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LES TECHNIQUES DE BASE DE LA BIOLOGIE MOLCULAIRE

I. PURIFICATION DES ACIDES NUCLIQUES.


I.1. EXTRACTION A PARTIR DE MATRIELS BIOLOGIQUES.
LADN (ou lARN) doit imprativement tre purifi partir de matriels biologiques dans des conditions
optimales de qualit et de quantit.
Dans la pratique, les acides nucliques sont souvent extraits du sang total. Le procd classique est
lextraction par le couple phnol-chloroforme. Le phnol est un excellent agent dnaturant des
protines et il permet de sparer efficacement les protines et les acides nucliques. Il est ensuite
limin par lextraction avec du chloroforme (non miscible avec leau). La sparation des phases
aqueuse et organique peut se faire par centrifugation. La phase aqueuse contient les acides
nucliques. Des traitements par des agents clivant les protines (protolyse) peuvent tre
ncessaires. Les acides nucliques peuvent tre finalement rcuprs sous forme solide la suite de
prcipitation par lalcool thylique ou par lalcool isopropylique. De nombreux ractifs sont disponibles,
prts lemploi, ce qui permet de simplifier les oprations de purification. Il est possible dextraire les
acides nucliques partir dchantillons biologiques varis: cultures cellulaires, tissus divers etc... Les
mthodes dextraction doivent bien entendu tre adaptes aux quantits disponibles de matriel
biologique.
I.2. ESTIMATION DES QUANTITS DADN.
Cette estimation est indispensable aprs extraction dADN partir dun matriel biologique. Elle
seffectue par spectrophotomtrie dans lultra-violet 260 nm. Il est indispensable de mesurer
galement labsorption 280 nm. Cette dernire longueur donde permet destimer la contamination
ventuelle de lextrait par des protines. Labsorption se dfinit par lunit de densit optique mesure
260 nm. Une unit de densit optique correspond labsorption dune solution dADN double brin
la concentration de 50 g/ml ou labsorption dune solution dADN simple brin (ou dARN) la
concentration de 25 g/ml.
II. MIGRATION LECTROPHORTIQUE DES FRAGMENTS DADN.
Les fragments dADN aprs digestion par les enzymes de restriction peuvent tre spars par
lectrophorse sur un gel dagarose. Dans ce type de gel, les migrations des fragments dADN
dpendent de la taille du fragment plus que de la charge de celui-ci. Plus le fragment a une taille
leve, moins la migration lectrophortique par rapport au puits dinclusion sera importante. A
loppos les fragments de petite taille auront une distance de migration la plus leve. La
dtermination prcise des tailles des fragments spars par lectrophorse est effectue en faisant
migrer des marqueurs de poids molculaire en parallle avec les chantillons analyser. La dtection
de lADN sur ce type de gel est ralise par exposition aux rayons UV aprs raction avec un ractif
spcifique (bromure dthidium par exemple, agent sintercalant entre les brins dADN).
Llectrophorse des fragments dADN en gel dagarose permet des sparations jusqu 20-25 kb
(20000-25000 pb). Le tampon utilis pour la migration lectrophortique a un pH basique (par
exemple: 8,3 dans le cas du tampon appel TBE = Tris-Borate-EDTA).
Des fragments dADN de taille restreinte (infrieure 1000 paires de bases) peuvent tre spars par
lectrophorse sur gel de polyacrylamide.
Dautres techniques lectrophortiques existent comme llectrophorse en champ puls qui permet
de sparer des grands fragments dADN (taille suprieure 50 kb). Le support dlectrophorse est
constitu par de lagarose et on applique au gel un champ lectrique de nature variable. Ainsi, le
champ lectrique peut tre appliqu dans une direction donne pendant 1 minute puis dans une

direction perpendiculaire au champ prcdent pendant une minute et ainsi de suite. Le processus de
rorientation des macromolcules dans le champ lectrique dpend de leur taille.
LECTROPHORSE EN GEL DAGAROSE APRS MIGRATION ET COLORATION PAR LE
BROMURE DETHIDIUM.

FIGURE DE GAUCHE:
- PISTE 1: Marqueurs de taille (en paires de bases).
- PISTE 2: Echantillon dADN dont la taille est dterminer.
FIGURE DE DROITE:
- Courbe dtalonnage en abscisses, les distances par
et en ordonnes les poids molculaires (chelle logarithmique).

rapport

au

puits

dinclusion:

III. LE TRANSFERT SELON SOUTHERN.


III. 1. PRINCIPE.
Cette mthode a t initialement dcrite par E.M. SOUTHERN en 1975. Elle consiste dtecter
spcifiquement des fragments dADN transfrs sur filtre par leur hybridation des squences
complmentaires marques par un radioisotope.

III. 2. RALISATION PRATIQUE.


Les tapes successives de cette technique sont les suivantes:
III. 2.1. Extraction de lADN gnomique.
Cette extraction seffectue partir des leucocytes circulants par exemple obtenus partir de sang
total.
III. 2. 2. Digestion par des enzymes de restriction diffrentes du mme ADN gnomique.
LADN gnomique est digr par des enzymes de restriction diffrentes: dans le tube 1, on ralisera
une digestion par lenzyme 1; dans le tube 2, une digestion par lenzyme 2; etc....). On peut bien
entendu raliser des digestions par deux enzymes dans un mme tube. Dans ces conditions, on
obtient un trs grand nombre de fragments, mais seuls quelques fragments correspondent une
partie ou la totalit du gne tudi.
III. 2. 3. Sparation lectrophortique des fragments dADN par lectrophorse dans un gel dagarose.
Aprs sparation lectrophortique en gel dagarose des fragments dADN bicatnaires obtenus par
digestion enzymatique, on ralise une dnaturation des fragments par un traitement alcalin du gel
dlectrophorse. Ce traitement transforme les fragments dADN double brin (ou bicatnaires) en
fragments dADN monobrin (ou monocatnaires).
III. 2. 4. Transfert des fragments monocatnaires du gel dagarose un support souple (feuille de
nylon par exemple).
Le transfert des fragments monocatnataires du gel dagarose un support type nylon seffectue par
simple capillarit.
III. 2. 5. Fixation des fragments monocatnaires dADN sur le support souple et hybridation dans des
conditions optimales de stringence avec une sonde complmentaire marque un radioisotope.
Les fragments monocatnaires dADN transfrs sur un support solide souple (nylon) sont mis en
prsence dune sonde qui va shybrider dans des conditions physico-chimiques bien dfinies. on parle
de conditions optimales de stringence. La sonde sapparie avec les fragments dADN monocatnaire
selon les rgles de complmentarit. De plus, elle est marque avec un radioisotope (soit son
extrmit 5, soit lintrieur de la chane polynuclotidique). Nous verrons plus loin la prparation des
sondes.
III. 2. 6. Lavages et rvlation (dans ce cas par autoradiographie).
Aprs de nombreux lavages, le support solide est mis en contact avec un film photographique pendant
plusieurs jours. Le film est ensuite rvl. Les bandes dADN monocatnaires hybrides avec la
sonde radioactive sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc. La position de ces
bandes par rapport des tmoins de poids molculaire permet de dterminer la taille de ces
fragments.
III.3. UTILISATIONS DE LA TECHNIQUE DE SOUTHERN.
Nous citerons parmi les applications de la technique de SOUTHERN:
III.3.1. Carte de restriction de lADN.
Les enzymes de restriction coupent lADN au niveau de squences parfaitement dfinies. Il est donc
possible dtablir une vritable carte dun gne donn par la technique de SOUTHERN. Cette carte
porte le nom de carte de restriction.

En pratique, lADN tudier est rparti en diffrentes fractions. Chaque fraction est traite par une
enzyme de restriction ou un couple denzymes de restriction. Ainsi dans lexemple ci-dessous. Dans le
puits 1, on dpose lADN digr par Eco RI seule; dans le puits 2, on dpose lADN digr par Hind III
seule et dans le puits 3, lADN digr par Eco RI et Hind III. La dtection des diffrents fragments est
ralise laide dune sonde marque du gne tudi (voir schmas).
Cartographie selon SOUTHERN et rsultats:

Interprtation:

(1): Position des coupures par Eco RI.


(2): Position des coupures par Hind III.
(3): Position des coupures par Hind III + Eco RI.
III.3.2. Si on dispose de sondes spcifiques du gne explorer.
Mise en vidence des dltions dans un gne ou une zone juxta-gnique. Ltendue de la dltion
peut tre estime par la dtermination de la taille des fragments dADN.
III.3.3. Comparaison de lADN de diffrents individus avec mise en vidence des polymorphismes de
restriction.
En prsence de mutation(s) ponctuelle(s) dans des sites de restriction, des variations dans la taille de
certains fragments seront observes et ceci par exemple lintrieur dune mme population. Ces
petites diffrences entre des individus dans une mme population sont appeles de polymorphisme
de taille des fragments de restriction (ou RFLP pour restriction fragment length polymorphism ).
III.3.4. Mise en vidence des recombinaisons entre des gnes.
IV. LA TECHNIQUE DAMPLIFICATION GNIQUE OU TECHNIQUE PCR ( POLYMERASE CHAIN
REACTION ).
IV. 1. PRINCIPE.
Cette technique dcrite en 1985 (K. MULLIS et collaborateurs) permet damplifier des squences
dADN de manire spcifique et daugmenter de manire considrable la quantit dADN dont on
dispose initialement. Elle ncessite de connatre la squence des rgions qui dlimitent lADN
amplifier. Ces squences serviront synthtiser des amorces oligonuclotidiques complmentaires
(de longueur de 20 30 nuclotides en gnral). Ces oligonuclotides serviront dlimiter la portion
dADN amplifier. LADN polymrase les utilisera comme amorces.
IV. 2. RALISATION PRATIQUE.
La technique comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession de trois
phases:
- Une phase de dnaturation par la chaleur pour sparer les deux brins dADN (92-95C)(30
secondes-1 minute).
- Une phase dhybridation avec les deux amorces spcifiques entre 55-60C. La premire amorce se
fixe sur un brin dADN, lautre sur le brin complmentaire (30 secondes-1 minute).
- Une phase dextension par lADN polymrase partir des amorces 70-72C (1-2 minutes).
Cette technique a pris un essor considrable avec lintroduction dune ADN polymrase rsistante la
chaleur. Cette ADN polymrase ou Taq polymrase est extraite dune bactrie thermophile ( Thermus
aquaticus). Elle permet une automatisation des diffrents cycles (dans des appareils appels
thermocycleurs). Le nombre de cycles est gnralement compris entre 30 et 40. Cette mthode
permet damplifier lADN compris entre les deux amorces dun facteur de 10 5 106. Les rsultats
doivent tre optimiss en fonction dun certain nombre de paramtres: concentration en MgCl 2,
concentration en amorces, spcificit des amorces etc... Le choix des amorces est particulirement
crucial pour obtenir des rsultats satisfaisants (spcificit, taille, paramtres physico-chimiques.....).
Lintroduction de logiciels spcialiss et des bases de donnes nuclotidiques a permis de raliser des
choix plus rationnels.

La Taq polymrase extraite de Thermus aquaticus prsente une activit exonuclasique 53, mais
elle est dnue dactivit exonuclasique 35, cest--dire de la fonction ddition. Elle peut insrer
des bases qui ne suivent pas la rgle classique dappariement et ceci au hasard. On estime quelle
ralise une mauvaise incorporation toutes les 104 105 bases.
Cette technique a volu considrablement. De nouveaux types de PCR ont t introduits. Nous
citerons brivement:
- La PCR dite Multiplex pour amplifier des gnes avec de nombreux exons (le gne CFTR
impliqu dans la mucoviscidose possde 27 exons), il est possible dintroduire dans le milieu
damplification des couples damorces spcifiques diffrentes.
- La PCR dite Nested PCR . Elle correspond une seconde PCR ralise en utilisant des
nouuvelles amorces situes lintrieur du domaine dfini par les amorces de la premire PCR.
- La PCR quantitative. Dans ce type de PCR, on cherche estimer le nombre de copies prsent dans
la squence cible dADN ou dARN. La proportionnalit entre le nombre damplifications et le nombre
de copies nest valable que pour un nombre de cycles PCR faible.
IV. 3. UTILISATIONS DES PRODUITS PCR.
Les utilisations des produits PCR sont trs varies, nous citerons quelques exemples (cette liste nest
pas exhaustive):
IV.3.1. Mise en vidence de mutations ponctuelles par hybridation des produits PCR avec des sondes
oligo-nuclotidiques (technique dite du dot-blot ).
Les produits PCR peuvent aprs transformation en monobrins tre hybrids avec des sondes
oligonuclotidiques fixes sur un support solide. Ces sondes correspondent des squences
normales et pathologiques (prsence de mutations ponctuelles par exemple) pour un gne donn.
IV.3.2. Analyse de restriction.
Le produit PCR est soumis une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une
mutation ponctuelle modifie le site de restriction intialement prsent, la taille des fragments dADN
obtenus aprs digestion sera modifie et dcelable aprs lectrophorse des fragments dADN (sur
gel dagarose ou gel de polyacrylamide).
A titre dexemple, la mutation ponctuelle (GAGGTG) sur le sixime codon du premier exon du gne
b de la globine humaine entrane lapparition dune hmoglobine anormale appele hmoglobine S
(mutation ponctuelle dun acide amin: GluVal). Cette anomalie est rpandue dans le monde entier.
Elle est responsable ltat homozygote dune pathologie grave: la drpanocytose homozygote. Cette
mutation entrane une modification du site de restriction de lenzyme Dde I: C / TNAG (N = A, T, C ou
G).
La squence suivante reprsente les 9 premiers codons normaux du premier exon du gne b de la
globine humaine:

La mutation Hb S conduit une mutation ponctuelle au niveau du codon 6 avec disparition du site de
restriction pour lenzyme Dde I:

Llectrophorse des produits PCR aprs digestion par lenzyme Dde I permet daffirmer ou dinfirmer
la prsence dune mutation GAGGTG sur le codon 6 par la comparaison des tailles des fragments.
On peut donc confirmer ltat htrozygote ou ltat homozygote pour cette mutation.
IV.3.3. Introduction du produit PCR dans un vecteur: clonage du produit PCR (voir cours sur les
vecteurs).
IV.3.4. Squenage direct du produit PCR (voir cours sur le squenage).
IV.3.5. Analyse lectrophortique des produits PCR: technique DGGE et technique SSCP).
Ces techniques danalyse lectrophortiques des produits PCR sont particulirement utiles pour
mettre en vidence des mutations ponctuelles au niveau dun gne. Des produits PCR (ou
amplimres) particuliers sont forms si des mutations sont prsentes sur lADN initial. Les produits
PCR seront diffrents en fonction de la prsence dune squence normale, dune squence mute
(homozygote, htrozygote ou composite)(voir schmas).
IV. 3.5.1. Technique DGGE (pour denaturating gel gradient electrophoresis ).
La temprature de fusion dun produit PCR (ADN double brin), cest--dire la temprature moyenne de
sparation des deux brins est fonction de sa squence. Une mutation ponctuelle qui change donc la
squence entrane une modification de la temprature de fusion. Cette modification est mise en
vidence par lectrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence dun gradient dagent dnaturant.
IV. 3.5.2. Technique SSCP (pour single strand chain polymorphism .
La technique SSCP est base sur lanalyse lectrophortique des produits PCR sous forme de
fragments simple brin. On amplifie par PCR une rgion que lon dsire tudier et on compare la
mobilit de lADN dnatur portant une mutation par rapport celle dun fragment de rfrence
comportant une squence normale. Une mutation ponctuelle au sein dune squence modifie
suffisamment la structure secondaire de lADN monobrin pour quil en rsulte des changements de
migration lectrophortique sur gel de polyacrylamide.
Les techniques DGGE et SSCP sont concurrences par des techniques de chromatographie liquide
haute performance avec des tempratures dlution variables (DHPLC: denaturing high pressure
liquid chromatography ).
V. LA RT-PCR.
La RT-PCR se droule en deux phases. Une premire phase correspond la copie dARN messager
en ADN complmentaire (cADN) et une seconde phase correspond une raction PCR classique sur
le cADN synthtis.
Dans la premire phase, lARN messager tudier est rpr en utilisant une sonde
oligonuclotidique spcifique (amorce 1 qui shybride lextrmit 3 du seul mARN auquel on
sintresse), puis la transcriptase inverse (ou rtrotranscriptase) permet la synthse du brin
complmentaire (sous une forme de cADN simple brin), une seconde amorce oligonuclotidique
spcifique (amorce 2) permettra la synthse du second brin par extension.
LADN complmentaire synthtis servira ensuite de matrice pour une raction PCR classique.

La technique RT-PCR a permis de montrer que la transcription de tous les gnes seffectuait dans
tous les tissus et ceci mme pour les gnes qui prsentent une trs grande spcificit tissulaire. On
parle dans ces conditions de transcription illgitime. Il est vident quavant les techniques
damplification gnique, la sensibilit des mthodes classiques navait pas permis de mettre en
vidence un tel phnomne.
VI. LE SQUENAGE DE LADN.
VI.1. TECHNIQUE DE SANGER.
VI.1.1. PRINCIPE.
Cette technique enzymatique est base sur la copie d'un fragment d'ADN monocatnaire que l'on
dsire squencer par une ADN polymrase. On utilise des didsoxynuclosides triphosphates. Ces
drivs ne possdent pas d'OH en position 3' du dsoxyribose. L'incorporation de ce
didsoxyribonuclotide par l'ADN polymrase bloque l'allongement de la molcule d'ADN en cours de
copie. En effet, l'allongement d'une chane polynuclotidique par une ADN polymrase ncessite un
groupement
OH
en
3'
disponible.
Soit l'ADN bicatnaire suivant dont la squence doit tre dtermine :

5'

3'
G C T C AT C C AT G G A
TTCGA
C C AG TAG G TAC C T
AAG C T

3'

5'

Les deux brins d'ADN sont pralablement spars par fusion. Considrons le brin orient 3'->5' :
C C AG T AG G T AC C T AAG C T
On ralise une hybridation avec une amorce de squenage1 : GGTCATCC, oriente 5'-->3' :
5'

3'
G C T C AT C C
C C AG TAG G TAC C T
AAG C T

3'

5'

1 L'amorce de squenage pour simplifier l'expos a t volontairement rduite en nombre de


nuclotides, ceci n'est pas le cas en pratique. L'exemple prsent ci-dessus est bien entendu
essentiellement but didactique.
Puis, on ralise une raction de squenage avec des dNTPs (dATP, dTTP, dCTP et dGTP) et
de la Taq polymrase. On prpare quatre tubes identifis : A, T, C et G.

Tube

Taq polymrase

dNTPs

ddNTP

ddATP

ddTTP

ddCTP

ddGTP

Dans le tube A : on introduit du ddATP.


La synthse d'ADN s'arrtera au niveau de chaque A avec les fragments suivants:
5'-GGTCATCCA-3' (8 nuclotides)
5'-GCTCATCCATGGA-3' (13 nuclotides)
5'-GCTCATCCATGGATTCGA-3' (18 nuclotides)
Dans le tube T : on introduit du ddTTP.
La synthse s'arrtera au niveau de chaque T avec les fragments suivants:
5'-GGTCATCCAT-3' (10 nuclotides)
5'-GGTCATCCATGGAT -3' (14 nuclotides)
5'-GGTCATCCATGGATT -3' (15 nuclotides)
Dans le tube C : on introduit du ddCTP.
La copie d'ADN s'arrtera au niveau de chaque C avec le fragment unique suivant :
5'-GGTCATCCATGGATTC -3' (16 nuclotides)
Dans le tube G: on introduit du ddGTP.
La synthse s'arrtera au niveau de chaque G avec les fragments suivants:
5'-GGTCATCCATG-3' (11 nuclotides)
5'-GGTCATCCATGG-3' (12 nuclotides)
5'-GGTCATCCATGGATTC-3' (17 nuclotides)
On voit facilement qu'avec cette technique, si l'amorce ajoute est marque en 5' par un
phosphate radioactif (32P), dans chaque tube, on aura diffrentes espces qui prsenteront
toutes un marquage en 5' au phosphate radioactif.

nt = nuclotide (nombre de nuclotides)


La lecture de ce gel se fait de bas en haut (des fragments de petite taille aux fragments de grande
taille). On aura donc le rsultat de squenage suivant:

VI.1.2. Les appareils de squenage automatique.


La technique de Sanger s'est considrablement automatise avec l'apparition des appareils de
squenage automatique. On utilise des amorces ou des didsoxynuclosides triphosphates marqus
des fluorochromes. La raction de squenage s'effectue comme dcrite prcdemment dans la
technique manuelle de Sanger. La lecture du gel se fait par un balayage automatique qui permet de
discriminer grce des fluorochromes diffrents les quatres bases A , T, C ou G. L'utilisation de

logiciels informatiques permet de fournir un trac lectrophortique avec des couleurs diffrentes pour
chaque base lmentaire.

VI.2. TECHNIQUE CHIMIQUE DE MAXAM ET DE GILBERT.


La mthode chimique de MAXAM et de GILBERT est moins utilise actuellement que la mthode
enzymatique de SANGER. LADN squencer est tout dabord marqu en 5 avec phosphore 32
(dATP), puis cliv aprs A, G, C ou T par divers ractifs chimiques. Aprs clivage par ces ractifs, les
fragments produits sont spars par lectrophorse en gel de polyacrylamide. Lexamen de
lautoradiographie correspondante permet de connatre la squence du brin analys.
VII L'HYBRIDATION MOLECULAIRE.
Nous avons dj dfini la temprature de fusion d'un ADN bicatnaire ainsi que les facteurs qui
influencent celle-ci comme la composition en bases ou la nature du milieu dans lequel l'ADN est en
solution. D'autres facteurs importants interviennent comme la longueur des fragments d'ADN ou la
prsence ventuelle dans l'ADN bicatnaire initiale de msappariements.
A l'inverse aprs sparation de brins par fusion, si la solution d'ADN est refroidie lentement dans des
conditions de milieus favorables, une rassociation des brins est progressivement observe. Ce
phnomne est appel hybridation molculaire. Cette rassociation peut concerner deux squences
d'ADN ou une squence d'ARN complmentaire. Elle est donc d'une spcificit trs grande.
VII.1 LES FACTEURS AFFECTANT L'HYBRIDATION MOLECULAIRE.
L'hybridation molculaire dpend d'un grand nombre de facteurs.
- Tout d'abord le temps. Plus le temps de raction est long, plus la probabilit d'appariements pour des
squences complmentaires augmente.
- La concentration en acides nucliques. Plus la concentration en acides nucliques est leve, plus la
probabilit de rencontres entre des squences complmentaires est leve. En pratique on introduit le
produit temps x concentration en acides nucliques, Ce paramtre est appel Cot pour les
hybridations entre fragments d'ADN et Rot pour les hybridations d'ARN et d'ADN. On utilise souvent
les valeurs de Cot 1/2 et de Rot 1/2 qui correspondent respectivement 50% d'hybridation dans le
cas d'hybridation molculaire d'ADN ou d'ADN-ARN.
- D'autres facteurs interviennent : la nature du milieu, la longueur des fragments, la prsence d'agents
chimiques supplmentaires (phnol...) etc...

QUESTIONS FRQUEMMENT POSES ET LES RPONSES


Outils enzymatiques et techniques de base de la biologie molculaire

1. Amplification PCR et longs fragments initiaux.


L'amplification PCR gnre des amplimres dont la taille est suprieure la taille escompte,
ceci particulirement dans les premiers cycles de la PCR. L'amplification de ces fragments
n'est cependant pas exponentielle.
2. Les dot-blots: homozygotie et htrozygotie pour une mutation ponctuelle, marquage des
amorces pour la PCR.

Les amorces ncessaires pour raliser l'amplification PCR sont marques. Il peut s'agir d'un
marquage chaud par un radio-isotope (32P) ou d'un marquage froid (biotine). L'hybridation se
fait dans les conditions optimales de stringence1 entre les produits PCR dnaturs et les
sondes oligonuclotidiques fixes sur le support solide (sondes normales et sondes portant une
mutation ponctuelle). Aprs hybridation, lavages, on peut dceler la prsence d'une mutation
donne l'tat htrozygote ou l'tat homozygote.
1 Les conditions de stringence d'une hybridation molculaire correspondent aux conditions
optimales physico-chimiques d'hybridation (temprature, temps, tampon, pH, additif
ventuel...).
3. Technique du Southern-Blot.
3.1. Liens entre le Southern-Blot et sites de restriction. Notion de carte de restriction,
polymorphisme de restriction.
La rvlation dans le cas du Southern-blot est troitement dpendante du couple enzyme de
restriction-sonde. Il est impratif de choisir avec soin la sonde pour dceler les fragments de
restriction situs dans le domaine reconnu par la sonde.
3.2. Transformation des fragments d'ADN bicatnaires en fragments d'ADN monocatnaires
dans le gel d'lectrophorse.
Aprs migration lectrophortique des fragments d'ADN bicatnaires sur un gel d'agarose, il y
a une dpurination par un traitement du gel avec de l'acide chlorhydrique dilu. Puis, le gel est
plong dans une solution de soude dilue ce qui permet la transformation des fragments
d'ADN bicatnaires en fragments d'ADN monocatnaires.
3.3. Pr-hybridation dans le Southern-Blot.
La pr-hybridation dans le Southern-Blot est une ncessit, car elle permet de diminuer le
bruit de fond li la fixation non spcifique de la sonde radioactive sur le support de transfert
(nylon par exemple). Cette pr-hybridation est souvent ralise avec une solution d'ADN
d'origine animale (par exemple de l'ADN de sperme de saumon).
3.4. Ncessit de reconnaissance par la sonde (exemple double digestion Hind III et Eco RI).
Dans l'exemple prsent de double digestion par Hind III et Eco RI, le fragment de 4,5 kb
n'est pas reconnu par la sonde utilise.
3.5. Il est toujours possible de raliser une dshybridation d'une sonde.
4. ADN polymrase I et le fragment de Klenow.
L'ADN polymrase I comme le fragment de Klenow prsentent une activit exonuclasique
3'5' qui est la base de la fonction d'dition (ou " proofreading ") de l'enzyme.
5. La squenase.
La squenase est une ADN polymrase drive d'une ADN polymrase d'E. coli infect par le
bactriophage T4. Cette ADN polymrase est dpourvue de l'activit 3'-->5' exonuclasique
donc de la fonction d'dition. Elle n'a pas d'activit 5'-->3' exonuclasique.
6. La nuclase S1.
La nuclase S1 coupe les acides nucliques qui sont sous forme de monobrins. Elle ne coupe
pas les ADN double brin (ou bicatnaires) et les hybrides ADN-ARN.

7. Les rtrotranscriptases.
Deux formes commerciales de rtrotranscriptases sont principalement utilises. Elles
proviennent de rtro-virus: AMV (avian myeloblastosis virus) et Mo-MLV (Moloney murine
leukemia virus). Ces rtrotranscriptases prsentent une activit RNase.
8. La raction typique des ADN polymrases.
Dans la raction suivante typique de l'action des ADN polymrases:
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi
avec:
dNTP = dsoxynuclosides triphosphates avec N = A, T, C ou G.
PPi = pyrophosphate. MP =monophosphate.
(dNMP)n+1 = chane d'ADN en cours d'longation.
9. Coloration des gels d'agarose par le B.E.T (bromure d'thidium).
Le B.E.T. est un agent intercalant, mais il peut rvler des mARN ou des cADN
monocatnaires. En principe, on fait migrer des cADN bicatnaires (voir le Northern Blot).
10. Activit exonuclasique des ADN polymrases:
L'activit 3'-->5' exonuclasique de l'ADN polymrase I (Kornberg) libre des nuclosides 3'monophosphates.
et
L'activit 5'-->3' exonuclasique de l'ADN polymrase I (Kornberg) libre des dinuclotides
(avec un 5' phosphate) et peut-tre des nuclosides 5'-phosphates.
11. L'lectrophorse en champ puls est essentiellement utilise pour des fragments d'ADN
trs volumineux (en principe suprieurs 50 kb).
12. Extraction de l'ADN.
L'enzyme protolytique utilise est la protinase K, puis on traite par le mlange
phnol/chloroforme. Le phnol est un agent efficace de dnaturation des protines. Les
procds d'extraction de l'ADN actuels disponibles sur le march peuvent tre libres de
phnol. On utilise cependant un traitement pralable par la protinase K.
13. Temprature de fusion (Tm) et temprature optimale d'hybridation (Ta optimale).
La temprature de fusion d'un fragment d'ADN peut tre dtermine avec prcision en suivant
l'absorbance 260 nm d'une solution de ce fragment en fonction de la temprature. Le
passage de la forme double-brin la forme simple-brin se traduit par une augmentation rapide
de l'absorbance (ou densit optique), la courbe est de type sigmode. Le point d'inflexion de
cette courbe correspond la temprature de fusion ou Tm. Cette temprature de fusion dpend
troitement de la composition du fragments en bases G, C, A et T. Il existe des formules pour
calculer directement la valeur du Tm en fonction de la composition en bases.
La temprature d'hybridation (ou temprature optimale d'hybridation) est une notion de la
PCR. Elle correspond la temprature laquelle l'hybridation des amorces se fait pendant la
PCR. Il est donc vident qu'il faut connatre la valeur des tempratures de fusion des amorces
pour dterminer la temprature optimale d'hybridation. En gnral, les amorces sont utilises

une temprature d'hybridation (Ta) infrieure de 5C leur Tm ou la Tm la plus faible des


deux amorces.
14. Choix des amorces pour la PCR.
Le choix des amorces doit se faire de manire rationnelle. Il est indispensable de choisir des
amorces de taille suffisante (20-30 nuclotides). Les amorces peuvent tre choisies par
l'utilisation de banques de donnes informatiques sur de nombreux gnes disponibles par
Internet. Aprs slection des amorces, il faut vrifier par des logiciels spcialiss les
proprits physico-chimiques des amorces retenues. L'appariement des amorces (formation de
dimres d'amorces) de mme que des diffrences importantes entre les tempratures
d'hybridation des amorces peuvent tre des problmes dlicats rsoudre.
15. Sparation des acides nucliques en gradient continu de chlorure de csium.
Les acides nucliques (ADN monobrin, ADN double brin et ARN) peuvent tre spars par
ultracentrifugation en solution concentre de chlorure de csium (8 M). L'ultracentrifugation
aboutit la constitution de zones de densit o vont se stabiliser les diffrents constituants.
Dans le sens croissant de densit (du sommet au fond du tube), on peut sparer : l'ADN
bicatnaire, l'ADN monocatnaire et enfin l'ARN.
16. Coupure par les nuclases.
Soit le polynuclotide suivant :
5'-----pApCp-----3'
p = phosphate.
Des nuclases peuvent couper :
5'-----pApCp-----3'
Cette attaque conduit aux produits suivants :
5'-----pA-OH-3'
et
5'-pCp-OH-3'
Par contre l'attaque suivante :
5'-----pApCp-----3'
conduit :
5'----pAp-3'
et
5'OH-Cp-3'

17. Note complmentaire sur les topoisomrases.


Parmi les topoisomrases :
1. Certaines peuvent relcher les super-tours ngatifs.
2. D'autres peuvent relcher les super-tours ngatifs et positifs.
3. Enfin, certaines peuvent introduire des super-tours ngatifs.
Deux classes de topoisomrases existent :
- Les topoisomrases de type I. Leur action sur les super-tours est possible parce qu'elles
ralisent une coupure transitoire d'un seul brin d'ADN.
- Les topoisomrases de type II. Leur action sur les super-tours est possible parce qu'elles
ralisent une coupure transitoire des deux brins d'ADN. En gnral, elles agissent sur les
super-tours positifs et les super-tours ngatifs.
Les topoisomrases existent aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Chez les
procaryotes, une topoisomrase de type I bien caractrise est code par le gne topA chez E.
coli. Cette topoisomrase relche l'ADN avec super-tours ngatifs. Elle n'agit pas sur les
super-tours positifs.
L'ADN gyrase bactrienne est une topoisomrase de type II qui peut introduire des supertours ngatifs dans un ADN circulaire bactrien l'tat relch.
L'amplification PCR d'une grande partie du gne b de la globine est ralise en utilisant au
cours d'une mme PCR, deux couples d'amorces A1 et A2, B1 et B2. Les tailles des produits
PCR sont contrles par lectrophorse en gel d'agarose. Dans un mme tube PCR, il est
possible d'introduire N couples d'amorces, bien entendu l'obtention des produits PCR
correspondants ncessite des conditions de droulement de la PCR trs voisines des PCR
ralises avec un seul couple d'amorces.

L'HYBRIDATION SPECIFIQUE AVEC DES SONDES OLIGONUCLEOTIDIQUES

Les produits PCR (PCR classique ou multiplex) sont dnaturs en ADN monobrin et peuvent
tre hybrids avec des oligo-nuclotides normaux ou pathologiques fixs de manire
covalente un support solide. La prsence du produit d'hybridation aprs lavages est dcele
par raction enzymatique grce la biotine fixe sur les amorces PCR. Les amorces PCR sont
en effet marques en 5' par de la biotine. La biotine ragit avec la streptavidine-peroxydase
(ou phosphatase alcaline) pour la rvlation enzymatique.
SEQUENAGE AUTOMATIQUE DOUBLE BRIN SUR SEQUENCEUR LI-COR 4200

Cette technique de squenage fait appel un marquage des amorces (" Dye Primer "). Il est
possible d'utiliser un marquage des di-dsoxynuclotides (ddNTPs) avec les marquages 700 et
800 nm (" Dye Terminator "). On veut dterminer la squence de l'ADN double brin suivant :

Les ractions de squenage sont prpares dans quatre tubes : A, T, C et G. La synthse


d'ADN est ralise en prsence d'une Taq polymrase, de dNTPs et des ddNTPs spcifiques.
L'appareil peut effectuer aprs migration lectrophortique une double dtection aux deux
longueurs d'onde par balayage du gel. Le tube de squenage indiqu ddA contiendra
diffrentes espces dont l'extrmit 3' est termine par ddA et l'extrmit 5' comporte un
marquage soit 700 nm, soit 800 nm. Ces espces sont spares par lectrophorse en gel
de polyacrylamide par une migration verticale.

APPAREIL DE SEQUENAGE AUTOMATIQUE LI-COR 4200