

Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP 5 mM et 50
l de solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3
0.2 M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la
solution enzymatique. La solution enzymatique a subi une dnaturation thermique 60C pour
F1 et 55C pour F4 de 0 30 minutes avant dtre dos. Labsorbance fut dtermine 405 nm.

f. Dtermination de leffet de substances affectant lactivit de la phosphatase acide

Les substances suivantes furent testes diffrentes concentrations afin de dterminer si elles
affectaient lactivit de la phosphatase acide. Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon
actate 0,1 M pH 5.5, du pNP 5 mM, 50 l de solution enzymatique et une concentration
dinhibiteur tester, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M.
Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution
enzymatique. Labsorbance fut dtermine 405 nm.

g. Dtermination du I50 du fructose -6-phosphate et du chlorure de mercure (II)

LI50 des inhibiteurs fut dtermin par rapport labsorbance des fractions sans inhibiteur
obtenue lors du dosage de lactivit enzymatique. LI50 fut dtermin en faisant varier la
concentration de linhibiteur et en dosant par la mthode de dosage enzymatique standard.

h. Dtermination du Ki des inhibiteurs

Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP une
concentration variant entre 0 et 1.2 mM, lun des inhibiteurs, chlorure de mercure (II) 20 M
ou fructose-6-phosphate 62.103 M et 50 l de solution enzymatique, pour un volume finale
de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-
incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 minutes de raction 55C
pour F1 et 50C pour F4. Labsorbance fut dtermine 405 nm.

i. Gradient de glycrol

Un volume de 0,5 ml de la fraction F1 et F4 ont migrs dans un gradient de glycrol afin de

dterminer le poids molculaire (PM) de ces dernires ltat natif. Le pourcentage de sel a t
dtermin grce un rfractomtre.
 18

Graphiques et tableaux :
3. Extraction et purification de la phosphatase acide de la luzerne

Tableau 1 : Purification de la phosphatase acide de la luzerne (Medicago sativa)

Concentration Quantit Act. Act. Act.

Volume Facteur de Rendement
Fraction protique protine relative Totale spcifique
(ml) purification (%)
(mg/ml) (mg) (U/ml) (U) (U/mg)
F1 1218 0.203 246.645 0.566 689.360 2.795 1.000 100

F2 29.7 6.550 194.535 24.157 717.474 3.688 1.320 104%

F3 27 0.920 24.840 5.318 143.590 5.781 2.068 21%

F4 10.6 0.398 4.219 5.024 53.254 12.623 4.516 8%

Lgende : les donnes de ce tableau furent rcoltes au fur et mesure de la purification de la phosphatase acide.
La fraction F1 reprsente lextrait brut, F2 reprsente lextrait obtenu aprs prcipitation au sulfate dammonium.
La fraction F3 reprsente lextrait obtenu aprs la premire chromatographie sur colonne Tert-Butyl et F4 aprs la
seconde chromatographie sur colonne ConcavalineA. Le volume fut mesur avant deffectu les diffrents
dosages. La concentration protique et la quantit de protines furent obtenues aprs dosage protiques et lactivit
relative et totale aprs dosage enzymatique avec pNPP.

4. Caractrisation de la phosphatase acide de la luzerne pour F1 et F4

a. La temprature optimale

100

80
Activit (%)

60

40

20

0
30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Temprature (C)
F1 F4

Figure 3 : Effet de la temprature (30C 75C) sur lactivit de la phosphatase acide

Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5, du pNP 5 mM et 50 l de solution
enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na 2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons
ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 min de raction des
tempratures comprises entre 30 et 75C. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la
moyenne des duplicatas.
 19

b. Le pH optimal

100

80
Activit (%)

60

40

20

0
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
pH
F1 F4

Figure 4 : Effet du pH (3.5 7.5) sur lactivit de la phosphatase acide

Le dosage de lactivit fut tabli avec les tampons actate de sodium 0.1 M et tris-malate 0.1 M pour couvrir une
fourchette de pH de 3.5 7.5, du pNP 5 mM et 50 l de solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La
solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout
de la solution enzymatique, et 10 min de raction 55C pour F1 et 50C pour F4. Labsorbance fut dtermine
405 nm et chaque point reprsente la moyenne des duplicatas.

c. La linarit en conditions optimales

2.5
Densit optique (405 nm)

y = 0.0695x
2
R = 0.9864

1.5
y = 0.0623x
1 R = 0.99

0.5

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (minutes)
F1 F4

Figure 5 : Dtermination de la linarit en conditions optimales de la phosphatase acide

Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP 5 mM et 50 l de solution
enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons
ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et entre 0 25 minutes de raction
55C pour F1 et 50C pour F4. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la moyenne
des duplicatas.
 20

d. Le coefficient de dnaturation thermique

Temps (minutes)
0
0 5 10 15 20 25 30
-0.1

-0.2

-0.3
Log (U/U0)

-0.4
y = -0.0224x
-0.5

-0.6 y = -0.032x
-0.7

-0.8
F1 F4

Figure 6 : Inactivation thermique de la phosphatase acide

Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP 5 mM et 50 l de solution
enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons
ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique. La solution enzymatique a subi une
dnaturation thermique 60C pour F1 et 55C pour F4 de 0 30 minutes avant dtre dos. Labsorbance fut
dtermine 405 nm et chaque point reprsente la moyenne des duplicatas.

e. Km et de Vmax
1

0.8 y = 0.0362x + 0.1675

R = 0.988
0.6
1/V

0.4
y = 0.0055x + 0.0123
R = 0.9771
0.2

0
-6 -3 0 3 6 9 12 15 18 21 24
-0.2
1/[S]
F1 F4

Figure 7 : Dtermination du Km et Vmax des fractions F1 et F4 avec la reprsentation de

Lineweaver-Burk
Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP une concentration variant entre
0 et 1.2 mM et 50 l de solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2
M. Les diffrents chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et
10 minutes de raction 55C pour F1 et 50C pour F4. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point
reprsente la moyenne des duplicatas. Le Km et le Vmax obtenu pour F1 est de 0.223 M et 6.010 U/mg. Le Km et
le Vmax obtenu pour F4 est de 0.412 M et 76.336 U/mg.
 21

f. Energie d'activation
1.2
y = -2892.2x + 10.082
R = 0.9084
1

0.8
Log Vmax app

0.6

0.4

y = -2434.8x + 8.107
0.2
R = 0.8602

0
0.00302 0.00307 0.00312 0.00317 0.00322 0.00327 0.00332
1/T (K-1)
F1 F4

Figure 8 : Dtermination de lnergie dactivation des fractions F1 et F4 avec le graphique

dArrhenius
Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5, du pNP 5 mM et 50 l de solution
enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na 2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons
ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 min de raction des
tempratures comprises entre 30 et 55C. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la
moyenne des duplicatas. Lnergie dactivation de F1 est de 46.390 kJ.mol -1 et de F4 est de 55.105 kJ.mol-1.

g. Gradient de glycrol
Tableau 2 : Poids molculaire de la phosphatase acide dtermin par gradient de glycrol
Poids Molculaire
Tube D.O. 280 nm Indices de Rfraction Log Poids Molculaire
(kDa)
17 2.949 30.5 2.01955 104.604411

h. Ki du Fructose-6-phosphate et Chlorure de mercure

 22

2.5
y = 0.2003x + 0.3475
R = 0.9314
2

y = 0.0364x + 0.5428
1.5 R = 0.7259
1/V

0.5 y = 0.0362x + 0.1675

R = 0.988

0
-15 -10 -5 0 5 10 15 20

-0.5
1/[S]
Sans Inhibiteurs Chlorure de Mercure(II) Fructose 6 phosphate

Figure 9 : Dtermination du Ki du chlorure de mercure (II) et du fructose-6-phosphate pour la

fraction F1 avec la reprsentation de Lineweaver-Burk
Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP une concentration variant entre
0 et 1.2 mM, lun des inhibiteurs, chlorure de mercure (II) 20 M ou fructose-6-phosphate 62.103 M et 50 l de
solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents
chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 minutes de
raction 55C pour F1 et 50C pour F4. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la
moyenne des duplicatas. Le Ki obtenu pour le chlorure de mercure (II) est de 8.777 M et celui du fructose-6-
phosphate 57.694 mM.
 23

0.08
y = 0.0102x + 0.0341
R = 0.9868
0.07

0.06 y = 0.0056x + 0.0359

R = 0.9695
0.05

0.04
1/V

0.03 y = 0.0052x + 0.0169

R = 0.9705
0.02

0.01

0
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
-0.01
1/[S]
Sans Inhibiteurs Chlorure de Mercure(II) Fructose 6 phosphate

Figure 10 : Dtermination du Ki du chlorure de mercure (II) et du fructose-6-phosphate pour la

fraction F4 avec la reprsentation de Lineweaver-Burk
Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5.5, du pNP une concentration variant entre
0 et 1.2 mM, lun des inhibiteurs, chlorure de mercure (II) 0.5 M ou fructose-6-phosphate 200 M et 50 l de
solution enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents
chantillons ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et 10 minutes de
raction 55C pour F1 et 50C pour F4. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la
moyenne des duplicatas. Le Ki obtenu pour le chlorure de mercure (II) est de 0.5 M et celui du fructose-6-
phosphate 177.9 mM.
 24

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.
 26

Annexe :
1.2

1
Absorbance (405 nm)

0.8
y = 5.9013x
R = 0.9919
0.6

0.4

0.2

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2
Quantit de pNP (mol)

Figure 11 : Courbe standard du pNP ( 1 mM) pour le dosage enzymatique

Lgende : La courbe standard fut tablie partir de tampon actate 0,1 M pH 5 et une concentration de pNP
variant de 0 195 M pour un volume final de 1 ml. La solution darrt tait le Na2CO3 0.2 M. Labsorbance fut
dtermin 405 nm et chaque point reprsente la moyenne des duplicatas.

0.35

0.3
Absorbance (750 nm)

0.25
y = 3.2568x
0.2 R = 0.9953

0.15

0.1

0.05

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Quantit de BSA (mg)

Figure 12 : Courbe standard de lalbumine de srum bovin (BSA), 0.1 mg/ml, selon la
mthode de Lowry
Lgende : la courbe standard du BSA fut tablie selon la mthode de Lowry avec une concentration de BSA de 0
0.1 mg/ml. Labsorbance fut dtermin 750 nm et chaque point reprsente la moyenne des duplicatas.
 27

0.8
Absorbance (405 nm)

y = 0.0402x
R = 0.9927
0.6

0.4

0.2

0
0 5 10 15 20 25
Temps (en min)

Figure 13 : Dosage de lactivit enzymatique de la fraction enzymatique F2, dilue par un

facteur 200, provenant de luzernes (Medicago sativa)
Lgende : Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5, du pNP 5 mM et 50 l de solution
enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons
ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et entre 0 25 minutes de raction
37C. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la moyenne des duplicatas.

1
Absorbance (405 nm)

0.8

0.6
y = 0.0362x
R = 0.9973
0.4

0.2

0
0 5 10 15 20 25
Temps (min)

Figure 14 : Dosage de lactivit enzymatique de la fraction enzymatique F1, dilue par un

facteur 5, provenant de luzernes (Medicago sativa)
Lgende : Le dosage de lactivit fut tabli avec du tampon actate 0,1 M pH 5, du pNP 5 mM et 50 l de solution
enzymatique, pour un volume finale de 1 ml. La solution darrt tait Na2CO3 0.2 M. Les diffrents chantillons
ont subi une pr-incubation de 3 min, avant lajout de la solution enzymatique, et entre 0 25 minutes de raction
37C. Labsorbance fut dtermine 405 nm et chaque point reprsente la moyenne des duplicatas.
 28

- Dosage des protines pour la F2 (voir page 8 et figure 12)

Pour obtenir la concentration en protines de la fraction F2, il faut convertir la moyenne des
absorbances 750 nm de F2, dilu 1/100, obtenues en concentration grce la pente de la
courbe standard, soit :

0.214 + 0.213
= = 0.2135
2

0.2135
: = 0.0655 /
3.2568

Il faut ensuite annuler la dilution soit :

0.0655 100 = 6.55 /

La concentration en protines de F2 est donc de 6.55 mg/ml. Pour obtenir la quantit de

protines, il faut multiplier la concentration par le volume de la fraction soit :

= 6.55 29.7 = 194.535

La quantit de protines de la fraction F2 est de 194.535 mg.

- Dosage de l'activit enzymatique pour la F2 (Figure 11 et 13)

Afin de calculer lactivit relative (en U/ml) de F2, il faut utiliser lquation de Beer-Lambert
avec, lquation de la pente de la fraction de F2 dilu 1/200 et de la pente de la courbe standard
du pNP, soit :
0.0402
= = = = 0.00681206 /
5.9013

Il faut ensuite retirer le facteur de dilution :

= 200 = 1.36241167 /

Enfin, on convertit cette concentration pour 1 ml, car celle-ci correspond 50 l de solution
enzymatique, soit par un produit en croix :

50 1000
= = 27.2482334 U/ml
1000 50

Lactivit relative de F2 est donc de 27.248 U/ml, et pour obtenir lactivit totale il faut
multiplier cette activit par le volume de F2 :

27.248 29.7 = 717.474

 29

- Calcul de l'activit spcifique pour la F2

Grce lactivit totale et la quantit de protine de F2, il est possible dobtenir lactivit
spcifique de F2 en divisant lactivit totale par la quantit de protines o :

717.474
2 = = = 3.688 /
194.535

Lactivit spcifique pour F2 est donc 3.688 U/mg de protines.

- Calcul du facteur de purification pour la F2

Le facteur de purification de F2 correspond au quotient de lactivit spcifique entre F2 et F1

2 3.688
soit : = 1 = 2.795 = 1.320

- Calcul du rendement pour la F2

Le rendement de F2 correspond quant lui au quotient de lactivit totale entre F2 et F1 soit :

2 717.474
= = = 1,041 104.1%
1 689.360

- Calcul du coefficient de dnaturation thermique pour la F4 (Figure 6)

Grce la figure 6, il est possible de dterminer le coefficient de dnaturation (Kd) qui

correspond la pente de la droite soit, -0.032 min-1.

- Calcul du Km et Vmax pour la F4 (figure 7)

Pour obtenir le Km de F4, il faut convertir en activit spcifique les absorbances obtenues
diffrentes concentration de pNPP. Pour cela, il faut diviser les absorbances par le temps de
raction, puis diviser le quotient par la pente de la courbe standard du pNP, diviser le quotient
par la concentration en protines de la fraction pour 1ml et enfin diviser le quotient par le facteur
de dilution utilis :

1
=

Le graphique de lactivit spcifique en fonction de la concentration en substrat permet

dobtenir la reprsentation de Michaelis-Menten. En faisant la reprsentation des inverses de ce
 30

graphique, on obtient la reprsentation de Lineweaver-Burk (figure 7). Cest grce lquation

de la courbe de tendance quon calcule le Km et le Vmax.

Pour obtenir le Km, il faut savoir que lquation de la courbe de tendance obtenue correspond
1 1 1
: = [] +
0

Le Km reprsente donc la pente sur lordonne lorigine (oao).

0.0054
= = 0.412
0.0131

Le Vmax reprsente linverse de loao, soit :

1
= = 76.339 /
0.0131

Le Km et le Vmax de F4 correspondent, respectivement, 0.412 M et 76.339 U/mg.

- Calcul de l'nergie d'activation pour la F4 (figure 8)

Pour calculer lnergie dactivation de F4, la formule de la pente de la forme linaire du

graphique dArrhnius est utilise, soit :

()
=
2.3

Avec R correspondant 8.284 J/mol/K.

= 2.3 = 2892.2 2.3 8.284 = 55105 . 1 55.105 . 1

Lnergie dactivation de F4 est donc de 55.105 kJ.mol-1.

- Calcul du Ki pour les inhibiteurs (figure 10)

Pour obtenir le Ki, les mmes tapes que pour le Km et Vmax ont t effectu jusquau calcul du
Km. On obtient donc un Lineweaver-Burk avec une courbe de tendance pour les ractions sans
inhibiteurs et des courbes de tendances avec inhibiteur. Selon la forme de la courbe de tendance
des ractions avec inhibiteurs par rapport la celle sans inhibiteurs, on dtermine si on est en
prsence dun inhibiteur comptitif, incomptitif ou non-comptitif.

Daprs la figure 10, il est possible de voir que le fructose-6-phosphate est incomptitif et le
chlorure de mercure (II) est non comptitif.

Lquation de la courbe de tendance des inhibiteurs incomptitifs est :

 31

1 1 1 []
=( )( )+( (1 + ))
0 []

Avec le Km et Vmax pour les ractions sans inhibiteurs, [I] correspondant la concentration de
linhibiteur. Donc afin de dterminer le Ki pour le Fructose-6-phosphate, il est possible
dutiliser lquation pour loao soit :
1 [] []
= (1 + ) =
( ) 1
200
= = 177.9
[(59.1716 0.0359) 1]

Lquation de la courbe de tendance des inhibiteurs non-comptitifs est :

1 [] 1 1 []
=( (1 + )) ( ) + ( (1 + ))
0 []

Avec le Km et Vmax pour les ractions sans inhibiteurs, [I] correspondant la concentration de
linhibiteur. Donc afin de dterminer le Ki pour le chlorure de mercure, il est possible dutiliser
lquation pour loao soit :
1 [] []
= (1 + ) =
( ) 1
0.5
= = 0.5
[(59.1716 0.0341) 1]

Le Ki du fructose-6-phosphate pour F4 est gal 177.9 M et le Ki du chlorure de mercure

pour F4 est gal 0.5 M.