UNIVERSITÉ DE MAROUA THE UNIVERSITY OF MAROUA

FACULTE DES SCIENCES FACULTY OF SCIENCE

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES DEPARTMENT OF BIOLOGICAL SCIENCES

BIOCHIMIE ANALYTIQUE I (BIO 244)

(PARTIE 2)

METHODES DE SEPARATIONS DES CONSTITUANTS D’UN MELANGE

PLAN

1. Décantation
2. Centrifugation
3. Filtration
4. L’extraction
5. Distillation
6. Cristallisation
7. Lyophilisation
8. La dialyse
9. La précipitation

I- LA DECANTATION
La décantation est une opération de séparation mécanique, sous l'action de la gravitation,
de plusieurs phases non-miscibles dont l'une au moins est liquide. On peut ainsi séparer soit
plusieurs liquides non-miscibles de densités différentes, soit des solides insolubles en
suspension dans un liquide.

1- Principe

a) Décantation de deux phase liquides

La séparation est basée sur la différence de densité des deux phases liquides en présence.
Sous l’action de la pesanteur, le liquide le plus dense se placera sous le liquide le moins
dense. On utilise alors une ampoule à décanter pour séparer les deux phases.

1- Liquide le moins dense

2- Liquide le plus dense
3- Robinet

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 b) Décantation de solides en suspension dans un liquide
Si on laisse reposer une suspension solide dans une phase liquide, on observe que les
particules sous l'action de la pesanteur, de la poussée d'Archimède, et du frottement lié à la
viscosité de la phase liquide, tendent à tomber vers le fond ou à remonter à la surface selon
leur densité et leur taille.
La vitesse de sédimentation d’une particule dans une phase liquide de viscosité connue est
donnée par la relation suivante :

avec :
, vitesse limite de chute (en m/s) ;
, rayon de la sphère (en m) ;
, accélération de la pesanteur (en m/s²) ;
, différence de masse volumique entre la particule et le fluide (en
kg/m³) ;
, viscosité dynamique du fluide (en Pa.s).

II- LA CENTRIFUGATION

C’est une technique de séparation des constituants d’un mélange utilisant une force
gravitationnelle et basée sur les différences de densité de ces constituants.

1- Principe
Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer dans ce champ jusqu'à
ce qu'elle rencontre une résistance capable de l'arrêter complètement. En mettant une
préparation biochimique dans le rotor d'une centrifugeuse et en faisant tourner celui-ci, on
génère une accélération qui va pousser les particules qui la composent vers le fond du tube
à centrifuger. La vitesse avec laquelle se déplaceront ces particules est proportionnelle à :
- la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise
- la masse de la particule
- la différence entre la densité de la particule et celle du solvant,
et inversement proportionnelle à
- la friction avec le milieu, en fonction de la taille et à la géométrie des particules.

On peut ainsi fractionner une préparation en un sédiment (ou "culot"), constitué de

matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un
surnageant qui sera le liquide résiduel au dessus du sédiment.

La force centrifuge générée par la rotation est donnée par la formule suivante :
Fc = mω2 r
m : masse de la particule
ω: vitesse angulaire (rad. Sec-1)
r : distance de l’axe de rotation (cm)
La vitesse ω peut aussi s'exprimer en nombre de révolutions par minute (R) : ω = 2π R / 60
et par conséquent, la force centrifuge peut encore s'écrire : Fc = m (2π R / 60) 2 r

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Généralement cette force centrifuge est exprimée comme un multiple de la constante de la
gravité terrestre (9,81 m.s-2). On peut alors définir la Force Centrifuge Relative (RCF, relative
centrifugal field) comme le rapport entre la force centrifuge appliquée par la centrifugeuse
sur la particule et la constante de gravité terrestre (Fg= mg où g= 9,81 m.s-2).
RCF = Fc/Fg = [(2π R / 60) 2 r] / 9,81
RCF = 1,118.10-5. R2.r
Avec RCF en (g), r en (m) et R en (rpm).

Ainsi, si on applique 10 000 g à une molécule, elle est soumise à un champ de gravité égal à
10 000 fois celui de la gravité terrestre.

Vitesse de sédimentation
La vitesse à laquelle sédimente une particule dépend de la loi de Stokes qui donne la force
de frottement qui s’exerce sur une particule sphérique en déplacement dans un fluide.

avec :
, vitesse limite de chute (en m/s) ;
a, rayon de la sphère (en m) ;
ω, vitesse angulaire
r, distance de l’axe de rotation
∆ρ = , différence de masse volumique entre la particule et le fluide (en
kg/m³) ;
, viscosité dynamique du fluide (en Pa.s).

Pour qu’une particule sédimente, sa densité doit être supérieure à la densité de la solution:
ρp > ρsol
Si la densité de la particule est égale à celle de la solution, alors la vitesse de sédimentation
est nulle et la particule ne sédimente pas:
ρp = ρsol ρp - ρsol = 0 donc v=0

Coefficient de sédimentation
Certains paramètres de la relation précédente ont pu être regroupés en une seule
variable désignée par S et portant le nom de coefficient de sédimentation. Cette relation se
simplifie en :
2
v=Sω r
-13
Le Svedberg a été définie comme égale à 10 s.

m= masse de la particule
f = coefficient de friction de la particule dans le solvant
ρ= densité de la solution
v = vitesse de sédimentation
ῡ= volume spécifique partiel de la particule

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 Temps de sédimentation
Si on intègre l’équation:

Sur l’intervalle de temps de t0 à tt, alors on obtient:

Il est maintenant possible calculer le temps nécessaire pour sédimenter une particule de
coefficient de sédimentation connu.
Si rt et r0 sont le rayon maximale au fond du tube et le rayon minimale au sommet du tube,
alors T=tt-t0 est le temps nécessaire pour sédimenter la particule de coefficient de
sédimentation S. L’unité de mesure du temps de sédimentation est l’heure.

2- Types de centrifugation

a) Centrifugation préparative
Elle est utilisée pour séparer les organites cellulaires et les macromolécules. Ce type de
centrifugation peut être différentielle ou en gradient de densité.

i. Centrifugation différentielle
Dans ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus
souvent à l'aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante.
On sépare ainsi les différents constituants en terminant pas les éléments les plus petits et
ayant le moins de différence de densité avec le solvant.

ii. Centrifugation en gradient de densité

Un des facteurs qui influence la vitesse est la différence entre la densité de la particule et
celle du solvant. On peut moduler la vitesse de sédimentation en faisant varier la différence
entre la densité du soluté et celle du solvant ; on obtient alors un gradient de concentration.
Il existe deux types de gradients :
 les gradients discontinus. Ils sont constitués d'un empilement de solutions de moins
en moins dense. Les différents éléments s'accumulent aux interfaces entre les
solutions de densité différentes.
 les gradients continus. Ici, la variation de densité du solvant est continue. Les
différents constituants vont alors migrer jusqu'à atteindre le point précis où leur
densité est égale à celle du solvant formant des bandes parfois visibles à l'œil nu.

b) Centrifugation analytique

Elle est destinée à l'étude de macromolécules et fournit des informations sur la pureté, la
masse molaire et la forme de la macromolécule.
La détermination de la masse moléculaire est réalisée à condition que la substance étudiée
soit pure.

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M est la masse moléculaire du soluté,
v son volume spécifique partiel
ρ est la densité du solvant
R est la constante des gaz parfait
T est la température absolue
S est le coefficient de sédimentation
D est le coefficient de diffusion

Remarque :
La distinction entre centrifugeuse et ultracentrifugeuse est faite par rapport à la vitesse
maximale atteinte. La centrifugeuse couvre un domaine allant de 0 à 20 000 t/mn alors que
l'ultracentrifugeuse accepte des vitesses bien supérieures.

III- LA FILTRATION
La filtration est une technique permettant de séparer les constituants d'un mélange
hétérogène au travers d'un milieu poreux.

1- Principe
L'utilisation d'un filtre permet de retenir les particules du mélange hétérogène qui sont plus
grosses que les pores du filtre. Le liquide ayant subi la filtration est nommé filtrat ou
perméat, tandis que la fraction retenue par le filtre est nommé résidu, rétentat ou gâteau.

La filtration est fréquemment employée en biochimie pour un grand nombre d'applications :

stérilisation, isolement de précipité, élimination de sels de solutions, concentration de
macromolécules, etc.
Suivant la nature des forces auxquelles est soumise le mélange à filtrer on distingue :
 La filtration par gravité: le mélange est soumis uniquement à la pression
atmosphérique. Le liquide passe à travers le support filtrant.
 La filtration par surpression: le mélange arrive sous pression dans le filtre. Cette
pression peut être due à une force centrifuge ou à du gaz comprimé.
 La filtration sous vide: le mélange est soumis d’un côté du filtre à la pression
atmosphérique, et de l’autre côté, à la sortie du filtre, à une dépression réalisée
grâce à une pompe à vide.

Suivant la nature du filtre utilisé on distingue :

 La filtration sur support : ici le filtre est une feuille très mince fait de divers matériaux
: dérivés de cellulose, fluorure de polyvinyle, polysulfone, acrylique, etc. Des pores
traversent presque de part en part cette feuille mince. Ces pores se bouchent
cependant assez rapidement et ont un débit très lent. Ils ont aussi une capacité de
rétention réduite.

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  La filtration en profondeur : Le filtre est constitué d'agrégats de divers matériaux
(fibre de verre, sable, gel) contenant des réseaux complexes de pores de diamètre
variable interconnecté entre eux. Ce type de filtre peut retenir de grandes quantités
de matériel. Il se bouche très lentement et les débits se maintiennent à un haut
niveau assez longtemps.

Remarque :
La différence entre filtration, microfiltration et ultrafiltration se situe au niveau de la taille
des pores de la membrane servant de filtre :
 Filtration : taille des pores > 10 µm
 Microfiltration : taille des pores comprise entre 0.1 et 10 µm
 Ultrafiltration : taille des pores comprise entre 0.001 à 0.1 µm

IV- L’EXTRACTION
C’est une technique de séparation d’une substance précise lorsque celle-ci est mélangée à
d’autres substances.

1- Principe
Un solvant d'extraction est utilisé pour solubiliser sélectivement un ou plusieurs composés
d'un mélange, sur la base de propriétés chimiques ou physiques. Le composé à extraire
possède plus d'affinité avec le solvant d'extraction qu'avec les composants principaux du
mélange initial. Après l'opération, on récupère deux phases pouvant être séparées par
décantation : l'extrait formé du solvant enrichi en soluté, et le raffinat, qui est le mélange
appauvri en soluté.
L'extraction se déroule en deux parties :
 une première partie de transfert du composé à extraire entre le mélange initial et le
solvant d'extraction
 une deuxième partie de séparation du moyen d'extraction du mélange principal.

2- Types d’extraction
a) Extraction liquide-liquide
Cette technique permet d'extraire une substance dissoute dans un solvant (phase
d'alimentation), à l'aide d'un autre solvant, appelé phase solvant d'extraction, dans lequel
elle est plus soluble. Le solvant initial et le solvant d'extraction ne doivent pas être miscibles.
Pour effectuer une extraction liquide-liquide en laboratoire, on peut utiliser une ampoule à
décanter ou un extracteur en continu.

Choix du solvant
Le choix du solvant obéit à trois critères et nécessite la connaissance d'un paramètre
physique caractéristique de ce solvant (densité).
 Etat physique du solvant.
Le solvant doit être liquide à la température et à la pression où l'on réalise l'extraction.
 Miscibilité du solvant.
Le solvant doit être non miscible à la phase qui contient initialement le composé à extraire.
 Solubilité.

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Le composé à extraire doit être très soluble dans le solvant. C'est-à dire, beaucoup plus
soluble dans le solvant que dans le milieu où il se trouve initialement (milieu aqueux en
général).
Densité du solvant.
Il est nécessaire de connaître ce paramètre car c'est lui qui détermine si la phase organique
contenant le composé à extraire, se trouve au dessus ou en dessous de la phase aqueuse (à
éliminer) dans l'ampoule à décanter.

b) Extraction solide-liquide
Il s'agit d'extraire une substance présente dans un solide pour la faire passer dans un solvant
liquide.
Les méthodes d'extraction solide-liquide sont :
 La macération (procédé qui consiste à laisser séjourner un solide dans un liquide
froid pour en extraire les composés solubles),
 L'infusion (extraction des principes actifs et/ou des arômes d'un végétal par
dissolution dans un liquide initialement bouillant que l'on laisse refroidir)
 La décoction (extraction des principes actifs et/ou des arômes d'un végétal par
dissolution dans un liquide porté à ébullition pendant un certain temps).
Au laboratoire, on utilise parfois des appareils plus efficaces, tel que l’extracteur de
Soxhlet qui fonctionne en continu.

3- Le coefficient de partage :
Le coefficient de partage « K » est le rapport des concentrations de la substance S dans les
deux phases, à l’équilibre.

4- Rendement d’extraction
Le rendement d’extraction «R» est le rapport entre la quantité maximale de substance
extraite par le solvant B (QB) et la quantité initiale en solution dans le solvant A (QA0).

Avec QA: quantité restante dans le solvant A à la fin de l’extraction.

Le rendement d’extraction «R» peut être donné en valeur absolue (entre 0 et 1) ou en
pourcentage (entre 0 % et 100 %).

V- LA DISTILLATION

La distillation est une technique de séparation des constituants d’un mélange liquide sur la
base de leur différence de points d’ébullition.

Principe
Le composé le plus volatil (ayant la plus grande capacité à s’évaporer) s'évaporera plus
facilement et composera la majeure partie des vapeurs. Par condensation de ces vapeurs,
un liquide appelé distillat peut être récupéré avec une concentration élevée du composé le
plus volatil.

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La distillation peut être effectuée de plusieurs manières :

 Distillation discontinue
Une distillation discontinue est une distillation où le mélange à séparer est chargé une fois
dans l'installation et d'où les composants sont distillés les uns après les autres. Ceci implique
un changement permanent de la composition du mélange initial et des profils de
température.

 Distillation continue
Une distillation continue est une distillation où l'installation de distillation est
continuellement alimentée avec le mélange à séparer. Ce type d'installation permet de
travailler sans modification des profils de composition ainsi que de température.

 Distillation sous vide

Certains produits sont trop peu volatils à pression ambiante ou se décomposent avant de
s'évaporer du fait de leur haut point d'ébullition. Dans ce cas, la pression de l'installation est
réduite à l'aide d'une pompe à vide afin de réduire le point d'ébullition.

VI- LA CRISTALLISATION
C’est une technique de séparation qui permet d’isoler un produit sous forme de cristaux.

Principe
Deux approches sont généralement utilisées :
 La diminution de la solubilité du produit en solution, par abaissement de la
température de la solution. La solubilité du produit diminue lorsque la température
diminue donc le produit va cristalliser.
 La concentration du produit en solution (comme pour l’eau de mer) par évaporation
du solvant. La concentration du produit augmente, la solution va être saturée et le
produit dissous va cristalliser.

La recristallisation
La recristallisation est l’ensemble des opérations permettant de purifier un composé
contenant des impuretés physiques ou chimiques.
Les différentes étapes sont :
1. la solubilisation à chaud dans un minimum de solvant
2. la filtration à chaud pour éliminer les impuretés insolubles à chaud
3. la recristallisation par refroidissement de la solution
4. la filtration à froid pour éliminer les impuretés solubles à froid

Choix du solvant
Le composé à purifier doit :
 être insoluble à froid et soluble à chaud dans le solvant. Lorsque la solubilité à chaud
est 5 fois supérieure à celle à froid, le solvant est correct.
 ne pas réagir avec le produit à purifier
 ne pas dissoudre les impuretés à chaud et à froid

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  avoir un point d’ébullition le plus bas possible
 être le moins toxique possible

VII-LA LYOPHILISATION

La lyophilisation, appelée autrefois cryodessication, est une opération de déshydratation à

basse température qui consiste à éliminer, par sublimation (passage d'un produit de l'état
solide à l'état gazeux, sans passer par l'état liquide) la majeure partie de l’eau contenue
dans un produit.

Principe
Le procédé de lyophilisation repose en pratique sur deux opérations chronologiques : la
congélation et la déshydratation. La congélation est une étape préalable à l’opération de
déshydratation.
La déshydratation recouvre deux principes physiques : la sublimation de la glace (cristaux
formés par congélation) et la désorption finale - ou déshydratation secondaire - de la
quantité d’eau résiduelle, non congelée.
Ces deux opérations nécessitent un apport de chaleur et se font généralement sous vide.

La lyophilisation permet d’obtenir des produits finaux de haute qualité. La forme et l’aspect
des produits sont bien conservés et leur qualité aromatique est bien supérieure à celle des
produits séchés. De plus, l'absence d'eau liquide dans le produit réduit considérablement le
développement des réactions d'altération et permet la conservation des principes actifs
dans le produit, qui peut alors être stocké à température proche de l'ambiante. Un autre
avantage technologique majeur de la lyophilisation repose sur la capacité du produit
lyophilisé à se réhydrater instantanément.

VIII- LA DIALYSE
La dialyse est une technique de séparation des molécules dissoutes sur la basse de leur taille
moléculaire par diffusion à travers une membrane semi-perméable. Les membranes à
dialyse sont caractérisées par une limite d'exclusion ("cut-off") qui sert à donner une idée de
la taille des molécules qui ne pourront pas la traverser (de masse supérieure à la limite) et
de celles qui pourront diffuser (de masse inférieure à la limite). La plupart des membranes à
dialyse ont généralement une limite de l'ordre de 5-15 kDa. Les molécules diffusibles vont
traverser la membrane selon le gradient de concentration (du milieu où elles sont le plus
concentrées vers le milieux où elles sont le moins concentrées). À l'équilibre, les
concentrations de chaque espèce diffusible seront égales de part et d'autre de cette
membrane.
La vitesse de la dialyse, c'est-à-dire le moment où l'équilibre est atteint est affectée par les
facteurs suivants :
 La température. Elle augmente le mouvement des particules.
 Le rapport entre le volume contenu dans le sac à dialyse et la surface de la
membrane. En effet, plus ce rapport est faible, plus il y aura de pores par lesquelles
les molécules diffusibles pourront sortir du sac.
 Le volume du liquide de contre-dialyse.

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  Le solvant de dialyse et les conditions (température, pH, force ionique, etc.) doivent
être compatibles avec la stabilité des molécules d'intérêt contenues dans le dialysat.
 Le brassage du dispositif de dialyse.

Vocabulaire
Boudin de dialyse : sac à dialyse contenant la solution à dialyser et dont les extrémités sont
ligaturées.
Rétentat : solution restant dans le sac à dialyse et débarrassée des molécules diffusibles
Diffusat : liquide de contre-dialyse contenant les molécules diffusibles

IX- LA PRECIPITATION
La précipitation a pour but de concentrer les molécules biologiques en solution mais aussi
d'opérer un fractionnement selon leur solubilité.

1- Principe
La solubilité d'une molécule repose essentiellement sur les interactions qu'elle a avec le
milieu extérieur (solvant, ions, constituants divers). Parmi ces interactions, les liaisons
hydrogène et électrostatiques prédominent. Plus la molécule possède d'interaction avec le
solvant (eau) et plus elle est soluble.
La précipitation s'obtient en détournant ou en détruisant les interactions établies entre la
macromolécule et le milieu extérieur. On procède à des perturbations du solvant grâce à
une modification :
• de la force ionique
• du pH
• de la température.
La précipitation doit rester un processus réversible, c'est-à-dire que les molécules, rendues
insolubles, ont leurs propriétés biologiques restaurées dès qu'elles sont diluées ou
dialysées.

2- Types de précipitation

a) La précipitation par les sels

Lorsqu’on augmente la force ionique d’une solution contenant une protéine donnée par
ajout de sel au milieu aqueux, des interactions électrostatiques se créent entre la protéine
et les ions ajoutés résultant en une augmentation de la solubilité de la protéine : ce
phénomène est appelé «salting-in ». Cependant, après ajout de quantités de plus en plus
importantes de sel (augmentation de la force ionique), on note une baisse de solubilité de la
protéine conduisant à une précipitation de cette dernière. Ce phénomène appelé « salting-
out » est dû à la solvatation des ions ajoutés en excès, privant les protéines de solvant, ce
qui a pour conséquence une augmentation des interactions protéine-protéine à l’origine de
la précipitation.

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 Les protéines ayant
différentes compositions ioniques, elles précipiteront à différentes concentrations en sel.
Ainsi, en ajustant la concentration en sel d’une solution contenant une mixture de protéines
juste en dessous du point de précipitation d’une protéine d’intérêt, on élimine celles qui ne
sont pas désirées.
Le pH de la solution doit être ajusté afin d’être proche du point isoélectrique de la protéine
désirée car la solubilité d’une protéine est minimale lorsque sa charge nette est égale à 0.

Le sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 est le sel le plus utilisé, ses avantages majeurs sont :
 Il a une forte solubilité (3,9M dans l’eau à 0°c) qui permet la préparation de solutions
ayant une force ionique élevée suffisante pour causer la précipitation de la plupart
des protéines.
 Il ne produit pas une chaleur excessive lors de sa dissolution, ce qui permet d’éviter
une dénaturation thermique des protéines.
 Même à saturation (~ 4,0 M à 20°C), il possède une densité moyenne (1,235 g/cm3)
qui n'interfère pas avec la sédimentation des protéines précipitées.

b) La précipitation par les solvants organiques

Les solvants organiques entrent en compétition avec l'eau en interagissant avec les
groupements polaires de la protéine. Les solvants, en réduisant la concentration de l'eau,
diminuent l'hydratation de la protéine. Les groupes hydrophobes des solvants peuvent aussi
abolir les interactions hydrophobes internes stabilisant la structure protéique et entraînent
leur précipitation.
Les solvants organiques dénaturent les protéines, particulièrement lorsqu'ils sont utilisés à
température ambiante. C'est pourquoi ils sont utilisés à des températures inférieures à 0°C.

c) La précipitation par les polyélectrolytes

Les polyélectrolytes sont des polymères chargés pouvant former des réseaux
intermoléculaires avec les protéines. Ce mode de précipitation utilise des pourcentages très
faibles en polyélectrolytes (0,05 à 0,10% m/v). Parmi les polyélectrolytes les plus employés,
se situent les acides polyacryliques [CH2-CH-(COOH)]n, la carboxyméthylcellulose ainsi que
des polyosides naturels tels que les alginates, pectates et carraghénanes. Le choix des
polyélectrolytes est fonction de deux critères importants que sont le point isoélectrique de
la protéine et la zone de pH dans laquelle elle conserve son activité biologique. Ainsi les
polyélectrolytes anioniques comme les acides polyacryliques doivent être utilisés à des
valeurs de pH inférieurs à celle du point isoélectrique de la protéine. Au contraire, les

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polyélectrolytes cationiques, comme le polyéthylène imine [-CH2NH-]n sont utilisés au-
dessus du point isoélectrique dans un domaine de pH plus compatible avec la stabilité des
enzymes.

d) La précipitation par affinité

La précipitation par affinité repose sur la formation de réseaux intermoléculaires créés par
fixation de ligands multifonctionnels aux protéines à purifier.
Les ligands d'affinité sont généralement des substrats ou des inhibiteurs d'enzymes à purifier et
assurent par conséquent un haut degré de spécificité et de sélectivité de la fixation. Cette
technique permet alors une purification en une seule étape. Toutefois, les rendements obtenus
peuvent être très variables selon les rapports stoechiométriques protéine/ligand. Après
centrifugation, la protéine d'intérêt peut être dissociée par l'intermédiaire de substrats,
inhibiteurs, analogues structuraux ou simplement par une variation du pH ou de la force ionique
du milieu.

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 INTRODUCTION A LA SPECTROPHOTOMETRIE
La spectrophotométrie est une technique d’analyse qualitative et quantitative, de
substances absorbant un rayonnement électromagnétique de longueur d’onde comprise
entre 300 et 900 nm avec le type d’appareil utilisé

Principe
Soit un faisceau parallèle de lumière monochromatique (de longueur d’onde λ) d’intensité
I0 traversant une solution absorbante de concentration C sur une longueur de cuve l de 1
cm. L’intensité du faisceau émergeant est I.

On définit la transmittance par:

avec :
It = intensite du rayonnement transmis
I0 = intensite du rayonnement incident

Loi de Beer-Lambert.
Elle décrit la relation entre la concentration d’un échantillon et l’intensité de la lumière
transmise par cet échantillon. La loi de Beer-Lambert utilise deux concepts : la transmittance
(T) et l’absorbance (A) et elle s’exprime mathématiquement par la formule :

dans laquelle :
A = absorbance mesuree
ε = coefficient d’extinction molaire (litres/moles/cm)
l = longueur du trajet parcouru par la lumière dans l’échantillon (trajet optique) en cm
c = concentration de l’échantillon (moles/litre)

Loi d’additivité des densités optiques

Dans le cas de mélanges homogènes dilués, les densités optiques des différentes espèces
contenues sans le mélange sont additives

Exemple: mélange de 2 constituants

Α = Α1 + Α2 = ε1lc1 + ε2lc2 = l(ε1c1 + ε2c2)

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Dosage spectrophotométrique:

Il est possible de déterminer la concentration d’une molécule à partir de son absorbance

(densité optique) mesurée à une longueur d’onde maximale précise.

1ère étape : Détermination de la longueur d’onde maximale

On peut la déterminer en mesurant l’absorbance de la molécule étudiée à l’aide d’un
spectrophotomètre à des longueurs d’onde variant de 10 à 400nm pas de 10 nm pour le
domaine de l’UV, et de 400 nm à 800 nm pour le domaine visible.

2ème étape : Courbe d’étalonnage

On réalise ensuite plusieurs solutions de la molécule étudiée de concentration connues pour
lesquelles on détermine l'absorbance A, à la valeur de λmax .
On établit une courbe d’étalonnage A = f(C). Dans le cas idéal, on obtient une droite qui
permettra de déduire graphiquement la concentration de la solution à analyser.

Remarque :
Le solvant est souvent lui -même absorbant. Pour connaître l’absorbance d’un soluté, il faut
compenser l’absorbance du solvant en réglant le «zéro» de l’appareil.
Par la suite, on notera absorbance ou densité optique d’une espèce, la valeur de
l’absorbance due uniquement à la contribution de cette espèce (absorbance totale
diminuée de l’absorbance du solvant).

3ème étape : Détermination de la concentration des protéines dans un échantillon donné

On prépare l’échantillon à analyser dans les mêmes conditions que celles de la réalisation de
la gamme d’étalonnage. Après lecture de la densité optique, on peut déduire la
concentration en protéine dans cet échantillon en exploitant l’équation de la droite obtenue
à partir de la courbe d’étalonnage.

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