[ENVIRONNEMl~Il

-oes bio-indicateurs I
de pollution i

r di I

Des plantes transgeniques sont a l'origine de

nouvelles methodes d'eualuation de la geno-
toxicite des eaux et des sols radioactifs ou chi-
miquement pollues. Ces tests presentent l'auan- permettent de derecrer des quantites
rrunimcs de substances rnutagenes
tage de la simplicite, ce qui en fait des outils de comme les meraux lourds (mercure,
selenium, zinc, cadmium, etc.), lcs
choix pour les etudes environnementales. hydrocarbures arornatiques polycy-
cliques (HAP) ou les pesticides (7,8,9).
Le tabac iNicounia tabacumi est aussi
tres Utilise, que cc sort une hgnee hete-

If'
• Fnednch Mlescher
a vie sur Terre est constamment sols ou de l'eau, et ne peuvent rendre rozygote pour Ie gene Sulphu - qUI
\.bJ
lnstrtut, BP2543,
4002 Bale, Suisse exposee a des forces naturelles compte nr des interactions biolo- affecte la teneur en chlorophylle -
E-mail comme Ie gel, la secheresse, la lumie- giques, comme les echanges entre les dont les feuilles changent de couleur
Igor@fml.ch re, Ie feu ou l'inondation, qui main- composes orgaruques du sol et les en presence d'agents mutagenes, ou
tiennent les orgarusmes vivants dans autres organismes presents, ni de la une hgnee sensible a l'ozone (voir Bio-
Adaptation un etat constant de fluctuation gene- bio-drsponibilire des polluants pour futur [1997]164,35-37) (10).
actuahsee d'un tique. Avec l'acceleranon du deve- les organismes superieurs, Pour eva-
article puone
loppement econornique, les hommes luer la reaction des etres vivants a la > Des oignons
en 1999dans
AgBlOtechNet 1 sont de plus en plus responsables de pollution d'origine anthropique, il et des rayons
(ABN 030) nouvelles nuisances telles que la dis- faut done utiliser des especes repre-
persion dans l'environnement de sentatives, vivant sur Ie terrain. En Les radiations ionisantes so nt, elles
produits chirruques, pharrnaceu- raison de leur mobilire, les arumaux aussi, de puissants agents mutagenes,
(1) D E. Levin, B.N. nques ou de nutriments xenobio- se preterit peu a ce genre d'etudes, L'utilisation humaine de l'energie
Ames (1986) Env tiques. De fait, la majorite de la pol- me me si quelques experiences ont etc atomique a des fins militaires ou
Mutagen. 8, 9-28
lution actuelle provient d'un deve- menees (4, 5, 6). Restent les plantes, civiles pose Ie probleme de la bio-
(2) J.H Miller loppement mdustriel irraisonne. qui, outre leur immobihre et leur securite et du srockage des dechets,
(1985) J Mol. BIOI Comment mesurer I'impact de ces duree de Vie, presenrent l'avantage et s'esr traduite par une importante
182,45-68 nouveaux polluants sur les orga- d'etre la principale source d'energie pollution radioactive dans certaines
nismes vivants ? de la plupart des eucaryotes supe- zones. L'explosion du reacteur 4 de
(3) R M Schaaper,
Les tests de laboratoire disponibles neurs, et done de participer active- la centrale nucleaire de T chernobyl
R.L. Dunn (1991)
CarcinogenesIs 11 , jusqu'a present, tels Ie celebre test ment au transfert des composes pol- (Ukraine), Ie 26 avnl 1986, en est
1087-1095. Ames, utilisant la reponse de bacte- luants tout au long de la chaine ali- I'exemple Ie plus spectaculaire. Ses
ries du genre Salmonella a des pro- mentaire. consequences font encore l'objet
(4) R Murti et al durts toxiques, ou d'aurres utilisant Des tests reposant sur l'observanon d'etudes intensives. La encore, les
(1994) Mutation
Res 307, 583-595
Escherichia coli, ne peuvent mesurer d'aberrarions chromosormques chez tests classiques unlisant Allium cepa
les effets de l'exposinon chronique des especes relies que l'oignon (AllIUm ou Tradescantia ont dernontre leur
(5) M Green et al d'eucaryotes superieurs a un envi- cepai, l'ephernere (genre Tradescan- unlite, Cependant, bien que sensibles
(1986) Proc. Nat! ronnement conrarnine (1, 2, 3). En tia) ou la feverole (View (aha) ont et operanonnels, ces sysrernes repo-
Acad. Sci. USA 83, effet, ils ne reproduisent pas la com- dernontre depuis quelques annces leur sent sur I'observation de change-
6667-6671.
plexite des profils de pollution des effrcacite. Extremement sensibles, ils ments dont les mecanismes molecu-

48 BIOFUTUR 205 • Novembre 2000

 (6) K, Amanuma
etet. (2000) Nat.
Btotectinol. 18,62-
65,

Quatorze ans apres I'explosion du reacteur 4, les alentours de la centrale nuclealre de Tchernobyl (Ukraine) sont (7) G Fiskesjo
toujours contamines, y compris les zones encore habitees et cultivees, (1998) Mutation
Res, 197,243-260

laires demeurent inconnus. lis don-
nent des resultats dont I'importance
est difficile a evaluer et extrapoler a
d'autres organismes. Nous avons
done developpe plusieurs nouvelles
methodes d'evaluation de la geno-
toxicite des eaux et des sols radioac-
tifs ou chimiquement pollues, en uti-
lisant des plantes transgeniques,
La premiere consiste a derecter les
recombinaisons homologues interve-
nant dans Ie genome de plantes
vivantes, en l'occurrence des plants
d'arabette (Arabidopsis thaLiana) ou
de tabac porteurs de deux versions
tronquees - done non fonctionnelles -
d'un gene chimerique codant une
enzyme, la ~-glucuronidase (uidA)
(11). Lorsqu'une recombinaison
homologue - mode de reparation de
l'ADN faisant intervenir une sequence
similaire intacte presente ailleurs dans
le genome - intervient a ce locus, l'ac-
tivite du gene uidA est retablie, Les
cellules exprimanr la ~-glucuronidase,
entourees de leurs descendantes,
apparaissent apres coloration histo-
chimique comme des secteurs bleus
sur les feuilles. Ce phenomene permet
d'obtenir un test quantitatif par
comptage des secteurs colores (voir La
photo p. 51).
On sait depuis 1995 que ces plantes
repondent a la presence d'agents
rnutagenes, tels que les rayons ultra-
violets ou le methyl-rnethanesulfona-
te (MMS), par une augmentation de
la frequence de recombinaison
homologue (12). Les agents muta-
genes provoquent en effet des modi-
(8) S, Ichikawa
fications biochimiques des acides (1992) Mutation
nucleiques et des coupures du double Res. 270. 3-22
brin de la molecule d'ADN. Bien
qu'en majorite reparees par recombi- (9) N, Kanaya et ai,
(1994) Mutation
naison non homologue (dite illegiti-
Res 310,231-247.
me ou end jommg), quelques cou-
pures Ie sont par recombinaison (10) M. Fnedlender
homologue. Lorsque la coupure s'est et al. (1996) Planta
produite au niveau du transgene, 199,307-313
seul ce dernier mecanisme restaure la
(11) P Swoboda
fonction de la ~-glucuronidase. Ces etal. (1994) EMBO
evenements permettent done de J, 13.484-489.
mesurer la frequence de coupure au
niveau de ce gene, et, par inference, (12)H, Puchta et et.
dans Ie genome entier. (1995) PlantJ. 7.
203-210.
L'evaluation de la stabilite du geno-
me des planres exposees a des radia-
tions ionisantes est importante, non
seulement parce que de nombreuses
regions agricoles sont polluees par •••
BIOFUTUR 205 • Novembre 2000 49
IENVIRONNE~ENT.I
••• des Isotopes a longue duree de vie,
mars aussi a cause de la bio-disponi-
bilite croissante du cesium 137 et du
srronnum 90 dam les rcrrttorres
conrammes, due en partrculier ,1 1a
nature geologique mouvante du
sons-sol et a l'acnon du vent. Nous
avons donc conduit autour de Tcher-
nobyl des experiences a grande
echelle avec de l'arabette et du tabac
transgeruques. lis ont ete cultives
tant au laboratoire que sur Ie terrain,
sur des echannllons de sols prove-
nant de la zone d'exclusion et des
trois autres zones moms conrarrunees
Dans la zone d'exclusion, lieu de la plus forte radioactivite,
les plantes experimentales ont rnontre des taux tres eleves
de perturbations genetiques.
(13, 14).La radroactivite des echan-
tillons provenant de la zone d'exclu-
sion, pour Ie cesium 137, varian de
1 472 kilobecquerels (kBq) par kilo
de terre dans la " Foret rouge » a
(131 L Kovalchuck 5 kBq/kg au point Lelev, contre
et st. (1998) Nat
24 Bq/kg dans la zone temorn non
Btotecttnot 16,
1054-1057. contaminee. La dose de rayons
gamma erruse allair de 2,84 nano-
(14) I Kovalchuck coulombs (ne) par heure dans la
et al (2000) Mutat a
zone ternoin 252 nClh Chistoga- a
Res 449,47-56
lovka, et atteignait 2 193 nClh dans
(15)A Morseev, V
la Foret rouge.
Ivanov (1991)
Directory for DOSI- > De I'importance
metryandRadiatIOn du sol
Hygiene Moscou,
Atormzdat. 220 pp
La dose totale absorbee par Arabi-
dopsls thaliana represente la somme
de la contamination, consequence de
l'absorption de radionucleides pre-
sents dans Ie sol, et de 1'lrradlatlOn,
due a l'expositlOn aux rayons
gamma emis par l'environnement de
la plante. La dose interne etait slmi-
laire au laboratOire et In SItu, malS,
bien entendu, I'lrradlation etait tres
differente, pUlsqu'on estime que les
40 m 2 de sol entourant une plante
50 BIOFUTUR 205 • Novembre 2000
conrribuent a la dose de rayons
gamma qu'elle absorbe (15). Amsi, la
part de la contaminanon dans la
dose totalc depassair 50 'Yo en labo-
ratoire, alors gu 'elle n'atteignait gue
20 a 25 % au champ.
Que ce sort au laboratoire ou en exte-
rieur; nous avons releve une correla-
tion tres forte, et sigmfrcarive, entre
la [requence de recombmarson homo-
logue et le ruveau de contamination
du sol, d'une part, cr entre cette
meme frequence et la dose absorbcc,
d'aurre part. Lorsque l'acnvite du sol
attergnair 11,1 terabecqucrels (TBq)
par kilometre carre, en exterieur, la
recombinaison etait 8,4 fois plus fre-
quente que chez les plantes temoins,
et jusqu'a 11 fors, en laboraroire,
avec une acnvite de 37 Tbq/krn-'.
Curieusement, pour des niveaux de
pollution encore superieurs, nous
avons constate que cette frequence
dirninue et ri'atteinr plus que 2,3 ,1
2,6 fois la normale. On peut avancer
plusieurs explications, pas forcernenr
exclusives, a ce phenomene : la rare-
faction des evenements de recombi-
naison peut provenir de I'effet
toxique des ruveaux eleves de radio-
activrte, qui tuent les cellules ou per-
turbent totalement Ie mecanisme de
reparanon de I'ADN. Elle peut aussi
etre due a une augmentation de la
recombmaison illegltIme, qUi devient
Ie mode essentie1 de reparation. Dans
ce dernier cas, PUisque la fonctlon du
transgene n' est pas restauree, Ii est
impOSSible de visualiser l'influence
des radiations.
D'un autre cote, la frequence de
recombinalson observee dans les cel-
lules germinales ou somatlques irra-
dlees peut largement depasser ce qui
est theoriquerncnt prevrsiblc compte
tenu des effets de, radianons sur
I'ADN. L'augrnentanon de la recorn-
bmaison pourrair alors ne pas corres-
pondre directemenr a des dommages
au rnveau du rransgene, mais prove-
rur d'alreranons d'une autre partie du
genome. Dans ce cas l.i drrmnunon
de la trequcnce de rccombinaison du
rransgene pour les tres ha utes doses
pourrair resulrer d'un effet de satura-
tion du mecanisme biochimique res-
ponsable de ce phenornene.
La zone dexclusion de T chernobyl
n 'erant III habiree III culnvee, y eva-
luer les effets a long terme des radia-
tions ronisantes sur Ie genome des
plantes u'est probablement pas de 1a
premiere Importance. En revanche, il
est urgent de dererrnmer le risque
generique du a des contarrunations
netternent mferieures. NC)JlS avons
donc mene des experiences dans les
regions habitees : la zone de contr6le
radrologique renforce du district de
Snyaryn (region de Ivano-Frankivsk)
et la zone de reinstallation obligator-
re du disrncr de Narodrchi (region de
Zyrorrur] ; des zones non contami-
nees servaient de contr6les. L'acnvite
du cesium 13 7 allair de 22 Bq/kg
pour les zones temoins a 6 549 Bq/kg
pour la plus haute contammation
retrouvee en zone habitee. L'acrivite
moyenne, calculee a partir des
echantillons, variair de 6,7 GBq/km 1
a I 1 10 GBq/km1 , respectivement.
Nous avons observe une augmenta-
tion stanstiquernent significative, et
dependante de la dose recue, de la
frequence de recombinaison homo-
logue dans les zones contaminces
(14). Nous avons merne pu detecrer
des differences entre les planres cultr-
vees dans les zones temoins et celles
qUl ont pousse sur des sols tres far-
blemcnt contarmnes, avec des
niveaux de radioacrivite aussi bas
que 44 a 122 GBq/km1 (soit 188 a
575 Bq/kg). Puisque nous avons
obtenu des donnees sirnilaires avec
des tabacs porteurs de Ia meme
modification genenque, Ie phenorne-
ne n'esr pas specifique a Aralndopsts
thaltana, mais affecte probablement
les autres vegetaux.
Afin d'evaluer I'importance et la fiabl-
lIte de notre methode, nous l'avons
comparee au classlque test de detec-
tion des aberrations chromosomlques
chez Alhum cepa. Nous avons donc
fait germer des oignons sur nos echan-
tillons de sols contamines. Trois jours
apres la germination, nous avons ana-
lyse l'actlvlte mitotlque des cellules de
l'extremlte des racines et eva Iue la fre-
quence des mitoses anormales. Finale-
o,
~
w
Z (appeles Ambre, Opale et Ochre) a
u.
Q;
Les secteurs bleus sur les feuilles de cette arabette transgEmique signalent
des cellules ayant subi une recombinaison homologue sous I'influence des
rayons gamma.
ment, il existe une tres forte correla-
tion entre la frequence de recombinai-
son homologue chez l'araberte trans-
genique et celie des aberrations chro-
rnosorruques des cellules rrutonques de
l'oignon (13). L'augrnentanon irutiale
de la frequence de recombinaison se
retrouve chez l'oignon, en particulier
sous la forme de ponts entre chromo-
somes ou de fragments isoles, resul-
tant de coupures simples ou doubles.
La dimmunon de cette frequence aux
doses de radioactivite tres elevees,
observee chez I'arabette, peut etre
reliee chez l'oignon a une augmenta-
tion de la proportion totale de cellules
aberrantes, bien que Ie pourcentage de
ponts et de fragments dimmue. L'aug-
mentation des mitoses aberrantes est
alors prmcipalement due a des pheno-
menes tels que des chromosomes
adherents ou des anaphases mulnpo-
laires, toutes modifications generale-
ment letales pour la cellule concernec.
Cette recrudescence des aberrations
letales pourrait constltuer une explica-
tion a la chute de la frequcnce de
recombinaison homologue constatee
chez les piantes cultivees sur des sols
rres hautement contamines.
Ces mesures concernaient des
plantes exposees de rnaruere proIon-
gee a des radiations ronisantes. L'ef-
fet d'une irradiation breve sur l'inre-
grrte du genome vegetal est-il com-
parable? Pour Ie savorr, no us avons
soumis nos plantes rransgeniques
aux deux types de situations. Chez
les plantes exposees a une irradia-
tion chronique, la frequence de
recombinaison homologue est multi-
phee par 5 ou 6 pour des doses aussi
faibles que 0,2 mGy. Par contraste,
nous n'avons constate aucune aug-
mentation de cette frequcnce chez
des plantes recevant des doses pone-
tuelles, meme mille fois plus irnpor-
tantes (0,1 a 0,5 Gy). On peut ccr-
tamement avancer plusieurs explica-
tions aces resultats mattendus. II est
possible, par exemple, qu'apres une
exposition poncruelle , les plantes
utilisent majoritairement la recom-
binaison rllcginrne, que notre syste-
me ne derecre pas, comme moyen de
reparation rapid« de I'ADN (16, 17).
Par aillcurs, des plantes culnvees sur
des sols chimiq uement differenrs
rna is avec un nrveau de radioactivire
equivalent nont pas Ie meme taux
de recombmaison. Elles nont done
pas absorbe les memes doses, ce qUI
reflere la difference de bio-disponibi-
lite des radionuclerdes dans les deux
types de sols (14).
> Des mutations
transmissibles
Bien que moms spectaculaires que les
coupures du double brin de I'ADN,
les mutations ponctuelles affecrant Ie
genome de cellules sornatiques peu-
vent etre importanres pour les vege-
raux, car elles sont susceptibles
d'etre transrruses a la generation SUI-
vante en raison de la production tar-
dive des organes reproducteurs a
partir des meristcmes. Les plantes,
qUI ne peuvent evidemmcnt pas se
derober a I'mfluence de I'environne-
ment, pourraient faire appel a un
mecanisme partrculier pour rnainte-
nir l'integnrc de leur genome. Aucun
systerne de mesure des mutations
somatiques ponctuelles chez les
plantes n'etanr disponible, nous
avons devcloppe recernrnenr une
autre approche. Pour cela, nous
avons introduit des codons stop
cinq positions differenres du gene
uidA chez Arabidopsis thaliana, Leur
presence abolit totalement l'acnvrte
de la ~-glucuromdase, qUI peut etre
restauree par des mutations pone-
tuelles retabliss.mt les codons origi-
naux. Nous avons ensuite expose ces
plantes a divers agents muragenes er
mesure la frequence de reversion.
Celle-ci est multiplier par 56 par des
rayons ultravrolets, par 3 par les
rayons X et par 2 par Ie !v1MS (18). (16) A B Bntt
(1999) Trends Plant
Nous avons aussi pu constater, au
SCI 4,20-25
cours dexperiences encore prehrru-
naires, que ce test est sensible merne (17) S Salomon,
dans des environncments hautement H Puchta (1998)
radioactifs, ce qui en fait Ie comple- EMBO J 17, 6086-
6095
ment du systeme base sur la recom-
bmaison homologue. (18) I Kovalchuk
L'unhsanon de bio-indicateurs trans- etal (2000) EMBO
gcmques consntue Ie premier test J 19,4431-4438
simple et representanf de l'nnpacr des
agents mutagenes sur le genome des (19) YA Izrael et al
(1997) In Radloe-
eucaryotes superieurs. De plus, 11
cokxucsl conse-
donne des resultats en quatre quences of the
semames et ne requierr ru equipernenr Tchemobyl eccteent
sophisrique ru connaissances speer- (A Karaoglu et al ,
eds), Luxembourg,
fiques : il peut donc etre largement
pp 1-10
utilise pour des etudes environnemen-
tales, rneme a grande echelle et pour
de faibles contaminations. C'est
important Sl l'on considere que les
zones conrammecs a un niveau de 37
a 185 GBq/km l representent des sur-
faces considerahles : 12 000 km- en
Suede, 11 500 krn- en Finlande,
8 600 km- en Aumche, 5 200 krn- en
Norvege et 1 300 km- en Suisse (19).
En outre, pour crecr un « systerne
d'alarme » efficace, l'orgarusme test
dolt pouvoir donner un Signal
davertissemenr avant que des dom-
mages ecologiques importants alent
eu lieu. Plus sensibles a certains pro-
duits conrarrunants que les arnmaux
et situees en bas de la chaine tro-
phique, donc affecrees avant les
autres orgarnsmes, les plantes consti-
tuent sans aucun doute de tres bons
candidats, •
BIOFUTUR 205 • Novembre 2000 51