L'effet protecteur de l'extrait méthanolique de catéchu indien contre la neurotoxicité

induite par le chlorure d'aluminium, un modèle de rongeur de la maladie d'Alzheimer

Résumé
La maladie d'Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus courante avec un large
éventail de manifestations, d'évolutions et de causes contributives. Bien qu'il ait été caractérisé
cliniquement il y a longtemps; aucun traitement n'a été développé qui pourrait améliorer la
pathologie ou ralentir la manifestation de la maladie jusqu'à présent. L'extrait méthanolique de
catéchu indien (ICME) s'est avéré avoir de multiples effets bénéfiques qui soutiennent son
utilisation dans plusieurs troubles, en particulier ceux d'étiologie complexe. Dans la présente
étude, nous avons évalué l'effet neuroprotecteur de l'ICME dans un modèle de rat de la MA à
l'aide de chlorure d'aluminium (AlCl3).
Mots clés
maladie d’Alzheimer, Catéchu indien, Acétylcholinestérase et neuro-monamines, Protéines
bêta-amyloïdes , Tauopathies ,Stress oxydant
1 . introduction
La MA est la cause la plus courante de démence qui affecte plus de 35 millions de personnes
dans le monde et ce nombre devrait atteindre 65,7 millions d'ici 2030. La démence et le déclin
cognitif induits par la MA peuvent augmenter la vulnérabilité aux accidents des patients,
classant la MA comme la quatrième cause de décès dans la population âgée. Le nombre de
personnes atteintes de la MA devrait augmenter considérablement au cours des prochaines
années, car la proportion de la population âgée de 65 ans ou plus augmente fortement
( Alzheimer's Association, 2019 ).
La pathogenèse de la MA n'est pas identifiée, cependant, la neuropathologie de la MA est
généralement caractérisée par des plaques séniles, des enchevêtrements neurofibrillaires et une
perte de neurones cholinergiques dans le noyau basal de Meynert. De multiples facteurs
étiologiques ont été suggérés pour contribuer à sa pathogenèse. Certains gènes à risque ont été
suggérés pour augmenter le dépôt de plaques bêta-amyloïdes, ainsi qu'une phosphorylation
anormale de la protéine tau pour former les enchevêtrements neurofibrillaires communs
( Kunkle et al., 2019 ). De plus, l'inflammation, le stress oxydatif ( Simunkova et al., 2019 ), le
déficit hormonal (œstrogène) ( Kong et al., 2019 ) et le vieillissement ont un rôle corroborant
( Selkoe, 2019 ).). De plus, selon la théorie cholinergique, le développement des symptômes de
la maladie d'Alzheimer est principalement lié à des altérations structurelles des synapses
cholinergiques, à la perte de sous-types spécifiques de récepteurs de l'acétylcholine (ACh), à la
mort des neurones générateurs d'ACh et, par conséquent, à la détérioration des
neurotransmission cholinergique. Ces problèmes conduisent à une accumulation relative de
l'enzyme hydrolysant l'ACh, l'acétylcholinestérase (AChE) ( Stanciu et al., 2020 ).
L'aluminium est le troisième élément le plus courant dans la croûte terrestre avec des niveaux
élevés d'exposition de l'être humain attendus par les ustensiles de cuisine, les antiacides
alimentaires et les déodorants ainsi que diverses applications industrielles ( Singh et Goel,
2015 ). L'aluminium est connu comme un agent neurotoxique puissant qui peut traverser la
barrière hémato-encéphalique dans des conditions normales et est largement distribué dans
différentes zones du cerveau. Il a été démontré que l'aluminium induisait des dommages
oxydatifs au cerveau, la mort neuronale, la dégradation des neurones cholinergiques et le dépôt
d'amyloïde avec des déficits ultérieurs de mémoire et d'apprentissage ( Alexander et al.,
1996 ; Germano et Kinsella, 2005 ; Miu et al., 2006). De plus, l'aluminium est considéré
comme un agent environnemental potentiellement dangereux avec un rôle suspecté dans le
développement de la maladie d'Alzheimer (MA), car des niveaux plus élevés d'aluminium ont
été signalés dans le cerveau de patients atteints de MA avec des niveaux plus élevés dans
l'hippocampe ( Rondeau et al., 2009 ; Kaur et Gill, 2006 ). De plus, l'aluminium provoque un
mauvais repliement des protéines du cytosquelette, ce qui conduit à la formation de plaques
amyloïdes et d'enchevêtrements neurofibrillaires dans le cerveau ( Campbell et al.,
2000 ; Kawahara et al., 2001 ). Par conséquent, il est largement accepté d'utiliser Al pour
induire des changements neurodégénératifs chez les animaux pour simuler la MA.
Actuellement, les médicaments disponibles pour la MA sont principalement des inhibiteurs de
la cholinestérase. Cependant, l'efficacité de ces médicaments est limitée car ils ne sont pas
capables d'arrêter complètement la progression de la maladie ( Sharma, 2019 ). Cela pourrait
être attribuable à la nature complexe de l'étiologie de la maladie. En tant que tel, un
médicament qui comprend différentes fonctions protectrices ainsi que des effets
anticholinestérasiques, pourrait offrir une approche thérapeutique prometteuse pour la MA.
Il a été rapporté que de nombreuses plantes ont un avantage thérapeutique dans les cas de
troubles de la mémoire, de la maladie d'Alzheimer (MA) et de maladies liées à la vieillesse. Fait
intéressant, au cours des 20 dernières années, certaines préparations à base de plantes
médicinales se sont avérées efficaces pour ralentir les manifestations de la démence et de la MA
( Tian et al., 2010 ).
Acacia catechu, également connu sous le nom de kattha (ourdou), est une plante commune en
Inde, dans d'autres pays asiatiques et en Afrique de l'Est. Traditionnellement, A. Acacia catechu
( A. catechu ), communément appelé « khair » en Inde, a des utilisations médicinales bien
connues ( Hazra et al., 2010 ) en raison de la variété de ses actions, par exemple anti-
inflammatoire, antidiabétique, effets antioxydants et anticholinestérase ( Ray et al.,
2006 ; Wadood et al., 2007 ). Le potentiel d'utilisation de l'extrait méthanolique de catéchu
indien (ICME) dans la gestion des maladies neurodégénératives n'a pas été étudié. Par
conséquent, la présente étude a été menée pour évaluer les effets anti-Alzheimer de l'extrait
méthanolique de catéchu indien sur un modèle animal utilisant la neurodégénérescence induite
par le chlorure d'aluminium.
2 . Matériaux & méthodes
2.1 . Questions éthiques
Cette étude a été menée conformément aux procédures et politiques éthiques du comité local de
bioéthique de la Northern Border University, en Arabie saoudite. Quarante rats Wistar mâles
pesant environ 250 ± 50 g ont été utilisés dans cette étude. Les rats ont été hébergés dans des
cages en polypropylène bien ventilées avec un cycle d'obscurité léger maintenu de 12/12 h à
une température de 25 ± 3 °C et 30 à 60 % d'humidité avec un accès libre à de la nourriture et
de l'eau standard. Les rats ont été autorisés à s'acclimater à ces conditions pendant une semaine
avant les expériences. Ensuite, les expériences ont été menées entre 09h00 et 17h00 en phase
lumineuse.
2.2 . Produits chimiques
Tous les produits chimiques utilisés dans l'étude ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (St
Louis, MO, USA) à moins qu'une autre source ne soit spécifiée.
2.3 . Préparation d'extrait méthanolique de catéchu indien (ICME)
Le catchu commercial a été acheté sur le marché local car il est largement vendu comme additif
alimentaire. Il est préparé par ébullition avec évaporation du breuvage résultant d'écorce d'A.
Catechu. La présence d' Uncaria gambier a été exclue par les résultats négatifs du test à la
fluorescéine de Gambier ( Ray et al., 2006 ). 75 g de la poudre ont été extraits de manière
exhaustive avec 95 % de méthanol. Les extraits méthanoliques ont été filtrés, évaporés sous
vide à 35 °C, lyophilisés et conservés à -20 °C ( Patil et Modak, 2017 ). D'autres dilutions de
l'extrait ont été préparées dans l'eau.
2.4 . Test d'activité anti-cholinestérase (AChE)
L'activité AChE a été mesurée sur la base de la méthode d' Ellman et al. (1961) , adapté pour un
format de plaque de microtitrage selon Nwidu et al. (2017) . Les activités anticholinestérase de
l'ICME ont été testées à des concentrations de 0,2, 2, 20 et 200 g/mL. Un test de contrôle
négatif effectué en l'absence d'AChE a fourni un blanc réactif. L'ésérine (3 M) a été utilisée
comme témoin positif bien connu. Le pourcentage d'inhibition de l'AChE par l'ICME a été
calculé par rapport à l'inhibition par l'ésérine, en supposant que l'ésérine (3 µM) produit 100 %
d'inhibition des activités enzymatiques. Les expériences ont été menées en triple pour les
différentes concentrations étudiées.
2.5 . Essai de piégeage des radicaux 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
Les activités antioxydantes de l'extrait ont été évaluées par un essai de piégeage des radicaux
DPPH selon Nwidu et al. (2017) en utilisant des concentrations finales de 1, 10, 100 et 1000
μg/mL. L'acide ascorbique a été utilisé comme témoin positif. La capacité de piégeage
radicalaire de l'extrait a été mesurée en calculant le pourcentage de piégeage radicalaire
DPPH. Les expériences ont été menées en triple pour les différentes concentrations étudiées.
2.6 . Induction du modèle de toxicité du chlorure d'aluminium
Trente rats choisis au hasard ont été divisés en quatre groupes contenant 10 animaux
chacun. Groupe I : rats traités avec une solution saline normale par gavage oral. Groupe II : rats
induits par 100 mg/kg d'AlCl3 b. poids quotidiennement pendant 60 jours par gavage oral
( Nampoothiri et al., 2015 ). Groupe III : rats induits avec AlCl3 comme groupe II et ont ensuite
reçu ICME (3 mg/kg/jour) IP sur une base quotidienne pendant 15 jours. Après 24 h de
l'administration de la dernière dose, des échantillons de sang ont été prélevés dans des tubes
anticoagulants d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA). Puis les rats ont été sacrifiés par
décapitation sous anesthésie au thiopental.
2.7 . Études neurocomportementales
2.7.1 . Champ ouvert
Les activités locomotrices et comportementales ont été évaluées par le test de surveillance de
l'activité en plein champ suivant Rajasankar et al. (2009) à l' aide d'un appareil en bois divisé en
16 (4 × 4) carrés. Le rat est placé à l'intérieur de la boîte et a eu le temps de se familiariser avec
l'atmosphère d'essai, puis il a été observé pendant 5 min pour le nombre et le motif des carrés
explorés, le temps total d'immobilité (mesuré en secondes), le nombre d'élevage et le nombre de
boulettes fécales.
2.7.2 . Le labyrinthe aquatique de Morris
L'effet de l'AlCl3 et de l'ICME sur la rétention de la mémoire de travail et spatiale chez les rats
a été évalué par le labyrinthe aquatique de Morris ( Morris, 1984 ; Nunez, 2008 ). L'animal a
été autorisé pendant 120 s à localiser la plate-forme et s'il a échoué, il est guidé vers celle-
ci. Alors que l'animal a été autorisé à rester sur la plate-forme pendant pas plus de 20 s. La
mémoire spatiale a été enregistrée par le temps pris (S) par le rat depuis son point d'immersion
jusqu'à ce qu'il atteigne la plate-forme depuis l'immersion dans la piscine. Alors que la mémoire
de travail a été enregistrée par le temps passé (S) par le rat dans le quadrant cible (maximum de
120 s) sans la plate-forme.
2.7.3 . Reconnaissance d'objets nouveaux
La reconnaissance d'objets nouveaux a été réalisée selon la méthode d' Antunes et Biala
(2012) . Pendant la phase de récupération, l'animal a été autorisé à explorer le terrain pendant
10 min. Les fonctions hippocampiques ont été évaluées à travers les indices de discrimination et
de reconnaissance, qui ont été mesurés en fonction du temps passé par les animaux à explorer
les objets familiers et nouveaux.
2.8 . Collecte de tissus
Après décapitation, le cerveau entier de chaque animal a été rapidement disséqué,
soigneusement lavé avec une solution saline isotonique, séché, pesé, puis divisé à mi-sagittal en
deux moitiés. L'hémisphère gauche a été spécifié pour les études histopathologiques dont la
moitié droite de chaque cerveau a été homogénéisée immédiatement après Carter et
al. (2007) . La teneur en protéines de l'homogénat cérébral a été estimée par la méthode
de Lowry ( Lowry et al., 1951 ) pour des investigations biochimiques plus poussées. Pour le
dosage de fragmentation de l'ADN, une partie de l'hémisphère a été lysée ont été
homogénéisées dans un tampon de lyse l (pH 8,0) en utilisant 10 fois leur volume suivant Wu et
al. (2002) .
2.9 . Dosage de l'acétylcholinestérase
L'activité AChE a été mesurée en utilisant la méthode d'Ellman ( Ellman et al., 1961 ) comme
indiqué avant d'utiliser les homogénats de cerveau des animaux témoins et traités comme
source d'enzyme cholinestérase. L'homogénat cérébral a été préparé à partir des zones corticales
et hippocampiques de l'hémisphère cérébral droit selon Carter et al. (2007) .
2.10 . Dosage des amines biogènes
Une chromatographie liquide haute performance en phase inversée (HPLC) avec un détecteur
électrochimique a été réalisée pour détecter les niveaux d'amines biogènes [noradrénaline (NA),
dopamine (DA), 5-hydroxytryptamine (5-HT)] dans des échantillons d'homogénats de cerveau
( Haider et al ., 2011 , 2014 ).
2.11 . Marqueurs biochimiques du stress oxydatif
2.11.1 . Production d'espèces réactives
Les espèces réactives à l'oxygène et les niveaux d'espèces azote-oxygène ont été étudiés en tant
que biomarqueurs du stress oxydatif. Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les tissus
cérébraux collectés ont été mesurées selon Singh et al. (2018) . Le niveau de ROS a été mesuré
par spectrophotométrie en utilisant des longueurs d'onde de 499 nm et 520 nm comme
longueurs d'onde d'excitation et d'émission respectivement.
2.11.2 . Essai de peroxydation lipidique (LPO)
La LPO a été estimée par les substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS) selon la
méthode de Niehaus et Samuelsson (1968) en utilisant le réactif tertiobutanol −acide
trichloroacétique−acide chlorhydrique (TBA–TCA–HCl). La fluorescence du surnageant de
couleur rose clair a été lue à 532 nm. Les données LPO ont été représentées en mol de MDA/g
de cerveau.
2.11.3 . Glutathion réduit
La teneur réduite en glutathion (GSH) dans les échantillons de cerveau a été étudiée selon
le protocole d' Ellman (1959) . L'activité du GSH a été exprimée en nM de GSH/100 g de tissu.
2.11.4 . Activités des enzymes antioxydantes
L'activité catalase (CAT) a été évaluée selon le protocole de Sinha (1972) en utilisant un dosage
colorimétrique. En bref, le tissu homogénat (0,1 ml) ont été ajoutés à 1 ml de tampon phosphate
0,01 M (pH = 7) et 0,4 ml H 2 O 2 (2M). Enfin, 2 ml d'acide dichromate-acétique ont été ajoutés
pour arrêter la réaction et l'absorbance a été lue à 620 nm et présentée en micromoles
d'H 2 O 2 consommées par minute par mg de protéine.
Le dosage de la superoxyde dismutase (SOD) a été réalisé à l'aide d'un kit commercial ab65354
(Abcam) en suivant le protocole du fabricant. Le principe du dosage était basé sur la capacité de
la SOD à inhiber la réduction du nitrobleu de tétrazolium en bleu formazan par les anions
superoxydes. Les tissus ont été homogénéisés et centrifugés à 14000 pendant 5 min à 4°C. Le
surnageant, contenant les enzymes SOD cytosoliques et mitochondriales totales, a été
collecté. Vingt pi de chaque échantillon ont été ajoutés au mélange réactionnel dans la plaque à
96 puits et incubés pendant 20 min à 37 °C. Ensuite, l'absorbance a été lue à 450 nm. L'activité
SOD a été normalisée par rapport aux protéines tissulaires totales des échantillons testés en
mg. Une courbe standard a été préparée en utilisant la SOD obtenue auprès d'Abcam.
2.12 . essai de fragmentation de l'ADN
La quantité d'ADN fragmenté a été déterminée comme décrit précédemment par Wu et
al. (2002) avec de légères modifications. Les tissus cérébraux homogénéisés ont été centrifugés
à 27 000 xg pendant 20 min pour séparer l'ADN intact dans le culot cellulaire de la partie
fragmentée du surnageant. Le culot et le surnageant ont été mis en suspension dans 1 ml de
tampon TE (pH 8,0) contenant 10 mM de Tris-HCl et 1 mM d'EDTA et traités avec un réactif
diphénylamine. L'absorbance pour obtenir un complexe de couleur bleue a été lue à 595 nm.
2.13 . Test d'expression génique (rtPCR)
Le réactif Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY) a été utilisé pour extraire l'ARN total
des échantillons de cerveau en suivant le protocole du fabricant. La quantité et la pureté de
l'ARN extrait ont été mesurées par NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA). Les gènes ciblés et leurs amorces utilisées dans l'expérience ont été présentés dans
le tableau 1. L'expression du gène de la -actine a été utilisée comme standard interne pour
normaliser l'expression du gène ciblé. Les brins d'ADNc ont été synthétisés en utilisant un kit
de système de transcription inverse (Promega, Madison, WI). La qRT-PCR a été réalisée à
l'aide de HotStart-IT® FideliTaq™ PCR Master Mix (2X) (n° de catalogue 71156, Affymetrix,
USA). Les conditions de thermocyclage ont été ajustées à 95°C pendant 10 min ; 40 cycles à 95
°C pendant 7 s, 57 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 30 s. Les réactions ont été
effectuées en utilisant le système en temps réel CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). les
expressions des gènes ont été calculées et normalisées par rapport à l'expression de la -actine du
gène de référence interne. Ensuite, les valeurs des contrôles ont été normalisées à un pour une
expression plus facile des données. Les expériences ont été faites en triple.
Tableau 1 . Les gens évalués par rt-PCR et leurs amorces directes et inverses utilisées
dans l'étude.
2.14 . Western blot
Les protéines d'homogénat du cortex et de l'hippocampe ont été extraites et quantifiées selon la
méthode de Lowry. Western blot pour les protéines Amyloïde 1-42, Tau phosphorylée, Caspase
3, Bax, Bcl2, CAT, SOD1, SOD2 et la protéine de ménage β-actine, en tant que contrôle interne
bien reconnu, selon Singh et al. (2018). Les anticorps primaires suivants ont été utilisés ; anti-
Aβ1-42 et anti p-Tau (Beijing Biosynthèse Biotechnology Co., Ltd.), caspase monoclonale de
souris-3 p17, (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), anti-Bax (1:400, Cell Signaling Technology,
Danvers, MA, USA), anti-Bcl-2 (1:400, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA),
anti-actine (1:50 000; Millipore). Des anticorps secondaires, un anticorps secondaire de chèvre
anti-lapin et un anticorps anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (1:20 000) ont été
utilisés en conséquence (Both Santa Cruz Biotechnology). Ensuite, les membranes ont été
lavées trois fois pendant 15 min dans du TBST. Les bandes de protéines ont été visualisées par
une technique basée sur la chimiluminescence en utilisant un kit de substrat de transfert
Western (Thermo Scientific). Enfin, la densité des bandes de protéines a été évaluée à
l'aide du logiciel GelQuant.NET fourni parbiochemlabsolutions.com . La densité estimée a été
normalisée par rapport à la densité des bandes d'actine totale d'entretien avant leur analyse
statistique.
2.15 . Investigation histologique
Les secondes portions des cerveaux des rats sacrifiés ont été utilisées pour l'examen
histopathologique, par fixation avec du formol salin tamponné à 10 %. Des échantillons
d'autopsie ont été prélevés dans le cerveau de rats de différents groupes et fixés dans une
solution saline de formol à 10 % pendant vingt-quatre heures. Le lavage a été effectué à l'eau du
robinet, puis des dilutions en série d'alcool (alcool méthylique, éthylique et éthylique absolu)
ont été utilisées pour la déshydratation. Les échantillons ont été clarifiés dans du xylène et
inclus dans de la paraffine à 56° dans un four à air chaud pendant vingt-quatre heures. Des
blocs de tissus de cire d'abeille en paraffine ont été préparés pour être sectionnés à 4 microns
d'épaisseur par microtome à lame. Les coupes de tissus obtenues ont été recueillies sur des
lames de verre, déparaffinées, colorées par coloration à l'hématoxyline et à l'éosine pour
examen au microscope électrique optique ( Banchroft et al., 1996 ).
2.15.1 . Immunohistochimie
Comme la bêta-amyloïde et la tau sont des facteurs clés dans l'étiopathogénie de la MA,
l'immunohistochimie pour l'Aβ1-42 et la (p)-Tau phosphorylée dans le tissu cérébral des rats a
été réalisée selon Delcambre et al. (2016). Les lames ont été incubées avec des anticorps contre
anti-Aβ1-42 et anti p-Tau (Beijing Biosynthèse Biotechnology Co., Ltd.) Après lavage avec du
PBS, les lames ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de
raifort (1:2 000 ; chat n° sc-7074 ; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) à 25 °C
pendant 4 h. Les lames ont été visualisées avec de la 3,3'-diaminobenzidine et de l'hématoxyline
de Mayer à température ambiante pendant 3 min. Ensuite, les lames ont été déshydratées avec
de l'éthanol et du xylène. Et les images ont été capturées à l'aide d'un microscope optique
Olympus IX73 (grossissement x100 ; Olympus, Tokyo, Japon). Le logiciel ImageJ a été utilisé
pour évaluer l'intensité de l'expression Aβ1-42 et p-Tau.
2.15.2 . Le test de coloration TUNEL
La coloration TUNEL est principalement utilisée comme marqueur d'apoptose. L'évaluation
TUNEL a été typiquement réalisée selon Smith et al. (1997) protocole. Brièvement, les coupes
de cerveau ont été incubées avec 100 ml de solution de protéinase K (20 mg/ml) puis 100 ml de
H 2 O 2 (3 %) et lavées deux fois avec du PBS. Après lavage, la solution de mélange réactionnel
TUNEL a été ajoutée et la lame a été maintenue dans une chambre humide pendant une
heure. Ensuite, 50 ml de TUNEL ont été ajoutés et la lame a été contre-colorée avec de
l'hématoxyline pour la microscopie optique.
2.16 . analyses statistiques
Une ANOVA à sens unique avec le post-test de Tukey a été utilisée pour l'analyse statistique
des données des 3 groupes expérimentaux. La signification a été considérée comme une valeur
p < 0,05. Le logiciel Graph pad prism 5 a été utilisé pour toutes les analyses statistiques.
3 . Résultats
La présente étude a été menée pour évaluer l'effet de l'ICME en tant que matériel végétal anti-
Alzheimer. Le stress oxydatif et l'augmentation des activités de la cholinestérase sont les
caractéristiques de la MA. Par conséquent, les activités AChE, ainsi que les activités
antioxydantes de l'ICME, ont été évaluées. Premièrement, l'ICME s'est avéré avoir un effet
anticholinestérase efficace avec une IC50 estimée de 24 ± 2,3 g/ml. La concentration de 2 g/ml
a montré un effet significatif sur les activités enzymatiques ( Figure 1 A). De plus, le dosage de
l'activité de piégeage du DPPH a montré que l'ICME possédait une activité de piégeage du
DPPH significative à une concentration de 10 g/ml avec une CE50 estimée de 103 ± 3,2 g/ml
( Figure 1 B).
Figure 1 . A montre l'activité antichoinestrase de l'extrait méthanolique de catéchum
indien (ICME) selon le test d'Ellman modifié. L'inhibition a été montrée en pourcentage
de l'activité de l'ésérine atichoinestrase. B montre l'activité de piégeage des radicaux
DPPH de l'extrait méthanolique de catéchu indien (ICME). L'activité antioxydante de
l'ICME a été évaluée en pourcentage d'inhibition de la DPPH. La vitamine E a été
utilisée comme témoin positif. Les résultats ont été exprimés en moyennes ± SD. ∗
 signifie valeur p < 0,05, ∗∗ signifie valeur p < 0,01, tandis que ∗∗∗ signifie valeur p <
0,001 par rapport à l'échantillon de contrôle (échantillons sans ICME) en utilisant les
données de ligne après soustraction des blancs.
L'AlCL3 a été utilisé comme modèle de toxicité bien connu pour la MA. Après le
développement du modèle. Différents tests comportementaux et biochimiques ont été menés
pour évaluer l'effet toxique de l'AlCl3 ainsi que les effets protecteurs et thérapeutiques de
l'ICME. Premièrement, trois études comportementales ont été menées. Le test en plein champ a
montré que l'AlCl3 diminuait significativement sur le nombre de carrés explorés avec une
augmentation significative du temps total d'immobilité, alors qu'il n'y avait aucun effet observé
sur le nombre d'élevage et le nombre de boulettes fécales (Figures 2 A, B) . Le test du
labyrinthe aquatique de Morris a montré que l'AlCl3 augmentait considérablement le temps pris
par le rat depuis son point d'immersion jusqu'à atteindre la plate-forme dans la piscine ainsi que
le temps passé par le rat dans le quadrant cible sans la plate-forme ( Figure 2C, D). Un nouvel
essai de reconnaissance d'objet a montré que l'AlCl3 traité a montré une diminution
significative des indices de reconnaissance et de discrimination ( Figure 2 E, F). Fait
intéressant, ICME a montré un effet correctif significatif sur le dysfonctionnement cognitif et
comportemental induit par ALCl3 ( Figure 2 A-F).
Figure 2 . Effet toxique neurocomportemental de l'AlCl3 et potentiels thérapeutiques et
neuroprotecteurs de l'extrait méthanolique de catéchum indien (ICME) en utilisant les
paramètres de dosage suivants. 1. Test en plein champ : A. carrés explorés, B. temps total
d'immobilité ; 2. Labyrinthe aquatique de Morris : C. le temps nécessaire pour s'échapper
vers la plate-forme, D. le temps passé dans le quadrant cible ; 3. Test de reconnaissance
d'objets nouveaux : E. indice de discrimination, 2. indice de reconnaissance. Les résultats
ont été exprimés en moyennes ± SD. Les valeurs p de l'ANOVA unidirectionnelle ont été
présentées sur la figure. ∗ signifie valeur p < 0,05, ∗∗ signifie valeur p < 0,01, tandis que
∗∗∗ signifie valeur p < 0,001.
Concernant les activités des neurones cholinergiques des animaux traités. Les échantillons
traités par les rats AlCl3 ont montré une augmentation significative des activités de Ch.E dans
les régions corticales et hippocampiques avec une augmentation plus importante dans les
échantillons d'hippocampe. Les échantillons de cerveau du groupe III ont montré une
augmentation moindre des activités de Ch.E, ce qui est significativement inférieur aux niveaux
mesurés des activités enzymatiques chez les rats traités avec AlCl3 seul ( figure 3 A).
Graphique 3 . A montre l'activité de la cholinestérase dans le tissu cérébral des rats en
réponse à la neurotoxicité de l'AlCl 3 et l'effet neuroprotecteur de l'extrait méthanolique
de catechu indien (ICME). BD montre une chromatographie liquide haute performance
(HPLC) en phase inversée avec un détecteur électrochimique pour les changements dans
les niveaux d'amines biogènes [3B. Noradrénaline (NA), 4C. dopamine (DA), 3D. 5-
hydroxytryptamine (5-HT)] dans le cerveau homogéne des échantillons des rats traités
avec AlCl3 seul ou avec à la fois AlCl3 et ICME. Les résultats ont été exprimés en
moyennes ± SD. Les valeurs p de l'ANOVA unidirectionnelle ont été présentées sur la
figure. ∗ signifie valeur p < 0,05, ∗∗ signifie valeur p < 0,01, tandis que ∗∗∗ signifie
valeur p < 0,001.
L'effet de l'AlCl3 sur les monoamines biogènes a été évalué. La LC en phase inverse a montré
que l'AlCl3 provoquait une diminution significative des amines biogènes NA, DA et 5-TH
d'environ 59,3 ± 7,4, 62,8 ± 6,2 et 73,4 ± 5,3 des niveaux de contrôle, respectivement. ICME a
montré que les groupes traités ont montré que les amines biogènes NA, DA et 5-TH n'étaient
réduites que d'environ 26,7 ± 4,9, 20,5 ± 6,2 et 23,9 ± 6,4 des niveaux de contrôle des
émetteurs, respectivement ( Figure 3 B, C, RÉ).
Le stress oxydatif est connu pour jouer un rôle dans la neurotoxicité de l'AlCl3 ainsi que dans le
développement de la MA. Des marqueurs oxydatifs dans le tissu cérébral des rats ont été
étudiés. Les marqueurs de stress oxydatif ont montré que l'AlCl3 provoquait une augmentation
significative de la production de ROS en plus d'une augmentation significative de la
peroxydation lipidique avec une diminution significative parallèle des activités du CTA et de la
SOD et une réduction du glutathion. Il a été démontré que l'ICME neutralise de manière
significative l'effet de l'effet AlCl3 des ROS, de la peroxydation lipidique et du glutathion
réduit sans effet significatif des activités des activités CAT et SOD ( figure 4 A-E).
Figure 4 . AE montre les biomarqueurs du stress oxydatif dans le cerveau des rats
traités ; A. espèces réactives de l'oxygène (ROS), B. produit de peroxydation lipidique
par les substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS). C. Activités de l'enzyme
catalase antioxydante (CAT), D. Activités de l'enzyme superoxyde dismutase (SOD)
antioxydante. E. Activités réduites du glutathion (GSH-R). F. Données d'essai de
fragmentation de l'ADN en tant que marqueur de l'effet génotoxique induit par AlCl3
dans le cerveau des rats traités. Les résultats ont été exprimés en moyennes ± SD. Les
valeurs p de l'ANOVA unidirectionnelle ont été présentées sur la figure. ∗ signifie valeur
p < 0,05, ∗∗ signifie valeur p < 0,01, tandis que ∗∗∗ signifie valeur p < 0,001.
De plus, l'effet génotoxique de l'AlCl3 sur le cerveau des rats traités a été étudié à l'aide d'un
test de fragmentation de l'ADN. Les données ont montré que l'AlCl3 augmentait
significativement le pourcentage d'ADN fragmenté (~ 55 %), tandis que les rats traités par
ICME n'ont montré que (~ 25 %) d'ADN fragmenté ( figure 4 F).
L'effet d'AlCl3 dans l'expression génique pour les familles de gènes impliquées dans l'apoptose
et le stress oxydatif a été évalué par rt-PCR. Les données ont montré que AlCl3 provoquait une
augmentation significative de l'expression des protéines Caspase 3 et Bax avec une diminution
significative parallèle de l'expression des gènes Bcl2, SOD1, SOD2 et CAT. En outre, ICME a
montré un effet bénéfique significatif pour contrer l'effet de l'AlCl3 dans les échantillons de
tissus cérébraux traités ( figure 5 ). Fait intéressant, les données de western blot corroboraient
les données observées par rt-PCR ( figure 6 ).
Figure 5 . Données de rt-PCR concernant l'effet de l'AlCl3 et de l'extrait méthanolique de
catéchum indien (ICME) sur l'expression des familles de gènes impliqués dans le stress
oxydatif et l'apoptose : A. l'expression du gène codant pour le gène de la catalase de l'enzyme
antioxydante (CAT), B. L'expression du gène de l'enzyme antioxydante superoxyde dismutase
1 (SOD1). C. L'expression du gène de l'enzyme antioxydante superoxyde dismutase 2
(SOD2). D. L'expression du gène de la caspase 3 (Cas-3). E. L'expression du gène pro-
apoptotique (Bax), F. L'expression du gène anti-apoptotique (Bcl-2). Les données ont été
semées sous forme de plis de changements dans l'expression des gènes étudiés par rapport aux
échantillons de contrôle. Les résultats ont été exprimés en moyennes ± SD. Les valeurs p de
l'ANOVA unidirectionnelle ont été présentées sur la figure. ∗ signifie valeur p < 0,05, ∗∗
signifie valeur p < 0,01, tandis que ∗∗∗ signifie valeur p < 0,001.
Graphique 6 .données de transfert western concernant l'effet de l'AlCl3 et de l'extrait
méthanolique de catéchum indien (ICME) sur les niveaux de protéines du peptide bêta-
amyloïde 1-42 (Aβ1-42) et des protéines phosphorylées Tau (P-Tau) (marqueurs de la
maladie d'Alzheimer) ainsi que d'autres protéines impliquées dans le stress oxydatif et
l'apoptose : 5A et 5B montrent les données de western blot pour (Aβ1-42) et Tau
phosphorylée (P-Tau). 5C et 5D montrent les niveaux de protéines du gène de la catalase
(CAT) des enzymes antioxydantes, de la superoxyde dismutase 1 (SOD1) et de la
superoxyde dismutase 2 (SOD2). 5E et 5F montrent les niveaux de protéines de caspase
3 (Cas-3), pro-apoptotique (Bax), Les protéines anti-apoptotique (Bcl-2). Les données
 ont été semées sous forme de plis de changements dans les niveaux de protéines étudiées
par rapport aux échantillons de contrôle. Les résultats ont été exprimés en moyennes ±
SD. Les valeurs p de l'ANOVA unidirectionnelle ont été présentées sur la figure. ∗
signifie p-valeur <0,05,
Des études histopathologiques ont été réalisées pour évaluer les changements morphologiques
induits par les hippocampes de rats traités à l'AlCl3 ainsi que le rôle protecteur et thérapeutique
de l'ICME testé. Les données sur l'hématoxyline et l'éosine ont montré une diminution du
nombre de neurones dans les échantillons traités par AlCl3 avec des noyaux pycnotiques
profondément colorés et des axones allongés par compassion pour les échantillons témoins non
traités. L'ICME s'est avéré améliorer de manière significative les changements pathologiques
qui ont été trouvés dans le cerveau des rats modèles ( figure 7 A-C). L'immunocoloration a
montré une augmentation significative à la fois de Aβ1-42 et de pTau dans les cerveaux
modèles. Les rats traités par ICME ont montré une diminution marquée des deux protéines dans
les taux traités avec AlCl3 et ICME (Figures 7 D-I et 8UN B). Alors que la coloration TUNEL
a montré une augmentation significative de l'apoptose dans les échantillons de cerveaux traités
par le modèle AlCl3 par rapport aux témoins, tandis que le troisième groupe a montré un effet
thérapeutique et protecteur significatif de l'ICME (figures 7 J-I et 8 C).
Graphique 7 . Modifications morphologiques induites par l'AlCl3 et l'extrait méthanolique de
catéchu indien (ICME) dans les tissus cérébraux de rats. Des coupes de tissu cérébral ont été
colorées par H&E (400) (AC) et immunocolorées pour le peptide bêta-amyloïde 1-42 (Aβ1-42)
(400) (DF) et les protéines phosphorylées Tau (P-Tau) (400) (GI) . Des coupes de tissu cérébral
ont également été colorées par TUNEL (400) (JL). La coloration des cellules positives Aβ1 42,
P-Tau et TUNEL a été mesurée par l'analyseur d'image.
Figure 8 . A et B montrent les données quantitatives d'immuno-histochimie concernant
l'effet de l'AlCl3 et de l'extrait méthanolique de catéchum indien (ICME) sur les niveaux
de tissus cérébraux des rats du peptide bêta-amyloïde 1-42 (Aβ1-42) (A), phosphorylé
Tau (P- Tau) protéines (B). Alors que C montre des niveaux de cellules positives
TUNEL (C) chez les animaux non traités et traités. Les résultats ont été exprimés en
moyennes ± SD. Les valeurs p de l'ANOVA unidirectionnelle ont été présentées sur la
figure. ∗ signifie valeur p < 0,05, ∗∗ signifie valeur p < 0,01, tandis que ∗∗∗ signifie
valeur p < 0,001.
4 . Discussion
La présente étude a été menée pour évaluer les effets anti-Alzheimer de l'ICME à l'aide
d'un modèle de neurodégénérescence toxique AlCl 3 qui simule de nombreuses caractéristiques
de la MA ( Ali et al., 2016 ; Prema et al., 2017 ; Singh et al., 2018 ). Il a été démontré que
l'aluminium induisait des dommages oxydatifs au cerveau, la mort neuronale, la dégradation
des neurones cholinergiques ( Germano et Kinsella, 2005 ; Miu et al., 2006 ).
Une approche ethnopharmacologique du criblage des produits végétaux naturels contre les
activités de la cholinestérase est une stratégie rentable et largement acceptée pour développer de
nouveaux agents thérapeutiques efficaces. La présente étude a montré que l'ICME peut inhiber
efficacement l'AChE de manière dose-dépendante, ce qui permet d'autres potentiels
thérapeutiques dans la MA en tant qu'autre produit végétal commercialisé comme médicaments
pour la MA comme la rivastigmine et la galantamine avec des inhibiteurs de
l'acétylcholinestérase signalés ( Munoz-Torrero, 2008 ; Ballard et al., 2011 ; Syad et Devi
2014 ).
En outre, le test de piégeage DPPH a montré que l'ICME possédait un effet antioxydant
significatif. Cet effet antioxydant peut être lié à sa teneur en polyphénols et composés
flavonoïdes comme indiqué précédemment ( Patil et Modak, 2017 ) où la teneur totale en
phénols (valeurs équivalentes d'acide gallique) pour 0,1%, 0,3%, 0,5% ICME a été estimée à
0,74 ± 0,068, 2,27 ± 0,071, 2,93 ± 0,041, respectivement. Et la teneur totale en flavonoïdes
(équivalent de la riboflavine) pour 0,1 %, 0,5 % et 1 % d'ICME s'est avérée être respectivement
de 2,30 ± 0,063, 3,41 ± 0,065, 5,58 ± 0,177. Ces composés phénoliques et flavonoïdes sont
connus pour avoir des activités antioxydantes élevées ( Choudhary et Swarnkar, 2011). Par
conséquent, l'ICME peut jouer un rôle dans de nombreuses maladies dans lesquelles le stress
oxydatif est un facteur majeur de sa pathogenèse, comme c'est le cas dans la MA. Cette
hypothèse est étayée par d'autres études qui ont montré le potentiel de certaines plantes dans la
MA sur la base de leurs activités antioxydantes et de piégeage des radicules libres comme les
plantes Withanamides, Bacopa monnieri et Centella asiatica ( Limpeanchob et al.,
2008 ; Jayaprakasam et al., 2010 ; Roy et al., 2017 ).
Nous avons évalué les effets bénéfiques de l'ICME -sur la base de ces effets anti-cholinestérase
et antioxydants- contre le modèle induit par AlCl3 chez le rat. AlCl3 est connu pour induire des
effets comportementaux, biochimiques et histopathologiques sur les animaux traités. Le modèle
animal actuel a montré que l'effet toxique de l'AlCl3 sur les rats entraîne une altération
significative du comportement, en plus d'une augmentation marquée des activités de la
cholinestérase dans les tissus cérébraux accompagnée d'un stress oxydatif et d'une
génotoxicité. La transmission cholinergique a une haute priorité dans la pathogenèse de la MA
car ses dysfonctionnements sont principalement liés à la gravité de la démence chez les patients
MA ( Amberla et al., 1993 ; Hampel et al., 2019). L'aluminium est connu pour avoir une
cholinotoxine puissante avec des activités Ch.E élevées en modifiant la structure secondaire de
l'enzyme avec une altération marquée de la transmission cholinergique cérébrale ( Zatta et al.,
2002 ; Kakkar et Kaur, 2011 ). D'autre part, le traitement par ICME a conduit à une diminution
significative des activités de Ch.E chez les rats traités par AlCl3, ce qui suit les tests in vitro
concernant son effet anticholinestérase de l'ICME. Fait intéressant, les tests comportementaux
ont montré que l'ICME contrecarrait de manière significative les changements
neurocomportementaux induits par AlCl3 liés aux capacités cognitives, y compris la mémoire
et les compétences d'apprentissage.
En ce qui concerne l'effet de l'AlCl3 sur la transmission d'autres monoamines biogènes, la
présente étude a montré que l'AlCl3 réduisait significativement les niveaux de noradrénaline, de
dopamine et de sérotonine dans les tissus cérébraux, comme observé précédemment ( Liaqat et
al., 2017 ; Haider et al., 2014 ). Cela imite les niveaux cérébraux des monoamines chez les
patients atteints de MA. Il est intéressant de noter que l'ICME atténue considérablement l'effet
de l'AlCl3 sur les monoamines biogènes. Il a été suggéré que la diminution des monoamines
joue un rôle important dans le vieillissement et le développement des maladies
neurodégénératives ( Palmer et DeKosky, 1993). Par conséquent, l'effet actuellement rapporté
de l'ICME pour préserver les niveaux de monoamines chez les rats traités par AlCl3 est
également très suggestif pour leur effet thérapeutique contre les troubles neurodégénératifs, y
compris la MA. Il est intéressant de noter que la modification des monoamines (noradrénaline,
dopamine et sérotonine) a été précédemment ciblée comme potentiel thérapeutique pour
l' extrait éthanolique de Moringa oleifera qui a été signalé comme modifiant la monoamine
dans le modèle de MA induite par la colchicine chez le rat ( Ganguly et Guha, 2008 ).
Les résultats histopathologiques ont montré des effets neurodégénératifs évidents sous forme de
pycnose et de dégénérescence, ainsi qu'une accumulation excessive de protéines bêta-amyloïdes
et phosphorylées, qui sont considérées comme des pathologies caractéristiques de la MA,
comme cela a été observé dans des travaux antérieurs utilisant AlCl3 ( Ali et al., 2016 ; Prema
et al., 2017 ; Singh et al., 2018 ). Le dépôt de bêta-amyloïde extracellulaire et de Tau
phosphorylée intracellulaire est connu pour jouer un rôle important dans la pathogenèse de la
MA. Il a été suggéré que l'inflammation et le stress oxydatif induits par AlCl3 jouent un rôle
important dans le dépôt des deux protéines ( Perry et al., 2002 ; Tanzi et al., 2004 ; Xiong et al.,
2013 ;Ma et al., 2017 ; Sahu et al., 2014 ). De plus, la bêta-amyloïde s'est avérée induire un
stress oxydatif, qui joue un rôle important dans la progression de la MA ( Butterfield et al.,
2013 ). L'ICME a significativement diminué les deux dépôts de protéines dans les tissus
cérébraux des rats traités à l'AlCl3. Cela peut être dû à ses effets antioxydants significatifs
montrés dans l'étude et à son effet protecteur sur les enzymes antioxydantes CAT et SOD. De
plus, des études antérieures avaient rapporté l'effet anti-inflammatoire des extraits de plantes
comme Chandra et al. (2019) . L'effet anti-amyloïde de certaines plantes a été précédemment
évalué comme une modalité thérapeutique pour la MA comme le Ginkgo bilobaqui a montré un
effet d'agrégation anti-amyloïde. Sur la base de cet effet, d'autres études sur le Ginkgo
biloba ont montré qu'un apport quotidien de 240 mg de Ginkgo biloba peut réduire l'incidence
de la MA ( DeKosky et al., 2008 ).
5 . Conclusion
Comme la neurotransmission cholinergique altérée et le stress oxydatif jouent un rôle important
dans la pathogenèse de la MA, les résultats actuels peuvent soutenir l'utilisation de l'ICME en
tant que thérapeutique potentielle pour la MA car il montre un effet anticholinestérase marqué
et un effet antioxydant significatif. L'étude des rats a montré que l'ICME améliorait
significativement la neurotransmission cholinergique et réduisait l'effet génotoxique de l'AlCl3
avec une amélioration beaucoup plus importante de l'histopathologie et des résultats
biochimiques.