Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Reagents
Homepage > Knowledge DB > Protocols >
Our reagents at a glance
SilenciX, Knockdown Cell Lines
Protocole de Western Blot (WB) Recommandé par les utilisateurs d'anticorps
Antibodies
Primary Antibodies
tebubio Secondary Antibodies
Hybridoma Cells
Support Products
Arrays
Functional Arrays
Protocole WB & conseils techniques améliorez la
Antibody Arrays
Protein Arrays
reproductibilité de vos résultats
Lectin Arrays
Support Products
Assays & Kits
Conformational Assays
Forts de leur propre expérience et de celle de nos utilisateurs d'anticorps tebubio, nos spécialistes anticorps vous
Cell Based Assays
proposent ce protocole Western Blot.
Functional Assays
Simplex Quantification
Un tutoriel conçu par les scientifiques, pour les scientifiques des étapes précises, utilisant des anticorps et des
Support Products
produits associés provenant de sources connues, validées et traçables, vous permettent d'assurer un niveau élevé de
Multiplex Quantification
fiabilité et de reproductibilité de vos expériences, en accord avec les nouvelles exigences de publication.
Cells, Media & Fractions
Primary Cells
Avec nos remerciements à Dr Mark Livingstone (Institut Pasteur, Paris), pour la préparation de ce protocole.
Subcellular Fractions
Media & ECM
Téléchargez le protocole en format PDF ici cliquez sur les liens en haut de la page pour le partager!
Cell Lines
Cell Lysates & RNA
Cell Separation
Plasma/Serum/Complement
Tissue Slides
Viruses
Support Products
Expression Vectors
Etape n°1 Les réactifs requis pour votre SDSPAGE et WB
AAV
Adenovirus
siRNA
Les solutions doivent être préparées avec de l'eau ultra pure déionisée ou un équivalent.
Transfection reagents
RNAi
TrisHCl (1.5M, pH 8.8): Mélanger 91g de Tris base (23483100) avec de l'eau distillée dans un volume total de 400mL. Ajuster le pH à 8.8 à l'aide du NaOH puis ,
ORF expression
ajouter de l'eau distillée pour obtenir un volume final de 500mL.
Genomics
PCR
10% APS (Ammonium Persulfate): Dissoudre 1g d'APS (17080100) dans de l'eau distillée pour un volume total de 10mL. Aliquoter dans des tubes de 1,5mL et
FISH
stocker à 20°C.
DNA Extractions
Reporter Assays
TrisHCl (0.5M, pH 6.8): Mélanger 30g de Tris base (23483100) dans de l'eau distillée pour un volume total de 400mL. Ajuster le pH à 6.8 à l'aide du NaOH puis,
Enzymes
ajouter l'eau distillée pour obtenir un volume final de 500mL.
Cloning Tools
DNA Controls
Tampon DS contenant du DTT 2X (1mL): Ajouter 50uL de DTT à 1M récemment préparé ou décongelé dans 1mL de tampon SDS 2X (MB018).
DNA Sequencing
Lab Consumables
Tampon de migration SDSPAGE 1X (1L): Mélanger 900mL d'eau distillée, 100mL de tampon TrisGlycine 10X (24088500), et 10mL de SDS 10% (MB015).
Beads & Microspheres
Buffers
Tampon de transfert SDSPAGE 1X (1L): Mélanger 700mL d'eau distillée, 100mL de tampon TrisGlycine 10X (24088500), et 200mL d'éthanol (100%).
Histology & Microscopy
Ladders & Agaroses
Plastics & Accessories
Pour les grosses protéines, certains protocoles recommandent de réduire la proportion en éthanol à 10% ou d'ajouter du SDS (<0.05%).
Prothermal
TMB
Lipidomics
PBST 1X (Phosphate Buffered Saline avec 0.1% de Tween 20): Ajouter 1mL de Tween 20 (T20) & 1L de PBS 1X.
Assays
Beads and Liposomes
Tampon de saturation (100mL): Mélanger 85mL d'eau distillée, 10mL de PBS/NaN
Lipid Interaction Tools 3 10X (MB011), 5g de lait écrémé en poudre (16020250), 100uL de Tween 20
(T20), bien mélanger. Stocker à 4°C.
Labeled Lipids
Lipids
Tampon de dilution pour anticorps primaire (100mL): Mélanger 85mL d'eau distillée, 10mL de PBS/NaN
miRNA 3 10X (MB 011), 5g de BSA (15010100) et bien
miRNA Assays
mélanger. Stocker à 4°C.
miRNA expression
miRNA inhibition
Tampon de dilution pour anticorps secondaire (100mL): Dissoudre 5g de lait écrémé WBgrade en poudre (875014200G), dans 95mL de PBST 1X et bien
miRNA qPCR
mélanger. Stocker à 4°C.
Molecules
Inhibitors & Activators
Anticorps secondaire: Selon les espèces utilisées pour produire l'anticorps primaire:
Chemicals
Lapin (GTX213110 01)
Labelling
Substrates
Souris (GTX213111 01)
Antibiotics & Metabolites
Libraries
Chèvre (GTX228416 01)
Polymers
Proteins & Peptides
Ces anticorps sont fournis en solution. Lorsque vous achetez des anticorps lyphilisés, resuspendez les anticorps dans une solution tampon 1X pour
Amino Acids & Synthesis Reagents
le stockage des anticorps secondaires (pour 10mL, mélanger 4,5 mL d'eau distillée, 100uL de HEPES (MB0620100), 300ul de NaCl à 5M (MB047),
Peptides
20mg de BSA (15010100), et 5mL de glycerol. Stocker les aliquots à 20°C.
Proteins
Synthesis reagents & tools
Transcriptomics
In Vitro Transcription
Microarrays
Etape n° 2 Préparation des échantillons Cellules de mammifères adhérentes cultivées dans une plaque
RNA Extractions
RNA Modifications
de 10cmRNA Sequencing
RTPCR
RNA Controls
1. Retirer le milieu de culture et laver les cellules 2 fois avec du PBS 1X, aspirer ce qui reste du tampon.
Others
2. Ajouter le tampon de lyse RIPA 1X (MB0300050) (250 µl) à chaque plaque 10cm. Gratter immédiatement les cellules pour les décoller de la plaque et transférer
Services
ce qui a été récolté dans un tube pour microcentrifuger. Garder les cellules dans la glace. Soniquer pendant 10 à 15 secondes à l'aide d'une sonde sonicatrice pour
tebubio's lab services at a glance
couper l'ADN.
Protein production in E.coli and HEK293
Alternativement, les lysats peuvent être microcentrifugés à la vitesse maximale à 4°C et le surnageant peut être collecté, cependant certaines protéines liées à
miRNA Profiling
l'ADN peuvent être perdues).
in vitro ingredient testing in cosmetology
3. Quantifier la quantité totale de protéines dans le lysat en utilisant le kit Total Protein Determination Kit (M1585), en respectant les instructions du fournisseur.
Brands
4. Mélanger 20ul de Tampon SDS 2X, 20ug de protéines totales (volume basé sur le kit), et une quantité suffisante de tampon de lyse RIPA 1X pour obtenir un
volume total de 40ul.
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 1/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
5. Chauffer l'échantillon à 95–100°C pendant 5 min, microcentrifuger brièvement, et stocker à 20°C jusqu'à la prochaine utilisation.
Etape n° 3 SDSPAGE et transfert sur Membrane de Nitrocellulose
Abnova
6. Préparer un mini gel de séparation SDSPAGE (10mL):
Dans un tube en plastique de 15mL, mélanger une solution d'acrylamide/bisacrylamide et d'eau distillée avec les volumes indiqués dans le Tableau 1,
selon le poids moléculaire de la protéine étudiée. Ajouter 2,5mL de TrisHCl (1.5M, pH 8.8), 100ul de SDS à 10% (MB 015), 80uL de APS à 10%, et 4uL
de TEMED (1718 0030). Bien mélanger la solution et pipetter immédiatement entre les deux plaques (plastique ou verre) comme indiqué par le manuel du
fournisseur SDSPAGE. Remplir la chambre jusqu'à atteindre un niveau qui soit 1cm en dessous du bas du peigne du gel lorsqu'il sera mis à la prochaine
étape. Recouvrez le gel avec de l'éthanol à 100%. Après que le gel de séparation ait polymérisé (environ 15 minutes), vider l'éthanol.
Advanced Biotechnologies
Tableau 1 Volumes de solution d'acrylamide/bisacrylamide et d'eau distillée requis pour faire un gel de polyacrylamide.
* Pour des résultats optimaux, utiliser acryl./bisacryl. 37.5:1 (24165100) pour des gels 12% et 15% et utiliser acryl./bisacryl. 29:1 (24169100) pour des gels 10%
et 7.5% gels.
7. Préparer un mini gel de concentration SDSPAGE : Dans un tube plastique de 15mL, mélanger 500uL
d'acryl./bisacryl. 29:1 (24169100), 2,2mL d'eau distillée, 940uL de TrisHCl (0.5M, pH 6.8), 38uL de SDS à
Alfa Aesar
Western Blot Protocol - R...
10% (MB015), 38uL d'APS à 10%, et 4uL de TEMED (17180030). Bien mélanger la solution et pipetter
immédiatement audessus du gel de séparation. Ajouter le peigne.
8. Après que le gel de concentration ait complètement polymérisé, retirer le peigne. Charger le gel de
polyacrylamide dans l'appareil à gel SDSPAGE comme indiqué par le fourniseur et préremplir les chambres
ainsi que les puits du gel avec du tampon de migration SDSPAGE 1X.
9. Mettre 5ul de Multicolor Protein Marker (TM0005) dans la première ligne du mini gel SDSPAGE à l'aide d'une
pipette..
10. Chauffer les lysats cellulaires de l'étape 5 à température ambiante, centrifuger brièvement, et charger 2030 ul
d'échantillon par puits.
AnaSpec
11. Démarrer la migration jusqu'à ce que le marqueur atteigne le bas du gel.
12. Préparer le transfert en utilisant un système de buvard à réservoir humide:
Laver l'appareil de transfert et les éponges avec de l'eau juste avant usage. Ajouter du tampon de transfert SDSPAGE 1X au réservoir contenant les
éponges. A l'aide de ciseaux, couper les membranes de transfert en nitrocellulose et du papier buvard Whatman un peu plus large que le gel SDSPAGE.
Tremper les membranes de nitrocellulose et le papier buvard dans du tampon de transfert SDSPAGE 1X. Démonter le gel SDSPAGE, et préparer des
tas dans la cassette de transfert selon l'ordre suivant: partie blanche de la cassette/éponge/papier buvard/membrane de nitrocellulose/gel/papier buvard/
éponge/partie noire de la cassette.
Une pipette de 10mL devrait être utilisée pour enlever les bulles après que le dernier papier buvard soit mis sur le tas.
Arbor Assays
Fermer et mettre la cassette dans l'appareil de transfert en faisant attention à la polarité positive (blanc/rouge) et négative (noir).
13. Ajouter une tige magnétique au réservoir, fermer le couvercle et effectuer le transfert à 4°C en remuant. Un courant continu de 300mA pendant 2 heures est
généralement conseillé.
14. Une fois le transfert terminé, déplacer la membrane de nitrocellulose sur une plaque en verre ou en plastique.
Note: une boîte de cônes est utile pour ce genre de manipulation.
Optionnel: Protocole de marquage au rouge Ponceau. Preparer la solution de marquage au rouge Ponceau, en
Array Bridge Inc
mélangeant 10mL d'eau distillée, 0,3mL d'acide acétique froid, 33mg de rouge Ponceau, bien mélanger puis ajouter une
quantité suffisante d'eau distillée pour obtenir un volume final de 30mL. Laver la membrane de nitrocellulose deux fois avec
de l'eau distillée puis marquer la membrane de nitrocellulose avec la solution de marquage au rouge Ponceau pendant 5
minutes avec une agitation douce. Retirer la solution de marquage au rouge ponceau et laver la membrane avec de l'eau
distillée au moins trois fois et visualiser les protéines cellulaires.
A ce stade, il est possible d'évaluer sur la membrane si la quantité de protéine mise dans chaque puits est
Ascendance Biotechnology
similaire. Il peut être utile de prendre une photo ou scanner la membrane marquée ou de couper la
membrane horizontalement afin d'utiliser un anticorps primaire sur la partie supérieure de la membrane et
un autre sur la partie inférieure.
15. Laver la membrane avec du PBST 1X.
Assay Biotech
Etape n° 4 Saturation, Incubations d'anticorps, et détection
16. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de saturation pendant une heure à température ambiante avec une agitation douce.
17. Laver la membrane avec du PBST 1X.
18. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de dilution d'anticorps primaire en présence de l'anticorps primaire à la dilution appropriée (e.g. 10uL pour une
dilution à 1:1000), pendant toute la nuit à 4°C avec une agitation douce, ou pendant une heure à température ambiante.
19. Collecter l'anticorps dilué et le garder pour des utilisations ultérieures à 4°C.
20. Laver la membrane trois fois avec 10mL de PBST.
Bayou Biolabs
21. Incuber la membrane dans 10mL de tampon de dilution d'anticorps secondaire en présence de l'anticorps
secondaire à la dilution appropriée (e.g. HRP antilapin si un anticorps primaire de lapin a été utilisé), pendant une
heure à température ambiante.
22. Eliminer l'anticorps secondaire et le tampon utilisés et laver la membrane de nitrocellulose 3 à 5 fois avec du
PBST pendant 5 minutes à chaque fois, avec une agitation douce.
Note: a ce stade, d'autres lavages supplémentaires avec une agitation plus forte améliorent souvent la ratio
signal/bruit de fond du Western Blot.
23. Preparer le substrat de l'ECL (Enhanced Chemiuminescence) (10mL): Mélanger 5mL de chacun des réactifs A
et B (SL100309). BBI Solutions
24. Suite au dernier lavage en PBST, éliminer le PBST et incuber la membrane dans 10mL de substrat de l'ECL pendant une minute avec une agitation douce.
25. Prendre la membrane avec des pinces, toucher le coin avec du papier absorbant et placer la membrane entre 2 feuilles de plastique transparent (par exemple:
transparents pour projecteurs, film saran, un sac plastique fin), et révéler la membrane en chambre noire avec un développeur.
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 2/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
BioAspect Inc.
Récapitulatif des réactifs requis
BosterBio
Selon vos propres conditions expérimentales, vous pouvez bien entendu adapter ce protocole si nécessaire.
BPS Bioscience
BroadPharm
Cedarlane Laboratories
Celartia
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 3/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Cell Applications
Cellix
CellResearch Corporation
Cellscript
Cellular Engineering Technologies
Ask your question
Celther Polska
CH3 BioSystems
CHI Scientific
Cypex
Cytoskeleton
Detroit R&D, Inc
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 4/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Dojindo EU Gmbh
Echelon Biosciences
Elabscience Biotech.
EnoGene Biotech
Enzium, Inc.
Ask your question
EpiCypher, Inc.
EpigenDx
Eurogentec
Exbio
Focus Biomolecules
Full Moon Biosystems
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 5/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Funakoshi
GeneCopoeia
Genomembrane
Gerbu
Globozymes
Ask your question
Goryo Chemical Inc
HemaCare Corp.
HyTest Ltd.
Illumina
Innovative Research
LifeSensors
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 6/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Lucerna Chem
Marker Gene Technologies
Mawi DNA Technologies LLC
Meridian Life Science
Montana Molecular
MTIGlobalStem
Nanocs
NanoSurface Biomedical, Inc.
Osenses
Otogenetics Corporation
PBL Assay Science
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 7/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Peprotech
Percipio Biosciences
Platypus Technologies
Polysciences Europe
Prodo Laboratories
Ask your question
Progen
ProSpecTany TechnoGene
ProteinOne
Puracyp
Qualyst Transporter Solutions
Quansys Biosciences
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 8/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Raybiotech
ReproCELL
ReproCell Europe
Rockland
San Diego Blood Bank
Ask your question
Sanbio Monosan
Sanguine Biosciences
SciKon Innovation, Inc.
SignaGen Laboratories
Smartox Biotechnology
Solvo Biotechnology
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 9/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Spirochrome AG
StemCultures
Stemgent
Sunred Biological Technology
Surmodics
Ask your question
Target Mol
Tataa Biocenter
tebubio
Time Bioscience
Trilink Biotechnologies
XCell Science Inc.
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 10/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Xenotech
ZenBio
Contact Us
Leave a message
Send
Reset
Your message was sent successfully! We will answer you within 24 hours.
Uh oh, something went wrong, try refreshing and submitting the form again.
Your local contact
tebu bio Sas
39 Rue de Houdan Ask your question
All our offices
78610 Le Perray En Yvelines
France
+33 1 30 46 39 00 | france@tebubio.com
Tebu-bio
39 Rue de Houdan, 78610 Le Perray- Enregist...
en-Yvelines
Agrandir le plan
Meetings → all meetings
10/24 Photodynamic Therapy and Photodiagnosis update
11/03 IX Symposium JeCCo
11/03 Dutch Chromatin Meeting 2016
11/03 5th I3S Annual Meeting Instituto de Investigação e Inovação em Saúde
11/12 Society for Neuroscience Annual Meeting SFN2016
Follow us
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 11/12
22/10/2016 Protocole de Western Blot (WB) - Recommandé par les utilisateu...
Promotions
http://www.tebu-bio.com/kdb/protocols/76/Protocole_de_Western_Blot_WB_Recommand%C3%A9_par_les_utilisateurs_d_anticorps_tebu_bio.html 12/12