Microbiologie sols & eaux Questions janvier 2012

1. Comment les diazotrophes prservent la nitrognase de lO2 ? Mtabolisation anarobie du CH4 et les bioracteurs Expliquer analyse qui peuvent tre ralises pour identifier le bon fonctionnement de la nitrognase dans les plantes 2. Citez et expliquez les conservateurs et leurs rles
Ils sont de 3 grands types : Produits sucrs servant de substrat la fermentation lactique. - 2% gramines - 4% lgumineuses

- La mlasse (50% sucres) employs :

- Crales moulues additionnes de malt ou de pulpe sche (avantage des crales et des pulpes sches diminuent les pertes sous forme de jus) Produits bactriostatiques

Inhibent slectivement la fermentation butyrique et restreignent l'ensemble des fermentations. Parmi les produits utiliss, il y avait le formol mais celui prsente des proprits cancrignes (retir de la vente). Il donne aux ensilages un pH lev mais avec trs peu d'ammoniac et d'acide butyrique. Semble plus intressant de l'employer faible dose associ des acides (ex: ac. formique) car les ensilages sont instables louverture des silo et cette dose (35%), ils provoquent une diminution de la digestibilit de la matire organique. Acides

- Mthode AIV : abaissement artificiel du pH (3,5) supprime toute fermentation butyrique et fermentation lactique. La solution A.I.V. est un mlange d'HCl et d'H2SO4. L'inconvnient est que lensilage est trs mal digr par les ruminants car trop acide et ils catabolisent des acides minraux. - Acide phosphorique : intressant pour ration alimentaire hivernale car dficience en phosphore ; pH = 4 fermentation encore possible. - Acide formique : action inhibitrice sur la respiration et sur la flore butyrique, il est le meilleur conservateur actuel ; pH = 4 l'ammoniognse demeure trs rduite, et la fermentation butyrique est inhibe. Excellent conservateur associ au formol (trs efficace). Acide propionique : bon pouvoir acidifiant (mais un peu moins que l'acide formique) ; pouvoir fongique (point contest par certains chercheurs) Acide actique : amlioration de conservation des ensilages quivalente l'acide formique + valeur alimentaire ( ac. formique)

3. Expliquez lvolution microbienne dans lensilage (Voir page MA 57 MA 60)

5 phases dans lensilage : Phase de respiration Dbut dacidification d aux coliformes Dbut de la fermentation lactique Phase de stabilisation par production maximale dacide lactique Phase des fermentations nuisibles Dans la 1re phase, pas dintervention de micro-organismes, juste remarquer quon observe une diminution du taux de sucre dans lensilage, sucre ncessaire plus tard aux bactries lactiques. Cette diminution va avec une diminution du taux de dioxygne en croissance du taux de dioxyde de carbone et de la temprature par lquation de la respiration arobie des vgtaux. Dans la 2me phase, la charge microbienne dun fourrage vert fraichement rcolt est de lordre de 107 1011 microbes/grammes (li la proportion de terre mise avec la matire vgtale). Bactries arobies strictes en grande quantit Bactries anarobies facultatives parmi lesquelles des coliformes : bacilles Gram -, non sporuls Bactries anarobies : bactries lactiques (- de 1% de la flore), butyriques et protolytiques Moisissures (arobies) et levures (anarobies facultatives) Dans la 3me phase, on observe une multiplication des bactries lactiques, car elles trouvent des conditions favorables leur croissance : absence totales ou presque totale doxygne et prsence de sucres fermentescibles en quantit suffisante et librs temps. Bactries lactiques 1milliard/g densilage frais en 8jours, elles reprsentent la quasi-totalit de la flore de lensilage. Elles transforment les sucres en acide lactique mais avec un rendement diffrent selon quelles sont homofermentaires (meilleur rendement) ou htrofermentaires(moins bon rendement). Abaissement du pH 4. Genres de bactries lactiques : Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus. Dans la 4me phase, pH 4.0 ou un peu en-dessous inhibition complte de toute lactivit microbienne, y compris la flore lactique. Etat stable pour une conservation quasi indfinie, en absence doxygne. Si air dans lensilage, cela rompt la stabilit du produit et des moisissures peuvent se dvelopper graves pertes en matires organiques Dans la 5me phase, si conditions pas favorables aux ferments lactiques, pH ne descend pas suffisamment et les bactries butyriques vont se dvelopper (Clostridium tels que Cl. Butyricum). Ces bactries sont apportes sous forme de spores par la terre. Elles se dveloppent toujours avec quelque temps de retard sur les bactries lactiques car elles ont besoin de germer avant de rentrer en activit. Les bactries butyriques sattaquent aux sucres rsiduels et lacide lactique dj form, et les transforment en acide butyrique et actique, en CO2 et en H2 remonte du pH. Lorsque le pH remonte, les bactries protolytiques sattaquent aux acides amins pour les transformer soit en ammoniac, acides gras volatils, CO2, amines (certaines toxiques) putrfaction.

4. Acide phytique dans cycle phosphore et influence sur lenvironnement

Voir cycle du phosphore, lacide phytique est le phosphore organique (voir reprsentation dans le cours) PO43- organique Sous forme dacide phytique (6 groupements phosphate), sucre = myoinositol (utilis en c.i.v.) Acide phytique homme ne sait pas le dstructurer quand on mange des vgtaux. Caractre complexant intressant. Il existe une enzyme que lhomme na pas mais que la flore du rumen a la phytase (voir la liste des microorganismes qui ont la phytase et voir ses activateurs et inhibiteurs) Environnement Epandre du lisier de porcs (qui nont pas su utiliser lacide phytique) induit une forte contamination du sol. Toute la charge phosphate est concentre dans le lisier. Les micro-organismes se ruent dessus, attirs par linositol eutrophisation naturelle. La flandre a beaucoup de problmes avec a, et donc problmes pour les eaux souterraines. Pour les polygastriques, pas de problmes car ils savent dcomposer lacide phytique

5. Mtabolisation anarobie du CH4 et les bioracteurs 6. Mcanisme dactivation des nitrognases (processus par lequel les enzymes bloquent lO2)
Certaines plantes (notamment les lgumineuses) vivent en symbiose avec des micro-organismes procaryotes, qui sont seuls capables de fixer l'azote atmosphrique. Ces micro-organismes, par exemple les bactries Rhizobium, possdent un ensemble de gnes qui codent pour un systme que l'on appelle le systme nitrognase. Le systme nitrognase est un assemblage de 3 protines : 1. la nitrognase proprement dite qui est un ttramre. chaque monomre contient un centre avec du Fe et du S ([4 Fe - 4 S]) ce ttramre est associ un cofacteur protique qui contient du Fe et du molybdne en consquence, la nitrognase fonctionnelles contient Fe, S et Mo 2. une rductase (hydrognase) qui est un dimre contenant un centre [4 Fe - 4 S] La ferrdoxine chez les bactries symbiotiques ou une flavodoxine FAD chez les bactries libres. C'est la protine transporteuse des lectrons du fer vers le molybdne La raction globale, irrversible, catalyse par le systme nitrognase, est la suivante : N2 + (6 H+ + 6 e-) + 6 ferrdoxine rduite (nitrognase) + (2 H+ + 2 e-) + 2 ferrdoxine rduite (hydrognase) + 12 ATP + 12 H2O 2 NH3 + H2 + 8 ferrdoxine oxyde + 12 ADP + 12 Pi On constate que cette raction est extrmement coteuse en nergie puisque 12 molcules d'ATP sont consommes par molcule d'azote rduit. Au niveau des cellules de nodosits, il y a prsence de la leghmoglobine .Ce pigment est situ dans le cytoplasme des cellules infectes. Lenzyme est trs sensible loxygne, sil y a trop doxygne elle ne fonctionne pas. Il existe diffrents mcanismes protecteurs de lactivit de la nitrognase. Chez les lgumineuses, la leghmoglobine fixe loxygne dissout dans le cytoplasme ainsi loxygne diminue ce qui active

lenzyme. Dautres organismes comme les cyanobactries filamenteuses fixent lazote que dans certaines cellules spcialises. Elle est inhibe par les ions ammoniums et les nitrates. Si on fournit des engrais azots aux lgumineuses, on inhibe alors l'activit d'enzyme. On dit quils ont un effet dpressif sur la fixation de N2. La leghmoglobine est une hmoprotine fixatrice de dioxygne prsente chez les Fabaces et trs proche de l'hmoglobine. On la trouve dans des nodosits de la racine lors de phnomnes de symbioses bactriennes, la partie globine est synthtise par la plante hte (essentiellement chez les lgumineuses) et l'hme est produit par la bactrie. Cette protine permet de protger un complexe enzymatique (nitrognase/hydrognase) des effets de l'O2 qui l'inactive. Elle n'est synthtise que dans les nodosits, De couleur rouge, la leghmoglobine confre aux nodosits une couleur rose caractristique. Un hme est un cofacteur contenant un atome de fer servant accueillir un gaz diatomique (souvent le dioxygne O2) En rsum Ce qui protge les nitrognase de lO2 est donc la leghmoglobine qui contient une partie globine (protine globulaire) et un hme (qui va capter lO2) ainsi loxygne prsent dans le cytoplasme diminue et lenzyme leghmoglobine peut fonctionner et transformer le N2 atmosphrique en NH3 utilisable par la plante : N2 + 3 H2 2 NH3 Remarque : Dautres organismes comme les cyanobactries filamenteuses fixent lazote que dans certaines cellules spcialises. Elle est inhibe par les ions ammoniums et les nitrates. Si on fournit des engrais azots aux lgumineuses, on inhibe alors l'activit d'enzyme. On dit quils ont un effet dpressif sur la fixation de N2.

7. Dgradation arobie, des matires cellulosiques et comment doser

Cf. cours, page 6

8. Dnitrification biotique et abiotique dans la matire du sol et comment on la dose

Biotique Rduction dissimilaire du NO3- en N2 par respiration anarobie (accepteur final de- diffrent dO2) par les bactries sulfatorductrices (anarobies strictes utilisant les sulfates) les bactries mthanognes (anarobies strictes utilisant le CO2) et les bactries dnitrifiantes (anarobies facultatives utilisant les nitrates). NB : les rductions dissimilatrices gnrent de lATP ( assimilatrices) Abiotique Perte due une raction chimique, la raction de VAN SLYKE (amine + ac. nitreux alcool) RNH2 + HNO2 ROH + H2O + N2 Dosage On va travailler par une raction rdox, il est donc impratif de travailler en anarobie afin dempcher loxydation par loxygne atmosphrique. Aussi, il faut savoir que la rduction des nitrates se fait avec deux enzymes : la nitrate rductase et la nitrite rductase. La nitrate rductase est de type A permet la respiration des nitrates : elle permet

des arobies strictes de travailler en anarobiose (celle de type B catalyse le chemin inverse qui est la nitrification). On place alors les nitrates dans un milieu de culture en tube. Les bactries arobies strictes se dveloppent alors partout dans la glose. Lorsquon ajoute du poison cellulaire, si rien de change, on est en prsence du type A. On inocule alors le tube de NO3 agar en ajoutant le ractif de GRIESS-ROMIJN et de la poudre de Zn (raction de ZO_BELL) pour rduire les nitrates en nitrites, on a donc un virage au rose. Si ce virage na pas lieu, on a confirmation quil ny avait pas de nitrates dans le tube glos.

9. Facteurs cologiques qui influencent la microflore du sol

Pas de sol sans cellulolyse ; mais se produit des vitesses et suivant des modalits extrmement varies dun milieu lautre. Potentiel doxydorduction Cellulolyse plus active dans les couches superficielles du sol o la population plus varie quen profondeur ; elle est aussi ralentie dans les sols lourds ou saturs pH En gnral, cellulolyse plus active en sols basique. pH joue un rle important dans la composition de la flore cellulolytique. T Cellulolyse de [5-65C] 65C grce des organismes thermophiles pour la plupart des Clostridium (anarobies dont la croissance est faible quand t>50C). (On considre aussi comme thermophiles des Actinomyctes (Steptomyces, Micromnospora) et des champignons du genre Chaetomium et Humicola mais ce sont plutt des msothermophiles). Thermophiles ne reprsente que 1% de la population ; surtout rencontr dans les fumiers, compost chaud, Les cellulolytiques sont plutt msophiles mais exigences variable selon les sp. et races Clostridium parmi les plus exigeants (optimum 33-40C, activit ralentie au dessous de 28C). Les autres bactries sont actives partir de 15-20C avec des valeurs optimales de 28-30C (les plus tolrants sont le genre Cytophaga) Optimum pour la production de cellulases par les bactries = 30C Humidit Cellulolyse proportionnelle la teneur en eau du sol, pratiquement suspendue quand point de fltrissement atteint. Alternance humidit/scheresse favorise les formes filamenteuses alors que milieux riches en eau favorises les unicellulaires.

Salinit Dans nature, influence parat faible, mais masque par dautre facteur notamment laration et [M.O] Conclusion Action combine de facteurs Dans rgions tempres cellulolyse principalement assure par champignons filamenteux et Actinomyctes srt si acides et bien ars. Quand pH augmente, les bactries arobies peuvent entrer en action, en particulier dans les couches superficielles du sol. Dans les rgions plus chaudes, humidit persistante favorise, parmi les bactries, les Clostridium msophiles exigeants.

10. Comment dire si un silo est bon ? (Apprciation de la russite dun ensilage)
La valeur nutritive dun ensilage est fonction : De sa valeur nergtique exprime en unit fourragre (UF) ou valeur amidon (VA) De la nature des fermentations subies dans les silos Des diffrentes pertes subies dans le silo autres que les pertes de fermentation c--d les pertes de bordures inconsommables car moisies ou pourries (dfinies par agents extrieurs : pluies, manque de soins lors de la couverture, mauvais tassement,) + Pertes sous forme de jus (essentiellement dfinies par la structure histologique des fourrages et teneur en eau lors ensilage si > 25-27% M.S. plus de pertes, cela est aussi valable pour le prfanage dherbes plus humides) De ses qualits hyginiques prsence de germes nuisibles la sant animales ou la production zootechnique (ex : fromage) est prendre en considration De sa composition chimique ensilage ne peut porter prjudice la sant animale (ex : acidit trop leve des ensilages AIV conservation par acide forts). Mthodes subjectives dapprciation Couleur Surtout influence par la t : < 30C couleur de la plante ensile 30C jaune fonc pour fourrages herbagers > 45=>60 couleur fonce de + en + vers le noir par caramlisations des sucres Peut tre trompeuse : ensilage trfles violets ainsi que fanes de pois souvent brun foncs (au lieu de brun clair) faisant croire malgr leur excellente qualit un ensilage rat Couleur du jus dextraction importante : plus il est clair, mieux cest Odeur Bon ensilage possde une odeur fruite douce, lgrement acide de pain coup (acide lactique). Odeur de miel (sucre) = bonne teneur en acide lactique Odeur rance et nausabonde = acide butyrique ensilage rat Odeur de moisi = manque de tassement et prsence dO2 dans le silo

Structure Structure de la plante doit tre compltement reconnaissable aprs ensilage sinon putrfaction avance ( ! lacration et broyage peuvent dtruire une partie de la structure). Aspect visqueux (glaireux) = activit de organismes pectinolytiques (sporulant dans lensilage). Mthodes chimiques dapprciation : Dtermination du pH Simple et rapide ; corrlation troite avec fermentations et pertes de pH stable entre ensilage de fourrages non prfans et ensilage de fourrages prfans. Pour ces derniers, la teneur en matire sche plus leve a pour effet daugmenter la teneur en sucres mais aussi la P.O. agissant sur les bact. Butyriques et protolytiques (Bon pH 4 si un peu en dessous encore mieux) Mauvais critre pour ensilage traits aux conservateurs (mtabisulfite, ac. formique,) Dosage des acides organiques et de lazote ammoniacal (NH3) / N total Acides gras volatils (actique, butyrique, propionique,) sont cot de la teneur en ac. lactique (non volatil) le reflet mme des fermentations il faut tenir compte la fois du type dacide form ainsi que de la quantit pour juger de la russite dun ensilage. Systme de Flieg : ne tient compte que des teneurs en ac. actique, butyrique et lactique (nglige les autres), leurs attribuent un nombre de points (chelle croissante pour lac. lactique et dcroissante pour les ac. actique et butyrique), plus la somme des points est leve, plus la russite de lensilage est bonne (somme des points /40) % azote ammoniacal (NH3) / N total (systme de Vanbelle) : plus il est bas, plus la russite de lensilage est bonne (la quantit NH3 traduit lactivit des protases, dsaminases et dcarboxylase qui est favorable pH lev entre 6 et 7 pH est bon indicateur) la somme des points est /60 Apprciation de ltat de conservation On fait la somme : points pour la fermentation des sucres (/40) + points pour les protines (/60) = somme des points /100. Plus la somme sapproche de 100, plus la conservation est bonne Teneur en terre Certains fourrage souill par excs de terre (ex : collets de Betteraves) peut tre ensemencs par des germes nuisibles (comme Listeria monocytogenes agent de la Listriose) + inconvnient que la terre diminue fortement la digestibilit de la M.O.

11. Expliquer analyse qui peuvent tre ralises pour identifier le bon fonctionnement de la nitrognase dans les plantes 12. Impact environnementaux de la nitrification
Impact sur Effets ngatifs Acidification du milieu Comptition avec dioxygne Accumulation de nitrites (toxique) Accumulation de nitrates (inhibition du mtabolisme microbien) Acidification du sol lessivage des Effets positifs Bilan Ngatif

Microflore

Plantes

NH4+ est rapidement absorb

Mitig

Environnement

cations dsertification au niveau racinaire Si trop dN, entrenuds plus long protection plus faible favorisation maladie Assimilation de nitrates coute plus cher la plante que celle de NH3. Plantes ayant accumul beaucoup de nitrates peuvent modifier hmoglobine en mthmoglobine (diminution transport dioxygne) Lessivage des nitrates entrane la contamination des nappes de surface Production de N2O dont transformation en N2 est inhibe par NO3Accumulation de nitrosamines fait que la flore produit des nitrites.

par les racines et directement transform (toxicit rduite) Nitrates facilitent lassimilation racinaire en Ca2+ et K+ Libration dengrais azots Rgnration de la capacit dabsorption par les sols de NH3 et de NO2 atm. Ngatif