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Anatomopathologie et cyto-histologie
 COURS ADAPTÉ EN FONCTION:
DES SUPPORTS DE COURS DU DR. SONIA EL GUENDI

ET

reproduction interdite DES SUPPORTS DE COURS DU PR. MARIE-CHRISTINE MANY,

UNIVERSITÉ CATHOLIQUE DE LOUVAIN, LABORATOIRE
MORF/IREC

ORIGINE DE CERTAINES IMAGES :

BANQUES D’IMAGES DU PÔLE DE MORPHOLOGIE,

LABORATOIRE MORF /IREC /UCL.
Types d’études

Celld.com viabilité bleu trypan

Cellules vivantes

Cellules entières fixées

Culture cellulaire CHU Angers MGG

Coupe de tissus après

fixation et inclusion

Histologie MEDSI coloration APS Futura sciences neurones dopaminergiques vert

différenciés à partir de cellules souches en rouge
Histologie

Visualiser
Produire des Interprétation
des
images des images
structures
 Technique la plus fréquente permet une
Les techniques résolution
histologiques des structures entre 0.2 et 0.6μm.

Comment obtenir les coupes?

Introduction

Techniques histologiques
Etapes:
1. Prélèvement de l’organe en extemporanés

2. Fixation du prélèvement

3. Amincissement
1. Enrobage (Durcissement)
2. Coupes:
Représentations en deux dimensions (2D)
de cellules, tissus, organes tridimensionnels (3D)

4. Coloration

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Introduction Modèles expérimentaux

Techniques histologiques
Trois filières:
1. Congélation:
1. Fixation: Congélation de l’organe dans l’azote liquide (- 196 °C) Avantage : rapidité
2. Amincissement: Durcissement par le froid salle d’opération
Coupes de 5 µm d’épaisseur dans cryostat (-20 °C) => service d’anatomo-pathologie
3. Coloration : idem filière paraffine

2. Paraffine:

3. Résine:

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Introduction Modèles expérimentaux

Techniques histologiques
Trois filières:
1. Congélation:

2. Paraffine:
1. Fixation: Chimique dans du formaldéhyde 4% ( 24 à 48h) => précipitation des protéines

2. Amincissement: Déshydratation des tissus dans bains d’alcool

=> Extraction partielle des glucides => Traces blanchâtres d’aspect spumeux
Passage dans solvants de la paraffine = solvants organiques
=> Extraction des lipides => gouttelettes blanches bien délimitées
=> Enrobage dans paraffine liquide (+ 60° C) et durcissement à T° ambiante
Coupes de 5 µm d’épaisseur (microtome et lames de verre)

3. Coloration: Trois colorations de routine et des colorations spéciales

8 3. Résine:
 Modèles expérimentaux

Colorations de routine:
3 types de colorants :
• Hémalun (basique)
=> en bleu foncé des structures acides dites basophiles
(ADN,ARN des ribosomes, RER, …)
• Soit Eosine, soit Ponceau-Fuschine (acide)
 en rouge/rose des structures basiques dites acidophiles ou éosinophiles
(protéines, cytoplasme)

1. Trichrome de Masson Bleu: Bleu d’aniline mise évidence en bleu des fibres
collagènes I des tissus conjonctifs
2. Trichrome de Masson Vert: Vert lumière mise évidence en vert des fibres
collagènes I des tissus conjonctifs
3. HES Hémalun-éosine-safran: Safran mise évidence en jaune-orange des
fibres collagènes I des tissus conjonctifs

Adaptation ou extrait du cours du Pr. Marie-Christine Many, Université Catholique de Louvain, MORF/IREC. // Origines des images : Banques d’images du pôle de Morphologie de l’UCL, IREC.
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Introduction Modèles expérimentaux

Techniques histologiques
Trois filières:
1. Congélation:
2. Paraffine:
3. Résine: 1. Fixation: Glutaraldéhyde => polymérisation des protéines
ou Osmium => maintien des lipides (gouttelettes vertes)
2. Amincissement: Enrobage dans résine très dure
coupes semi-fines coupes ultra-fines
0,5 µm d’épaisseur 0,05 µm d’épaisseur
microscopie optique (MO) microscopie électronique (ME)

3. Coloration: Bleu de Toluidine Image en noir et blanc

- Nuance de bleus - structures denses aux électrons (foncées)
- structures peu denses aux électrons (claires)

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 Fragment d’organe inclus dans bloc de résine

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 PLAN

INCLUSION/
PRELEVEMENT FIXATION DESHYDRATATION AMINCISSEMENT
IMPREGNATION

Déparaffinage/
MONTAGE DESHYDRATATION COLORATION COLLAGE
réhydratation
 1- Prélèvements

➢ Autolyse cellulaire rapide: signes de

souffrance cellulaire

➢ Maintien de l ’architecture tissulaire

Prélèvements :
Biopsies
Pièces opératoires
Exérèses
Prélèvements

- un cadavre ( rapide)
- pièce opératoires (fixés)
- biopsie ( sans recoupes)

==> utiliser des instruments tranchants

==> artéfacts
==> Scalpel
Prélèvements
 2-La fixation
de conserver les structures et assure une dureté au tissu
- immobilisation des constituants tissulaires et cellulaires
- prévenir l’autolyse cellulaire
- prévenir la putréfaction bactérienne post-mortem
- permettre de réaliser des techniques histologiques et colorations ultérieures
- Fixateur chimique et physique
- Fixateur le plus commun (m.o) = formol 4%
* Stabilisation des tissus
le fixateur provoque la formation d’un réseau intermoléculaire stabilisé par des
liaisons covalentes

* Maintien des caractéristiques physico-chimiques et d’organisation

pas blocage des groupements chimiques particuliers qui pourraient faire l’objet
d’une coloration histochimique
 2.1 Fixation physique
• La congélation - 20 à -180 °C ==> azote liquide
•empêche l ’autolyse
•durcit le prélèvement
•coupe rapide possible
•meilleur système pour une biopsie
•cryostat
•Recherche , mais on peut le faire en routine
• La cryodessiccation
•congélation et évaporation complète sous vide
•utile lors de la recherche de petites molécules facilement hydrolysables dans le
tissu
 2.2 Fixateurs chimiques

L’éthanol: Le formol
fixe les glucides mais solvant (formaldéhyde=méthanol en
des lipides. Durcit les tissus. solution aqueuse):
• Utilisé pour les frottis mais non pour les pièces • Ponts méthyléniques inter et intraprotéines,
histologiques.
blocage de la cytolyse

• tue les éventuelles bactéries qui pourraient

dégrader le tissu. Bon pouvoir de
pénétration.

• Manipulation précautionneuse (risques pour

l’utilisateur: irritation des muqueuses…).
2.2 Fixateurs chimiques

Formol ou formaldéhyde 4% (24 à 48h)

! cancérogène
⚫ Fixation provoquant l’agrégation des macromolécules
bloquant l’activité biologique de la cellule et la rend plus
perméable à la coloration.
 2.2 Fixateurs chimiques
Le Liquide de Bouin:
mélange de formol, d’acide picrique en • Utilisé pour les pièces histologiques, de petite taille
solution dans l’eau ou l’éthanol préférentiellement en première intention (pénétration
(coagulation des protéines) et d’acide
acétique (bon fixateur nucléaire, mais lente). Convient à la microscopie optique uniquement.
altère collagène et mitochondries).

Liquide de Carnoy:
mélange d’alcool + • Utilisé pour les très petites pièces histologiques.
chloroforme + acide acétique.
Fixe bien les noyaux.

L’acide osmique (OsO4):

• Utilisé pour les tissus nerveux surtout, convient à la
stabilise bien les lipides mais microscopie électronique
perte de 20% des protéines.
 2.2 Fixateurs chimiques

• Préparer le fixateur en milieu tamponné. Les organes prélevés (ovaires à gauche

Un volume correspondant à 50x celui de la pièce à fixer est nécessaire. et testicules à droite) sont fixés par un
bain dans le liquide de Bouin.
• Prélever l’échantillon par biopsie ou dissection, le laver à l ’eau Photo F Jauzein INRP

physiologique (NaCl à 9g/L d’eau stérile, pas d’éclatement des cellules).

• Couper en tranche de 5 mm à 2 à 3 cm.
• Immerger rapidement dans le fixateur.
• Identifier le flacon, le fermer hermétiquement et laisser de quelques
heures à plusieurs jours.

Rem:
un colorant (éosine…) peut être ajouté au fixateur pour repérer les petites
pièces.
Le rôle du technicien/du médecin dans l’étape d’analyse
des pièces histologiques
• Les échantillons sont décrits
macroscopiquement puis des fragments à
étudier au niveau histologique sont préparés.

• Les fragments d’organe doivent être orientés par

rapport à la pièce initiale

• Les tissus doivent être découpés proprement pour

maintenir l’architecture tissulaire.
 3 la déshydratation/substitution

Étape préalable à l’inclusion

Permet de chasser l’eau des tissus et de

préparer ainsi le remplacement par des
produits hydrophobes

se fait par passages successifs dans des

bains d’alcool de degré croissant ( 10h)
==> éclaircissement ou clarification
 4- inclusion/ imprégnation

• Permet d ’obtenir des pièces rigides autorisant une coupe fine 2 à 10 µm pour la
microscopie optique
• le produit d’inclusion va remplacer l ’eau des tissus
• mélange d’hydrocarbures hydrophobes
ex: paraffine
 4- inclusion/ imprégnation

⚫ L’automate de déshydratation
et inclusion en paraffine
(TP1020/Leica) permet la
déshydratation progressive des
échantillons fixés grâce à des
bains croissants d’éthanol puis
de xylène suivi de
l’imprégnation dans de la
paraffine liquide

http://abridge.inra.fr/index.php?option=com_flexicontent&view=item&cid=45:equipements-abridge&id=15:tp1020-leica-automate-de-
deshydratation-et-d-inclusion-en-paraffine&lang=fr&Itemid=108
4- inclusion/ imprégnation
5- La coupe

Réalisation de coupes de 1 à 25µm en

général, autorisant l’observation en
microscopie.

Préparation du bloc de paraffine:

Les coupes histologiques

⚫ Coupes = tranche d’une épaisseur de 5 um

⚫ Coupes = 2 dimensions
⚫ Orientation du bloc de paraffine
⚫ Plan de la coupe
⚫ Reconstituer spatialement les structures
Les différentes coupes en
histologie
⚫ coupe sagittale : c'est une coupe
longitudinale qui sépare le côté gauche du côté
droit.

⚫ coupe frontale: c'est une coupe longitudinale

qui sépare la partie ventrale de la partie
dorsale.

⚫ coupe transversale: c'est une coupe

perpendiculaire à l'axe longitudinal
 Cryostat ==>
Microtome ==> fixation formol + paraffine congelé
Ruban de coupes
 6- le collage

Protocole:
-Goutte d’une solution de collage = d’étalement
(albumine dans l’eau, albumine glycérinée ou eau
gélatinée) sur la lame.
-Placer une bonne coupe sur la lame face brillante contre
le verre.
-Lame déposée sur une plaque chauffante => la paraffine
ramollit sans fondre =>
déplissage.
-1 à 2h dans une étuve à 37°C => évaporation de
l’excédent d’eau.
6- le collage
Préparation à la coloration
 7- déparaffinage et réhydratation

• Il faut éliminer la paraffine ( hydrophobe) pour

rendre les tissus perméables aux colorants
(solutions aqueuses ou alcooliques)
• technique: des bains successifs de xylène puis
d ’alcools de degré décroissant jusqu’à l ’eau
courante
PLAN
1. PRELEVEMENT
2. FIXATION
3. DESHYDRATATION
4. INCLUSION/IMPREGNATION
5. COUPES
6. COLLAGE
7. Deparaffinage/rehydratation
8. COLORATION
9. DESHYDRATATION
10. MONTAGE
 8- la coloration

➢ Les colorants utilisés en histologie sont plus ou moins sélectifs ;

➢ La plupart sont des composants acides ou basiques en milieu aqueux qui forment des sels avec les
radicaux ionisés des tissus.

➢Des composants acides ➔ utilisés pour les zones tissulaires

basophiles
➢Des composants basiques ➔ utilisés pour les zones
tissulaires acidophiles .
 Méthodes de mise en évidence

❑ Coloration topographique : HE

❑ Colorations empiriques

❑ Histochimie

❑ Histoenzymologie

❑ Immunohistochimie
Topographique HE x100
 La coloration HE hémalun éosine (safran)

• Coloration trichromique
• coloration par hémalun
• coloration par l ’éosine,
• coloration par le safran ou l ’orange (fibres de collagène orange)
HES
Histochimie

Réaction biochimique
=>mise en évidence in situ
de constituants présents dans les tissus ou cellules
 La coloration PAS acide périodique -Schiff

• Objectif: coloration des glucides de réserve ( glycogène amidon), glucides de

soutien , mucoplosaccharides (chaînes d ’hexosamines des sécrétions visqueuses),
glycolipides et glycoprotéines
• principe
1° temps : oxydation par l ’acide périodique des polysaccharides ( formation des
aldéhydes)
2° temps : réaction des aldéhydes avec le réactif de Schiff ( fuchsine décolorée)
coloration rouge-violacée
Structures colorées par PAS:
1. Mucus des cellules
caliciformes.
2. Glycoprotéines et
mucopolysaccharides
recouvrant les microvillosités
des entérocytes.
 Le trichrome de Masson

⚫ Coloration trichromique:
⚫ Coloration en bleu sombre des
noyaux par l’hémalun.
⚫ Coloration en rouge-rosé des
cytoplasmes par le ponceau-
fuschine.
⚫ Coloration en bleu-vert des fibres
conjonctives par le bleu d’aniline.
Coloration Composants Cytoplasme Collagène Élastine ADN Autres
Hémalun- Hématoxyline, rouge/rose bleu/
rouge/rose rouge
Eosine érythrosine (safran) jaune) noir
Van Hématoxyline, fuchsine et - (parfois
jaune rouge noir
Gieson acide picrique rose)
Hématoxyline, acide de
Goldner rouge vert - noir
fuchsine, Lichtgrün
Elastica Orcéine, fuchsine brun-violet
- (parfois
Azan Azocarmine, bleu aniline rouge bleu rouge
rose)
rouge
Orange G, méthylblue,
(érythrocyte
Ladewig fuchsine acide, hématoxyline bleu noir
orange)
Colorant soluble dans les Lipides en
Sudan III
lipides orange

Hématoxyline, acide Polysaccharides :

PAS periodique, réactif de Schiff bleu violet-rouge
Trichrome Hématoxyline, ponceau / Bleu/
rose bleu
Masson fuchine, bleu d’aniline noir
Thionine (ou toluidine ou
Nissl bleu (avec le RE) bleu
violet de crésyle)
Immunohistochimie
*Processus par lequel on met en évidence une protéine dans un tissu grâce à un anticorps.

*L’utilisation de l’immunohistochimie est basée sur la propriété de formation de complexes

stables entre les antigènes et les anticorps
Immunohistochimie directe

Cours Chantal Humblet, 2017-2018

Détection des cellules produisants de l’insuline

Cours Chantal Humblet, 2017-2018

 9 - la déshydratation

Étape préalable au montage avec des produits de type hydrocarbure

10 - le montage

➢ Recouvrement de la préparation par une lame protectrice en utilisant une « colle »

= le baume ou résine de montage

➢ pour une conservation longue on utilise le baume du Canada ou le Néo entellan

= indice de réfraction proche du verre

Archivage