UNIVERSIT DE TOLIARA

FACULTE DES SCIENCES Dpartement de chimie

Valorisation de plantes antipaludiques et anticancreuses dans la rgion du Sud-ouest de Madagascar : cas dEvonymopsis Longips (CELASTRACEAE)
Mmoire dtudes Prsent la Facult des Sciences Diplme dtudes approfondies (D.E.A) en chimie des substances naturelles Ralis par Adimanana Ruben RASOLOMANANA

Devant le Jury compos de : Prsident : Docteur Hugues LEZO

Rapporteur : Docteur Benot RASOLONDRATOVO Examinateur : Docteur Frderic MANJARY Examinateur : Docteur Pierre Ruphin FATIANY

Soutenue Publiquement le, 17 Janvier 2O12 Laboratoire de chimie des substances naturelles au CeDRATOM Toliara

REMERCIEMENTS

Jai eu de la chance et le plaisir deffectuer ce travail de recherche dans le laboratoire de chimie de la Facult des sciences, sis au CeDRATOM de Toliara. Laboratoire de chimie de substance Naturelle sous la direction Benoit RASOLONDRATOVO Matre de confrence. Tout dabord, je tiens particulirement remercier Monsieur Benoit RASOLONDRATOVO, Matre de confrence et Matre de confrence Responsable de la Formation Doctorale en Option des Substances Naturelles lUniversit de Toliara, pour mavoir accueilli au sein du laboratoire de chimie, pour mavoir fait confiance, que pour mavoir guid dans mon travail tout au long de ces annes, mavoir encourag et conseill tout en me laissant une grande libert. Je remercie sincrement Monsieur le Frderic MANJARY, Matre de confrence et Directeur de lInstitut Suprieur de Technologie Toliara, qui ma aid, conseill et encourag au long de mon travail. Merci pour son entire disponibilit et son aide prcieuse chaque tape de mes recherches. Pour son soutien et sa grande gnrosit, quil soit assur de ma profonde gratitude. Mes remerciements vont galement Monsieur Hugues LEZO, Matre de confrence et Doyen de la Facult des Sciences de lUniversit de Toliara, davoir accept de prsider le jury de ma soutenance de mmoire. Jaimerais galement remercier Monsieur Pierre Ruphin FATIANY, Matre de confrence, Chef de Laboratoire de Phytochimie lInstitut Malgache des Recherches Appliques, qui a accord de nous faire un norme honneur, dapporter sa propre vision en matire des recherches et de prsenter ses critiques constructives en tant quexaminateur. Je tiens exprimer mes remerciements Monsieur MANJOVELO Sambany Christian, Matre de confrence, Enseignant Chercheur de lUniversit de Toliara, pour son aid et pour les discussions enrichissante qui ont contribues ce travail.

Un grand merci tout les personnels et enseignants de la Facult des Sciences de lUniversit de Toliara en particulier les personnels et enseignants du Dpartement de chimie. Jadresse galement remercier tous mes collgues et amis qui mont aid accomplir ce travail, particulirement, Monsieur Mananga Joseph, Ingnieur Informaticien, Assistant Informatique de la Direction Rgionale de lEducation Nationale Atsimo Andrefana, Monsieur TOVO, Secrtaire particulier du Chef de Service de la Planification de la Direction Rgionale de lEducation Nationale Atsimo Andrefana. Merci enfin, lensemble du personnel de la mmoire dtudes. Je tiens remercier galement, et tout particulirement, tous les membres de ma famille. Ils ont constamment t prsent et ce malgr la distance lors des travaux de terrain. Direction Rgionale de

lEducation Nationale Atsimo Andrefana qui a contribu la ralisation matrielle de ce

SOMMAIRE

Introduction. Premire partie : Rappel Bibliographique Gnralit sur le paludisme et le cancer Deuxime partie : Etude de lEvonymopsis Longips Rsultats et discussions Conclusion Bibliographies Annexes

LISTE DES TABLEAUX

N
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12

TABLEAUX Dplacement chimique (en ppm) des solvants deutrs utiliss Extraction de lEvonymopsis longips Rsultat de test cytotoxique de lextrait brut actonique Sparation grossire de lextrait brut Rsultat de test dantipaludique de chaque extrait Partition liquide-liquide de lextrait actonique avec leurs activits antipaludique in vitro. Fractionnement de lextrait cyclohexanique BR5 Purification de lextrait BR5F9 = BR9 Purification de BR9F3 = BR11 Purification BR11F1 = BR12 Dplacement chimique des protons et des carbones Rcapitulation de linterprtation des spectres de la molcule isole

Page 28 41 41 42 42 44 44 45 45 45 47 52

LISTE DES FIGURES

N FIGURES 01 Molcule antipaludique. 02 Molcule anticancreuse. 03 Molcule anticancreuse... 04 Molcule anticancreuse... 05 Molcule anticancreuse... 06 Molcule anticancreuse... 07 Structure de base de la quinone triterpne 08 Premire squence. 09 Deuxime squence... 10 Troisime squence... 11 Quatrime squence.. 12 Cinquime squence.. 13 Structure dfinitive de la molcule isole.

Page 01 09 09 10 10 11 18 48 48 49 50 51 51

LISTE DES ABREVIATIONS

ACOET/ H2O : Actate dthyle par lEau BUOH/ H2O :

13

C : Carbone 13

CCM : Chromatographie sur Couche Mince Cellules/ml : Cellules par millilitre cf : voir CH3 : Mthyle CH2 : Mthylne CH : Mthine Cl50 : 50 pour cent de Chlorure Cl90 : 90 pour cent de Chlorure CO2 : Dioxyde de Carbone ou Gaz carbonique COSY : COrrlation SpectroscopY Cyclohexane/ H2O : Cyclohexane par lEau DEA : Diplme dEtudes Approfondies DMSO : Dimthylsulfoxyde F.x : Fraction x (x= 1,2,n)
1

H : Proton

H2 : Dihydrogne HMBC : Heternuclear Multiple Bond Correlation H2O : Eau HPLC : Chromatographie Liquide haute Pression HSQC : Heternuclear Single Heternuclear Quantum Coherence IMRA : Institut Malgache de Recherche Applique

Jmod : Mode denregistrement de spectre de carbone 13

2 2 3

J : Constant de couplage du second ordre JH : Cconstant de couplage proton proton JH-C : Constant de couplage proton carbone

MeOH : Mthanol MeOH/H2O : Mthanol par leau MPLC : Chromatographie liquide moyen pression NaCl : Chlorure de Sodium NOESY : Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY OMS : Organisation Mondiale de la Sant RMN : Rsonnance Magntique Nuclaire RMN-1D : Rsonnance Magntique Nuclaire une dimension RMN-2D : Rsonnance Magntique Nuclaire deux dimension SM : Spectromtre de Masse UV : Ultraviolet

LISTE DES PHOTO

N 01 02 03 04 05 06 07 08

PHOTO Carte de localisation de la Rgion du Sud-Ouest. Reampy (Evonymopsis Longips). Reampy (Evonymopsis Longips). Laboratoire de chimie, sis au CeDRATOM Toliara... Chromatographie sur couche mince (CCM).. Appareil pour la chromatographie sur colonne moyen pression (MPLC).. Appareil chromatographique liquide haute pression (HPLC). Profile chromatographique liquide haute pression (HPLC) de BR9F3..

Page 32 34 35 36 39 39 40 40

LISTE DES SCHEMAS

N SCHEMAS 01 02 03 04 05 06 Classification des Terpnes

Page 12 13 15 17 38 43

Classification Biogntique des produits naturels... Biogense Dymthyl allyl pyrophosphate... Biogense de quinones triterpnes.. Protocole dextraction. Protocole de fractionnement et isolement du principe actif

TABLE DE MATIERES
Page

Remerciements. Sommaire Liste des Tableaux .. Liste des figures... Liste des abrviations....... Liste des photos... Liste des schmas. Table de matires. INTRODUCTION. I.- GENERALITE SUR LE PALUDISME ET SUR LE CANCER.. 1.1.- LE PALUDISME.. 1.1.1.- Epidmiologie du paludisme et rpartition gographique du paludisme....... 1.1.2.- Des chiffres alarmantes.. 1.1.3.- Le parasite et le vecteur.. 1.1.3.1.- Les parasites du genre plasmodium.. 1.1.3.2.- Le vecteur : lanophle femelle .. 1.1.4.- Cycle de reproduction des plasmodies... 1.1.4.1.- Cycle asexu ou schizogonique chez lhomme 1.1.4.2.- Cycle asexu ou sporogonique chez lanophle... 1.2.- LE CANCER 1.2.1.- Dfinition. .. 1.2.2.- Evolution de la maladie.. 1.2.3.- La chimiothrapie dans le traitement des cancers.. 1.2.3.1.- Dfinition.. 1.2.3.2.- Mode daction de la chimiothrapie. 1.2.3.3.- Les principales molcules anticancreuses.. 1.3.- LES TERPENES. 1.3.1.- Dfinition 1.3.2.- Classification.. 1.3.3.- Classification biogntique des produits naturels.. 1.3.4.- Biogense.......

i iii iv v vi vii ix x 1 3 3 3 3 4 4 4 5 5 6 7 7 7 7 7 8 8 11 11 12 13 14

1.4.- TECHNIQUE DANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE. 1.4.1.- Mthodes et technique de sparation des constituants chimiques.. 1.4.2.- Chromatographie sur couche mince (CCM) . 1.4.3.- Chromatographie dadsorption sur colonne....... 1.4.4.- Chromatographie liquide haute pression (HPLC) 1.5.- TEST BIOLOGIQUE.. 1.5.1.- Test antipaludique in vitro.. 1.5.1.1.- Culture in vitro de plasmodium falciparum. 1.5.1.2.- Evaluation de lactivit antipaludique.. 1.5.1.3.- Protocole exprimental. 1.5.1.4.- Test de cytotoxicit... 1.6.- TECHNIQUES SPECTROSCOPIES 1.6.1.- La Spectroscopie de Masse (SM)... 1.6.2.- La Rsonance Magntique Nuclaire (RMN) 1.6.2.1.- RMN monodimensionnelle (RMN-1D)....... 1.6.2.2.- RMN bidimensionnelle (RMN-2D). II.- MATERIELS ET METHODES. 2.1.-ENQUETE ETHNOBOTANIQUE. 2.2.- MATERIEL VEGETAL. 2.2.1.- Rcolte de la plante 2.3.- IDENTIFICATION BOTANIQUE 2.3.1.- Schage et broyage de la plante.. 2.3.2.- Solvant, ractif et adsorbant....... 2.3.3.- Mthode dextraction.. 2.3.4.- Test biologique....... 2.3.5.- Sparation grossire 2.3.6.- Fractionnement bioguid 2.4.- LA CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM) DES EXTRAITS.... 2.4.1.- Fractionnement et isolement des composs de lextrait dactate dthyle 2.4.2.- Fractionnement et isolement des composs de lextrait cyclohexanique... 2.5.- RESULTATS ET DISCUSSION.... 2.5.1.- Rsultats. 2.5.1.1.- Extraction. 2.5.1.2.- Test biologique de lextrait actonique....

20 20 21 22 23 24 24 24 24 25 26 27 28 28 29 29 31 31 31 31 33 35 35 36 36 37 37 38 38 39 41 41 41 41

2.5.1.3.- Sparation grossire.. 2.5.1.4.- Fractionnement bioguid.. 2.5.1.5.- Fractionnement et isolement des composs de lextrait cyclohexanique..... 2.5.1.6.- Purification de BR5F9 = BR9 2.5.1.7.- Purification de BR11. 2.5.1.8.- Purification de BR12. 2.5.2.- Discussion... CONCLUSION.. BIBLIOGRAPHIE.

42 42 44 45 45 45 45 53 xiii

INTRODUCTION

Le paludisme et le cancer sont les deux maladies qui proccupent le monde actuel. Deux milliards quatre cent millions de personnes sont exposes un risque de paludisme travers le monde et deux millions denfants de moins de 5 ans en meurent chaque anne. Ces chiffres font de cette maladie la premire endmie mondiale (OMS, 2000). A Madagascar, le paludisme est encore la seconde cause de morbidit aprs les infections respiratoires aigus. Le nombre de cas de paludisme prsum est de 1 234 5201 soit un taux de mortalit de 17%. Alors lobjectif de lEtat malagasy est de rduire ce pourcentage 9% dici fin 2012. Les mdicaments utiliss pour le traitement du paludisme sont tous dorigine vgtale. La quinine, extraite de Sincons (Rubiaces) est la source de diffrents quinolines de synthse dont la plus connue est la chloroquine. Lartmisinine, isole de lArtmisia Annus (Composites), a t utilise depuis 2 000 ans en Chine pour combattre le paludisme. Cest une sesquiterpne lactone endoperoxyde.

Figure (01) : Molcules antipaludiques Le terme cancer regroupe un ensemble de maladies. On compte plus de 100 types de cancer mais tous ont en commun la croissance anormale des cellules qui envahissent et dtruisent les tissus normaux au lieu de les construire ou de les rparer (Association pour la Recherche sur le cancer, 1999). Les cancers appels tumeurs malignes peuvent envahir les tissus et 1 les organes sains avoisinants. En passant dans la circulation sanguine ou dans

K D ^

le systme lymphatique, les cellules cancreuses peuvent diffuser dans dautres parties de lorganisme pour y former de nouvelles tumeurs. La chimiothrapie recouvre un ensemble dune cinquantaine de mdicaments ayant tous en commun une action de destruction des cellules cancreuses. Ces mdicaments existent, pour la plus part, depuis les annes 1950. Le grand Sud malgache est une source despoir et davenir pour des nouveaux mdicaments isols partir des plantes mdicinales. Le premier mdicament anticancreux de ce monde est isol partir de Catharenthus rosus, une plante malgache appele vernaculairement Tsongatse ou Befela ou Vonenina dont le premier chantillon a t rcolt Tsihombe, Rgion de lAndroy Madagascar. La seconde plante est la plante code LCA000 qui est galement candidat devenir mdicament anticancreux au stade dessai clinique lIllinois Chicago dAmrique. Dans notre part, nous avons fait une recherche sur les plantes mdicinales de la Rgion Sud Ouest de Madagascar. Lobjectif de notre tude est donc de rechercher de nouvelles molcules vise antipaludique et/ou anticancreuse. Parmi les plantes tudies, lEvonymopsis Longips (CELASTRACEAE) possde la fois les deux proprits vises: anticancreuse et antipaludique. Pour cette plante, aucun travail chimique, ni pharmacologique na t mentionn dans la littrature. Quant la mthodologie dtude, une approche ethnopharmacognosique a t applique pour la slection des plantes, suivie dune tude pharmaco-chimique. Alors, le prsent mmoire, pour lobtention du Diplme dEtudes Approfondies D.E.A), sera consacr principalement mes travaux personnels, savoir la bibliographie, ltude chimique et lvaluation biologique des principaux mtabolites secondaires isols de lEvonymopsis Longips Dans une premire partie, nous procderons une prsentation synthtique du paludisme et du cancer suivi de la description de la plante tudie. La deuxime partie concernera les matriels et mthodes avec une prsentation des techniques disolement et danalyse utilises au cours de ce travail. La troisime partie prsentera les rsultats obtenus qui seront suivis dune discussion et dune conclusion gnrale.

I.- GENERALITE SUR LE PALUDISME ET SUR LE CANCER

1.1.- LE PALUDISME 1.1.1.- Epidmiologie du paludisme et rpartition gographique du paludisme Le paludisme pose aujourdhui un problme de sant publique pour plus de 100 pays reprsentant un total de 2,4 milliards de personnes soit environ 40% de la population mondiales. Ces pays sont essentiellement des pays en dveloppement situs en Afrique, Asie et Amrique latine. Tous les ans, on recense 300 500 millions de personnes contamines et environs trois millions de morts, la plupart en Afrique. Le nombre de dcs aisment celui du SIDA (Aris. 2000). LAfrique est le continent le plus particulirement touch par le paludisme. Le danger est quasi nul en Afrique du Nord, mais majeur en Afrique de lEst, en Afrique subsaharienne et en Afrique quatoriale. En Asie, le paludisme est absent des grandes villes et plutt rare dans les plaines cures. Le danger est majeur dans les zones rurales du Cambodge, de lIndonsie, du Laos, de la Malaisie, des Philippines, de la Thalande, du Vietnam et en Chine dans le Yunnan et Hainan. Dans les Antilles, le paludisme svit Hati et prs de la frontire de la Rpublique dominicaine. En Amrique centrale, il, existe quelques micro-zones, mais le risque est relativement faible. En Amrique du sud, le risque est faible dans les grandes villes, mais rel dans les zones rurales en Bolivie, en Colombie, en quateur, au Prou et au Venezuela, et majeur dans toute la zone amazonienne. Notons que les estimations sont le plus souvent difficiles dun fait du manque de fiabilits des statistiques dans les diffrents pays concerns. En 2002, des chercheurs de la revue Nature estimaient 515 millions de malades, soit deux fois plus que les estimations de lOMS (Snow et al.. 2005 ; Simon et al.. 2004 :http:/ siteresources worldbank. org : page consulte le 12 juillet 2005). 1.1.2.- Des chiffres alarmants Entre 300 millions 500 millions de cas cliniques tous les ans. Entre 1 3 millions de morts principalement des enfants de moins de cinq ans et les femmes enceintes. Trois mille enfants de moins de cinq ans en meurent chaque jour

Lorganisation mondiale de la sant (OMS) estime que le malaria coffre environ 1,3% du produit intrieur brut annuel des tats dans lesquels la maladie svit. Dans certaines rgions de lAfrique, les familles ne dpensent pas moins de 25% de leur revenu pour le traitement de la maladie. Et le fardeau de cette pathologie continue daugmenter en raison de la rsistance des parasites aux drogues existantes, lexpansion gographique des moustiques rsistants aux insecticides, au manque dinfrastructures mdicale et une incapacit dorganisation pour aborder le problme (Rinaldi, 2004) Les rgions impaludes sont dtermines selon la rsistance de la maladie la chimioprophylaxie par la chloroquine et/ou la pyrimthamine/sulfadoxine. Pays du groupe I : Il sagit des pays dans lesquels on nobserve pas de souches multirsistantes de P. falciparum Pays du groupe II : prsence de P. falciparum rsistant la chloroquine Pays du groupe III : zones de prvalence leve de chloroquinorsistance et/ou prsence de souches de P. falciparum multirsistante. 1.1.3.-Le Parasite et le vecteur 1.1.3.1.- Les parasites du genre plasmodium En 1878 le mdecin militaire Alphonse Laveran fut le premier dmontrer la nature parasite du paludisme en dtectant des lments se prsentant rouges des malades atteints de fivres palustres, en dcrivant des lments se prsentant sous formes de croissant, de sphres ou de flagelles. Le parasite appartient lembranchement des Sporozoaires parmi lesquels on distingue les Sarcosporidies et les Coccidiomorphes dont fait partie le genre Plasmodium. Les Plasmodium sont des parasites des hmaties : cest pourquoi on les nomme parfois hmatozoaires. Ils appartiennent plus prcisment lordre des Hmosporides ou Hmococcidies et la fin famille des Plasmodiides. Il existe de nombreuses espces du genre Plasmodium parmi lesquels quatre peuvent tre responsables dune infection chez lhomme. Il sagit de : Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale. 1.1.3.2. Le vecteur : lanophle femelle Ce sont des moustiques culicids de la famille des Anophlins. Les anophles femelles se reconnaissent leur position de repos oblique par rapport au support sur lequel ils sont poss et leurs appendices cphaliques.

Leur reproduction exige du sang, de leau et de la chaleur. La fconde ne peut pondre quaprs un repas sanguin, pris sur lhomme ou sur lanimal. Les gtes de ponte varient selon lespce anophlienne : collections deau permanente ou temporaire (persistant au moins dix jours conscutifs), claires ou pollues, douces ou saumtres, ensoleilles ou ombrages. Dans leau les ufs se transforment en larves puis en nymphes, dont natra une nouvelle gnration dadulte. Chaleur et humidit conditionnent galement lactivit gnitale des femelles : en zone tempre, les anophles ne pondent qu la belle saison ; en zone quatoriale leur activit est permanente ; en zone tropicale la saison sche limite la prolifration par rduction du nombre de gtes. Les femelles vivent environ un mois. Elles piquent surtout au crpuscule ou durant la nuit. La plupart des anophles ne sloignent gure de leur lieu de naissance; ils sont parfois entrans des grandes distances par les automobiles, les avions et a un moindre degr par les vents car les anophles prsentent une certaine fragilit (Gentilini.1990). Lanophle se dirige plus volontiers vers les lieux ou la concentration en dioxyde de carbone est la plus importante, cest--dire lintrieur des habitations, ou proximit des humains lextrieur de leurs habitations. 1.1.4. Cycle de reproduction des plasmodies Le cycle de dveloppement du Plasmodium comprend une phase de multiplication asexue qui se droule chez lhomme, et une phase de multiplication sexue qui se droule chez le moustique (Anophle). 1.1.4.1. Cycle asexu ou Schizogonique chez lhomme Au cours de son repas, le moustique injecte avec sa salive des centaines de parasites sous forme de sporozotes fusiformes qui gagnent rapidement le foie o seffectue le cycle exorythrocytaire primaire. Les sporozotes pntrent dans les cellules hpatiques o ils prennent le nom de cryptozotes. Ils grossissent, se divisent et constituent en une semaine les corps bleus (schizontes matures) volumineux, dformant lhpatocyte et repoussant son noyau en priphrie. Lclatement des corps bleus libre de nombreux mrozotes, qui pour la plupart passent dans la circulation sanguine. En cas dinfestation par le P.vivax ou P.ovale, certains cryptozotes peuvent rester quiescents, pendant plusieurs mois plusieurs annes. Quand ces formes quiescentes, appeles hypnozotes, se divisent, effectuant un cycle exorythrocytaire secondaire, ils sont

susceptibles de rensemencer le sang en mrozotes et de dterminer ainsi des reviviscences. P falciparum et P.malariae, ne comportent ni hypnozotes, ni schizogonie tissulaire secondaire. Dans le sang seffectue le cycle asexu rythrocytaire (schizogonie rythrocytaire). Chaque mrozotes pntre dans une hmatie par endocytose et sy transforme en trophozoite. Il grossit et son noyau se divise, donnant alors un schizonte qui se charge de pigment malarique ou hmozone. La multiplication des noyaux dont chacun sentoure dune plage cytoplasmique forme un schizonte m ou un corps en rosace. Paralllement, lhmozone se dgrade et, dans lhmatie parasite, apparaissent des granulations de Schuffner (P.vivax et P.ovale), ou des taches de Maurer (P. falciparum) ou aucune forme de colorant malarique (P. malaria) Le corps en rosace dilate et m clate. Cet clatement, responsable de laccs fbrile, libre des mrozotes qui vont parasiter des hmaties vierges et effectuer de nouveaux cycles schizogoniques rythrocytaire. Chaque cycle rythrocytaire dure 48heures pour P.vivax P ovale et P.falciparum, et 72heures pour P.malariae Apres plusieurs cycles schizogoniques, apparaissent dans les hmaties des lments a potentiels sexus que sont les gamtocytes males et femelles. 1.1.4.2. Cycle sexu ou sporogonique chez lanophle Le gamtocyte femelle donnera chez le moustique un unique gamte femelle. Le gamtocyte male, en revanche, donnera naissance quatre gamtes males, de forme filamentaire (Mollaret. 1880). Apres une piqre sur un paluden, le moustique absorbe des schizontes, des corps en rosace et des gamtocytes. Les lments asexus sont digrs et seuls les gamtocytes ingrs poursuivent le cycle (Ministre de la Sant SNIGS. 1994). Dans lestomac du moustique le gamtocyte mle se transforme en gamte par exflagellation, le gamtocyte femelle par expulsion de corpuscules chromatiniens. Cette exflagellation ne se produit pas dans lorganisme humain, mais peut tre obtenu dans le sang humain mis entre lame et lamelle, et grce des modifications physicochimiques. La fcondation du gamte femelle donne un uf mobile, lookinte, qui

traverse la paroi de lestomac de lanophle, se fixe sur sa face externe, formant oocyste dans lequel sindividualisent les sporozotes. Libres par lclatement de loocyste, ces derniers gagent les glandes salivaires de lanophle. La dure du cycle sporogonique varie entre 10 et 40 jours.

1.2.-LE CANCER 1.2.1.-Dfinition Le cancer est une maladie caractrise par une prolifration cellulaire anormalement importante au sein d'un tissu normal de l'organisme de telle manire que la survie de ce dernier est menace. Ces cellules drivent toutes d'un mme clone, cellule initiatrice du cancer qui a acquis certaines caractristiques lui permettant de se diviser indfiniment. 1.2.2.-Evolution de la maladie La cellule cancreuse a une croissance anarchique et incontrle. Les cellules saines, qui sont llment de base des tissus, poussent, se divisent et se renouvellent dune faon ordonne. Ce processus permet lorganisme de conserver son quilibre. Il arrive cependant que certaines cellules perdent leur capacit de croissance contrle, se mettent se diviser trop rapidement et crotre de faon dsordonne. Du tissu excdentaire est ainsi produit, commenant former une tumeur. Les tumeurs peuvent tre bnignes ou malignes. (i)-Les tumeurs bnignes ne sont pas des cancers. En effet, elles ne diffusent pas dans lorganisme et menacent rarement la vie du patient. Le plus souvent, les tumeurs bnignes peuvent tre enleves par la chirurgie et les risques de rcidive locale sont trs faibles. (i)-Les tumeurs malignes sont des cancers. Elles peuvent envahir les tissus et les organes sains avoisinants. De plus, en passant dans la circulation sanguine ou dans le systme lymphatique, les cellules cancreuses peuvent mtastaser (essaimer, diffuser) dans dautres parties de lorganisme pour y former de nouvelles tumeurs. Mme si une tumeur cancreuse est enleve, la maladie peut de ce fait rcidiver. Cette capacit de diffusion dans tout lorganisme fait quil est essentiel pour le mdecin de dtecter le plus tt possible toute tumeur et de savoir si elle est bnigne ou maligne. Ds que le diagnostic de cancer est pos, le mdecin peut mettre en uvre un traitement en vue de matriser la maladie. 1.2.3.-La Chimiothrapie dans le traitement des cancers 1.2.3.1.-Dfinition Le terme de chimiothrapie ou chimiothrapie anticancreuse recouvre un ensemble dune cinquantaine de mdicaments ayant tous en commun une action de destruction des cellules cancreuses. Ces mdicaments existent, pour la plupart, depuis les annes 1950. Employs seuls, combins entre eux ou encore en association avec dautres armes

de lutte contre le cancer (chirurgie, radiothrapie, immunothrapie), ces mdicaments ont permis dobtenir de nombreuses rmissions et parfois lradication complte de la maladie. En France et dans de nombreux pays, la chimiothrapie est habituellement prescrite par un spcialiste du traitement mdical du cancer appel oncologue mdical . La spcialit de ce mdecin est loncologie mdicale. 1.2.3.2.-Mode daction de la chimiothrapie Comme la plupart des cellules de lorganisme, les cellules malignes qui composent le cancer se multiplient par division. La chimiothrapie anticancreuse est compose dun ensemble de mdicaments qui ont la proprit de tuer les cellules en cours de division (cellules dites en cours de cycle cellulaire ). Si les cellules tumorales sont mieux dtruites par ces mdicaments que les cellules normales de lorganisme, cest en partie parce que ces dernires se divisent habituellement beaucoup moins vite, et sont donc moins exposes leffet de la chimiothrapie. A peu prs tous les anticancreux agissent sur lADN des cellules. Les anticancreux peuvent par exemple empcher la fabrication de lADN, le casser une fois fabriqu, lempcher dtre actif, inhiber la formation ou le dplacement des chromosomes, etc...Certains anticancreux peuvent galement agir sur lARN ou sur les protines de la cellule. Cependant, lADN reste la cible privilgie de la chimiothrapie. 1.2.3.3.-Les principales molcules anticancreuses Dans ce chapitre nous allons donner les diverses molcules anticancreuses aussi bien dorigine vgtale, dhmisynthse et de synthse. Les premires molcules anticancreuses isoles partir de plantes sont le vinblastine (velbe) et le vincristine (oncovin).Ces molcules ont t isoles partir de Catharanthus roseus ( la pervenche de madagascar) dans la rgion dAndroy. Ces molcules sont les premiers mdicaments anticancreux dans le monde. Le vinblastine est utilis contre le cancer de sein et de lutrus, le vincristine est contre le cancer de sang chez les enfants. Les formules de ces dernires sont ci-dessous. Le vindosine est une molcule obtenu par hemisynthse partir de la squelette de base de vinblastine et de vinchristine. Il y a galement le navelbine qui est un produit dhmisynthse de la mme anologue . Elles ont la mme proprit que le vinblastine et le vincritine avec moins de toxicit et deffet secondaire moder.

OH N N N H H 3 CO2 C OH H 3CO N H R1 R2 R3

OH

1- Vinblastine (Velbe) R1 = CH3, R2 = CO2CH3, R3= OAc 2 - Vincristine (Oncovin) R1= CHO, R2 = CO2CH3, R3=OAc 3- Vindesine R1= CH3, R2 = CONH2, R3 = OH
Figure (02) : Molcule anticancreuse

N N N H H 3 CO2 C OH H 3CO N H R1 R2 R3

R1 = CH3, R2 =CO2CH3, R3 = OAc Navelbine (Vinorelbine)

Figure (03) : Molcule anticancreuse Une molcule d nomm paclitaxel (Taxol) a t isole partir dune plante Amricaine le Taxus Brevifolea. Le travail a t effetu par Wani et all en 1971. Cette molcule a une activit anticancreuse contre le cancer de sein et de lutrus. Toute fois le dveloppement industriel de la molcule fut difficile dans la mesure o le nombre de plante travailler est insuffisant pour son exploitation dans la mesure o on a une grosse molcule. La formule de la molcule est la suivante :

R 1O H3C

O CH3

OH

H R2O O OCOCH 3

HO

H OCOC 6H 5

R1 1 Paclitaxel (Taxol) COCH3

C6H5CO C6 H5

R2
NH O

OH

2 Taxotre

Me3COCO

NH

C6H5 OH

3 10-Deacetyl baccatine III

Figure (04) : Molcule anticancreuse

Des molcules triterpniques sont parmi les candidats des anticancreuses dont leurs familles gurissent le cancer de sang ou la leucmie. Les reprsentants des structures sont ci-dessus :
OH HO COOCH 3 O O OR 2

R 1O H H

Triterpne glucosides : R1 Bruceantin : H

O

R2

Figure (05) : Molcule anticancreuse

H CHO

AcO H AcO OAc OH OH

Cumindysoside A
Figure (06) : Molcule anticancreuse Si les recherches autour des anticancreux connus se poursuivent par le dveloppement de drivs mieux tolrs, par une meilleur comprhension des phnomnes de rsistance certaines drogues, par la mise au point dassociations plus adaptes, la dcouverte de molcules nouvelles reste le premier moteur des progrs en chimiothrapie. Les efforts dans ce sens se sont considrablement intensifis. 40 000 substances sont testes chaque anne. Les grands laboratoires pharmaceutiques ont leur propre programme de screening . 1.3.-LES TERPENES
1.3.1.-Dfinition

Les terpenodes sont des mtabolites secondaires des vgtaux. Cependant, on peut en rencontrer chez les animaux : phromones et hormones juvniles, etc. Du point de vue biogntique, tous les terpnes sont forms par lassemblage de cinq units de carbones ramifies drives du 2-mthylbutadine. En 1887, O.Wallach envisageait dj que les terpnes devraient tre construits partir dunits isoprniques et trente ans aprs, cette hypothse est devenue une rgle gnrale. Chaque groupe de terpnes est issu de la condensation tte--queue dun nombre variable dunits isoprniques. Cette rgle

formelle postule que la diversit structurale nest quapparente : dans chaque groupe de terpnes, un prcurseur unique conduit aux diffrents constituants connus par une succession de ractions classiques (cyclisation, fonctionnalisation, rarrangement). La formule du prcurseur des terpnes est la suivante :

1
H2C

2
C

3
CH

5
H3C

4
CH2

Isoprne : methyl 2 butadine Les terpnes = n (C5) = n

1.3.2.- Classification

La classification des terpnes sont rpertories dans le schma ci-dessous avec comme formule gnrale nC5 o n est un nombre entier non nul
Pour n= 1, on a l'isoprne C5 C5 dimrisation C10 C5 dimrisation Pour n = 3, les sesquiterpnes C15 dimrisation C 30 C15 Pour n = 6, les triterpnes C20

Pour n= 2, les monoterpne

C10

C20 Pour n = 4, les diterpnes

C40 Pour n = 8, les tetraterpnes Schma (01) : Classification des terpnes

Les monoterpnes (C10) et les sesquiterpnes (C15) sont les principaux constituants des huiles essentielles. Les diterpnes, les triterpnes et les tetraterpnes sont les substances que lon rencontrent dans les divers extraits des plantes et dans quelques animaux gnrale est .

(hormones ). Ils

existent aussi les polymres des terpnes qui sont les caoutchoucs et les gommes. Sa formule

1.3.3.- Classification Biogntique des produits naturels

La classification biogntique des produits naturels est rpertorie dans le schma ci-dessous :

Schma (02) : Classification Biogntique des produits naturels

1.3.4.- Biogense

Les terpnes ont deux origines biogntiques : le premier est par la voie de lacide mvalonique et le deuxime est par la voie shiquimique. La voie par lacide mvalonique sera dveloppe ici. Le prcurseur de lisoprne en C5 est lacide mvalonique obtenu partir de lestrification de lacide actique avec un groupe thiol dune molcule complexe appel coenzyme de formule HSCo (HS : thiol) pour donner actyle coenzyme suivi de condensation de 3 unit actyle coenzyme.

CH3

COOH

+ HSCoA OH-

CH3

COSCoA

H 2O

Cration de carbocation :
CH3 COSCoA

CH 2

COSCoA

SCoA
-

CH 2

COSCoA + CH 3

S.N
C O OH CH 3 C OCH 2 C O SCoA

CH3 C O CH 2 C H2 C C O O

CH 2 C O

SCoA

-CH 2

SCoA SCoA

CH3 C O CH 2 SCoA O C H2 C C O

CH 2 C O C O

SCoA

OHA.N
CH 3 O CH 2 C H2 C C OH OH C O

SCoA SCoA

CH 3

C OH

OH-

CH 3

C OH

OH

(R) NADH
HO COOH

H3C

OH

Acide mvalonique (MVA) + CO2 + H2O

O

CH 2 HO H O

H2C HO

-mcanisme concert -raction de trans limination

+ 2 H3PO4
H 2C

H 2C O O P O O P O

=
O OH

H 2C PPO

HO

Pyrophosphate d'isopentyl IPP

PPOH 2 C

PPOH 2 C

IPP

Dimthyl allyl pyrophosphate DMPP

Schma (03) : Biogense Dimthyl allyl pyrophosphate NB : le groupe phosphate est bon partant. Le DMAP est un groupe trs ractif.
1.3.5. Elaboration des diffrents squelettes des terpnes
H OPHPH 2 + DMAP t OPP q OPP He H 5

IPP

Hz

Le geranyl pyrophosphate GPP (C 10)

H+
CH2 OH + Terpenyl Le geraniol Le geranyl pyrophosphate GPP (C10) CH 2OPP

OH+

Pinane OH -terpinol

CH 2 OPP

Le geranyl pyrophosphate GPP (C 10)

C5
+

H+

PPOH 2 C

CH 2OPP CH 2OH Bisabolane

Farnesyl Pyrophosphate

FPP C,t

Farnesol

FPP tt

C5

PPO CH2

Cembrene
OH CH2 OPP
+

CH2OPP Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP)

H+ Manool

CH 2 OPP

q q Squal ne

PPOH 2C O

q q

Le squalne naturelle est l'epoxy-squalne dont la formule est le suivante

H 1 + O HO 2 H

H+

ho HO

Cycloartrol (provenant de phytostrol)

Lanostrol

CH2 OPHPH 2

PPOH2 C

Phytone

16

17 6 1' 5 4 18

2 3

carotne
Schma (04): Biogense de quinones triterpnes

Il existe des monographies dont la plus clbre est celle de Robert Hegnauer intitul Chemotaxonomie der Pflenzen pour la connaissance de la chimiotaxonomie des plantes [Hegnauer, 1993]. Avec la venue de la technologie, de linformation et de la communication, un cdrom sur les produits naturels a t conu, ralise et mise jour priodiquement par chapman & Hall. Lavnement de la bibliographie on line telle que NAPRALERT, HINARI (http://www.who.int/hinari/en/) dans lequel on peut tlcharger les articles de sciences@Direct partir de 1998, Google Scholar (http://scholar.google.com/), Sciences Finder Scholar (http://www.escience.org/scholarescience.html) a encore amlior la recherche chimiotaxonomique. Les recherches bibliographiques que nous avons effectues partir de ces bases de donnes nous ont permis de connatre dans les grandes lignes la biogense des quinones triterpnes. Cette classe de substances naturelles est localise presque exclusivement dans la famille des Celastraceae et des Hyppocratiaceae [Bruning and Wagner, 1978]. Elles sont caractrises par la prsence dun noyau quinonique au niveau du cycle A dun triterpne de type friedline. Le terme Anglo-saxon methide signifie quil existe un groupe methyl port par ce noyau quinonique, savoir par le carbone 4. La numrotation est la structure gnrale de cette famille chimique dans laquelle Rn (n= 1- 4) peut tre H, -OH, -CH3, -CH2OH, =O (cas de R3), -CO2CH3, sont donnes ci-dessous.
R1 R2

27 12 11 1
O

19 18

20 28 17

R3

21 22
R4

13
H

10 2 3 A 4

9 25

8 7

14 15 26

16

HO

5 6

23 f igure (07) : structure de base de la quinone triterpne

Ces composs possdent des proprits anticancreuses, antimicrobiennes et antimalariques. Il est probable que la prsence du noyau quinonique confre ces molcules des activits biologiques intressantes. Les grandes lignes de la biogense sont rsumes dans le schma ci-dessous [Corsino et al, 2000] :

Oxidosqualne

Cyclase

HO

3 -friedelanol Oxydoreductase

friedelin

H O

HO

Quinonemethide

Figure :shma de la biogense des quinones triterpnes

1.4.- TECHNIQUE DANALYSE CHROMATHOGRAPHIQUE 1.4.1.-Mthodes et techniques de sparation des constituants chimiques La chromatographie est aujourdhui, une mthode analytique largement utilise pour la sparation des constituants chimiques dans des mlanges complexes. Les facteurs qui interviennent dans le partage des molcules sparer entre la phase stationnaire et la phase mobile sont : 9 La solubilit dans un solvant liquide, 9 La taille (la forme), 9 La polarit et la charge lectrique, 9 La prsence de groupement datomes formant des sites particuliers. Les diffrents types de chromatographie rsultent du fait que lon a privilgi leffet de lun de ces facteurs par rapport lautre, mais il faut noter que lexclusivit dun mcanisme nest jamais totale au cours dune sparation chromatographique. Il existe diffrentes sortes de chromatographies parmi lesquelles on peut citer : La chromatographie de partage : cest une chromatographie liquide-liquide. Elle est base sur le partage du solut dans les deux phases liquides. On a privilgi la solubilit dans un solvant liquide ; La chromatographie dexclusion : la phase stationnaire est un solide poreux. Alors, les grosses particules sont exclues de la phase fixe et les petites particules incluses diffusent plus lentement dans les pores du gel. Ici, on a privilgi la taille ou la forme ; La chromatographie dadsorption : cest une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire. Si la phase stationnaire est apolaire, on parle de chromatographie dadsorption en phase inverse. On a privilgi la polarit ; La chromatographie sur changeurs dions : la phase stationnaire est constitue par une rsine porteuse de groupements ioniss ngativement ou positivement, exerant des interactions de type lectrostatique avec les soluts ioniques du milieu. On a privilgi la charge lectrique. La chromatographie daffinit : la phase stationnaire est un support macromolculaire chimiquement inerte, sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit biologique pour un solut de lchantillon analyser (affinit enzyme-substrat, antigne-anticorps). On a privilgi la prsence de groupement datomes formant des sites particuliers.

Pour la sparation de lextrait actonique de lEvonopsis Longips, nous avons utilis trois types de chromatographies : o La chromatographie sur couche mince (CCM) ; o La chromatographie dadsorption sur colonne ; o La chromatographie liquide haute pression (HPLC). 1.4.2.-Chromatographie sur couche mince (CCM). La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur le phnomne dadsorption. Cest la plus simple des mthodes chromatographiques. Elle indique le nombre de composants dans un extrait. Sa mise en uvre ncessite plusieurs matriels (photos IIIa) tels que : Une cuve chromatographique : cest un rcipient en verre (forme rectangulaire) ferm par un couvercle maintenu intense. Une phase stationnaire : cest une couche dadsorbant, un gel de silice, tale uniformment sur un support en aluminium de dimension 5cm x 10cm avec paisseur comprise en 0,5mm et 2mm. Cet adsorbant permet la sparation des substances lipophile et hydrophile dun mlange. La phase mobile : cest lluant, il est compos dun mlange du solvant qui Lchantillon : cest lextrait du vgtale solubilis dans lalcool neutre 90. Les micropipettes : cest pour dposer les chantillons analyser. Le mode opratoire consiste dposer sur une plaque de gel de silice 60F254 (MERCK), de dimensions 10cm x 3cm, un petit spot sous forme de point de lchantillon analyser. La plaque est dpose verticalement dans la cuve contenant dj la phase mobile qui est un mlange de solvants (luant). La cuve est ferme et on laisse lluant diffuser. La tache migre sur la feuille plus ou moins vite selon la nature des interactions quelle subit de la part du support et de lluant. On arrte la migration lorsque le front de lluant est arriv 1cm du haut de la plaque. Les techniques de dtection utilises en CCM sont simples et reproductibles. Elles sont galement relativement sensibles car elles permettent la dtection de la majorit des substances prsentes, mme en faibles quantits. migre lentement le long de la plaque en entrainant les composants de lchantillon dpos.

Dans le prsent travail, de lextraction lisolement et purification, nous avons utilis deux Burchard. (i)-Vanilline sulfurique : Cest un ractif spectre large qui permet la dtection des terpenodes, des drivs de type phnylpropane et des phnols. Elle est obtenue partir du mlange (v/v) dune solution thanolique dacide sulfurique et dune solution thanolique de vanilline 1%. Les deux solutions sont prpares comme suit : o Solution I : mlanger, volume gal, de lthanol 96% et de lacide sulfurique concentr. o Solution II : dissoudre 1g de vanilline dans de lacide sulfurique 96%. La solution de pulvrisation est obtenue en effectuant un mlange, volume gal, de la solution I et de la solution II. Aprs pulvrisation, la plaque est chauffe 105C pendant une dizaine de minutes avant observation des tches obtenues. (ii)-Le ractif de Liebermann Burchard : Trois solvants sont utiliss dans la prparation du ractif et la ralisation de ce test. Il sagit de lthanol, de lanhydride actique et de lacide sulfurique. Pour raliser ce test, on prpare une premire solution compose dun mlange volume gal (5ml) dacide sulfurique et danhydride actique. A cette solution, on rajoute 50 ml dthanol absolu. La prparation est effectue froid dans de la glace. Aprs pulvrisation, la plaque est chauffe 100C pendant une dizaine de minutes. Ce test permet la mise en vidence des triterpnes ainsi que les strodes. Selon le type de compos test, on observe des tches de colorations diverses la lumire UV 365 nm : o Coloration rouge ou jaune orange pour les triterpnes ; o Coloration jaune ou jaune-vert pour les strodes. 1.4.3.-Chromatographie dadsorption sur colonne. Ladsorption est la fixation des molcules dissoutes, par une phase stationnaire. Cette fixation est due ltablissement de liaisons secondaires de surface entre ladsorbant et la molcule absorbe. Dans cette forme de chromatographie, la phase stationnaire est contenue dans une colonne. Lluant qui peut-tre sous la pression dune pompe ou non, entre par une extrmit et sort par lautre. Il peut-tre un solvant unique ou un mlange de solvant. ractifs de pulvrisation : Vanilline sulfurique et le Ractif de Liebermann

Sous laction de lluant et des liaisons quelles tablissent avec ladsorbant, les molcules vont se dplacer diffremment dans la colonne et prendre un certain retard les unes par rapport aux autres pendant la migration. Elles vont donc se prsenter avec un certains retard en sortie de colonne. Llution peut se faire sous forme isochratique ou sous forme dun gradient. En principe, la phase mobile est compose des mmes solvants que ceux utiliss pour la CCM analytique. Toutefois, llution peut-tre acclre grce laddition progressive de solvant de solvant de plus en plus polaire par rapport la phase initiale. Les diffrentes fractions sont collectes dans des erlenmeyers ou dans des piluliers. Ces fractions sont ensuite analyses comme dcrit prcdemment. 1.4.4.-Chromatographie liquide haute pression (HPLC). La chromatographie liquide haute pression est une technique base sur les mmes principes que ceux de la chromatographie classique sur colonne sans en prsenter les inconvnients que sont : la lenteur des sparations, labsence de dtecteurs et la quantit considrable dchantillon ncessaire. Cest un appareillage plus sophistiqu qui permet de mettre en uvre, selon la nature de la phase stationnaire, aussi bien des phnomnes de partage, qui sont les plus courants, que des phnomnes dadsorption, dchanges dions ou dexclusion. La mthode de sparation quelle utilise fait appel aux mmes lments de base que ceux employs pour la chromatographie classique sur colonne, soit un ou plusieurs solvants et une colonne remplie avec une phase stationnaire. Dans ce cas, la colonne est prcde dune pr-colonne qui permet dviter les colmatages ventuels occasionns par laccumulation de molcules de trs grosse taille. Ces colonnes en phase inverse permettent la sparation des composs polaires, solubles dans leau ou dans les mlanges hydro-alcooliques. La grande diffrence par rapport la chromatographie classique rside dans la dure dlution. Cette vitesse est obtenue par lapplication dune pression leve grce une pompe qui maintient constant le dbit de lluant. Cette technique se distingue galement de la chromatographie classique par lutilisation dun dtecteur dont le message est enregistr puis exploit par un dtecteur reli au systme. Il est souvent difficile de trouver rapidement les conditions opratoires qui mneront une bonne sparation. Dans ce cas, la phase analytique (HPLC analytique) conduit au choix des conditions exprimentales de la sparation.

1.5.- TEST BIOLOGIQUE 1.5.1.-Test antipaludique in vitro 1.5.1.1.-Culture in vitro de Plasmodium falciparum La condition de base dans la culture continue de Plasmodium falciparum est la strilit. A cet effet, toutes les manipulations sont effectues sous une hotte flux laminaire vertical (HERAEUS) afin dviter la contamination des cultures par des germes exognes qui pourraient envahir le milieu, inhiber ou perturber la croissance de Plasmodium falciparum. Pour les tests biologiques, la souche de Plasmodium falciparum 3d7 a t utilise. Cest une souche chloroquinosensible provenant du National Institute for Medical Research division of Parasitological Londres et mise en culture continue. Dans la culture cellulaire, le choix et la prparation des milieux de culture sont les paramtres les plus importants. Les milieux doivent tre bien adapts et la strilit respecte. Les boites de cultures sont places dans une cloche contenant une bougie et incubes dan une cuve bactriologique (Heracus) maintenue 37C. Toutes les 24 heures, la croissance des parasites est value en effectuant des frottis. 1.5.1.2.-Evaluation de lactivit antipaludique Le test utilis est une adaptation du semi micro test microscopique prcdemment dcrit en 1978 par Rieckmann et al (1978) et adopt par lOMS pour la surveillance pidmiologique de lmergence de la rsistance des Plasmodium falciparum aux mdicaments antipaludiques. Dans cette technique, seuls les parasites jeunes sont utiliss. Les tests sont effectus en triple avec une gamme de concentration allant de 128 1 g/ml avec des dilutions successives de moiti. Pour raliser ce test, le sans parasit et synchronis est incub 37C en prsence de la gamme de concentration dextraits pendant 24 heures. Les lames (frottis) correspondantes chaque dilution sont ralises, colores au Giemsa et lues au microscope optique. Le nombre de schizontes dans chaque puits est compt. Le pourcentage dinhibition qui exprime laction des extraits sur la croissance des parasites est dtermin.

1.5.1.3.-Protocole exprimental Le test est effectu lorsque les cultures atteignent une parasitmie de 2% avec une prdominance de trophozoite jeunes et se droule en quatre tapes : a.Synchronisation de la culture au sorbitol Afin de partir exclusivement des globules infects par des formes jeunes du parasite, il est recommand de faire une synchronisation au sorbitol (Uhlemann et al, 2000). Lobtention exclusive de trophozote jeunes rsulte de la diffrence de rsistance membranaire des rythrocytes infects par les formes jeunes et ceux infects par les formes ges (schizontes), sous la pression du sorbitol 5%. b.Ralisation de la gamme de concentration La gamme de concentration est ralise partir dune solution mre dextrait de concentration de 200 g/ml. Cette solution est prpare comme suit : lextrait est dissous dans un premier temps dans du DMSO. La solution obtenue permettra de prparer la solution mre avec du RPMI comme solution de travail. c. Incubation Les plaques de tests (plaques 96 puits) sont incubes 37C dans une cloche contenant une bougie pendant 24 36 heures. Aprs 24 heures, un frottis de culture tmoin est ralis pour valuer la maturation des parasites. Si les parasites ne sont pas matures, lincubation est poursuivie jusqu 36 heures. Au-del de 36 heures dincubation, le test nest plus valable. d.Interprtation du test Les Cl50 (Concentration dextrait qui inhibe de 50% la croissance des parasites) et les coefficients de corrlation (R2) correspondants sont dtermins graphiquement, en utilisant la droite de rgression reprsentant le pourcentage dinhibition en fonction du logarithme dcimal de la concentration de lextrait test.

% dinhibition =

1.5.1.4.-Test de cytotoxicit La mthode dAdolphe (15) lgrement modifie a t suivie pour les tests de cytotoxicit. a.Sortie de lazote liquide des cellules KB et Hela Aprs la sortie de lazote et dconglation rapide 37C, les cellules ont t laves comme suit : elles ont t disperses par pipettages rptes, ensuite centrifuges pendant 5 mn 1 000 tours/mn (Centrifugeuse CR 312-Jouant) : aprs avoir limin le surnageant, le culot cellulaire a t rcupr dans le milieu complet et mis en culture stationnaire. b.Mise en culture des cellules Les cellules ont t entretenus en permanence dans les flacons de 50 ml de milieu complet o elles se multiplient (et adhrent la paroi infrieure du flacon de culture Nunclon couch horizontalement). Elles y sont ares avec un mlange gazeux (75% H2, 5% CO2, 20% O2) avant dtre incube 37C. Lorsquelles atteignent la phase stationnaire de croissance, les cellules sont adhrentes la paroi du flacon de culture et/ou confluantes. Les cellules en suspension sont rpliques comme suit : aprs rejet du milieu de culture, les cellules ont t dtaches les unes des autres et de la paroi laide dune solution de trypsine. Aprs dcollement et lavage, les cellules ont t remise en suspension dans un milieu complet (5ml). A partir dun flacon de culture, deux flacons fils ont t prpars. Le repiquage consiste transfrer 50.000 cellules/ml pour les souches Hela, 10.000 cellules/ml de KB partir de la suspension-mre que lon complte 5 ml du milieu de culture pour un flacon de 50 ml et 15 ml pour un flacon de 160 ml avec le milieu. c. Conservation sous azote des lignes cellulaires Les souches peuvent tre remises en conservation dans lazote liquide, les cellules adhrentes ont t trypsines. Aprs dcollement, lavage et centrifugation, le culot cellulaire a t rcupr. Les cellules ont t remises en suspension dans un cryotube contenant 0.9 ml de milieu complet pour les Hela ou 0.9 ml de srum de veau ftal pour les KB 0.1 ml de DMSO (dimthyle sulfoxyde) dans tous les cas. Le cryotube a t rfrigr pendant 1h plus de 4C puis congel 2 heures -30C avant dtre plong dans lazote liquide.

d.Evaluation de lactivit cytotoxique : La mthode mise au point par Fisher (17) laquelle nous avons apport une modification, a t suivie. 1er Jour : Ensemencement et traitement Un flacon a t vid de son milieu de culture, les cellules adhrentes ont t dtaches en faisant agir 2 ml de trypsine, jusquau dbut du dcollement ; une partie de la trypsine a t rejete et le reste (250l) a t mise en suspension dans 5 ml de milieu complet. Une goutte de la suspension a t tale sur un hmatotocymtre de Thomas (10-4 ml) et observe au microscope optique (grossissement x 10) pour prciser la concentration cellulaire dans le flacon de culture. Les cellules ont t ensuite ensemences sur plaques Multiwell (96 puits, Flacon). Chaque cupule a reu 200l de suspension prpare 60.000 cellules/ml. Des solutions-mres des fractions F-1 F-5 ont t prpares et strilises en solubilisant 5 mg de ces extraits dans 10 ml du systme de solvant MeOH/H2O (5/5). Une srie de concentrations ont t prpares alors par dilutions successives de la solution-mre de dpart pour avoir des concentrations finales allant de 1 80 mM dans les cupules. Ces diffrentes concentrations ont t distribues comme suit : un lot de 4 cupules ont t traits laide de ces concentrations de lextrait. Ensuite, les plaques ont t incubes dans une tuve 37C dans 5% de CO2. 4me Jour : Numration cellulaire Les numrations cellulaires ont t faites aprs 72 heures de traitement : toutes les cupules ont t vides de leur milieu, puis 50 ml de trypsine a t laisse en contact avec les cellules pendant 30 minutes. Ensuite, 50 ml dune solution de bleu trypan (0.25% dans du NaCl 9%) ont t ajouts. La numration cellulaire a t ralise immdiatement au microscope sur une cellule de Thomas. Expression des rsultats : Les rsultats ont t exprims par : Le pourcentage dinhibition (%) de la croissance cellulaire dans les cupules non traits par rapport celle des cupules tmoins, en fonction de la concentration des extraits ; Les concentrations inhibitrices 50 et 90 (Cl50 et Cl90) de la croissance cellulaire. 1.6.- TECHNIQUES SPECTROSCOPIQUES Lidentification des structures molculaires organiques se fait gnralement par utilisation combine de plusieurs techniques spectroscopiques : La spectroscopie de masse ; La RMN (Rsonnance Magntique Nuclaire) du proton et du carbone.

1.6.1.- La spectromtrie de masse (SM) La spectromtrie de masse est une technique de dtection extrmement sensible qui permet de dterminer le poids molculaire dun produit pur ou de recueillir des informations structurales partir de la nature des fragments obtenus. Le principe de la spectromtrie de masse est bas sur lionisation des molcules introduites dans lappareillage. Lion ainsi obtenu, appel ion molculaire, permet la dtermination de la masse molaire du compos. Il peut y avoir ruptures de liaisons chimiques au sein de lion molculaire, avec formation dions fragments caractristiques puisque cette dissociation ventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mcanismes bien dtermins. Lensemble de ces ions constituent le spectre de masse dont la lecture permet lidentification de la structure molculaire. 1.6.2.- La Rsonance Magntique Nuclaire (RMN) La RMN ou rsonnance magntique nuclaire est une technique utilise pour lanalyse des structures de nombreuses molcules chimiques. Elle sert principalement la dtermination structurale des composs organiques. Cette mthode repose essentiellement sur le phnomne de magntisme. En effet, les noyaux de certains atomes (1H, 13C, etc.) possdent un moment magntique nuclaire, cest--dire quils se comportent comme des aimants microscopiques caractriss par une grandeur quantique appele le spin (Boudonneu, 1990 ; Canet, 1991). La technique de RMN tudie le comportement des noyaux atomiques en prsence dun champ magntique externe. Le champ magntique appliqu aux produits entrane un ddoublement des niveaux dnergie du spin nuclaire, de sorte quon puisse induire des transitions entre eux, suite labsorption dune radiation lectromagntique adquate. Les chantillons sont dissous dans un solvant deutr qui peut-tre du mthanol, du chloroforme, de la pyridine, etc. Ces solvants possdent des dplacements chimiques spcifiques (exemples au tableau 01) SOLVANTS Chloroforme Mthanol Pyridine DMSO

1H (ppm)
7.27 4.87 8.71 2.49

13C (ppm)
77.0 49.0 149.9 39.5

Tableau (01) : Dplacement chimique (en ppm) des solvants deutrs utiliss.

On distingue deux techniques de RMN : (i)-RMN monodimensionnelle (RMN-1D) ; (ii)-RMN bidimensionnelle (RMN-2D) 1.6.2.1.- RMN monodimensionnelle (RMN-1D) RMN proton (1H) Le spectre RMN du proton est une mthode puissante utilise dans la dtermination structurale des composs organiques inconnus. Il fournit de nombreuses informations telles que les diffrents types dhydrognes prsents dans la molcule analyse, les diffrents types dhydrognes prsents dans lenvironnement lectronique, le nombre dhydrognes voisins dun hydrogne donn et le dplacement chimique caractristique de chaque proton. RMN carbone (13C) : DEPT 135 et Jmod Dans cette exprience, chaque atome de carbone qui est dans un environnement unique provoque une crte distincte sur un spectre. Gnralement, cette technique permet de mettre en vidence tous les carbones de la molcule. Lanalyse se base les dplacements chimiques observs en fonction de lenvironnement de chacun des atomes de carbone. Cette exprience permet la mise en vidence des carbones primaires (CH3), secondaires (CH2), tertiaire (CH) et dans une moindre mesure les carbones quaternaires. La diffrence majeure entre le DEPT 135 et Jmod, rside dans le fait que les carbones quaternaires sont dtects avec le Jmod alors quils ne le sont avec le DEPT. 1.6.2.2.- RMN bidimensionnelle (RMN-2D) Les expriences de RMN 2D reposent sur une succession de trois intervalles de temps, le temps de prparation, le temps dvolution et le temps de dtection. Dans certaines autres expriences, il peut sajouter une autre priode avec la dtection. Cest le temps de mixage (Gunter, 1994). Corrlations homonuclaires o COSY (1H 1H) : Cette exprience fournit des informations sur les couplages homonuclaires 2J et 3J (protons spars par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont adjacents. o NOESY (1H 1H) : Cette technique permet dobserver, dans lespace, les corrlations entre protons (effets Overhausser) dune mme molcule.

 Corrlations htronuclaires o HSQC (1JH-C) : Cette technique permet dobserver les couplages chimiques entre les carbones et les protons directement lis entre eux. Toutefois, elle ne permet pas dobserver les dplacements chimiques des atomes de carbones quaternaires. o HMBC (2JH-C , 3JH-C ) : Cette technique permet rpondre aux problmes prcdemment poss, puisquelle permet la dtection des couplage longues distance (2JH-C , 3JH-C ), et permet de dduire les carbones quaternaires coupls au protons.

II.-MATERIELS ET METHODES Il existe trois mthodes dapproche pour les rcoltes de plantes : Le premier est le random selection approch qui consiste rcolter au hasard les plantes. La deuxime est bas la chimiotaxonomie qui consiste choisir les plantes en fonction de leurs familles chimique en consultant une base de donne. Le dernier est de choisir les plantes en se basant sur lenqute ethnobotanique auprs des gurisseurs. Cest ce dernier que nous avons choisit le long de notre travail. La plante dont le nom vernaculaire est Reampy a t choisit par le gurisseur de nom scientifique est Evonymopsis longips (Celastraceae) 2.1.-Enqute ethnobotanique Avant la rcolte de la plante, une enqute ethnobotanique est toujours ncessaire. Cette approche consiste recueillir auprs des populations locales des renseignements concernant les utilisations traditionnelles de la plante. Le plus souvent, lenqute ethnobotanique se fera auprs de gurisseur. Ces derniers possdent des savoirs authentiques tenus secrets et transmis de bouche oreilles, leur efficacit provenant des proprits pharmacologiques des plantes quils utilisent. Dans le Sud de Madagascar, le savoir des plantes est considr comme un attribut des gurisseurs. Connatre les plantes ne va pas seul mais implique la connaissance de lensemble des choses du monde (Mickael Lambek, 1981, 1999), pouvoir accord par la divination gomantique (sikidy) et par les astres (destins zodiacaux ou orikandro). La plante est un lment essentiel dans la composition des charges (aoly) qui saccompagne de rituels et parfois de sacrifices. Cependant, la connaissance des plantes mdicinales nest pas rserve aux seuls gurisseurs. Les possds (tromba) et les femmes accoucheuses y ont galement recours. Et les plantes que lon trouve sur les marchs refltent les besoins des diffrents recours thrapeutiques ainsi identifis. 2.2.-Matriel vgtal 2.2.1.-Rcolte de la plante La plante a t rcolte dans la fort dEzombitse 20 km de Sakaraha et cest le gurisseur dnomm Jaonary qui nous a fourni le renseignement ncessaire. La ville de Sakaraha (cf. carte de Madagascar ci-aprs) est situe 133 km de Toliara, sur la route nationale RN7. Cest un chef lieu de district dans la Rgion Sud Ouest de Madagascar La plante dEvonymopsis Longips, qui nous a servie dchantillons danalyse, a t rcolte le 04 dcembre 2010 dans la fort dEzombitse Sakaraha. Lors de la rcolte, nous tions accompagns par Monsieur Jaonary, gurisseur et vendeur de plantes mdicinales au march de Toliara.

Photo (01) : Carte de Localisation de la Rgion du Sud-Ouest

2.3.-Identification botanique LEvonymopsis Longips est une plante endmique des rgions sud-ouest semidsertiques de Madagascar. Lidentification botanique de la plante a t effectue par Monsieur Armand RAKOTOZAFY, botaniste de lIMRA : -Famille ; CELESTRACEAE -Genre : Evonymopsis -Espce : Longips -Nom Vernaculaire Malgache : Reampy. Arbuste hermaphrodite aux arbres moyens. Feuilles opposes ou occasionnellement whorls parfois chestec lapex des tiges, simple, entiers ou dentel-spinose, penninerved coriace, stripules trs petits, cymose, petit fleures, 5 merous, court calys fondus, simbriquent aux lobes de sousvalver, le petale 5, fortement tordus dans les deux directions dans le bourgeon, la marge de recouvrement dilate, la marge couverte coupe brusquement, stale aux stamens danthse 5, alternent les petales insers au milieu du disque court filaments les anthres intorse longitudinalement dhiscents, disque plat, pais et charnu.5 angl, ovaire incompltement 5 loculaire. 1 ou 2 avortant souvent la base lgrement vier dans le disque, dnomment le stigma court obscurment lober : ovule 4 12 par locule, bisris. Porte des gros fruits, charnu, indhiscent, 5 10 graine de baie ; les graines couvertes par un aril mince et entier, lcale du grain crustace, dendosperme pais et charnu. Evonymopsis est distribu dans les forts vertes et humides, aussi bien que dans les forts subarides caduques. Il peut tre identifi par 5 fleurs merous, les ptales fortement tordus dans le bourgeons, a cart plat lanthse, avec la marge de recouvrement dilate et la marge couverte abruptement dcoupe, les stamens insrs au milieu du disque un ovaire incompltement loculaire avec 4 12 ovules, et des graines couvertes par un aril entier mince, lcale du grain crustace et manquante des nerfs distincts.

Photo (02) : Reampy (Evonymopsis Longips)

Photo (03) : Reampy (Evonymopsis Longips) 2.3.1.-Schage et broyage de la plante Aprs la rcolte, les chantillons (tiges et feuilles) sont schs labri du soleil et la temprature ambiante. Aprs quelques jours, ils sont rduits en poudre dans un broyeur IK WERKE (6000/mn) et les trois mille neuf cent soixante deux gramme (3 962g) de poudres obtenu sont conserves temprature ambiante. 2.3.2.-Solvant, ractif et adsorbant Lactone, lhexane, lactate dthyle, le dichloromthane, le mthanol, le cyclohexane, lactonitrile ont t achetes dans des bouteilles de cinq litres (5l). Les plaques pr-fabriques de type 25 feuilles daluminium CCM 20x20 Gel de silice 60 F254 portant la rfrence 1.05554.0001 MERCK ont t utilises pour les chromatographiques sur couches minces (CCM). Le gel de silice de granulomtrie 0,06 portant la rfrence 20000017 SDS a t utilis pour les chromatographiques sur colonne.

Les ractifs suivant : vanilline, vanilline sulfurique, liode, le Liebermann Burchard, acide phosphomolybdique, ont servi de rvlateurs en CCM. Aprs pulvrisation, les plaques ont t chauffes ltuve 110-120C. Un appareil UV 254nm 365nm a t utilis pour la dtection des plaques chromatographique aprs schage ltuve de 100C. 2.3.3.- Mthodes dextraction Lextraction de lEvonymopsis Longips a t ralise au Laboratoire de chimie de la Facult des Sciences, sis au CeDRATOM Toliara (cf. photo 2).

Photo (04) : Laboratoire de chimie, sis au CeDRATOM Toliara Lextraction se fait par macration froid. La macration est une opration qui consiste laisser la poudre du matriel vgtal en contact prolong avec un solvant pour en extraire les principes actifs. Cest une extraction qui se fait temprature ambiante. Pour notre cas, trois mille neuf cent soixante deux gramme (3 962 g) de poudre de plante sec ont subit une macration froid, suivit dagitation pendant environ quatre heures (4h) dans de lactone. Lopration a t fait deux fois de suite jusqu lpuisement de matires vgtales. 2.3.4.-Test biologique Lextrait brut a t soumis un test antipaludique sur plasmodium falciparum FCM 29. On a constat que lextrait brut est trs actif.

2.3.5.-Sparation Grossire La sparation grossire consiste faire une chromatographie sur colonne de silice utilisant de solvants avec une lution isochratique et en changeant de solvant suivant le degr de polarit. Une colonne de longueur 85 cm et de diamtre 3,5 cm remplie de gel de silice de masse vingt (20) fois de plus de lextrait sparer a t utilis au cours de lopration. Lopration se fait deux fois de suite : - Une premire lution avec 150 ml de hexane a donn un premier extrait cyclohexanique not H1 ; - Une deuxime lution avec 150 ml de hexane a donn un deuxime extrait cyclohexanique not H2 ; - Une premire lution avec 150 ml dactate dthyle a donn un premier extrait dactate dthyle not E1 ; - Une deuxime lution avec 150 ml dactate dthyle a donn un deuxime extrait dactate dthyle not E2 ; - Une premire lution avec 150 ml dactone a donn un premier extrait actonique not A1 ; -Une deuxime lution avec 400 ml dactone a donn un deuxime extrait actonique not A2. 2.3.6.-Fractionnement bioguid Le Fractionnement bioguid consiste test les extraits obtenues chaque fractionnement pour permettre de localiser chaque fois le produit actif au cours du processus. Ceci a t mise au point pour viter de travailler laveuglette et de ne pas perdre le principe actif. Pour notre cas, nous avons tablit le test antipaludique de chaque extrait obtenu aprs la sparation grossire. Nous avons constat que lextrait dactate dthyle prsente une activit intressante. Lextrait actonique brut a t soumis ensuite des partitions liquide-liquide successives au cyclohexane/eau, lactate dthyle/eau et au butanol/eau (voir schma). Le protocole dextraction est consign dans le schma ci-dessous. Aprs vaporation sec sous pression rduite des diffrentes phases, nous avons obtenu les extraits suivants : extrait cyclohexanique, extrait dactate dthyle, extrait butanolique et extrait aqueux.

Schma (05) : Protocole dextraction Lextrait cychlohexanique et lextrait dactate dthyle prsentent une activit antipaludique intressante. 2.4.- La Chromatographie sur couche mince (CCM) des extraits Plusieurs essais aussi bien dluant que de rvlateurs ont t ralise pour permettre de faire un isolement trs efficace. Comme luant pour lextrait dactate dthyle, le dichloromthane/mthanol (CH2Cl2/MeOH 95/5), le cychlohexane/actate dthyle (Cychlohexane/ACOET 80/20, 70/30 et 60/40) ont t fait. Seul le CH2Cl2/MeOH qui marche trs bien et comme rvlateur la vanilline sulfurique, le Lieberman Burchard, lacide phosphomolybdique et liode. Cest liode qui est le meilleur rvlateur. Pour lextrait cychlohexanique, on adopt le mme protocole, le Cychlohexane/ACOET 90/10, 80/20 est le meilleur luant et liode est le bon rvlateur. 2.4.1.- Fractionnement et isolement des composs de lextrait dactate dthyle Lextrait dactate dthyle a subit une chromatographie sur colonne de silice en utilisant un systme luant constitu de CH2Cl2/MeOH (80/20, 95/5), suivi dune chromatographie sur colonne de Sephadex LH20. Cette opration na pas aboutit aucun produit pur.

Photo (05) : CCM des produits 2.4.2.- Fractionnement et isolement des composs de lextrait cyclohexanique Lextrait cyclohexanique a subit une chomatographie sur colonne de silice utilisant comme luant isochratique cyclohexane/ACOET 90/10. Dix neuf fractions sont obtenues. La fraction BR5F8 =BR6 a subit une chromatographie sur colonne avec une moyenne pression (MPLC) en phase normale avec comme luant cyclohexane/ACOET 90/10, 80/20. Le test antipaludique des fractions obtenues ont montr que les fractions BR5F8 et BR5F9 prsentent une activit antipaludique remarquable. Une colonne de deux grammes (2g) avec de silice fine dj press lusine. Le dbit est de 3ml/mn. Lappareil est form dun adaptateur, dune pompe qui sert pomper le solvant et qui rgle le dbit de la colonne et dun appareil dtecteur-enregistreur qui est rgl 220nm. La photo de lappareil de chromatographie moyen pression (MPLC) est ci-dessous :

Photo (06) : Appareil pour la chromatographie sur colonne moyen pression (MPLC) Les diverses fractionnement sur colonne de silice moyen pression na pas abouti un rsultat satisfaisant. Nous avons oblig de faire une chromatographie liquide haute pression (HPLC). Lappareil de HPLC est consign dans la photo ci-dessous :

Photo (07) : Appareil chromatographique liquide haute pression (HPLC) La colonne utilise est une colonne phase inverse, le solvant est lactonitrile et leau. Leau est 100% fix par lappareil, lactonitrile est 90/10, 50/50. Le dbit est fix 0,8 ml/mn, la longueur donde est fixe 220 nm. On a inject la fraction BR5F3 = BR9 de 2g et on a observ la bonne sparation du produit A et B qui sont trs net. Le profil chromatographique est consign sur la photo ci-dessous :

Photo (08) : Profile chromatographique liquide haute pression (HPLC) de BR9F3 Suite au rsultat du HPLC du BR9F3, nous allons procder une reproduction lchelle de MPLC phase inverse. Lextrait BR9F3 = BR11, de masse 28 mg, laide dune colonne MPLC,

colonne en phase inverse cartouche C18 40-60m de 3g, avec un systme dluant constitu dActonitrile/H2O (90/10), en augmentant progressivement la polarit de lluant jusqu 100% deau. Ceci a permis davoir sept (07) fractions dont la fraction BR11F2 est un produit pur qui est le produit B. Lextrait BR11F1 note BR12, de masse 24 mg, nest pas encore pur, nous lavons soumis une chromatographie MPLC en phase inverse cartouche C18 40-60 m de 7g. Lluant utilis est lActonitrile/H2O (70/30). Nous avons obtenu neuf (09) fractions dont les fractions BR12F3 et BR12F4 sont des produits purs. Il sagit du produit A. Le protocole du fractionnement et isolement du produit actif est sur le schma dans la page suivante. 2.5.- Rsultats et Discussion 2.5.1.- Rsultats 2.5.1.1.- Extraction Matriel vgtal Macration poudroy froid de dure 3 962,2 g 4h Nombre de lopration 2 Extrait obtenu 136g Rendement 3,43%

Tableau (02) : Extraction de lEvonymopsis longips 2.5.1.2.- Test biologique de lextrait actonique Nom vernaculaire Nom Scientifique % dinhibition 10 g/ml et 1g/ml 99,97 92,91 CI50 CI90

Reampy

Evonymopsis longips (Celastrace)

8,40

0,39

Tableau (03) : Rsultat de test cytotoxique de lextrait brut actonique

2.5.1.3.- Sparation grossire Masse de lextrait brut 1g Eluant Hexane Actate dthyle Actone Total Tableau (04) : Sparation grossire de lextrait brut 2.5.1.4.- Fractionnement bioguid Extraits E1 E2 A1 A1 CI90 Concentration % dinhibition CI50 2.5 8.7349560 0.67586617 1.75915065 1.25 87.6350406 0.625 40.7668626 2.5 100.083963 0.54148658 1.75219742 1.25 82.5412818 0.625 52.8631402 10 67.6742233 6.57998433 16.9673981 5 38.4047019 10 35.8018472 5.29457308 43.84483455 5 48.9168766 Tableau (05) : Rsultat de test dantipaludique de chaque extrait Quantit (ml) 150 150 150 150 150 150 Nom de lextrait H1 H2 E1 E2 A1 A2 Masse (mg) 120 100 220 180 270 110 1 000

Extrait cyclohexanique BR5 C.C.S Cyclohexane/ACOET 90/10 BR5

F 1 F2 F F F 5 3 4

F6 F7

F8

F9

F10 F11 F12 F13 F14 F15

F16

F17 F18 F19

BR5F9 = BR9

MPLC Cyclohexane/ACOET 90/10

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

BR 9F3 = BR11

MPLC en phase inverse Actonitrile/H2O 90/10

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

Produit pur Produit B MPLC en phase inverse Actonitrile/H2O 90/10

BR 11F1 = BR12

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

Produit pur Produit A Tritepne quinone

Schema (06) : Protocole de fractionnement et isolement du principe actif

Partition liquide-liquide de 8,3 g de lextrait actonique : entre le cyclohexane et leau, lactate dthyle et leau, le nbutanol et leau. Extraits Cyclohexane ETOAc nBuOH nBuOH/ H2O Total Quantit (g) 0,685 5,056 0,955 0,357 7,053 CI50 (g/ml)

% 1,56
2,8 50 50

Tableau(06) : Partition liquide-liquide de lextrait actonique avec leurs activits antipaludique in vitro.

2.5.1.5.- Fractionnement et isolement des composs de lextrait cyclohexanique Fraction BR5F1 BR5F2 BR5F3 BR5F4 BR5F5 BR5F6 BR5F7 BR5F8 BR5F9 BR5F10 BR5F11 BR5F12 BR5F13 BR5F14 BR5F15 BR5F16 BR5F17 BR5F18 BR5F19 N tube 1-4 5-8 9-10 11-12 13-22 23-31 32-34 35-50 51-58 59-67 68-83 84-92 93-144 145-207 208-256 257-300 301-332 333-348 349-386 Masse (mg) 44 25 5 9 86 22 8 164 41 53 44 18 70 77 61 104 45 20 62 CI50 (g/ml) CI90 (g/ml)

1,13 < 100ng/ml 0,24

1,9 0,42

1,74

2,91

Tableau (07) : Fractionnement de lextrait cyclohexanique BR5

2.5.1.6.- Purification de BR5F9 = BR9 Fraction BR9F1 BR9F2 BR9F3 BR9F4 BR9F5 BR9F6 BR9F7 BR9F8 BR9F9 BR9F10 N tube 1-3 4-7 8-18 19-22 23-28 29-34 35-40 41-46 47-54 55-60 Masse (mg) 2 4 28 10 9 7 10 4 6 5

Tableau (08) : Purification de lextrait BR5F9 = BR9 2.5.1.7.-.Purification de BR11 Fraction BR11F1 BR11F2 BR11F3 BR11F4 BR11F5 BR11F6 BR11F7 N tube 1 2 3 4 5 6 7 Tableau (09) : Purification de BR9F3 = BR11 2.5.1.8.- Purification de BR12 Fraction BR12F1 BR12F2 BR12F3 BR12F4 BR12F5 BR12F6 BR12F7 BR12F8 BR12F9 2.5.2.- Discussion LEvonymopsis longips connu sous le nom vernaculaire Reampy peut gurir le paludisme daprs lenqute ethnobotanique auprs du gurisseur JAONARY. Lextrait actonique brut possde une activit antipaludique dont le pourcentage dinhibition par 10mg/ml et 1mg/ml sont respectivement de 99,97% et 92,91%. Ce rsultat

Masse (mg) 24 3 4 1 3 3 3

N tube 1-7 8-11 12-13 14-20 21-34 35-46 47-48 49-56 57-64 Tableau (10) : Purification BR11F1 = BR12

Masse (mg) 2 4 2 3 3 7 1 3 1

confirme que la plante possde une activit antipaludique. Le pourcentage dinhibition est proche de 100%. Les concentrations inhibitrices 50 et 90 (CI50 et CI90) sont respectivement 8,40g/ml et 0,39 g/ml, ce rsultat est infrieur celui de la chloroquine tmoin qui est de 15g/ml. La sparation grossire a permis dobtenir les quatre extraits E1, E2, A1 et A2 dont lextrait dactate dthyle E1 et E2 sont trs actifs avec des concentrations inhibitrices Cl50 respectivement 0,675 et 0,541 puis CI90 respectivement 1,759 et 1,752. Pour les extraits actoniques A1 et A2 : ils sont galement actifs mais leurs concentrations inhibitrices ne sont pas significatives avec Cl50 respectivement 6,579 et 5,294 puis CI90 respectivement 16,967 et 43,848. Pour les extraits cyclohexaniques : les tests effectus sur le plasmodium falciparum ont montr quils possdent une activit antipaludique avec CI50 1.50. Le produit A pur a une concentration inhibitrice CI50 gale 100ng/ml qui est bien suprieure celle de la chloroquine avec CI50 = 15 g/ml. Le test anticancreux du produit A pur, effectu sur une cellule cancreuse P338, a montr quil est trs cytotoxique avec une CI50 = 0,078 g/ml. Il est donc intressant de connatre la structure chimique du produit A. Alors une tude structurale a t ralise. 2.6.-Dtermination structurale Ltude de spectre RMN proton monodimensionnel, le spectre HSQC deux dimensions montre les corrlations entre le proton et les carbones qui portent ces protons. Le spectre carbone 13 (13C) J-modul a permis didentifier le nombre de carbone de la molcule, ainsi que la prsence de deux carbonyles dont les dplacements chimiques sont respectivement 178,3 ppm et 178,7 ppm, enfin ce dernier nous permet didentifier le methyl, le groupe CH, le groupe CH2 et les carbones quaternaires. Lexploitation de ces spectres nous montrent la molcule possde sept CH2, quatre CH et sept groupes mthyles. La molcule renferme galement neuf carbones quaternaires (; c 117,1, 127,4, 164,7, 42,9, 170,0, 45,0 39,4, 30,5 et 40,4) et quatre C=C (; c 146,0, 117,1, 119,6, 164,7, 1127,4, 134,0, 118,1, 170,0 et ;
H

6,52, 6,98 , 6,34 )

Les

dplacements chimiques des protons et des carbones 13 sont consigns dans le tableau cidessous suivant le rsultat de lexploitation des spectres 1H 1D, COSY, HMQC et 13C Jmodul.

Dplacement chimique des protons 6,52 2,21 6,98 6,34 1,18 1,65 ; 1,55 1,85 ; 1,48 1,09 2,01 ; 0,98 1,35 ; 2,18 3,5 1,15 1,68 ; 2,4 1,56 0,55 1,65 ; 1,78 2,15 ; 1,82 1,45

Dplacement chimique des carbones 119,6 10,2 134,0 118,1 21,6 28,7 36,4 31,6 34,8 29,9 51,5 32,7 30,9 44,3 18,3 29,7 33,6 38,2

Tableau (11) : Dplacement chimique des protons et des carbones

Ltude du spectre HMBC de lAMBR12F6 a permis de dterminer la structure dfinitive de cette molcule. En effet pour la premire squence : le proton 6,52 ppm corrle avec les carbones 146,0 ppm qui porte lhydroxyle et avec le carbone 127,4 un quaternaire. Il corrle galement au carbone 42,9 ppm qui appartient au cycle suivant accol ce dernier. Le proton 2,21 ppm qui est port par le carbone 10,2 ppm est attribu un mthyle qui port par un carbone thylnique. Ce mthyle corrle avec le carbone 117,1 ppm qui est le carbone qui le porte, avec le carbone 146,0 ppm qui est le carbone qui porte lhydroxyle et enfin avec le carbone quaternaire 127,4 ppm. On a la squence dans la page suivante :

6,52
H

178,7 146,0
HO

119,6 127,4 117,1 10,2 CH 3 2,21

42,9

Figure (09) : Premire squence

Le proton 1,45 ppm qui est port par le carbone 38,2 ppm est attribu un mthyle. Ce mthyle corrle avec le carbone 42,9 ppm qui est le carbone qui porte ce mthyle, avec le carbone 164,7 ppm qui est le carbone quaternaire voisin du carbone 119,6 ppm, et enfin avec le carbone quaternaire 170,0 ppm. Le proton 6,98 ppm qui est port par le carbone 134,0 ppm corrle avec le carbone 117,1 ppm, avec le carbone 164,7 ppm et enfin avec le carbone quaternaire 170,0 ppm. Le proton 6,34 ppm qui est port par le carbone 118,1 ppm corrle avec le carbone 127,4 ppm, avec le carbone 42,9 ppm, et enfin avec un quaternaire 45,0 ppm. On a la deuxime squence suivante :
1,45
H H3C 38,2

42,9 164,7 127,4

HO

45,0 170,0 118,1

117,1
CH 3

134,0
H

6,34

6,98

Figure (10) : Deuxime squence

-Le proton 1,82 ppm qui est port par le carbone 33,6 ppm corrle avec le carbone 33,6 ppm, avec le carbone 42,9 ppm, avec le carbone 164,7 ppm, avec le carbone 29,7 ppm et enfin le carbone 39,4 ppm. -Le proton 2,15 ppm qui est port par le carbone 33,6 ppm corrle avec le carbone 42,9 ppm, avec le carbone 29,7 ppm et enfin avec le carbone 39,4 ppm. -Les protons 1,82 ppm et 2,15 ppm sont port par le carbone 33,6 ppm. Il sagit dun mthylne CH2. -Le proton 1,78 ppm qui est port par le carbone 29,7 ppm corrle avec le carbone 29,7 ppm, avec le carbone 39,4 ppm et enfin avec le carbone 45,0 ppm. -Le proton 1,65 ppm qui est port par le carbone 29,7 ppm corrle avec le carbone 39,4 ppm, avec le carbone 45,0 ppm et enfin avec le carbone 18,3 ppm. -Les protons 1,78 ppm et 1,65 ppm sont port par le carbone 29,7 ppm. Il sagit dun mthylne CH2. -Le proton 0,55 ppm qui est port par le carbone 18,3 ppm est attribu un mthyle. Il corrle avec le carbone 29,7 ppm, avec le carbone 39,4 ppm et enfin le carbone 44,3 ppm. -Le proton 1,18 ppm qui est port par le carbone 21,6 ppm est attribu un mthyle. Il corrle avec le carbone 45,0 ppm, avec le carbone 39,4 ppm et enfin le carbone 28,7 ppm. On a la squence suivante :
1,78
H

1,65
H

2,15
H

0,55
CH 3

18,3 29,7 33,6

1,82
H H H3 C

44,3 39,4 45,0

42,9 164,7 21,6 CH 3 1,18

HO H

28,7

CH 3

Figure (11) : Troisime squence -Le proton 1,65 ppm corrle avec le carbone 45,0 ppm, avec le carbone 36,4 ppm et enfin avec le carbone 30,5 ppm, -Le proton 1,55 ppm corrle avec le carbone 45,0ppm et avec le carbone 30,5 ppm.

-Les protons 1,65 ppm et 1,55 ppm sont ports par le carbone 28,7ppm. Il sagit dun mthylne (CH2), -Le proton 1,85ppm corrle avec le carbone 44,3 ppm, avec le carbone 31,6 ppm et enfin avec le carbone 34,8 ppm, -Le proton 1,48ppm corrle avec le carbone 45,0 ppm, -Les protons 1,85 ppm et 1,48 ppm sont ports par le carbone 36,4 ppm. Il sagit dun mthylne (CH2), -Le proton 1,09 ppm est port par le carbone 31,6 ppm qui est attribu un mthyl. Il corrle avec le carbone 36,4 ppmet avec le carbone 30,5 ppm et enfin avec le carbone 44,3 ppm, -Le proton 1,56 ppm port par le carbone 44,3 ppm corrle avec le carbone 18,3 ppm. On a la squence suivante :
1,56
H H H H H3 C O H H

18,3
CH 3

34,8 44,3 30,5

31,6
CH3 H

36,4 45,0 28,7

CH 3 H H

1,09

1,48
H

1,65

1,85 1,55
H

HO CH 3 H

Figure (12) : Quatrime squence

-Le proton 2,01 ppm corrle avec le carbone 30,5 ppm, -Le proton 0,98 ppm corrle avec le carbone 44,3 ppm, avec le carbone 40,4 ppm, -Les protons 2,01 ppm et 0,98 ppm sont ports par le carbone 34,8 ppm. Il sagit dun mthylne, -Le proton 1,35 ppm corrle avec le carbone 34,08 ppm, avec le carbone 29,9 ppm et enfin avec le carbone 178,3 ppm qui est le carbonyl, -Le proton 2,18 ppm corrle avec le carbone 30,9 ppm, -Les protons 1,35 ppm et 2,18 ppm sont ports par le carbone 29,9 ppm. Il sagit dun mthylne (CH2). -Le proton 2,4 ppm corrle avec le carbone 44,3 ppm, avec le carbone 30,9 ppm et enfin avec le carbone 40,4 ppm, -Le proton 1,68 ppm corrle avec le carbone 44,3 ppm, avec le carbone 40,4 ppm et enfin avec le carbone 178,3 ppm, -Les protons 2,4 ppm et 1,68 ppm sont ports par le carbone 30,9 ppm. Il sagit dun mthylne. -Le proton 1,25 ppm port par le carbone 32,7 ppm, est attribu un mthyle. Il corrle avec le carbone 30,9 ppm, avec le carbone 40,4 ppm et enfin avec le carbone 178,3 ppm. -Le proton 3,5 ppm qui est port par le carbone 51,5 ppm, est attribu un mthyle. Il corrle avec le carbone 178,3 ppm. On a la squence suivante :

O 1,15 32,7 1,68 H3C H H H H H H H3C O CH3 H HO CH3 H H H 2,4 H CH3

30,9

40,4

51,7 3,5 OCH 3 178,3 H 2,18 H 1,35 H 0,98 H 2,01

29,9

34,8
44,3 30,5 CH3 H H H

Figure (13) : Cinquime squence

Cette dernire squence nous a permis davoir la structure de la molcule isole partir de lEvonymopsis longips. Les dplacements chimiques des protons et carbones avec les corrlations entre proton-proton (COSY) et protons carbones sont consigns dans le tableau (10) de la page 50. La formule dfinitive de la molcule est la suivante :
O

30 20

31 29 19 21 22
O

27 25
O

11 9

12

13 14

18 15

17 16 28

2 3 24
HO

1 5 4

10

8 26

6 7

23

Figure (14) : Structure dfinitive de la molcule isole N de carbone 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 H H1 (6,52)

1

H6 (6,98) H7 (6,34)

H11a (1,82) H11b (2,15) H12a (1,78) H12b (1,65) H15a (1,65) H15b (1,55) H16a (1,85) H16b (1,48) H18 (1,56) H19a (2,4) H19,b (1,68) H21a (2,18) H21b (1,35) H22a (0,98) H22b (2,01) H23 (2,21) H25 (1,45) H26 (1,18) H27 (0,55) H28 (1,09) H30 (1,15) H31 (3,5)

C 119,6 178,7 146,0 117,1 127,4 134,0 118,1 170,0 42,9 164,7 33,6 29,7 39,4 45,0 28,7 36,4 30,5 44,3 30,9 40,4 29,9 34,8 10,02 38,2 21,6 18,3 31,6 178,3 32,7 51,5

13

COSY

HMBC C3, C4, C9

6,34 6,98

C4,C10,C8 C5,C9,C14

1,45 ; 1,65 1,82 ; 1,65 1,65 2,15 ; 1,82 1,48 ; 1,55 1,65 ; 1,85 1,65 ; 1,55 1,55 ; 1,85 2,4 ; 055 1,68 ;1,56 ; 1,15 0,55 ; 2,4 2,01 ; 1,35; 0,98 0,98 ; 1,35; 2,01 1,35 ;2,01 ; 2,18 1,09 ; 2,18

C11, C10 , C9, C12, C13 C9, C12, C13 C12,C13 ;C14 C13,C14,C27 C14, C16, C17 C14, C17 C18, C22, C28 C14 C27 C18, C19, C20 C18, C20, C29 C19 C21 ,C22 C20, C18 C17 C3, C4, C5 C8, C9, C10 C14, C13, C15 C12, C13, C18 C16, C17, C18 C19, C20, C29 C29

Tableau (12) : Rcapitulation de linterprtation des spectres de la molcule isole

CONCLUSION
Depuis des millnaires, les tres humains se sont servis de la nature pour leurs besoins quotidiens. Ceci commence par la nourriture, le vtement, la maison, les armes pour se protger contre leurs ennemis, le moyen de lutter contre les maladies quils attrapent, jusqu la mort. Depuis toujours les plantes ont constitu la source majeure de mdicaments grce la richesse de ce qu'on appelle le mtabolisme secondaire. Celui-ci produit des molcules varies permettant aux plantes de contrler leur environnement animal et vgtal. Parmi les milliers de molcules produites par ce mtabolisme, l'Homme slectionne celles qui lui permettent de se dfendre contre les agressions d'autres organismes vivants pathognes (champignons, bactries, virus...) et de corriger ses troubles mtaboliques. Lenqute ethnobotanique qui a t ralis auprs du gurisseur JAONARY a affirm que la plante dont le nom vernaculaire est Reampy possde une activit antipaludique par dcoction. Lextrait brut actonique de la plante qui a t test sur une souche de plasmodium FCM 29 prsente une activit antipaludique trs remarquable. En effet, cette activit est bien suprieure celle de la chloroquine tmoin. Ceci confirme que la mthode par le biais de lenqute ethnobotanique est trs efficace par rapport aux autres mthodes. La molcule isole partir du Evonymopsis longips montre une activit antiplasmodiale trs intressante, mais le fait quelle est trs cytotoxique ne permet pas de le proposer aux industriels afin dtre candidate parmi les mdicaments antipaludique. Toute fois son activit cytotoxique est intressante pour quelle devienne un mdicament anticancreux. Mais la taille de la molcule nintresse pas les industriels. En effet sa synthse est trs couteuse et mme lhemisynthse savre aussi difficile. La plupart des travaux de recherche sur les plantes mdicinale dans la rgion de Toliara prsente un rsultat trs remarquable jusqu ce jour. Un exemple parmi tant dautre est

la dcouverte de vincristine et vinblastine isols partir du Catharanthus rosus qui est une plante rcolt Tsihombe. Il est de mme pour une plante qui a t rcolt dans le district de Betioky-Sud, commune dAndraname qui est candidat pour tre mdicament anticancreux. Il est utilis contre le cancer de sain et de lutrus. Et enfin, une plante de la rgion dandroy qui va tre lance sur le march international. Il est utilis contre limpuissance. Ainsi, le grand sud est une source potentielle des molcules candidats pour tre des nouveaux mdicaments. Le test biologique sur plasmodium falciparum FCM 29 et sur la cellule cancreuse a t ralis par lquipe du Laboratoire photochimique de lIMRA.

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