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gov/pmc/articles/PMC34941/
Étant donné que l'amylopectine est phosphorylée et que l'amylose ne l'est pas, il est
intéressant de déterminer si le SBE de la pomme de terre (EC 2.4.1.18) peut utiliser
des glucanes phosphorylés comme substrat. Dans la présente étude, nous avons testé
l'implication possible de la SBE dans la formation d'amidon phosphorylé. Le mode
d'action normal du SBE consiste à catalyser le clivage d'une liaison glucosidique α (1
→ 4), suivi d'une condensation du glucane α (1 → 4) libéré en une chaîne accepteur,
introduisant ainsi une glucosidie α (1 → 6). lien. Le mécanisme catalytique peut
impliquer une liaison séquentielle de la chaîne accepteuse puis de la chaîne donneuse
(Borovsky et al., 1976) ou, en variante, une liaison de deux chaînes de glucane α (1 →
4) ayant formé une double hélice.
Des plantes de pomme de terre (Solanum tuberosum L. cv Dianella) ont été cultivées
en serre comme décrit précédemment (Nielsen et al., 1994). Des tubercules d'environ
5 cm de diamètre ont été récoltés à partir de plantes âgées de 4 mois, rincés à l'eau
du robinet et utilisés immédiatement pour des expériences d'incubation. Les mini
tubercules ont été cultivés comme décrit par Visser et al. (1994) avec la modification
suivante: Des plantes stériles, cultivées in vitro, utilisées comme plantes donneuses,
ont été initialement obtenues en plaçant des sections de tige stérilisées en surface à
partir de plantes cultivées en serre sur un milieu induisant des pousses. Les plants de
pomme de terre in vitro ont été cultivés à 22 ° C en utilisant une période de lumière
de 14 h (160 µmol m -2 s -1). Pour l'induction des tubercules, une section de tige (1
cm) avec un bourgeon auxiliaire au repos et une feuille complètement développée a
été excisée d'une plante donneuse. La feuille a été retirée et la tige a été transférée
dans un milieu induisant des tubercules et placée dans un endroit sombre à 14 ° C. Au
bout de 4 semaines, les tubercules formés (3 mm de diamètre) ont été récoltés et
utilisés immédiatement pour des expériences.
Expériences de radiomarquage
Les granules d'amidon ont été isolés et lavés comme décrit précédemment (Nielsen
et al., 1994), en incorporant deux lavages supplémentaires de l'amidon dans 10 ml
d'acide phosphorique à 100 mm pendant 5 min à température ambiante.
Pour la dégradation enzymatique, les glucanes phosphorylés (0,1 mg) ont été dissous
dans 0,5 ml de Mes, 5 mm, CaCl2 4 mm, pH 6,5 et incubés avec de l'a-amylase (1
unité, 2 h, 25 ° C). Après incubation, un échantillon de 100 μL a été immédiatement
appliqué sur une colonne échangeuse d'anions CarboPac PA-100 (voir ci-dessous) et
analysé à l'aide de la méthode décrite par Blennow et al. (1998a).
Une modification de la méthode de Borovsky et al. (1976) ont été utilisés pour
synthétiser chimiquement un substrat de glucane α (1 → 4) non phosphorylé
marqué par 3H. Des glucanes neutres (1 mg) dans 100 ul de NaOH 0,1 n ont été mis à
réagir avec 0,5 MBq de NaB (3H) 4 (25 ° C, toute la nuit). Pour assurer une réduction
quantitative de toutes les extrémités réductrices, un excès de NaBH4 non marqué (2
mg dans 200 pi de NaOH 0,1 n) a été ajouté et la réaction a été laissée se poursuivre
pendant 2 h supplémentaires. Le réactif en excès a été détruit par addition de HCl 1 n
jusqu'à ce qu'il ne reste plus d'hydrogène. Le borate précipité a été éliminé par
application de l'échantillon sur une colonne de NAP-10 (Pharmacia) et l'élution des
glucanes a (1 - 4) a été réalisée avec 1,5 ml de tampon phosphate 50 mm (pH 7,5). La
fraction de glucane α (1 → 4) marquée à l'extrémité 3H a été utilisée immédiatement.
Le PSBE-I a été isolé des tubercules de pomme de terre jusqu'à homogénéité par
chromatographie d'affinité. Le PSBE-I isolé était dépourvu d'amylases et d'autres
activités hydrolytiques, analysé par des mesures d'activité et une analyse en
zymogramme en utilisant la méthode décrite dans Viksø-Nielsen et al. (1998). Pour
les expériences de transfert de chaîne, PSBE-I (10 ng) a été incubé (25 ° C, 2 h) avec
des α (1 - 4) glucanes phosphorylés marqués au 33P (1 mg), solubilisés dans 0,25 ml
de NaOH 0,1 n et neutralisés avec 0,1 n HCl) et avec des α (1 → 4) glucanes marqués
avec 3H (1 mg) dans 0,5 ml de tampon au phosphate de sodium de 50 mm, pH 7,5,
0,05% de n-octylglucoside et 0,1 mg / ml de BSA.
L'enzyme a été inactivée par ébullition (5 min) et le produit résultant a été appliqué à
une colonne échangeuse d'anions (1 x 5 cm, DEAE-Sepharose) équilibrée dans Mes 5
mm, pH 8,0. Les glucanes neutres ont été lavés de la colonne avec 15 ml d'eau. Les
glucanes phosphorylés ont ensuite été élués avec 15 ml de NaCl à 100 mm et de HCl à
10 mm (fractions de 1,5 ml).
HPAEC
RÉSULTATS
Tableau I
Incorporation de [U-14C] Glc et de 33PO43− dans de l'amidon à l'aide de disques de
tubercules de pomme de terre et de mini-tubercules de pomme de terre après 4 h
d'incubation
Isolement Et Caractérisation Du Glucane α (1 → 4) Marqué À L'aide De 33P De
L'amidon Debranched
Les glucanes phosphorylés isolés ont été lyophilisés, redissous dans NaOH
0,1 n et fractionnés par HPAEC. La présence possible de chaînes de glucane
phosphorylées portant plus d'un groupe phosphate et une localisation
interne variable du groupe phosphate dans chaque chaîne de glucane,
associées à la variabilité de la longueur de la chaîne, ont abouti à un profil
d'élution large. La radioactivité a été éluée dans les mêmes fractions que le
glucane phosphorylé (Fig. (Fig.2,2, A et B). Pour garantir que tout le
marqueur 33P provenait de groupes phosphate liés à α (1 → 4) glucane,
une fraction Le profil d'élution obtenu (Fig. (Fig.2C) 2C) était celui attendu
de la conversion du glucane phosphorylé en un oligosaccharide plus court.
Le schéma de marquage superposable (Fig.2D) 2D) documente le fait que
le marqueur 33P détecté dans l'échantillon non dégradé (Fig.2B) 2B) est
lié aux chaînes de glucane α (1 → 4).
Figure 2
A, Profil d'élution des chaînes de glucane α (1 → 4) phosphorylées marquées au 33P,
déterminé par HPAEC / PAD. B, Distribution de la radioactivité du 33P dans des
fractions de 1 mL de l'éluat échangeur d'anions de A. C, Élution de l' α (1 → 4) glucane
phosphorylé à la limite de l'a-amylase. D, élution de la radioactivité de 33P dans des
fractions de 1 mL de l'éluat échangeur d'anions dans C. nC, Nanocoulombs.
Pour créer un second substrat bien défini pour PSBE-I, le glucane non
phosphorylé α (1 → 4) a été synthétisé à partir de Glc-1-P en utilisant une
phosphorylase a et du maltoheptaose comme amorce. La distribution des
longueurs de chaîne de la fraction de glucane précipitée a été déterminée
par HPAEC et a révélé une distribution approximativement binomiale
culminant à DP 33 (Fig. (Fig.3) .3). Pour produire un substrat marqué au
3H différent des chaînes de glucane phosphorylé marquées au 33P, le
centre anomérique libre a été réduit avec NaB (3H) 4.
figure 3
Distribution des chaînes de glucane α (1 → 4) neutres synthétisées avec la
phosphorylase a de maltoheptaose et de Glc-1-P, déterminée par HPAEC / PAD en
utilisant une colonne CarboPac PA-100. NC, Nanocoulombs.
Les α (1 → 4) glucanes marqués 33P et 3H ont été testés en tant que substrats de PSBE-
I, lesquels ont été isolés jusqu'à homogénéité (Fig. (Fig.4) 4) par chromatographie
d'affinité (Viksø-Nielsen et al. , 1998). Après incubation des glucanes marqués 33P et
3H avec du PSBE-I, la moitié du mélange réactionnel a été appliquée à une colonne
échangeuse d'anions pour séparer les produits neutres et phosphorylés obtenus à
partir du processus de transfert de chaîne. Comme prévu, les produits neutres étaient
exclusivement étiquetés 3H. Au contraire, les produits phosphorylés élués ont été co-
marqués avec 3H et 33P (figure 5A) .5A). Cela indique que PSBE-I a catalysé une
réaction de transfert de chaîne, entraînant la formation d'une liaison covalente entre les
glucanes α (1 → 4) marqués 33P et 3H.
Figure 4
SDS-PAGE et zymogramme de PSBE-I isolés jusqu'à homogénéité par chromatographie
d'affinité γ-cyclodextrine. Ligne A, SDS-PAGE de PSBE-I isolé. Ligne B, Zymogramme de
PSBE-I isolé. L'emplacement des marqueurs de poids moléculaire SDS-PAGE (M. 116
000, 66 000, 45 000 et 27 000) est indiqué à gauche.
Figure 5
Chromatographie par échange d'anions (DEAE-Sepharose) de produits obtenus à partir
d'une réaction de transfert de chaîne catalysée par PSBE-I. A, produits de réactions de
transfert de chaîne catalysées par PSBE-I. B, Échantillon comme dans A, ramifié avec de
l'isoamylase. Les barres noires représentent la radioactivité provenant d' α (1 → 4)
glucanes phosphorylés marqués au 33P. Les barres blanches représentent la
radioactivité provenant des groupes marqués aux extrémités 3H.
DISCUSSION
La SBE est localisée à la surface des granules d’amidon (Kram et al., 1993)
ou fortement liée aux granules d’amidon (Larsson et al., 1996) et est
supposée intégrer des glucanes α (1 → 4) phosphorylés solubles dans
l’amylopectine par la réaction A Fig. (Fig.7) .7). Cela nécessiterait de
longues chaînes de glucanes non ramifiées dépassant de la surface des
granules, comme proposé par Lineback (1986), et l'existence de glucanes
solubles phosphorylés. L'implication possible de PSBE-I dans
l'introduction de glucanes α (1 → 4) solubles dans l'amylopectine est
corroborée par une augmentation observée du pool de glucanes solubles
dans les tubercules de pomme de terre dans lesquels l'activité de PSBE-I a
été réduite par des techniques antisens (Kossmann et al., 1997). Il a été
proposé que les glucanes α (1 → 4) affectent la synthèse de l'amidon dans
les tubercules de pomme de terre (Denyer et al., 1996). Les tubercules de
pomme de terre contiennent de petites quantités de glucanes α (1 → 4)
solubles et ramifiés, qui peuvent être détectés par analyse HPAEC
(données non présentées). Ces glucanes sont probablement synthétisés
dans le stroma d'amyloplaste par des synthases d'amidon solubles ou par
un isoforme de phosphorylase plastidique ayant une affinité pour les
glucanes α (1 → 4) linéaires de faible masse moléculaire (Steup, 1988). La
quantité de glucanes solubles pouvant être obtenue est trop faible pour
permettre une analyse de leur teneur en phosphate. Les α (1 → 4)
glucanes solubles peuvent également provenir de la coupe ou de la
modification de la molécule d'amylopectine par des enzymes débranchées
ou des amylases (Ball et al., 1996; Mouille et al., 1996). Si les α (1 → 4)
glucanes phosphorylés sont dérivés d'un processus d'élimination du
glucane, le transfert de chaîne d'α (1 → 4) glucanes phosphorylés médiés
par PSBE-I peut ne pas être le principal moyen de phosphoryler l'amidon.
Dans ce cas, cela constituerait un moyen de réintroduire les α (1 → 4)
glucanes phosphorylés libérés dans l'amylopectine.
ABRÉVIATIONS: