Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
direction perpendiculaire au champ prcdent pendant une minute et ainsi de suite. Le processus de
rorientation des macromolcules dans le champ lectrique dpend de leur taille.
LECTROPHORSE EN GEL DAGAROSE APRS MIGRATION ET COLORATION PAR LE
BROMURE DETHIDIUM.
FIGURE DE GAUCHE:
- PISTE 1: Marqueurs de taille (en paires de bases).
- PISTE 2: Echantillon dADN dont la taille est dterminer.
FIGURE DE DROITE:
- Courbe dtalonnage en abscisses, les distances par
et en ordonnes les poids molculaires (chelle logarithmique).
rapport
au
puits
dinclusion:
En pratique, lADN tudier est rparti en diffrentes fractions. Chaque fraction est traite par une
enzyme de restriction ou un couple denzymes de restriction. Ainsi dans lexemple ci-dessous. Dans le
puits 1, on dpose lADN digr par Eco RI seule; dans le puits 2, on dpose lADN digr par Hind III
seule et dans le puits 3, lADN digr par Eco RI et Hind III. La dtection des diffrents fragments est
ralise laide dune sonde marque du gne tudi (voir schmas).
Cartographie selon SOUTHERN et rsultats:
Interprtation:
La Taq polymrase extraite de Thermus aquaticus prsente une activit exonuclasique 53, mais
elle est dnue dactivit exonuclasique 35, cest--dire de la fonction ddition. Elle peut insrer
des bases qui ne suivent pas la rgle classique dappariement et ceci au hasard. On estime quelle
ralise une mauvaise incorporation toutes les 104 105 bases.
Cette technique a volu considrablement. De nouveaux types de PCR ont t introduits. Nous
citerons brivement:
- La PCR dite Multiplex pour amplifier des gnes avec de nombreux exons (le gne CFTR
impliqu dans la mucoviscidose possde 27 exons), il est possible dintroduire dans le milieu
damplification des couples damorces spcifiques diffrentes.
- La PCR dite Nested PCR . Elle correspond une seconde PCR ralise en utilisant des
nouuvelles amorces situes lintrieur du domaine dfini par les amorces de la premire PCR.
- La PCR quantitative. Dans ce type de PCR, on cherche estimer le nombre de copies prsent dans
la squence cible dADN ou dARN. La proportionnalit entre le nombre damplifications et le nombre
de copies nest valable que pour un nombre de cycles PCR faible.
IV. 3. UTILISATIONS DES PRODUITS PCR.
Les utilisations des produits PCR sont trs varies, nous citerons quelques exemples (cette liste nest
pas exhaustive):
IV.3.1. Mise en vidence de mutations ponctuelles par hybridation des produits PCR avec des sondes
oligo-nuclotidiques (technique dite du dot-blot ).
Les produits PCR peuvent aprs transformation en monobrins tre hybrids avec des sondes
oligonuclotidiques fixes sur un support solide. Ces sondes correspondent des squences
normales et pathologiques (prsence de mutations ponctuelles par exemple) pour un gne donn.
IV.3.2. Analyse de restriction.
Le produit PCR est soumis une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une
mutation ponctuelle modifie le site de restriction intialement prsent, la taille des fragments dADN
obtenus aprs digestion sera modifie et dcelable aprs lectrophorse des fragments dADN (sur
gel dagarose ou gel de polyacrylamide).
A titre dexemple, la mutation ponctuelle (GAGGTG) sur le sixime codon du premier exon du gne
b de la globine humaine entrane lapparition dune hmoglobine anormale appele hmoglobine S
(mutation ponctuelle dun acide amin: GluVal). Cette anomalie est rpandue dans le monde entier.
Elle est responsable ltat homozygote dune pathologie grave: la drpanocytose homozygote. Cette
mutation entrane une modification du site de restriction de lenzyme Dde I: C / TNAG (N = A, T, C ou
G).
La squence suivante reprsente les 9 premiers codons normaux du premier exon du gne b de la
globine humaine:
La mutation Hb S conduit une mutation ponctuelle au niveau du codon 6 avec disparition du site de
restriction pour lenzyme Dde I:
Llectrophorse des produits PCR aprs digestion par lenzyme Dde I permet daffirmer ou dinfirmer
la prsence dune mutation GAGGTG sur le codon 6 par la comparaison des tailles des fragments.
On peut donc confirmer ltat htrozygote ou ltat homozygote pour cette mutation.
IV.3.3. Introduction du produit PCR dans un vecteur: clonage du produit PCR (voir cours sur les
vecteurs).
IV.3.4. Squenage direct du produit PCR (voir cours sur le squenage).
IV.3.5. Analyse lectrophortique des produits PCR: technique DGGE et technique SSCP).
Ces techniques danalyse lectrophortiques des produits PCR sont particulirement utiles pour
mettre en vidence des mutations ponctuelles au niveau dun gne. Des produits PCR (ou
amplimres) particuliers sont forms si des mutations sont prsentes sur lADN initial. Les produits
PCR seront diffrents en fonction de la prsence dune squence normale, dune squence mute
(homozygote, htrozygote ou composite)(voir schmas).
IV. 3.5.1. Technique DGGE (pour denaturating gel gradient electrophoresis ).
La temprature de fusion dun produit PCR (ADN double brin), cest--dire la temprature moyenne de
sparation des deux brins est fonction de sa squence. Une mutation ponctuelle qui change donc la
squence entrane une modification de la temprature de fusion. Cette modification est mise en
vidence par lectrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence dun gradient dagent dnaturant.
IV. 3.5.2. Technique SSCP (pour single strand chain polymorphism .
La technique SSCP est base sur lanalyse lectrophortique des produits PCR sous forme de
fragments simple brin. On amplifie par PCR une rgion que lon dsire tudier et on compare la
mobilit de lADN dnatur portant une mutation par rapport celle dun fragment de rfrence
comportant une squence normale. Une mutation ponctuelle au sein dune squence modifie
suffisamment la structure secondaire de lADN monobrin pour quil en rsulte des changements de
migration lectrophortique sur gel de polyacrylamide.
Les techniques DGGE et SSCP sont concurrences par des techniques de chromatographie liquide
haute performance avec des tempratures dlution variables (DHPLC: denaturing high pressure
liquid chromatography ).
V. LA RT-PCR.
La RT-PCR se droule en deux phases. Une premire phase correspond la copie dARN messager
en ADN complmentaire (cADN) et une seconde phase correspond une raction PCR classique sur
le cADN synthtis.
Dans la premire phase, lARN messager tudier est rpr en utilisant une sonde
oligonuclotidique spcifique (amorce 1 qui shybride lextrmit 3 du seul mARN auquel on
sintresse), puis la transcriptase inverse (ou rtrotranscriptase) permet la synthse du brin
complmentaire (sous une forme de cADN simple brin), une seconde amorce oligonuclotidique
spcifique (amorce 2) permettra la synthse du second brin par extension.
LADN complmentaire synthtis servira ensuite de matrice pour une raction PCR classique.
La technique RT-PCR a permis de montrer que la transcription de tous les gnes seffectuait dans
tous les tissus et ceci mme pour les gnes qui prsentent une trs grande spcificit tissulaire. On
parle dans ces conditions de transcription illgitime. Il est vident quavant les techniques
damplification gnique, la sensibilit des mthodes classiques navait pas permis de mettre en
vidence un tel phnomne.
VI. LE SQUENAGE DE LADN.
VI.1. TECHNIQUE DE SANGER.
VI.1.1. PRINCIPE.
Cette technique enzymatique est base sur la copie d'un fragment d'ADN monocatnaire que l'on
dsire squencer par une ADN polymrase. On utilise des didsoxynuclosides triphosphates. Ces
drivs ne possdent pas d'OH en position 3' du dsoxyribose. L'incorporation de ce
didsoxyribonuclotide par l'ADN polymrase bloque l'allongement de la molcule d'ADN en cours de
copie. En effet, l'allongement d'une chane polynuclotidique par une ADN polymrase ncessite un
groupement
OH
en
3'
disponible.
Soit l'ADN bicatnaire suivant dont la squence doit tre dtermine :
5'
3'
G C T C AT C C AT G G A
TTCGA
C C AG TAG G TAC C T
AAG C T
3'
5'
Les deux brins d'ADN sont pralablement spars par fusion. Considrons le brin orient 3'->5' :
C C AG T AG G T AC C T AAG C T
On ralise une hybridation avec une amorce de squenage1 : GGTCATCC, oriente 5'-->3' :
5'
3'
G C T C AT C C
C C AG TAG G TAC C T
AAG C T
3'
5'
Tube
Taq polymrase
dNTPs
ddNTP
ddATP
ddTTP
ddCTP
ddGTP
logiciels informatiques permet de fournir un trac lectrophortique avec des couleurs diffrentes pour
chaque base lmentaire.
Les amorces ncessaires pour raliser l'amplification PCR sont marques. Il peut s'agir d'un
marquage chaud par un radio-isotope (32P) ou d'un marquage froid (biotine). L'hybridation se
fait dans les conditions optimales de stringence1 entre les produits PCR dnaturs et les
sondes oligonuclotidiques fixes sur le support solide (sondes normales et sondes portant une
mutation ponctuelle). Aprs hybridation, lavages, on peut dceler la prsence d'une mutation
donne l'tat htrozygote ou l'tat homozygote.
1 Les conditions de stringence d'une hybridation molculaire correspondent aux conditions
optimales physico-chimiques d'hybridation (temprature, temps, tampon, pH, additif
ventuel...).
3. Technique du Southern-Blot.
3.1. Liens entre le Southern-Blot et sites de restriction. Notion de carte de restriction,
polymorphisme de restriction.
La rvlation dans le cas du Southern-blot est troitement dpendante du couple enzyme de
restriction-sonde. Il est impratif de choisir avec soin la sonde pour dceler les fragments de
restriction situs dans le domaine reconnu par la sonde.
3.2. Transformation des fragments d'ADN bicatnaires en fragments d'ADN monocatnaires
dans le gel d'lectrophorse.
Aprs migration lectrophortique des fragments d'ADN bicatnaires sur un gel d'agarose, il y
a une dpurination par un traitement du gel avec de l'acide chlorhydrique dilu. Puis, le gel est
plong dans une solution de soude dilue ce qui permet la transformation des fragments
d'ADN bicatnaires en fragments d'ADN monocatnaires.
3.3. Pr-hybridation dans le Southern-Blot.
La pr-hybridation dans le Southern-Blot est une ncessit, car elle permet de diminuer le
bruit de fond li la fixation non spcifique de la sonde radioactive sur le support de transfert
(nylon par exemple). Cette pr-hybridation est souvent ralise avec une solution d'ADN
d'origine animale (par exemple de l'ADN de sperme de saumon).
3.4. Ncessit de reconnaissance par la sonde (exemple double digestion Hind III et Eco RI).
Dans l'exemple prsent de double digestion par Hind III et Eco RI, le fragment de 4,5 kb
n'est pas reconnu par la sonde utilise.
3.5. Il est toujours possible de raliser une dshybridation d'une sonde.
4. ADN polymrase I et le fragment de Klenow.
L'ADN polymrase I comme le fragment de Klenow prsentent une activit exonuclasique
3'5' qui est la base de la fonction d'dition (ou " proofreading ") de l'enzyme.
5. La squenase.
La squenase est une ADN polymrase drive d'une ADN polymrase d'E. coli infect par le
bactriophage T4. Cette ADN polymrase est dpourvue de l'activit 3'-->5' exonuclasique
donc de la fonction d'dition. Elle n'a pas d'activit 5'-->3' exonuclasique.
6. La nuclase S1.
La nuclase S1 coupe les acides nucliques qui sont sous forme de monobrins. Elle ne coupe
pas les ADN double brin (ou bicatnaires) et les hybrides ADN-ARN.
7. Les rtrotranscriptases.
Deux formes commerciales de rtrotranscriptases sont principalement utilises. Elles
proviennent de rtro-virus: AMV (avian myeloblastosis virus) et Mo-MLV (Moloney murine
leukemia virus). Ces rtrotranscriptases prsentent une activit RNase.
8. La raction typique des ADN polymrases.
Dans la raction suivante typique de l'action des ADN polymrases:
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi
avec:
dNTP = dsoxynuclosides triphosphates avec N = A, T, C ou G.
PPi = pyrophosphate. MP =monophosphate.
(dNMP)n+1 = chane d'ADN en cours d'longation.
9. Coloration des gels d'agarose par le B.E.T (bromure d'thidium).
Le B.E.T. est un agent intercalant, mais il peut rvler des mARN ou des cADN
monocatnaires. En principe, on fait migrer des cADN bicatnaires (voir le Northern Blot).
10. Activit exonuclasique des ADN polymrases:
L'activit 3'-->5' exonuclasique de l'ADN polymrase I (Kornberg) libre des nuclosides 3'monophosphates.
et
L'activit 5'-->3' exonuclasique de l'ADN polymrase I (Kornberg) libre des dinuclotides
(avec un 5' phosphate) et peut-tre des nuclosides 5'-phosphates.
11. L'lectrophorse en champ puls est essentiellement utilise pour des fragments d'ADN
trs volumineux (en principe suprieurs 50 kb).
12. Extraction de l'ADN.
L'enzyme protolytique utilise est la protinase K, puis on traite par le mlange
phnol/chloroforme. Le phnol est un agent efficace de dnaturation des protines. Les
procds d'extraction de l'ADN actuels disponibles sur le march peuvent tre libres de
phnol. On utilise cependant un traitement pralable par la protinase K.
13. Temprature de fusion (Tm) et temprature optimale d'hybridation (Ta optimale).
La temprature de fusion d'un fragment d'ADN peut tre dtermine avec prcision en suivant
l'absorbance 260 nm d'une solution de ce fragment en fonction de la temprature. Le
passage de la forme double-brin la forme simple-brin se traduit par une augmentation rapide
de l'absorbance (ou densit optique), la courbe est de type sigmode. Le point d'inflexion de
cette courbe correspond la temprature de fusion ou Tm. Cette temprature de fusion dpend
troitement de la composition du fragments en bases G, C, A et T. Il existe des formules pour
calculer directement la valeur du Tm en fonction de la composition en bases.
La temprature d'hybridation (ou temprature optimale d'hybridation) est une notion de la
PCR. Elle correspond la temprature laquelle l'hybridation des amorces se fait pendant la
PCR. Il est donc vident qu'il faut connatre la valeur des tempratures de fusion des amorces
pour dterminer la temprature optimale d'hybridation. En gnral, les amorces sont utilises
Les produits PCR (PCR classique ou multiplex) sont dnaturs en ADN monobrin et peuvent
tre hybrids avec des oligo-nuclotides normaux ou pathologiques fixs de manire
covalente un support solide. La prsence du produit d'hybridation aprs lavages est dcele
par raction enzymatique grce la biotine fixe sur les amorces PCR. Les amorces PCR sont
en effet marques en 5' par de la biotine. La biotine ragit avec la streptavidine-peroxydase
(ou phosphatase alcaline) pour la rvlation enzymatique.
SEQUENAGE AUTOMATIQUE DOUBLE BRIN SUR SEQUENCEUR LI-COR 4200
Cette technique de squenage fait appel un marquage des amorces (" Dye Primer "). Il est
possible d'utiliser un marquage des di-dsoxynuclotides (ddNTPs) avec les marquages 700 et
800 nm (" Dye Terminator "). On veut dterminer la squence de l'ADN double brin suivant :