v = - d(A) / dt = k (A)x

Initiation à l’enzymologie
v est toujours en M.T-1
Pascale Bobillo
k : Constante cinétique expérimentale, kexp

A savoir X = 0 : ordre 0 apparent

X = 1 : ordre 1 apparent

X = 2 : ordre 2 apparent

k1
Réaction d’ordre 0 apparent A B
k-1
(A) = - k t + (A)0 k est en M . T-1

Réaction d’ordre 1 apparent τc : temps caractéristique, la vie du complexe τc = 1

k1 + k-1

Ln (A) = - k t + Ln (A)0 k est en T-1

τ1/2 : 50% de l'effet maximal τ1/2 = Ln 2
k1 + k-1
Réaction d’ordre 2 apparent

1 / (A) = k t + 1 / (A)0 k est en M-1 . T-1

La thermodynamique
dEn = Enf – En0 = dq + dw La thermodynamique des solutions diluées

H = Qp = En + p V Transport d’ions à travers une membrane

(X)2
dEn = dq – p dV ΔG = R T Ln
(X)1

ΔSsystème + ΔSenvironnement > 0 (X)2

ΔG = R T Ln + ZF ΔΨ
(X)1

A pression constante : G = H – TS = En + pV - TS ΔG1 = ΔG1° + R T Ln [ (B) / (A) ]

dG = dH – TdS k*= kB T / h

ΔG = Gproduits - Gréactifs k = ( kB T/ h) e ( -ΔG* / RT)

1
 Ea = ΔH*+ RT k1 k2
E+S ES E+P
k-1 k-2
Equation d’Arrhénius
(P)0 = 0 (S) >> (E)T d(ES) / dt = 0
d(Ln k)/dT = Ea /(RT²)

Equations utilisées :
Equation de Van’t Hoff [1] (E)T = (E) + (ES)
[2] v = d(P)/dt = k2 (ES)
d(Ln K)/dT = ΔH°/RT² [3] d(ES)/dt = k1(E)(S) - (k-1 + k2) (ES)

Résolution des équations en EQS:

VM (S)
Excès: (S) >> (E)T v=
Saturation: (S) >> KM KM + (S) Effecteur linéaire
T.O. = kcat k1
k2
E+S ES E+P
1/v = (1 + KM / (S)) / VM
Représentation de Lineweaver Burk +F k-1 +F
a = 0 Inhibition totale
Représentation de Eadie-Hofstee
a > 1 Activateur
v = VM - KM.v / (S)

KF K'F a < 1 Inhibition partielle

EF+S ESF E+P+F

a k2

Concentration initiale en P est nulle : (P)0 = 0

Equations utilisées
Excès de Substrat : (S) >> (E)T [1] (E)T = (E) + (ES) + (EF) + (ESF)

[2] d(ES)/dt = k1(E)(S) - (k-1 + k2) (ES) = 0

Résolution en EQS : d(ES)/dt = 0 KM = (E) (S) / (ES) = (k-1 + k2) / k1

[3] KF = (E) (F) / (EF)

Excès d'effecteur : (F) >> (E)T donc (F) = Cste
[4] K'F = (ES) (F) / (ESF)

[5] VM = k2(E)T

[6] vi = d(P)/dt = k2(ES) + a k2(ESF)

2
Résolution des équations Effecteur linéaire
[2] Ù(E) = (ES) KM / (S)
[3] Ù (EF) = (E) (F) /KF = (ES) [KM / (S)] [(F) / KF ] VM (S) ( 1 + a(F)/K’F)
v=
[4] Ù(ESF) = (ES) (F) / K'F KM ( 1 + (F)/ KF) +(S) ( 1 + (F)/K’F)

[1] Ù (E)T ={[1 + (F)/K'F ] + [KM /(S)][1 + (F)/KF]}(ES)

[6] Ù vi = d(P)/dt = k2 [1 + a (F) / K'F ] (ES) 1 + a(F)/K’F 1 + (F)/KF
VMapp = VM KMapp= KM
1 + (F)/K’F 1 + (F)/K’F
vi = . k2 (E)T [ 1 + a (F) / K'F ] (S)
KM [1+(F)/KF ]+(S)[1+(F)/K'F
vi = VMapp ( S) / [KMapp + (S)]

VM (S) ( 1 + a(F)/K’F)
v=
Effecteur
Inhibitionlinéaire
Totale KM ( 1 + (F)/ KF) + (S) ( 1 + (F)/K’F)

k1 VM (S)
k2 v=
E+S ES E+P KM ( 1 + (I)/ KI) + (S) ( 1 + (I)/K’I)

+F k-1 +F
a=0 1 + a(F)/K’F 1 + (F)/KF
VMapp = VM KMapp= KM
1 + (F)/K’F 1 + (F)/K’F
KF K'F

EF+S ESF E+P+F 1 1 + (I)/KI

a k2 VMapp = VM KMapp= KM
1 + (I)/K’I 1 + (I)/K’I

a=0 a=0

Inhibition Mixte Inhibition Compétitive

1 1 + (I)/KI 1 1 + (I)/KI
VMapp = VM KMapp= KM VMapp = VM KMapp= KM
1 + (I)/K’I 1 + (I)/K’I 1 + (I)/K’I 1 + (I)/K’I

Graphe 1 / v = f ( 1 / (S) ), (I) paramétrique : VMapp = VM KMapp= KM [1 + (I)/KI]

K’I - KI - KI
1/v conv = 1/S conv = VM (S)
VMK’I KM K’I v=
KM ( 1 + (I)/ KI) + (S)

3
 Inhibition Conditionnelle Inhibition non Compétitive
VM (S) ( 1 + a(F)/K’F) VM (S) ( 1 + a(F)/K’F)
v= v=
KM ( 1 + (F)/ KF) + (S) ( 1 + (F)/K’F) KM ( 1 + (F)/ KF) + (S) ( 1 + (F)/K’F)
VM (S) VM (S)
v= v=
KM + (S) ( 1 + (I)/K’I) [KM + (S)]( 1 + (I)/KI)

1 + a(F)/K’F 1 + (F)/KF 1 + a(F)/K’F 1 + (F)/KF

VMapp = VM KMapp= KM VMapp = VM KMapp= KM
1 + (F)/K’F 1 + (F)/K’F 1 + (F)/K’F 1 + (F)/K’F

1 1 1
VMapp = VM KMapp= KM VMapp = VM KMapp= KM
1 + (I)/K’I 1 + (I)/K’I 1 + (I)/KI

Inhibitions selon Eadie-Hofstee Allostérie

On définit un protomère par la présence d'un seul site substrat
VMapp et d'un seul site effecteur. Un protomère peut être constitué de
deux sous-unités, fixant respectivement les deux composés
v v v (substrat et effecteur).
Vm/KMapp
Une protéine coopérative contient plusieurs protomères
identiques, disposés selon un assemblage symétrique (au moins
v/S v/S v/S un axe de symétrie).
Non compétitive Compétitive Incompétitive
VMapp variables VMapp constant (conditionnelle)
KMapp constant KMapp varaible VMapp proportionnel La protéine existe sous deux conformations différentes, toutes
à KMapp deux symétriques, appelées R (relaxée) et T (tendue).

Modèle de Monod, Wyman et Changeux L’activité de l’enzyme varie avec :

Allostérie • la nature du substrat : choix de la méthode de mesure

de la cinétique
• la nature du solvant : pH, force ionique, etc.

• la température

• la durée de la réaction : le temps

4
 Substrat Alternatif
Courbes de Progression
(P)
S2

S1 E+S ES E+P
+A

EA E+B Inhibiteur compétitif

Temps
To Tx

Couplage de réactions Influence du pH

Réaction principale
Le pH peut agir sur plusieurs facteurs :
E1
A B • l'ionisation du substrat et / ou du produit
E2
• la structure des protéines : donc la stabilité de l'enzyme
+ NADH C + NAD+
Réaction auxiliaire • la liaison du substrat à l'enzyme
Pour qu’un couplage réussisse, il faut que le système remplisse
deux types de conditions : • l'activité catalytique de l'enzyme
•Condition cinétique : l’étape limitante doit être celle que l’on
veut étudier. Expérimentalement, les réactions doivent se
•Condition sur les concentrations : Aucun équilibre ne doit faire en milieu tamponné, donc avec un pH
pouvoir s’installer constant pendant toute l'expérience.

VM = f (pH) Mécanisme
EH2+
VM
K1
VMopt
EH + S EHS EH + P
K2
VMopt/2
E-
pH
pK1 pHopt pK2