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22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...

Reagents
Homepage > Knowledge DB > Protocols >
Our reagents at a glance
SilenciX, Knockdown Cell Lines
Protocole de Western Blot (WB) ­ Recommandé par les utilisateurs d'anticorps
Antibodies
Primary Antibodies
tebu­bio Secondary Antibodies
Hybridoma Cells
Support Products
Arrays
Functional Arrays
Protocole WB & conseils techniques ­ améliorez la
Antibody Arrays
Protein Arrays
reproductibilité de vos résultats
Lectin Arrays
Support Products
Assays & Kits
Conformational Assays
Forts de leur propre expérience et de celle de nos utilisateurs d'anticorps tebu­bio, nos spécialistes anticorps vous
Cell Based Assays
proposent ce protocole Western Blot.
Functional Assays
Simplex Quantification
Un tutoriel conçu par les scientifiques, pour les scientifiques ­ des étapes précises, utilisant des anticorps et des
Support Products
produits associés provenant de sources connues, validées et traçables, vous permettent d'assurer un niveau élevé de
Multiplex Quantification
fiabilité et de reproductibilité de vos expériences, en accord avec les nouvelles exigences de publication.
Cells, Media & Fractions
Primary Cells
Avec nos remerciements à Dr Mark Livingstone (Institut Pasteur, Paris), pour la préparation de ce protocole.
Subcellular Fractions
Media & ECM
 Téléchargez le protocole en format PDF ici ­ cliquez sur les liens en haut de la page pour le partager!
Cell Lines
Cell Lysates & RNA
  Cell Separation
Plasma/Serum/Complement
Tissue Slides
Viruses
Support Products
Expression Vectors
Etape n°1 ­ Les réactifs requis pour votre SDS­PAGE et WB
AAV
Adenovirus
siRNA
Les solutions doivent être préparées avec de l'eau ultra pure déionisée ou un équivalent.
Transfection reagents
RNAi
Tris­HCl (1.5M, pH 8.8): Mélanger 91g de Tris base (23483­100) avec de l'eau distillée dans un volume  total de 400mL. Ajuster le pH à 8.8 à l'aide du NaOH puis ,
ORF expression
ajouter de l'eau distillée pour obtenir un volume final de 500mL.
Genomics
PCR
10% APS (Ammonium Persulfate): Dissoudre 1g d'APS (1708­0100) dans de l'eau distillée pour un volume total de 10mL. Aliquoter dans des tubes de 1,5mL et
FISH
stocker à ­20°C.
DNA Extractions
Reporter Assays
Tris­HCl (0.5M, pH 6.8): Mélanger 30g de Tris base (23483­100) dans de l'eau distillée pour un volume total de 400mL. Ajuster le pH à 6.8 à l'aide du NaOH puis,
Enzymes
ajouter l'eau distillée pour obtenir un volume final de 500mL.
Cloning Tools
DNA Controls
Tampon DS contenant du DTT 2X (1mL): Ajouter 50uL de DTT à 1M récemment préparé ou décongelé dans 1mL de tampon SDS 2X (MB­018).
DNA Sequencing
Lab Consumables
Tampon de migration SDS­PAGE 1X (1L):  Mélanger 900mL d'eau distillée, 100mL de tampon Tris­Glycine 10X  (24088­500), et 10mL de SDS 10% (MB­015).
Beads & Microspheres
Buffers
Tampon de transfert SDS­PAGE 1X  (1L):  Mélanger 700mL d'eau distillée, 100mL de tampon Tris­Glycine 10X (24088­500), et 200mL d'éthanol (100%).
Histology & Microscopy
Ladders & Agaroses
Plastics & Accessories
Pour les grosses protéines, certains protocoles recommandent de réduire la proportion en éthanol à 10% ou d'ajouter du SDS (<0.05%).
Prothermal
 TMB
Lipidomics
PBST 1X (Phosphate Buffered Saline avec 0.1% de Tween 20): Ajouter 1mL de Tween 20 (T20) & 1L de PBS 1X.
Assays
Beads and Liposomes
Tampon de saturation (100mL): Mélanger 85mL d'eau distillée, 10mL de PBS/NaN
Lipid Interaction Tools 3 10X (MB­011), 5g de lait écrémé en poudre (1602­0250), 100uL de Tween 20
(T20), bien mélanger. Stocker à 4°C.
Labeled Lipids
Lipids
Tampon de dilution pour anticorps primaire (100mL): Mélanger 85mL d'eau distillée, 10mL de PBS/NaN
miRNA 3 10X (MB­ 011), 5g de BSA (1501­0100) et bien
miRNA Assays
mélanger. Stocker à 4°C.
miRNA expression
miRNA inhibition
Tampon de dilution pour anticorps secondaire  (100mL): Dissoudre 5g de lait écrémé WB­grade en poudre  (875014­200G), dans 95mL de PBST 1X et bien
miRNA qPCR
mélanger. Stocker à 4°C.
Molecules
Inhibitors & Activators
Anticorps secondaire: Selon les espèces utilisées pour produire l'anticorps primaire:
Chemicals
Lapin (GTX213110­ 01)
Labelling
Substrates
Souris (GTX213111 ­01)
Antibiotics & Metabolites
Libraries
Chèvre (GTX228416­ 01)
Polymers
Proteins & Peptides
Ces anticorps sont fournis en solution. Lorsque vous achetez des anticorps lyphilisés, resuspendez les anticorps dans une solution tampon 1X pour
Amino Acids & Synthesis Reagents
le stockage des anticorps secondaires (pour 10mL, mélanger 4,5 mL d'eau distillée, 100uL de HEPES  (MB­062­0100), 300ul de NaCl à 5M (MB­047),
Peptides
20mg de BSA (1501­0100), et 5mL de glycerol.  Stocker les aliquots à ­ 20°C.
Proteins
Synthesis reagents & tools
Transcriptomics
In Vitro Transcription
Microarrays
Etape n° 2 ­ Préparation des échantillons ­ Cellules de mammifères adhérentes cultivées dans une plaque
RNA Extractions
RNA Modifications
de 10cmRNA Sequencing
RT­PCR
RNA Controls
1. Retirer le milieu de culture et laver les cellules 2 fois avec du PBS 1X, aspirer ce qui reste du tampon.
Others
2. Ajouter le tampon de lyse RIPA 1X  (MB­030­0050) (250 µl) à chaque plaque 10cm. Gratter immédiatement les cellules pour les décoller de la plaque et transférer
Services
ce qui a été récolté dans un tube pour microcentrifuger. Garder les cellules dans la glace. Soniquer pendant 10 à 15 secondes à l'aide d'une sonde sonicatrice pour
tebu­bio's lab services at a glance
couper l'ADN.
Protein production in E.coli and HEK293
Alternativement, les lysats peuvent être microcentrifugés à la vitesse maximale à 4°C et le surnageant peut être collecté, cependant certaines protéines liées à
miRNA Profiling
l'ADN peuvent être perdues).
in vitro ingredient testing in cosmetology
3. Quantifier la quantité totale de protéines dans le lysat en utilisant le kit Total Protein Determination Kit (M1585), en respectant les instructions du fournisseur.
Brands
4. Mélanger 20ul de Tampon SDS 2X, 20ug de protéines totales (volume basé sur le kit), et une quantité suffisante de tampon de lyse RIPA 1X pour obtenir un
volume total de 40ul.

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5. Chauffer l'échantillon à 95–100°C pendant 5 min, microcentrifuger brièvement, et stocker à ­20°C jusqu'à la prochaine utilisation.

Etape n° 3 ­  SDS­PAGE et transfert sur Membrane de Nitrocellulose
Abnova
6. Préparer un mini gel de séparation SDS­PAGE (10mL):

Dans un tube en plastique de 15mL, mélanger une solution d'acrylamide/bisacrylamide et d'eau distillée avec les volumes indiqués dans le Tableau 1,
selon le poids moléculaire de la protéine étudiée. Ajouter 2,5mL de Tris­HCl (1.5M, pH 8.8), 100ul de SDS à 10% (MB­ 015), 80uL de APS à 10%, et  4uL
de TEMED (1718­ 0030). Bien mélanger la solution et pipetter immédiatement entre les deux plaques (plastique ou verre) comme indiqué par le manuel du
fournisseur SDS­PAGE. Remplir la chambre jusqu'à atteindre un niveau qui soit 1cm en dessous du bas du peigne du gel lorsqu'il sera mis à la prochaine
étape. Recouvrez le gel avec de l'éthanol à 100%. Après que le gel de séparation ait polymérisé (environ 15 minutes), vider l'éthanol.

Advanced Biotechnologies
Tableau 1 ­ Volumes de solution d'acrylamide/bisacrylamide et d'eau distillée requis pour faire un gel de polyacrylamide. 

Poids moléculaire  Pourcentage du gel Acrylamide/bisacryl.* Eau distillée


<25kDa 15% 5mL 2,3mL
25­50kDa 12% 4mL 3,3mL
50­75kDa  10% 3,3mL 4mL
AIM Biotech
>75kDa 7,5% 2,5mL 4,8mL

* Pour des résultats optimaux, utiliser acryl./bisacryl. 37.5:1 (24165­100) pour des gels 12% et 15%  et utiliser acryl./bisacryl. 29:1 (24169­100) pour des gels 10%
et 7.5% gels. 

7. Préparer un mini gel de concentration SDS­PAGE : Dans un tube plastique de 15mL, mélanger 500uL
d'acryl./bisacryl. 29:1 (24169­100), 2,2mL d'eau distillée, 940uL de Tris­HCl (0.5M, pH 6.8), 38uL de SDS à
Alfa Aesar
Western Blot Protocol - R...
10% (MB­015), 38uL d'APS à 10%, et 4uL de TEMED (1718­0030). Bien mélanger la solution et pipetter
immédiatement au­dessus du gel de séparation. Ajouter le peigne.
8. Après que le gel de concentration ait complètement polymérisé, retirer le peigne. Charger le gel de
polyacrylamide dans l'appareil à gel SDS­PAGE comme indiqué par le fourniseur et pré­remplir les chambres
ainsi que les puits du gel avec du tampon de migration SDS­PAGE 1X.
9. Mettre 5ul de Multicolor Protein Marker (TM0005) dans la première ligne du mini gel SDS­PAGE à l'aide d'une
pipette..
10. Chauffer les lysats cellulaires de l'étape 5 à température ambiante, centrifuger brièvement, et charger 20­30 ul
d'échantillon par puits.
AnaSpec
11. Démarrer la migration jusqu'à ce que le marqueur atteigne le bas du gel. 
12. Préparer le transfert en utilisant un système de buvard à réservoir humide: 

Laver l'appareil de transfert et les éponges avec de l'eau juste avant usage. Ajouter du tampon de transfert SDS­PAGE 1X au réservoir contenant les
éponges. A l'aide de ciseaux, couper les membranes de transfert en nitrocellulose et du papier buvard Whatman un peu plus large que le gel SDS­PAGE.
Tremper les membranes de nitrocellulose et le papier buvard dans du tampon de transfert SDS­PAGE 1X. Démonter le gel SDS­PAGE, et préparer des
tas dans la cassette de transfert selon l'ordre suivant: partie blanche de la cassette/éponge/papier buvard/membrane de nitrocellulose/gel/papier buvard/
éponge/partie noire de la cassette.
Une pipette de 10mL devrait être utilisée pour enlever les bulles après que le dernier papier buvard soit mis sur le tas.
Arbor Assays
Fermer et mettre la cassette dans l'appareil de transfert en faisant attention à la polarité positive (blanc/rouge) et négative (noir).

13. Ajouter une tige magnétique au réservoir, fermer le couvercle et effectuer le transfert à 4°C en remuant. Un courant continu de 300mA pendant 2 heures est
généralement conseillé.
14. Une fois le transfert terminé, déplacer la membrane de nitrocellulose sur une plaque en verre ou en plastique. 
Note: une boîte de cônes est utile pour ce genre de manipulation.

Optionnel: Protocole de marquage au rouge Ponceau. Preparer la solution de marquage au rouge Ponceau, en
Array Bridge Inc
mélangeant 10mL d'eau distillée, 0,3mL d'acide acétique froid, 33mg de rouge Ponceau, bien mélanger puis ajouter une
quantité suffisante d'eau distillée pour obtenir un volume final de 30mL. Laver la membrane de nitrocellulose deux fois avec
de l'eau distillée puis marquer la membrane de nitrocellulose avec la solution de marquage au rouge Ponceau pendant 5
minutes avec une agitation douce. Retirer la solution de marquage au rouge ponceau et laver la membrane avec de l'eau
distillée au moins trois fois et visualiser les protéines cellulaires. 
 

A ce stade, il est possible d'évaluer sur la membrane si la quantité de protéine mise dans chaque puits est
Ascendance Biotechnology
similaire. Il peut être utile de prendre une photo ou scanner la membrane marquée ou de couper la
membrane horizontalement afin d'utiliser un anticorps primaire sur la partie supérieure de la membrane et
un autre sur la partie inférieure. 

15. Laver la membrane avec du PBST 1X.

Assay Biotech
Etape n° 4 ­ Saturation, Incubations d'anticorps, et détection
16. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de saturation pendant une heure à température ambiante avec une agitation douce.
17. Laver la membrane avec du PBST 1X.
18. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de dilution d'anticorps primaire en présence de l'anticorps primaire à la dilution appropriée (e.g. 10uL pour une
dilution à 1:1000), pendant toute la nuit à 4°C avec une agitation douce, ou pendant une heure à température ambiante.
19. Collecter l'anticorps dilué et le garder pour des utilisations ultérieures à 4°C. 
20. Laver la membrane trois fois avec 10mL de PBST.
Bayou Biolabs
21. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de dilution d'anticorps secondaire en présence de l'anticorps
secondaire à la dilution appropriée (e.g. HRP anti­lapin si un anticorps primaire de lapin a été utilisé),  pendant une
heure à température ambiante. 
22. Eliminer l'anticorps secondaire et le tampon utilisés et laver la membrane de nitrocellulose 3 à 5 fois avec du
PBST pendant 5 minutes à chaque fois, avec une agitation douce.
Note: a ce stade, d'autres lavages supplémentaires avec une agitation plus forte améliorent souvent la ratio
signal/bruit de fond du Western Blot.
23. Preparer le substrat de l'ECL (Enhanced Chemiuminescence) (10mL): Mélanger 5mL de chacun des réactifs A
et B (SL100309). BBI Solutions
24. Suite au dernier lavage en PBST, éliminer le PBST et incuber la membrane dans 10mL de substrat de l'ECL pendant une minute avec une agitation douce.
25. Prendre la membrane avec des pinces, toucher le coin avec du papier absorbant et placer la membrane entre 2 feuilles de plastique transparent (par exemple:
transparents pour projecteurs, film saran, un sac plastique fin), et révéler la membrane en chambre noire avec un développeur.

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Désignation Référence Conditionnement


La vidéo et les photos ont été prises dans notre propre laboratoire. Merci à Aurélien Pitois (de la Plateforme de Production de
Protéines Recombinantes tebu­bio) qui a réalisé le WB. Cat.
Crédits photo/vidéo: François Tissandier (IT Manager chez tebu­bio).

BioAspect Inc.

Récapitulatif des réactifs requis

Désignation Référence Conditionnement


Cat.
BioAustralis Fine Chemicals
Ammonium Persulfate (APS) 1708­0100 100 g

Anti Goat IgG (HRP) GTX228416 1 mL


Anti Mouse IgG (HRP) GTX213111 1 mL

Anti Rabbit IgG (HRP) GTX213110 1 mL

Anti Sheep IgG (HRP) GTX26900 1 mg


Biocolor
Bovine Serum Albumin (BSA) Biotech Quality 1501­0100 100 g

DTT 25185­5 5 g


Glycerol, USP (Glycerine) 00084­1 1 kg

HEPES 1,0M pH 7,2 MB­062­0100 100 mL


LumiGOLD™ ECL Western Blotting Detection SL100309 250 mL
Kit BioLife Solutions

PBS 10X pH 7.2 MB­008 1 L

PBS 10X with azide pH 7,2 MB­011 1 L


PolyPAGE­40 24169­100 10 mL

Protein MultiColor Marker TM0005 2 x 300uL


RIPA Lysis Buffer 1X BiosensisMB­030­0050 50 mL
Ask your question
SDS 10% MB­015 100 mL

SDS PAGE Sample Buffer 2X MB­018 100 mL


Sodium Chloride 5M MB­047 100 mL

TEMED 1718­0030 30 mL


Total Protein Determination kit Bioworld technology
M1585 1 Kit

Tris Base Chemzymes Ultra Pure 23483­100 100 g


Tris Glycine Buffer (TG Buffer) 24088­500 500 mL

Western­blot grade Non­Fat Milk Powder 875014­200G 200 g

 
BosterBio

Selon vos propres conditions expérimentales, vous pouvez bien entendu adapter ce protocole si nécessaire.

BPS Bioscience

BroadPharm

Cedarlane Laboratories

Celartia

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Cell Applications

Cellix

CellResearch Corporation

Cellscript

Cellular Engineering Technologies
Ask your question

Celther Polska

CH3 BioSystems

CHI Scientific

Cypex

Cytoskeleton

Detroit R&D, Inc

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Dojindo EU Gmbh

Echelon Biosciences

Elabscience Biotech.

EnoGene Biotech

Enzium, Inc.
Ask your question

EpiCypher, Inc.

EpigenDx

Eurogentec

Exbio

Focus Biomolecules

Full Moon Biosystems

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Funakoshi

GeneCopoeia

Genomembrane

Gerbu

Globozymes
Ask your question

Goryo Chemical Inc

HemaCare Corp.

HyTest Ltd.

Illumina

Innovative Research

LifeSensors

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Lucerna Chem

Marker Gene Technologies

Mawi DNA Technologies LLC

Meridian Life Science

Montana Molecular

Ask your question

MTI­GlobalStem

Nanocs

NanoSurface Biomedical, Inc.

Osenses

Otogenetics Corporation

PBL Assay Science

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22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...

Peprotech

Percipio Biosciences

Platypus Technologies

Polysciences Europe

Prodo Laboratories
Ask your question

Progen

ProSpec­Tany TechnoGene

ProteinOne

Puracyp

Qualyst Transporter Solutions

Quansys Biosciences

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Raybiotech

ReproCELL

ReproCell Europe

Rockland

San Diego Blood Bank
Ask your question

Sanbio Monosan

Sanguine Biosciences

SciKon Innovation, Inc.

SignaGen Laboratories

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