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Analyse du mecanisme dentree du virus de lhepatite B

: Identification dun nouveau determinant de linfectivite


Charlotte Lepere - Douard

To cite this version:


Charlotte Lepere - Douard. Analyse du mecanisme dentree du virus de lhepatite B : Iden-
tification dun nouveau determinant de linfectivite. Biologie cellulaire. Universite Rennes 1,
2009. Francais. <tel-00498099>

HAL Id: tel-00498099


https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00498099
Submitted on 6 Jul 2010

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abroad, or from public or private research centers. publics ou prives.
N dordre : 3927 ANNE 2009

THSE / UNIVERSIT DE RENNES 1


sous le sceau de lUniversit Europenne de Bretagne

pour le grade de
DOCTEUR DE LUNIVERSIT DE RENNES 1
Mention : BIOLOGIE
Ecole doctorale Vie Agronomie Sant
prsente par

Charlotte Lepre-Douard
prpare lunit de recherche INSERM U522 Rgulation des quilibres
fonctionnels du foie normal et pathologique , et lunit SeRAIC EA 4427
Signalisation et Rponse aux agents infectieux et chimiques .
Science de la vie et de lenvironnement

Thse soutenue Rennes


le 2 dcembre 2009
Analyse du mcanisme devant le jury compos de :
Eve-Isabelle PECHEUR
dentre du Virus de CR1, Universit de Lyon, rapporteur
Camille SUREAU
lHpatite B : DR, Universit de Paris 5 et Paris 7, rapporteur
Jean-Franois HUBERT
identification dun PU, Universit de Rennes 1, examinateur
Philippe ROINGEARD
nouveau dterminant PUPH, Universit de Tours, examinateur
Dominique GUYADER
de linfectivit PUPH , Universit de Rennes 1, directeur de thse
Philippe GRIPON
CR1, Universit de Rennes 1, co-directeur de thse
R EMERCIEMENTS

Ce travail de thse a t ralis au sein de lunit INSERM 522, dirige par le Dr


Christiane Guguen-Guillouzo, et de lunit EA-SeRAIC 4427 dirige par le Dr Dominique
Lagadic-Gossmann. Je tiens remercier le Dr Guguen-Guillouzo de mavoir accueillie dans son
laboratoire. Je remercie galement le Dr Lagadic-Gossmann pour son accueil, sa disponibilit et
son intressement dans mon travail de thse. La direction de cette thse a t assure par le
Pr Dominique Guyader que je tiens remercier pour sa disponibilit et son aide prcieuse pour la
correction de la partie concernant les aspects cliniques de lhpatite B.

Tout dabord, je tiens remercier le Dr Philippe Gripon, ayant encadr ma thse, qui ma
permis de raliser ce travail et aux cts de qui jai pu dcouvrir le mtier de chercheur. Outre sa
trs large culture scientifique, il a mis profit sa rigueur et son esprit critique, pour menseigner
les fondements du raisonnement scientifique et du mtier de chercheur qui me seront utiles dans
ma vie professionnelle future. Je le remercie tout particulirement pour sa disponibilit, son
coute et sa confiance qui mont permis de raliser cette thse dans les meilleures conditions.
Merci galement pour toutes les discussions que nous avons pu partager, tant au niveau
scientifique que dans tout autre domaine. Merci de mavoir donn lopportunit de prsenter mes
rsultats lors de congrs internationaux, jusquen Californie aux Etats-Unis, puis Tours en
France. Et enfin, merci pour avoir pris le temps de corriger ce manuscrit.

Je tiens exprimer toute ma reconnaissance envers Eve-Isabelle Pcheur et Camille


Sureau qui ont accept de faire partie de ce jury en qualit de rapporteurs et de me donner de leur
temps afin de juger et damliorer ce travail. Je tiens galement remercier Philippe Roingeard
et Jean-Franois Hubert qui ont accept de participer ce jury et dexaminer ce travail.

Je voudrais galement remercier les membres de lquipe pdagogique de biologie


cellulaire pour les quatre annes denseignement que jai eu la chance de mener dans la bonne
humeur en leur compagnie. Particulirement, je souhaite remercier le Dr Claire Piquet-Pellorce
pour sa disponibilit, ses conseils aviss, et les nombreuses discussions que nous avons pu
partager.

Loccasion mest galement donne de pouvoir remercier tous les membres du


laboratoire, notamment toute lquipe de doctorants et de post doctorants : Nadia, Claire,
Adeline, Klig, Maud, Emilie, Christophe, Delphine, Sasse-Fanie, Emmanuelle, Marie-Laure,

2
Lnac, Hlne sans qui je naurais pu raliser cette thse. Leur bonne humeur de tous les jours
et la joie de les retrouver tous les matins au laboratoire ma permis de raliser cette thse dans
une atmosphre joyeuse que je noublierais pas.
Je souhaite remercier trs particulirement Maud Trotard, doctorante, pour ces trois
annes passes ensemble. Merci pour. tout, pour les discussions professionnelles ou non, ta
disponibilit, tes conseils, ton coute, ton aide prcieuse, les moments de dtentes, les fous rires,
notre complicit, nos coups de gueules, etc., il y en a tellement que je ne peux tous les numrer,
alors juste encore une fois MILLE MERCI toi.
Je souhaite galement remercier trs particulirement le Dr Jacques Le Seyec pour sa
disponibilit, sa compagnie toujours agrable et ses nombreux conseils tant professionnels que
personnels. Tu as toujours t l lorsque jen avais besoin et je ten remercie profondment.

Je tiens remercier tous mes amis et tout particulirement Marie, Matthieu, Romain,
Olivia, Caroline, Sandrine, Mickael, Rachelle, Morgan, Thomas, Elinore qui ont su mpauler
durant toutes ces annes.

Merci toute ma famille, mes parents, ma sur adore et sa famille, pour tous les
moments de bonheurs que vous mavez offert et que lon continue de partager tous les jours.
Sans vous rien naurait t possible et vous mavez toujours soutenue. Merci pour tout. Merci
galement ma belle famille, Jean-Pierre, Rose-Anne, Marie-Ccile et Julien, qui font tout
simplement parti de la famille et sur qui je peux toujours compter.

Enfin, je souhaite terminer ces remerciements par un ENORME MERCI mon mari
ador, David, qui a toujours t mes cts et qui ma offert du rconfort et du bonheur tous les
jours ds que je rentrais la maison. Ce nest pas toujours facile davoir un femme qui fait une
thse qui doit travailler le week end et pendant les vacances mais tu mas toujours soutenue et
aide. Je naurais pas pu y arriver sans toi, merci. Et enfin un petit merci Kidi pour ses clins
rconfortants.

3
S OMMAIRE

REMERCIEMENTS ................................................................................................................................... 2
SOMMAIRE ................................................................................................................................................ 4
INDEX DES FIGURES............................................................................................................................... 6
LISTE DES ABREVIATIONS................................................................................................................... 7
AVANT-PROPOS ....................................................................................................................................... 8
INTRODUCTION GENERALE................................................................................................................ 9
DECOUVERTE DU VIRUS DE LHEPATITE B ...............................................................................................9
I. Premires observations ..................................................................................................................9
II. Dcouverte des hpatites sriques ................................................................................................9
III. Premire observation du virus...................................................................................................10
IV. Dcouverte et histoire du vaccin................................................................................................11
V. Dcouvertes rcentes...................................................................................................................13
CARACTERISTIQUES CLINIQUES DU VHB .................................................................................................14
I. Prvalence de linfection par le VHB...........................................................................................14
A. Dans le monde ..........................................................................................................................................................14
B. En France..................................................................................................................................................................14
II. Aspects cliniques de linfection par le VHB................................................................................15
A. Transmission.............................................................................................................................................................15
B. Manifestations cliniques ...........................................................................................................................................15
III. Traitement de linfection chronique par le VHB .......................................................................21
A. Thrapies base dinterfron ...................................................................................................................................21
B. Inhibiteurs de la polymrase virale...........................................................................................................................22

BIOLOGIE DU VHB ................................................................................................................................ 24


VIRUS APPARENTES ET SATELLITES ........................................................................................................24
I. Famille des hepadnaviridae .........................................................................................................24
A. Caractristiques communes des hepadnavirus .........................................................................................................25
B. Caractristiques divergentes des hepadnavirus ........................................................................................................25
C. Les gnotypes du VHB .............................................................................................................................................27
II.
Virus satellite ..............................................................................................................................29
CARACTERISTIQUES STRUCTURALES ......................................................................................................30
I. Structure des particules virales compltes et des particules subvirales ......................................30
A. Particules subvirales .................................................................................................................................................30
B. Particules virales compltes .....................................................................................................................................32
II. Nuclocapside .............................................................................................................................41
III. Gnome viral..............................................................................................................................43
A. Structure ...................................................................................................................................................................43
B. Organisation gntique .............................................................................................................................................43
CYCLE VIRAL ...........................................................................................................................................45
I. Attachement ..................................................................................................................................45
A. Implication des protines de lenveloppe virale .......................................................................................................46
B. Implication de protines cellulaires et autres ...........................................................................................................54
C. Attachement du DHBV.............................................................................................................................................59
II. Libration des nuclocapsides ....................................................................................................63
A. Compartiment cellulaire ...........................................................................................................................................63
B. Mcanisme................................................................................................................................................................69
III. Adressage nuclaire et dcapsidation .......................................................................................80
IV. Conversion de lADN relax circulaire en ADN superenroul .................................................82
V. Transcription virale.....................................................................................................................83
A. Structures et fonctions des transcrits viraux.............................................................................................................83
B. Mcanisme et rgulation de la transcription.............................................................................................................84
VI. Traduction et maturation des protines .....................................................................................86
A. Polymrase virale .....................................................................................................................................................86
B. Antigne de la capside et antigne e.........................................................................................................................86
C. Protine X .................................................................................................................................................................87
D. Protines de lenveloppe virale ................................................................................................................................87

4
VII. Encapsidation et synthse de lADN viral ................................................................................87
A. Encapsidation de lARN prgnome ........................................................................................................................87
B. Synthse de lADN viral ..........................................................................................................................................88
VIII. Assemblage et scrtion des particules virales .......................................................................89
A. Particules subvirales .................................................................................................................................................89
B. Particules virales compltes .....................................................................................................................................91

OBJECTIFS DE LA THESE ................................................................................................................... 93


RESULTATS ............................................................................................................................................. 95
PARTIE I : ANALYSE DU ROLE DU MOTIF DE TRANSLOCATION PRESENT DANS LE DOMAINE PRE-S2 DES
PROTEINES DENVELOPPE DU VHB LORS DE LETAPE DINFECTION .......................................................95
I. Introduction ..................................................................................................................................95
II. Stratgie exprimentale...............................................................................................................96
III. Rsultats et discussion ...............................................................................................................96
IV. Article I ......................................................................................................................................97
PARTIE II : ANALYSE DU ROLE DU PEPTIDE DE FUSION PUTATIF DES PROTEINES DENVELOPPE DU VHB
LORS DE LETAPE DINFECTION ...............................................................................................................98
I. Introduction ..................................................................................................................................98
II. Stratgie exprimentale...............................................................................................................98
III. Rsultats.....................................................................................................................................99
IV. Discussion ................................................................................................................................100
V. Article II ....................................................................................................................................102
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES.............................................................................. 103
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................................. 113
RESUMES................................................................................................................................................ 140

5
I NDEX DES FIGURES

Figure 1. Distribution gographique des infections chroniques par le VHB Page 14


Figure 2. Manifestations cliniques dune infection par le VHB Page 15
Figure 3. Les phases dune infection chronique par le VHB Page 17
Figure 4. Evolutions possibles dune infection chronique par le VHB Page 18
Figure 5. Arbre phylogntique des orthohepadnavirus Page 26
Figure 6. Rpartition gographique des gnotypes du VHB Page 27
Figure 7. Photos de microscopie lectronique des particules virales Page 30
Figure 8. Schmatisation des particules subvirales Page 30
Figure 9. Reconstruction 3D de particules subvirales Page 31
Figure 10. Schmatisation dune particule virale complte Page 32
Figure 11. Structure et modifications post-traductionnelles des protines de surface du VHB Page 33
Figure 12. Topologie prdite des protines denveloppe du VHB Page 33
Figure 13. Profil dhydrophobicit de la protine L du VHB Page 34
Figure 14. Topologie prdite de la grande protine denveloppe du DHBV Page 37
Figure 15. Modle 3D dune particule virale complte Page 39
Figure 16. Particules virales compactes et particules virales espaces Page 40
Figure 17. Organisation des antignes de surface dans lenveloppe virale Page 40
Figure 18. Reconstruction 3D de capsides natives Page 42
Figure 19. Organisation du gnome viral Page 43
Figure 20. Cycle viral du VHB Page 45
Figure 21. Rgions des protines denveloppe du VHB ncessaires linfection Page 49
Figure 22. Partenaires protiques ou autres interagissant avec les protines de surface du VHB Page 55
Figure 23. Modle reprsentant le mcanisme de translocation Page 70
Figure 24. Squence du peptide de fusion putatif des protines denveloppe du VHB Page 76
Figure 25. Squence des peptides de fusion du VHB et du DHBV Page 104
Figure 26. Variabilit dans les protines de surface et dans la polymrase virale Page 105
Figure 27. Modle in silico de la structure 3D de la protine S Page 108

NB : Les figures sont places en vis vis des numros de page indiqus ci-dessus.

6
L ISTE DES ABREVIATIONS

AA Acide amin
ADN Acide dsoxyribonuclique
ADNccc ADN superenroul, (covalently closed circular)
ADNrc ADN relax circulaire
AFSSAPS Agence franaise de scurit sanitaire des produits de sant
Ag Antigne
AGL Antigenic loop
ASAT, ALAT Transaminases
CHC Carcinome hpatocellulaire
CPN Complexe des pores nuclaires
CPD Carboxypeptidase D
C-term / N-term Extrmit C / N terminale
CYL Cytoplasmic loop
DMSO Di-mthyl-sulfoxide
DR1, DR2 Direct repeat
ERGIC Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment
GDC Glycine dcarboxylase
HA Hmagglutinine
HBc Hepatitis B core
HBe Hepatitis B e
HBs Hepatitis B surface
HC Hydrophobic cluster
INVS Institut national de veille sanitaire
L Grande protine du VHB
M Protine moyenne du VHB
NLS Nuclear localization signal
OMS Organisation mondiale de la sant
PEG Polythylne glycol
PEST Squence peptidique riche en rsidus Pro, Glu, Ser et Thr.
RE Rticulum endoplasmique
S Petite protine du VHB
T3, T4 Triangulation gale 3 ou 4
TLM Translocation motif
TM Transmembranaire
VHB Virus de l'hpatite B
VHC Virus de lhpatite C
VHD Virus de lhpatite D
VIH Virus de l'immunodficience humaine
WT Wild type (sauvage)

7
A VANT - PROPOS

Lhpatite B est une maladie infectieuse grave, extrmement contagieuse, qui


provoquerait plus de 600 000 dcs par an dans le monde (Goldstein et al, 2005). On estime 2
milliards le nombre de personnes touches par cette maladie, dont plus de 350 millions sont des
porteurs chroniques capables de transmettre le virus pendant des annes (WHO, 2002). Entre 15
et 40 % de ces derniers dveloppent des complications hpatiques de type cirrhose, lsion du foie
et hpatocarcinome (Lavanchy, 2004; Lok, 2002), ce dernier constituant le cinquime cancer le
plus frquent dans le monde (Parkin et al, 2001).
Malgr lexistence dun vaccin efficace, recommand par lorganisation mondiale de la
sant depuis 1991, le nombre de malades atteints chroniquement par la maladie reste trs lev.
Pour ces malades, deux types de traitement sont disponibles, bass soit sur lutilisation
dinterfrons pour stimuler les dfenses antivirales de lhte, soit sur lutilisation dinhibiteurs de
la polymrase virale qui bloquent la multiplication des virus. Bien que de nombreux progrs
aient t raliss dans la prise en charge thrapeutique des malades, les protocoles base
dinterfron ne sont efficaces que dans environ 40 % des cas et sont responsables dimportants
effets secondaires. En ce qui concerne les antiviraux, ils doivent tre utiliss trs long terme et
sont parfois responsables de lapparition de virus rsistants au traitement. Dans ce contexte, la
recherche de nouvelles cibles thrapeutiques afin de dvelopper de nouveaux antiviraux contre le
virus de lhpatite B (VHB), est un enjeu important. Ainsi, une meilleure comprhension du
cycle viral, et particulirement du mcanisme par lequel le virus entre dans les cellules, pourrait
fournir les bases ncessaires au dveloppement de nouvelles thrapeutiques qui inhibent les
premires tapes de linfection, comme cela a t rcemment illustr par la dcouverte dun
inhibiteur de lentre virale driv des protines de surface du virus (Gripon et al, 2005; Petersen
et al, 2008).
Une des approches utilises pour analyser le mcanisme dentre dun virus au sein de sa
cellule cible consiste tudier ses protines de surface. Ainsi, au cours de ma thse, jai
recherch la prsence de nouveaux dterminants de linfectivit dans les protines de surface du
VHB afin dessayer de mieux comprendre son mcanisme dentre.
La premire partie de ce manuscrit correspond une introduction gnrale dans laquelle
jai souhait prsenter lhistoire de la dcouverte du virus de lhpatite B, puis les manifestations
cliniques dune hpatite virale B. Ensuite, lintroduction se poursuit par la description de la
structure du virus, et particulirement de celle de ses protines de surface, puis elle se termine
par la description des diffrentes tapes du cycle viral. Dans un deuxime temps, jai prsent les
objectifs de cette thse dans le contexte actuel de la recherche. Enfin, mes principaux rsultats
sont rapports dans deux articles, publis en anglais dans Journal of Virology , dont jai
rsum en franais les points cls dans les pages prcdents chaque publication. Pour conclure,
jai voulu clore ce manuscrit par une discussion gnrale sur lensemble de nos rsultats et sur
leurs perspectives.

8
I NTRODUCTION G ENERALE

DECOUVERTE DU VIRUS DE LHEPATITE B

I. Premires observations
Dj plus dun sicle sest coul depuis lide originale propose par Mc Donald en
1908 selon laquelle lhpatite aigu serait une maladie infectieuse transmise par un virus
pathogne (le mot virus signifiant lpoque : agent subcellulaire infectieux pouvant tre filtr)
(McDonald, 1908). Si lon remonte encore un peu plus loin en 1885, Lrman et Jehn taient
respectivement les tmoins dpidmies de jaunisse chez les travailleurs dun chantier naval
et les dtenus dun asile (Jehn, 1885; Lrman, 1885). Ces deux populations ayant rcemment t
immunises contre la variole grce un vaccin consistant en une prparation de lymphe
humaine, Lrman en a dduit quil tait probable que le vaccin soit la cause de la maladie
(Lrman, 1885), observant ainsi pour la premire fois des hpatites sriques , aujourdhui
connues sous le nom dhpatites B et C, dont la nature infectieuse sera postule 23 ans plus tard
par Mc Donald. De nombreux cas similaires ceux observs par Lrman et Jehn jusque dans les
annes 40 ont entrin lhypothse selon laquelle la transmission des hpatites sriques tait
provoque par des aiguilles contamines par du sang, ladministration de vaccins drivs de
tissus humains tels que ceux de la variole ou de la fivre jaune, et enfin ladministration de
produits sanguins tels que linsuline.

II. Dcouverte des hpatites sriques


Durant la seconde guerre mondiale, la propagation des hpatites virales chez un grand
nombre de victimes transfuses a dclench le dveloppement de projets de recherche majeurs
sur la maladie aux Etats-Unis et en Angleterre. Ainsi, les premiers rsultats de ces tudes,
souvent bases sur la transmission dlibre dhpatites infectieuses des sujets volontaires,
apparaissent la fin de la guerre (Havens, 1946; MacCallum FO, 1944; MacCullum, 1947;
Neefe JR, 1945; Paul JR, 1945). Ils permettent pour la premire fois de faire une distinction
claire entre les infections aigus transmises par des aliments souills par le virus, ou hpatites
A , et les hpatites sriques, ou hpatites B , dont le temps dincubation est de plusieurs mois
et qui conduisent parfois la chronicit. Bien que ces rsultats solides concernant ltiologie
virale des hpatites fussent longtemps controverss par la communaut mdicale de lEurope
continentale, de nombreuses recherches visant identifier et isoler le ou les virus responsables
des hpatites virales ont t menes durant les annes 1950 et 1960. Pourtant, cest une tude
ralise par Blumberg et al en 1965 sur un tout autre sujet, savoir ltude du polymorphisme
gntique des protines sriques, qui a permis disoler et dtudier pour la premire fois sans en

9
avoir conscience, le virus de lhpatite B (Blumberg et al, 1965). Cest la technique mise au
point par ces chercheurs qui a conduit lisolement du virus. En recherchant des anticorps
dirigs contre diffrentes formes polymorphiques de protines sriques chez des patients
multi-transfuss, ils ont identifi un anticorps ragissant contre le srum dun australien dont
lantigne cibl fut appel Australia antigen (Au) (connu aujourdhui sous le nom dantigne
de surface du VHB : AgHBs) (Blumberg, 2002; Blumberg et al, 1965). Plusieurs tudes ont
ensuite permis de corrler la prsence de cet antigne avec celle dhpatites et lont identifi
comme un constituant du virus responsable des hpatites sriques B qui sera alors appel virus
de lhpatite B (VHB) partir des annes 70 (Blumberg et al, 1967; Giles et al, 1969; Gocke &
Kavey, 1969; London et al, 1969; Okochi & Murakami, 1968; Prince, 1968). Lanalyse des dons
de sang et lexclusion des lots contamins par lantigne (Au) permettront ds 1969 de rduire de
faon significative le dveloppement dhpatites post-transfusion (Blumberg, 1977; Senior et
al, 1974).

III. Premire observation du virus


En 1970, les premires images de virus issus de srum de patients prsentant une hpatite
virale associe lantigne Australia sont publies par Dane et al (Dane et al, 1970). On y
observe trois types de particules virales : des petites sphres et des btonnets de 20 nm de
diamtre environ, ainsi que des particules plus grosses de 42 nm, connues depuis sous le nom de
particules de Dane, correspondant au virus complet et contenant une capside de 30 nm environ.
Les dcouvertes qui senchainent alors rapidement permettent dtablir la structure des virions et
du gnome viral ; les plus marquantes dentre elles sont rsumes dans le tableau 1 ci-dessous.

Date Nature Auteurs et description de la dcouverte


1971 HBc Almeida et al. dcrivent lantigne de capside quils nomment HBc. Il est issu de particules de
Dane traites par des dtergents (Almeida et al, 1971).
1972 HBe Magnius et Espmark dcouvrent lantigne e (HBe), qui contrairement lantigne HBs est une
protine soluble prsente dans le srum des patients infects par le VHB (Magnius & Espmark,
1972a; Magnius & Espmark, 1972b). La prsence danticorps dirigs contre cet antigne sera
rapidement corrle un bon pronostic concernant lvolution de la maladie.
1972 Sous-types Le Bouvier et al. identifient les dterminant immunogniques a, d et y (Le Bouvier et al, 1972),
alors que Bancroft et al. observent les dterminants w et r (Bancroft et al, 1972). Le premier
systme de classification du virus apparat dj aves les quatre sous types majeurs adw, ayw, adr et
ayr.
1973 ADN Kaplan et al. dmontrent la prsence dune activit ADN polymrase dans les capsides des
polymrase particules de Dane (Kaplan et al, 1973).

10
1974 ADN viral Robinson et al. dcouvrent que les capsides contiennent une petite molcule dADN circulaire
double brin qui constitue le substrat de lADN polymrase (Robinson & Greenman, 1974).
1975 Structure Summers et al. proposent un modle selon lequel, dans les particules virales, environ 20% de la
ADNrc molcule dADN serait sous une forme simple brin (Summers et al, 1975).
1976 Vaccin Philippe Maupas et al. mettent au point chez lhomme le premier vaccin efficace contre le VHB
(Maupas et al, 1976; Maupas et al, 1978).
1976 Interfron Greenberg et al., Desmyter et al. et Purcell et al. prsentent des tudes selon lesquelles un
traitement base dinterfron permettrait de rduire la rplication du VHB chez les porteurs
chroniques (Desmyter et al, 1976; Greenberg et al, 1976; Purcell et al, 1976).
1982 Transcriptase Summers et al. dcouvrent lactivit reverse transcriptase de la polymrase virale (Summers &
inverse Mason, 1982).
1982 Inhibiteur Weller et al. dmontrent leffet inhibiteur de lacyclovir, analogue nuclosidique, sur la rplication
polymrase du VHB chez lhomme (Weller et al, 1982).
1988 Modle Gripon et al. mettent au point le premier modle dinfection in vitro par le VHB (Gripon et al,
dinfection 1993; Gripon et al, 1988).
2002 Ligne Gripon et al. identifient la premire ligne hpatocytaire infectable par le VHB (Gripon et al,
HepaRG 2002).
2005 Inhibiteur Gripon et al. mettent au point un peptide inhibiteur de lentre virale in vitro (Gripon et al, 2005).
dentre
2008 Inhibiteur Peterson et al. dmontrent lefficacit du peptide inhibiteur de lentre virale in vivo (Petersen et
dentre al, 2008).

Tableau 1. Quelques grandes dcouvertes concernant le virus de lhpatite B, de 1971 aujourdhui.

IV. Dcouverte et histoire du vaccin


En 1976, le premier vaccin test chez lhomme efficace contre le virus de lhpatite B est
labor par lquipe franaise de Philippe Maupas, qui a test le vaccin sur lquipe
dhmodialyse du CHU de Tours aprs se ltre eux mme inject (Maupas et al, 1976; Maupas
et al, 1978). Linstitut Pasteur est alors charg de dvelopper le vaccin pour une utilisation
grande chelle et obtient lautorisation de mise sur le march du Hevac B en 1981 (Sebton,
2004). Par la suite, de nombreux vaccins se sont succds, le premier bas sur lutilisation de
protines recombinantes de lenveloppe virale, Engerix B , fut dvelopp par SmithKline
Beecham en 1985 et mis sur le march en 1989, il fut rapidement en comptition avec dautres
vaccins dvelopps par les laboratoires Merck et lInstitut Pasteur (Sebton, 2004).
Lorganisation mondiale de la sant (OMS) a alors lanc, en 1991, une campagne
mondiale dradication de lhpatite B (programme largi de vaccination de 1991) (WHO, 1991;
WHO, 1993). Ainsi, en France, depuis la vague extraordinaire de vaccination du milieu des
annes 90 jusquen 2001, plus de 29 millions de personnes ont t vaccines (AFSSAPS, 2002).
Pourtant, si depuis leur mise en place, les programmes de vaccination dans le monde nont pas
t interrompus compte tenu de la remarquable efficacit du vaccin sur la prvalence de la
11
maladie [A Taiwan par exemple, aprs 20 ans de vaccination, le taux de porteurs chroniques
chez les enfants est pass de 10% en 1984 moins de 1% en 2004 (Chien et al, 2006; Ni et al,
2007); aux Etats Unis, lincidence des hpatites aigus rapportes a chut de 82% entre 1990 et
2007 (Daniels et al, 2009)], la France fait aujourdhui figure dexception puisque que le 1er
octobre 1998, le ministre de la sant Bernard Kouchner, suspendait la vaccination effectue par
les mdecins scolaires dans les collges, en dsaccord avec plusieurs associations de mdecins et
lOMS (Cals, 2001). Cette dcision survenait aprs la publication de deux bulletins dalerte par
lAgence franaise de scurit sanitaire des produits de sant (Afssaps) en mars 1995 concernant
les effets indsirables neurologiques des vaccins anti-hpatite B. Plusieurs tudes de pharmaco
vigilance ont alors t menes, et en 2002, lAfssaps publiait un communiqu de presse dans
lequel elle concluait sur labsence de corrlation dmontre entre la vaccination et le
dveloppement daffections dmylinisantes (AFSSAPS, 2002):
Ainsi, les conclusions de l'valuation par l'Afssaps des donnes, issues de la
notification spontane et des tudes pidmiologiques, ont constamment fait apparatre que les
rsultats ne dmontrent pas l'existence d'un risque de survenue d'affection dmylinisante
associ la vaccination contre l'hpatite B, et qu'ils permettent de conclure l'absence d'un
risque important, sans toutefois permettre d'exclure la possibilit d'un risque faible .
De la mme faon, lOMS, aprs lanalyse de lensemble des tudes ralises sur les
risques potentiels du vaccin na jamais remis en cause la campagne de vaccination entreprise en
1991 (WHO, 2004), et linstitut national de veille sanitaire (INVS) publiait le 20 avril 2009 dans
son bulletin pidmiologique hebdomadaire sa recommandation concernant la vaccination des
nourrissons et des adolescents (INVS, 2009) :
Le Haut conseil de la sant publique et le Comit technique des vaccinations
recommandent que la vaccination contre lhpatite B continue de sappliquer en priorit tous
les nourrissons. Il recommande aussi que le rattrapage de la vaccination contre lhpatite B soit
poursuivi chez les enfants et les adolescents jusqu lge de 15 ans rvolus. Tout enfant ou
adolescent g de moins de 16 ans, non antrieurement vaccin, devrait se voir proposer la
vaccination contre lhpatite B loccasion dune consultation mdicale ou de prvention.
Malgr la prise de dcision claire en faveur du vaccin de tous les organismes de sant
(AFSSAPS, 2002; AFSSAPS et al, 2004; INVS, 2009; WHO, 2008), et une polmique
uniquement en France, le doute subsiste aujourdhui au sein de la population franaise qui refuse
encore souvent la vaccination. Quelles seront les consquences de ces dix annes (1998-
aujourdhui) de faible vaccination du nourrisson sur la prvalence de la maladie en France dans
les prochaines annes ?

12
Pour la prise en charge des malades non vaccins et infects chroniquement par le virus,
les traitements base dinterfron ont t mis en place rapidement. En effet, ds 1976,
Greenberg et al, Desmyter et al et Purcell et al ont prsent des tudes selon lesquelles un
protocole utilisant de linterfron permettrait de rduire la rplication du VHB chez les porteurs
chroniques (Desmyter et al, 1976; Greenberg et al, 1976; Purcell et al, 1976). Cest seulement
quelques annes plus tard que les inhibiteurs de la polymrase virale sont apparus (Hantz et al,
1984; Hirota et al, 1987; Lofgren et al, 1989; Nordenfelt et al, 1987; Tao et al, 1988), aprs la
dcouverte de son activit reverse transcriptase par Summers et al en 1982 (Summers & Mason,
1982). Depuis, ces deux types de traitement sont toujours utiliss, indpendamment lun de
lautre, pour traiter les malades souffrant dhpatites chroniques (EASL, 2009).

V. Dcouvertes rcentes
En 2002, la dcouverte de la premire ligne hpatocytaire infectable par le VHB a
permis de faciliter ltude des dterminants viraux impliqus dans ltape dinfection (Gripon et
al, 2002). En effet, avant la dcouverte de cette ligne, le seul modle dinfection in vitro
disponible, mis au point en 1988 et amlior en 1993, consistait en lutilisation dhpatocytes
humains cultivs en culture primaire auxquels laccs tait souvent difficile (Gripon et al, 1993;
Gripon et al, 1988). Grce ce nouveau modle, en 2005, un travail ralis au sein de notre
laboratoire en collaboration avec Stephan Urban (Universit de Heidelberg en Allemagne) a
permis la dcouverte dun peptide inhibiteur de linfection in vitro correspondant lextrmit
N-terminale de la grande protine de lenveloppe virale (Gripon et al, 2005). En 2008,
lefficacit prometteuse de cet inhibiteur de lentre virale a t dmontre in vivo sur des souris
possdant un foie humanis (Petersen et al, 2008).
En conclusion, il aura fallu attendre plus dune cinquantaine dannes pour que les
premiers cas de jaunisses sriques observs la fin du XIXme sicle soient attribus la
prsence dun agent infectieux transmis par le srum de patients infects (fin de la seconde
guerre mondiale) ; puis, une vingtaine dannes supplmentaires pour que le virus responsable de
la maladie soit observ en 1970, avant dassister lenchainement des dcouvertes qui ont
permis de caractriser la structure et les diffrentes tapes du cycle viral. La forte prvalence de
la maladie dans le monde ainsi que la comprhension incomplte de la pathogense associe au
virus ou de certaines tapes du cycle viral, telles que ltape dentre, expliquent les nombreuses
recherches menes actuellement sur le VHB. En effet, malgr toutes les avances de la
recherche, lexistence dun vaccin efficace et de traitements antiviraux puissants, le nombre de
personnes chroniquement infectes par le VHB dans le monde demeure extrmement lev.

13
Figure 1. Distribution gographique des infections chroniques par le virus de lhpatite B. (source : World
health organisation. Introduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization services, 2001, Geneva,
WHO, WHO/V&B/01.31 ).
CARACTERISTIQUES CLINIQUES DU VHB

I. Prvalence de linfection par le VHB


A. Dans le monde
Lhpatite B est une maladie infectieuse grave, extrmement contagieuse, qui
provoquerait plus de 600 000 dcs par an dans le monde (Goldstein et al, 2005). On estime 2
milliards le nombre de personnes touches par cette maladie, dont plus de 350 millions sont des
porteurs chroniques capables de transmettre le virus pendant des annes (WHO, 2002). Entre 15
et 40 % de ces derniers dveloppent des complications hpatiques de type cirrhose, lsion du foie
et hpatocarcinome (Lavanchy, 2004; Lok, 2002), ce dernier constituant le cinquime cancer le
plus frquent dans le monde (Parkin et al, 2001). Le virus prsent dans de nombreux fluides
corporels tels que le sang, la salive, le sperme et la sueur des individus infects (Lavanchy, 2004;
WHO, 2002; WHO, 2008) est facilement transmis par contact avec ces fluides et est 50 100
fois plus infectieux que le virus de limmunodficience humaine (VIH) (WHO, 2008).
Environ 45% de la population mondiale vit dans des rgions telles que lAsie du sud-est
ou lAfrique sub-Saharienne o le niveau dinfection par le VHB est lev (Fig. 1) (Mahoney,
1999). Dans ces rgions de forte endmie, entre 70 et 90% de la population devient infecte
avant lge de 40 ans et 8 20% des personnes sont des porteurs chroniques du virus (WHO,
2002). La plupart des infections rsultent dune transmission de la mre lenfant au moment de
la naissance ou de contacts rapprochs entre les jeunes enfants (WHO, 2002). Dans les rgions
o le risque dinfection est modr, dans lesquelles on recense entre 2 et 7% de porteurs
chroniques, on recense 43% de la population mondiale. Enfin, les zones de faible endmicit
telles que lEurope occidentale ou les Etats-Unis, o la quantit de porteurs chroniques est
infrieure 2%, abritent 12% de la population mondiale (Mahoney, 1999). Dans ces rgions,
lincidence la plus leve de la maladie est retrouve chez les adolescents et les jeunes adultes.
Malgr le faible nombre de personnes infectes, certains groupes dindividus ayant une activit
sexuelle risque ou tant souvent en contact avec des produits sanguins prsentent un niveau
lev dinfection, compte tenu de limportante contagiosit du VHB dont la quantit de
particules virales est extrmement importante dans les fluides corporels tels que le sang ou le
sperme.

B. En France
Une enqute permettant dvaluer la prvalence de lhpatite B en France mtropolitaine
a t mene en 2004 par lINVS (INVS, 2007). L'enqute incluant 14 416 sujets a permis
destimer que 0,65% de la population, soit environ 280 000 personnes taient infectes

14
Figure 2. Manifestations cliniques dune infection par le VHB (INVS, 2004; Liaw & Chu, 2009).
chroniquement par le VHB et que plus de 3 millions de franais avaient t en contact avec le
virus. Parmi ces personnes, 45% seulement taient conscientes de leur infection. Cette tude a
galement permis de dmontrer que la prvalence de la maladie variait selon l'ge passant de 10-
12% chez les personnes de 45 60 ans 3% chez les personnes de 18 24 ans. Par ailleurs,
certains facteurs souvent lis la classe sociale des individus, tels que l'usage de drogues par
voie injectable ou un niveau d'tude infrieur au baccalaurat, ont t associs avec un risque
dinfection plus lev.

II. Aspects cliniques de linfection par le VHB


A. Transmission
Lhpatite B se transmet par voie parentrale via une exposition percutane ou muqueuse
des fluides biologiques infects tels que le sang ou les scrtions sexuelles. La contagiosit
leve du VHB est lie dune part sa prsence en grande quantit dans la plupart des liquides
biologiques des sujets infects et dautre part la stabilit des particules virales pouvant rester
infectieuses jusqu sept jours dans lenvironnement (WHO, 2008). Dans les rgions de forte
endmie, la transmission s'effectue le plus souvent par voie verticale (de la mre l'enfant, en
Asie principalement) mais aussi de faon horizontale (d'enfant enfant, en Afrique Noire
principalement). La dissmination intrafamiliale du virus est le plus souvent aggrave par les
mauvaises conditions dhygine et la promiscuit importante. Dans les rgions dendmie
intermdiaire, la transmission est surtout horizontale (le grand enfant, l'adolescent et l'adulte
jeune). Enfin, dans les pays occidentaux, linfection virale nest pas endmique et se transmet
principalement par les rapports sexuels et les toxicomanies (INVS, 2007; Liaw & Chu, 2009).

B. Manifestations cliniques
1. Les diffrentes volutions dune infection par le VHB
Les manifestations cliniques de linfection sont trs varies (Fig. 2) [pour revue, consulter
les rfrences (EASL, 2009; Liaw & Chu, 2009)]. Souvent, linfection par le VHB passe
inaperue. En effet, dans les deux tiers des cas, la maladie demeure asymptomatique. Cependant,
aprs une incubation de 45 180 jours, linfection peut se manifester par le dveloppement
dune hpatite aigu dont les principaux symptmes sont la prsence dun ictre, la fatigue, une
perte de lapptit, des douleurs abdominales, des nauses, et des vomissements. Cette hpatite est
caractrise par une ncrose hpatique associe un processus inflammatoire dpendant de
cytokines de limmunit inne et adaptative telles que le TNF, lIFN et lIFN. La lyse des
hpatocytes peut tre mise en vidence par le dosage des transaminases (ASAT, ALAT) dont la
concentration augmente dans le srum des patients. Dans de rares cas, savoir pour environ 1 %

15
des formes aigus, le virus provoque une hpatite fulminante associe un taux de mortalit
lev en absence de transplantation hpatique. Celle-ci rsulte dune rponse immunitaire
excessive qui limine rapidement les virus et les hpatocytes infects conduisant ainsi la
destruction presque totale du parenchyme hpatique.
La gurison de lhpatite B survient chez plus de 90% des patients adultes. Cependant, de
petites quantits dADN viral sont souvent retrouves par PCR dans le srum et dans les
monocytes priphriques des personnes ayant t infectes plusieurs annes aprs leur gurison,
indiquant un tat occulte de linfection (Mulrooney-Cousins & Michalak, 2007). Ainsi, le virus
peut toujours tre transmis via une transplantation dorgane, et une ractivation de linfection
peut apparaitre suite la prise de traitements immunosuppresseurs ou de chimiothrapie. Par
ailleurs, les personnes ayant t en contact avec le virus continuent de produire des anticorps
quelques annes aprs la primo-infection, les protgeant durablement contre un nouveau contact
avec le virus.
Le risque de dvelopper une hpatite chronique est fortement corrl avec lge des
patients au moment de linfection. En effet, celle-ci persiste chez prs de 90% des nourrissons
infects la naissance, chez 20 30% des enfants infects entre 1 et 5 ans, chez 6% de ceux
infects entre 5 et 15 ans et finalement elle ne sinstalle que chez 1 5% des patients infects
lge adulte. Cette volution de la maladie semble imputable la faiblesse du systme
immunitaire chez les jeunes enfants et chez certains adultes. En effet, il a t suppos que la
reconnaissance des hpatocytes infects par des lymphocytes T cytotoxiques spcifiques du virus
constituerait le mcanisme principal de contrle de linfection virale, bien que ce mcanisme soit
galement responsable des dommages hpatiques associs linfection. Chez les individus
chroniquement infects, la rponse immunitaire impliquant les lymphocytes T spcifiques du
virus serait trop faible pour liminer ce dernier mais serait suffisante pour induire une rponse
inflammatoire persistante et inefficace. Etant donn que le VHB nest pas cytopathogne,
except dans certaines formes cliniques telles que les hpatites fibrosantes cholestatiques
survenant chez des patients immunodprims, les diffrences de svrit de lhpatite B sont
attribues des variations individuelles de la rponse immunitaire, les rponses humorales et
cellulaires permettant dliminer les virus circulants et les cellules infectes, respectivement.

2. Les phases de linfection chronique par le VHB


Le dveloppement de la chronicit implique plusieurs phases, pas ncessairement
squentielles, rsultant de linteraction entre le virus, les hpatocytes et la rponse immunitaire
(Fig. 3) [pour revue, consulter les rfrences (EASL, 2009; Liaw & Chu, 2009)]. La premire
phase, dont la dure est dautant plus longue que la contamination se fait tt dans la vie,
correspond une phase de tolrance immune, la seconde, une rponse immunitaire active
16
Figure 3. Schmatisation des vnements associs aux diffrentes phases dune infection chronique par le VHB
acquise pendant lenfance. Lors dune infection lge adulte, la premire phase de tolrance est quasi
inexistante. (Source : revue gnrale parue dans The Lancet en 2009, Hepatitis B virus infection (Liaw &
Chu, 2009)).
contre linfection qui fait chuter la virmie et la troisime, faisant suite une sroconversion
HBe (HBe : antigne viral scrt), une infection rsiduelle faiblement rplicative (charge
virale < 104 copies/mL), au cours de laquelle des ractivations (signant lmergence de virus
mutants AgHBe ngatifs ) peuvent provoquer un retour dans la phase active. Enfin, la perte
de lAgHBs (antigne viral de surface), saccompagne le plus souvent, dun niveau dADN viral
indtectable.
La phase de tolrance, qui concerne gnralement des patients jeunes et
asymptomatiques, est caractrise par la prsence dAgHBe et par une charge virale leve qui
ninduit pas de souffrance hpatique comme en tmoigne un niveau normal des transaminases.
Durant cette phase, la virmie trs leve rend les malades extrmement contagieux.
Durant la phase immunitaire active, toujours caractrise par la prsence dAgHBe, la
charge virale diminue et la progression de la fibrose augmente par rapport la phase prcdente.
Cette phase peut perdurer pendant plusieurs annes durant lesquelles le taux de perte spontane
de lAgHBe est augment. Cest la phase o se constituent les lsions de fibrose et sa dure
conditionne la gravit de la maladie hpatique. De faon importante, il a t dmontr que le
risque de dvelopper une cirrhose et/ou un carcinome hpatocellulaire au cours dune infection
chronique par le VHB tait proportionnel la rplication virale et aux atteintes hpatiques
provoques par le systme immunitaire lors des phases actives de la maladie. En effet, le
processus inflammatoire induit en permanence des cycles de ncrose - rgnration du tissu
hpatique conduisant la cirrhose du foie. Cette dernire se caractrise par une fibrose annulaire
et par lapparition de nodules de rgnration qui augmentent le risque de survenue du cancer du
foie. Toutefois, ce phnomne nest pas responsable lui seul des hpatocarcinomes lis au
VHB (cf. chapitre suivant).
Aprs la phase immunitaire active, survient la phase dite inactive, ou rsiduelle. Elle se
manifeste aprs la sroconversion HBe, qui correspond lapparition danticorps dirigs contre
lAgHBe induisant la disparition de cet antigne. Elle est caractrise par une charge virale
faible, voire indtectable, du fait du contrle immunitaire de linfection.
Une des volutions tardive et frquente de la maladie, surtout dans certaines rgions du
monde telles que lEurope, compte tenu du vieillissement des personnes infectes par le VHB,
correspond lapparition dune hpatite chronique dite ngative pour lAgHBe (75% des
hpatites chroniques actives en France sont AgHBe ngative). Cette dernire est due
lapparition de virus mutants incapables de produire lAgHBe cause de mutations prsentes
dans le promoteur, ou le gne, permettant lexpression de cet antigne. Elle se caractrise par des
pousses de ractivation priodique de la maladie traduites par des niveaux variables dADN
viral et de transaminases hpatiques. Il est important dindividualiser cette forme clinique de la

17
Figure 4. Schma simplifi des volutions possibles dune infection chronique par le VHB. (Source : revue
gnrale parue dans The Lancet en 2009, Hepatitis B virus infection (Liaw & Chu, 2009)).
maladie car elle est associe un trs faible taux de rmission spontane et prolonge (Fig. 4) et
touche souvent des malades au stade de cirrhose. Pour cela, un suivi attentif des patients est
ncessaire au cours duquel la charge virale et le niveau des transaminases doivent tre
rgulirement contrls.
Enfin, la dernire phase de lhpatite chronique correspond la disparition de lAgHBs.
Elle saccompagne le plus souvent de niveaux indtectables dADN viral et de la prsence, ou
non, danticorps dirigs contre lAgHBs. Elle est associe un arrt souvent dfinitif de la
rplication virale. Il ny a donc habituellement plus de risque daggravation de la maladie et le
pronostic dpend du stade de la fibrose lorsque survient cet vnement. La principale
proccupation concernant les patients dans cette phase est la survenue dune ractivation en cas
dimmunosuppression.

3. VHB et carcinome hpatocellulaire


Le carcinome hpatocellulaire (CHC), avec une incidence estime plus de 500 000 cas
en lan 2000, est le cinquime cancer le plus frquent au monde (El-Serag, 2004; Llovet et al,
2003; Parkin et al, 2001; Shibuya et al, 2002). De plus, il constitue la troisime cause de mort par
cancer derrire les cancers du poumon et de lestomac, notamment cause de sa forte rsistance
aux traitements. La distribution gographique variable des CHC a permis didentifier linfection
chronique par le VHB comme la cause majeure de ce cancer (Ahn et al, 2005; Evans et al, 1998;
Montalto et al, 2002; Pollicino et al, 2004). Ainsi il a t estim que plus de 50% des cas
dhpatocarcinome dans le monde pouvait tre associ au VHB (Parkin et al, 2001). Par ailleurs,
les patients porteurs du virus ont 25 37 fois plus de risque de dvelopper un CHC compar aux
personnes non infectes (Hassan et al, 2002; Yang et al, 2002), ce risque tant proportionnel la
charge virale (Iloeje et al, 2006). De nombreuses tudes ayant cherch comprendre la relation
entre linfection par le VHB et le dveloppement de CHC ont permis de mettre en vidence des
liens, directs ou indirects, entre les deux pathologies [pour revue, consulter la rfrence
(Lupberger & Hildt, 2007)].

a. Effet direct de lintgration du gnome viral


Bien que lintgration du gnome viral ne soit pas ncessaire la rplication du VHB,
quasiment tous les cas de CHC associs au virus prsentent une insertion de lADN viral dans un
chromosome cellulaire (Beasley et al, 1981; Brechot et al, 1980; Brechot et al, 2003). Celle-ci se
caractrise dans la plupart des cas par des rarrangements tels que des dltions tant dans le
gnome viral quau niveau du site chromosomique dintgration (Thorgeirsson & Grisham,
2002). Cependant, il semble que linsertion site spcifique du gnome viral dans des oncognes
soit un vnement rare ne pouvant expliquer le lien troit entre la survenue du cancer et

18
linfection bien que quelques exemples aient t documents.

b. Effets indirects de lintgration du gnome viral


- Rle de la protine HBx :
Dans la plupart des gnomes viraux intgrs, le gne de la protine X est conserv et
transcrit (Schluter et al, 1994). La protine X, petite protine rgulatrice conserve parmi les
hepadnavirus (famille de virus laquelle appartient le VHB), a t dcrite comme un activateur
transcriptionnel (Twu & Schloemer, 1987; Wollersheim et al, 1988). Sa localisation subcellulaire
variable, soit au niveau du cytoplasme, soit au niveau du noyau serait associe ses diffrentes
fonctions (Hafner et al, 2003; Sirma et al, 1998). Dans le cytoplasme, elle permettrait la
rgulation dun grand nombre de gnes en interagissant avec des cascades de signalisation, en
amont des complexes de transcription, permettant lactivation de facteurs de transcription tels
que AP-1, NF-B, SP1 et oct-1 (Waris & Siddiqui, 2003; Zhang et al, 2006). Dans le noyau, elle
pourrait interfrer directement avec certains facteurs de transcription ou encore jouer un rle de
facteur de transcription. De plus, il a t dmontr que la protine X perturberait les mcanismes
de rparation de lADN, augmentant ainsi le risque dapparition de mutations impliques dans la
carcinogense. Cependant, lanalyse de la frquence de mutation dans des souris transgniques
exprimant la protine X est en dsaccord avec cette hypothse (Madden et al, 2000). Enfin, des
donnes supportent lhypothse selon laquelle la protine X interagirait directement avec le
suppresseur de tumeur p53 et serait capable dinduire sa rpression transcriptionnelle (Tang et al,
2006). Nanmoins, la pertinence physiologique de ces rsultats doit encore tre dmontre
compte tenu de limportant excs de la protine p53 par rapport la protine X dans les
hpatocytes. Quoiquil en soit, la protine X affecte lexpression dun grand nombre de gnes
cellulaires impliqus dans des mcanismes tels que la prolifration cellulaire et lapoptose,
suggrant fortement son implication dans la carcinogense associe linfection par le VHB
(Chan & Sung, 2006; Cougot et al, 2005; Koike et al, 2002; Staib et al, 2003).
- Rle des protines Pre-S2 activatrices :
Comme pour la protine X, dans la plupart des gnomes viraux intgrs, le cadre de lecture
des protines Pre-S2 activatrices est conserv et transcrit. Ces protines sont produites par des
gnes des protines denveloppe tronqus en 3 (Schluter et al, 1994). Elles correspondent la
protine de surface M (cf. chapitre Lenveloppe virale , page 33) dlte dune partie
C-terminale de plus ou moins grande taille, la plus grande dltion aboutissant la production du
domaine Pre-S2 (N-terminal) uniquement. Ainsi, il existe deux types de protines rgulatrices,
celles insres dans la membrane du rticulum endoplasmique (RE) via les deux premiers
domaines transmembranaires de la rgion S des protines denveloppe (Hildt et al, 1993; Meyer
et al, 1992) et les protines rgulatrices cytoplasmiques qui ont perdu leurs domaines
19
transmembranaires (Hildt et al, 1996b; Lauer et al, 1992). Lanalyse des protines M tronques
membranaires a mis en vidence plusieurs diffrences entre elles et leur quivalent non tronqu
dans lenveloppe virale : (i) elles ne sont pas scrtes et restent associes aux membranes du RE
(Hildt et al, 1993), (ii) elles ne sont pas glycosyles sur le quatrime rsidus du domaine Pre-S2
(Hildt et al, 1993), (iii) leur domaine Pre-S2 est expos du ct cytoplasmique de la membrane
du RE et peut interagir avec des partenaires cytoplasmiques impliqus dans des voies de
signalisation (Hildt et al, 1995). A ce jour, aucune diffrence de fonction entre les formes
membranaires et cytoplasmiques des protines Pre-S2 rgulatrices, na t mise en vidence
(Hildt et al, 1995). La grande protine denveloppe, L, possdant elle aussi un domaine Pre-S2
pouvant tre orient du ct cytoplasmique du RE, appartient galement la famille des
protines Pre-S2 activatrices (Hildt et al, 1996a).
Les protines de cette famille sont capables dinteragir avec la protine kinase C,
phosphorylant le domaine Pre-S2, et dactiver des voies de transduction impliquant les kinases
c-raf-1, MEK et ERK impliques dans le contrle de la prolifration cellulaire (Hildt et al, 2002).
Lactivation de ce type de voie pourrait jouer un rle important dans la carcinogense. En effet,
des souris transgniques exprimant une protine M tronque rgulatrice et dveloppant des
cancers du foie lge de 10 mois environ prsentent une activation permanente des voies de
transduction impliquant les kinases prcdentes. Bien que des tumeurs se dveloppent de la
mme manire dans des souris transgniques exprimant la protine denveloppe L, il semble que
dans ces cas le facteur essentiel impliqu dans la carcinogense rsulte de lactivit
inflammatoire permanente provoque par la surexpression et laccumulation forte de la protine
L dans les hpatocytes (Chisari, 2000; Chisari et al, 1989; Dunsford et al, 1990), alors appels
hpatocytes en verre dpoli ou plus communment en anglais ground glass hepatocytes .
Toutefois, un rle direct dans la carcinogense peut tre attribu aux protines Pre-S2
activatrices via lactivation de voies de transductions impliques dans la prolifration des
hpatocytes.
- Rle de la rponse immunitaire :
Malgr le rle important des protines rgulatrices X ou Pre-S2, il est probable que le
systme immunitaire joue un rle majeur dans le dveloppement des CHC associs au VHB
(Chisari, 2000; Rehermann, 2003; Rehermann & Nascimbeni, 2005). En effet, des tudes ont
montr que linflammation chronique du tissu hpatique provoque par le systme immunitaire
augmentait le risque de cancer en induisant une forte mortalit cellulaire et donc une forte
prolifration des hpatocytes (Chisari, 2000; Chisari et al, 1985; Ferrari et al, 2003; Visvanathan
& Lewin, 2006). Ainsi, la qualit de la rponse immunitaire serait non seulement implique dans
le dveloppement de la chronicit mais serait galement un facteur majeur impliqu dans la

20
carcinogense lors dune hpatite chronique.

III. Traitement de linfection chronique par le VHB


Malgr lexistence dun vaccin efficace, de nombreuses personnes dans le monde nayant
pu tre vaccines ont t infectes chroniquement par le VHB. Diffrents traitements, consistant
schmatiquement en lutilisation dinterfrons ou dinhibiteurs de la polymrase virale, peuvent
tre utiliss pour traiter ces personnes lorsquelles dveloppent une hpatite [pour revue,
consulter les rfrences (EASL, 2009; Lok & McMahon, 2007)].
La premire tape ncessaire la mise en place dun traitement adapt et efficace consiste
vrifier la relation de cause effet entre les symptmes observs dune part et la prsence
dune infection par le VHB dautre part. La recherche de marqueurs viraux, tels que lADN viral,
permet didentifier lagent responsable de lhpatite et ventuellement de dtecter la prsence
dune co-infection par un autre virus tel que le virus de lhpatite C (VHC), le virus de
limmunodficience humaine (VIH) ou le virus de lhpatite delta (VHD). De plus, la mesure du
titre viral est primordiale pour la prise de dcision thrapeutique, et galement pour le suivi de
lvolution de la maladie. La deuxime tape consiste valuer lactivit de la maladie qui se
traduit par une cytolyse (lvation des taux sriques des transaminases ALAT et ASAT), reflet
de lintensit de la ncrose hpatocytaire. La biopsie hpatique permet dvaluer le stade de
fibrose ainsi que le niveau de lactivit ncro inflammatoire. Il y a un grand intrt pour le
dveloppement de techniques non invasives dvaluation de la fibrose telles que llastomtrie
impulsionnelle (Fibroscan) et les tests sriques (Fibromtre ou Fibrotest). Schmatiquement,
la combinaison des donnes prcdentes, savoir (i) le niveau srique dADN viral, (ii) le
niveau srique des transaminases et (iii) le stade de la fibrose ainsi que le grade de lactivit
ncro inflammatoire, permet au clinicien de dcider de la ncessit de la mise en place dun
traitement. Si tel est le cas, ces facteurs ainsi que lge du patient, son tat de sant gnral ou
encore le gnotype par lequel il a t infect orienteront le choix du traitement.
Quel que soit le traitement, le but de la thrapie est damliorer la qualit de vie ainsi que
la survie des personnes infectes en empchant la progression de la maladie. Pour cela, les
mdicaments administrs doivent rduire au maximum le niveau dADN viral afin quil soit
idalement indtectable. En effet, il a t dmontr que la rduction de la charge virale induite
par une thrapie tait associe une rmission de la maladie. De plus, un faible niveau dADN
viral prvient la survenue de rsistances et favorise la sroconversion HBe ainsi que la perte de
lAgHBs, ces deux vnements constituant lobjectif ultime des thrapies.

A. Thrapies base dinterfron


Les interfrons sont des molcules immunomodulatrices dont lefficacit, aprs 4 12

21
mois de traitement, est de 30-40% chez des patients chroniquement infects par un virus sauvage
AgHBe positif. Son efficacit est galement bonne en cas dhpatite virus mutant pr-C
AgHBe ngatif, mais dans ce dernier cas, les rechutes aprs traitement sont frquentes. Le
gnotype du virus influence la rponse aux interfrons. En effet, les patients porteurs du
gnotype A, par rapport au D, ou les patients porteurs du gnotype B, par rapport au C rpondent
mieux au traitement. Ce type de thrapie est indiqu chez les patients, gnralement jeunes,
prsentant une infection du foie compense, un gnotype favorable (A ou B), une virmie faible
et un taux de transaminases lev. Le suivi des patients traits a permis de dmontrer que les
thrapies base dinterfron taient bnfiques long terme en permettant : (i) daugmenter les
taux de sroconversion HBe et HBs, (ii) de diminuer la frquence de survenue de la cirrhose et
du carcinome hpatocellulaire, et (iii) daugmenter la survie des rpondeurs. Un avantage
important de ce type de thrapie consiste en la dure dfinie du traitement et en labsence de
rsistance. Cependant, de nombreux effets secondaires peuvent tre observs tels quun
syndrome pseudo grippal, de la fatigue, un syndrome dpressif, une anorexie, une perte de poids,
une thyrodite et un retentissement hmatologique (leucopnie ou thrombopnie) pouvant
conduire larrt du traitement ou une diminution des doses. La tolrance en est difficile en cas
de cirrhose dcompense qui constitue une contre indication son emploi.

B. Inhibiteurs de la polymrase virale


Ces antiviraux, savoir la lamivudine, ladefovir, lentecavir, la telbivudine et le tenofovir,
cits par ordre de leur apparition sur le march pour traiter le VHB, correspondent des
analogues de nuclotides ou de nuclosides ayant une grande affinit pour la polymrase virale.
Leur action inhibitrice passe par leur incorporation dans la molcule dADN viral afin de bloquer
son longation. Ils ont lavantage dtre rapidement efficaces pour inhiber la rplication virale,
dtre bien tolrs et peuvent tre administrs par voie orale. Ils sont donc prfrs chez les
patients prsentant une dcompensation hpatique et devant tre traits efficacement le plus
rapidement possible. Lassociation de linterfron la lamivudine naugmente pas lefficacit du
traitement. Lassociation aux autres antiviraux reste une voie thrapeutique valuer. Il ny a pas
de corrlation entre la puissance du traitement (contrle de la charge virale B) et la survenue de
sroconversion HBe (15-20% des cas) qui, seule, permet desprer une efficacit durable
larrt du traitement. Il sagit donc le plus souvent de traitements au long cours avec le risque
dmergence de mutations de rsistance dans le gne de la polymrase conduisant un
chappement thrapeutique (remonte de la charge virale de plus de 1 log sous traitement).
Cependant, les nouvelles molcules, telles que lentecavir et le tenofovir, ont un bon profil de
rsistance avec un recul de 2 ans. De plus, il est possible de combiner les antiviraux ne

22
prsentant pas de rsistances croises, pour bloquer la rplication des virus rsistants.

23
B IOLOGIE DU VHB

VIRUS APPARENTES ET SATELLITES

I. Famille des hepadnaviridae


Le virus de lhpatite B appartient une famille de virus nomme hepadnaviridae, pour
virus hpatotropes ADN. Ces virus apparents infectent les oiseaux (genre des
avihepadnavirus) et les mammifres (genre des orthohepadnavirus). Aprs le clonage et le
squenage du gnome du VHB (Galibert et al, 1979), le premier hepadnavirus non humain a t
mis en vidence chez les marmottes (WHV pour Woodchuck Hepatitis Virus) (Summers et al,
1978). Il a t dcouvert dans le srum danimaux levs en captivit, souffrant dhpatite
chronique et pouvant dvelopper des carcinomes hpatocellulaires. Ultrieurement, toute une
srie de virus homologues, prsente dans le tableau 2 a t dcouverte. Les virus isols chez les
primates tant regroups proximit des diffrents gnotypes du virus humain sur les arbres
phylogntiques (Fig. 5), la nomenclature HBVcpz, HBVgbn et HBVoru, du mme type que
celle utilise pour les virus apparents au VIH (virus de limmunodficience humaine) a t
utilise (Schaefer, 2007).

VIRUS ABREVIATION HOTE REFERENCE


ORTHOHEPADNAVIRUS
Hepatitis B Virus HBV Homme (Dane et al, 1970)
Chimpanzee Hepatitis B Virus HBVcpz Chimpanz (Vaudin et al, 1988)
Gibbon Hepatitis B Virus HBVgbn Gibbon mains blanches (Norder et al, 1996)
Orangutan Hepatitis B Virus HBVoru Orang-outan (Warren et al, 1999)
Gorilla Hepatitis B Virus HBVcpz Gorille (Grethe et al, 2000)
Wooly Monkey Hepatitis B Virus WMHBV Singe laineux (Lanford et al, 1998)
Woodchuck Hepatitis Virus WHV Marmotte (Summers et al, 1978)
Ground Squirrel Hepatitis Virus GSHV Ecureuil terrestre (Marion et al, 1980)
Arctic Squirrel Hepatitis Virus ASHV Ecureuil terrestre arctique (Testut et al, 1996)
AVIHEPADNAVIRUS
Duck Hepatitis B Virus DHBV Canard domestique (Mason et al, 1980)
Grey Teal Hepatitis B Virus GTHBV Sarcelle australienne (Li et al, 1998)
Heron Hepatitis B Virus HHBV Hron (Sprengel et al, 1988)
Maned Duck Hepatitis B Virus MDHBV Canard crinire (Li et al, 1998)
Ross Goose Hepatitis Virus RGHV Oie de Ross (Naumann et al, 1993)
Snow Goose Hepatitis B Virus SGHBV Oie des neiges (Chang et al, 1999)
Cigogne blanche
Stork Hepatitis B Virus STHBV (Pult et al, 1998)
Grue demoiselle
Crane Hepatitis B Virus CHBV Grue royale (Prassolov et al, 2003)
Tableau 2. La famille des hepadnaviridae et ses htes (Schaefer, 2007). Les gnomes des virus infectant
le chimpanz et le gorille diffrant de moins de 5% lun de lautre, on parle dun seul gnotype, HBVcpz.

24
A. Caractristiques communes des hepadnavirus
Les virus appartenant la famille des hepadnaviridae possdent de nombreux points
communs tels que :
(i) lultrastructure des particules virales : linformation gntique est encapside et enveloppe ;
des particules subvirales, correspondant des enveloppes vides, sont produites en grande
quantit ;
(ii) le gnome est constitu dune molcule dADN relaxe circulaire partiellement double brin
dont la taille et lorganisation gntique sont peu variables ;
(iii) le mode de rplication implique une tape de transcription inverse ;
(iv) leur spcificit despce est trs troite, par exemple, le VHB ninfecte que lhomme et les
primates, et le DHBV ninfecte pas les oies.
(v) le tropisme des virus est essentiellement hpatocellulaire.
Les hepadnavirus sont considrs comme des virus hpatotropiques bien que de lADN
viral soit aussi retrouv dans plusieurs tissus (Coffin & Michalak, 1999; Korba et al, 1990;
Korba et al, 1988a; Korba et al, 1989a; Korba et al, 1989b; Korba et al, 1988b; Korba et al,
1987; Korba et al, 1986; Lew & Michalak, 2001; Michalak et al, 2004; Michalak et al, 1999;
Mulrooney & Michalak, 2003). Les cibles extrahpatiques sont observes aussi bien pour les
virus aviaires que pour le WHV et le VHB. Bien que ces donnes soient controverses (Kock et
al, 1996b), il a t suggr que le DHBV se rpliquerait dans le tissu pancratique des canards
infects, et que le VHB et le WHV seraient capables dinfecter des cellules du systme
lymphatique. Le rle prcis des infections extrahpatiques na pas encore t lucid, mais elles
constitueraient sans doute un "rservoir" pour le virus, ce qui expliquerait par exemple la
rinfection frquente du foie aprs une greffe.

B. Caractristiques divergentes des hepadnavirus


1. Le groupe des avihepadnavirus
En dpit de leurs ressemblances, les hepadnaviridae sont diffrents sur quelques points.
Les virus aviaires sont les plus divergents par rapport aux autres membres de la famille. Leurs
gnomes sont lgrement plus courts que ceux des virus de mammifres et ils prsentent une
faible homologie de squence avec ces derniers (Mandart et al, 1984; Sprengel et al, 1985). Leur
organisation gntique est galement modifie puisquils ne codent que pour 2 protines
denveloppe (L et S) et ne comportent pas de gne X individualis.
Globalement, les avihepadnavirus ne possdent que 40% dhomologie de squence
avec le VHB (Schaefer, 2007). Cependant, le VHB et le DHBV, prototype des avihepadnavirus,
partagent de nombreuses caractristiques fondamentales. Les homologies entre les deux virus et

25
Figure 5. Arbre phylogntique des orthohepadnavirus.
Lalignement est ralis avec clustal w entre les gnomes
complets des gnotypes du VHB : A (X02763), B (D00330), C
(M12906), D (V01460), E (X75657), F (X69798), G (AF160501),
H (AY090454), VHBcpz (D00220), VHBoru (NC002168) et
VHBgbn (U46935) et les gnomes du WMHBV (AF046996), du
WHV (J02442), du GSHV (K02715) et du ASHV (nc_001719).
Source : (Schaefer, 2007).
la disponibilit, pour le DHBV, dun modle dinfection trs efficace avec prs de 100% des
hpatocytes primaires de canard infectables in vitro, a rapidement conduit lutilisation du
DHBV comme modle de substitution pour ltude de la biologie du VHB [pour revue, consulter
les rfrences (Funk et al, 2007; Glebe, 2007; Glebe & Urban, 2007)]. Nanmoins, les
diffrences observes entre les deux virus, rsumes dans le tableau 3, doivent tre prises en
considration lorsque lon compare des donnes obtenues dans ces deux modles.

DIFFERENCES OBSERVEES DHBV HBV


Transmission du virus Principalement verticale Verticale et horizontale
Dveloppement dhpatite NON, ou trs faible OUI. Aigu ou chronique
Induction de CHC NON OUI
Protines denveloppe L et S : non glycosyles L, M et S : glycosyles
L : phosphoryle Pas de phosphorylation
Protine X ORF cryptique X-like Plusieurs rles identifis dans le cycle
Diamtre des virus Virus complets : 55-60 nm Virus complets : 45 nm
Particules subvirales : 55-60 nm Particules subvirales : 22 nm
Ponts disulfures de lenveloppe Peu nombreux. Virus solubiliss Nombreux. Virus rsistants aux dtergents.
par des dtergents.
Modle dinfection 100% des hpatocytes en culture Niveau dinfection trs faible des
primaire peuvent tre infects. hpatocytes en culture primaire.
Rcepteur Carboxypeptidase D (CPD) La CPD nest pas ncessaire linfection
Motif de translocation (TLM) du Ncessaire linfectivit Pas impliqu dans ltape dinfection
domaine Pre-S
Translocation du domaine Pre-S Dpendante du TM1 et du TM2 Dpendante du TM2 de la protine L
Entre virale Bloque par la bafilomycine Augmente par la bafilomycine
Tableau 3. Principales diffrences observes entre les modles du VHB et du DHBV (Glebe, 2007;
Glebe & Urban, 2007).

2. Le groupe des orthohepadnavirus


A la diffrence des avihepadnavirus, les virus infectant les mammifres tels que le WHV
ou le GSHV, ne diffrent que de 17% du VHB, et ceux infectant les primates, trs proches du
virus humain, sont apparents des gnotypes du VHB (Fig. 5) (Schaefer, 2007). Compte tenu
de certaines limites inhrentes aux diffrences entre le DHBV et le VHB, le WHV, dont le mode
de transmission est trs similaire celui du VHB, est un modle de choix pour tudier la
pathogense associe linfection par le virus humain. Cependant, il existe une diffrence
importante entre le VHB et le WHV concernant lvolution de la maladie puisque prs de 100%
des animaux chroniquement infects par le WHV dveloppent un CHC ainsi que 20% de ceux
ayant guri dune hpatite aigu. Ceci est en troite corrlation avec le fait que le WHV semble
tre le seul virus possder un site prfrentiel dintgration dans lADN de la cellule hte
(Fourel et al, 1994; Fourel et al, 1990; Hsu et al, 1988; Wei et al, 1992). Nanmoins, le WHV est
un excellent modle pour ltude prclinique de nouvelles molcules antivirales ainsi que pour
lanalyse de la rponse immunitaire associe linfection [pour revue, consulter les rfrences
(Glebe, 2007; Menne & Cote, 2007)].

26
Figure 6. Rpartition gographique des gnotypes du VHB (Schaefer, 2007).
C. Les gnotypes du VHB
Le VHB peut tre classifi en 8 gnotypes (A-H), diffrents de 8% au moins et identifis
grce lanalyse de la squence des gnomes complets, et en 24 sous-gnotypes, diffrents de
4% au moins et identifis par des analyses phylogntiques [pour revue, consulter les rfrences
(Schaefer, 2005; Schaefer, 2007)]. Bien avant la classification en gnotypes, trs rapidement
aprs la dcouverte du virus, diffrents sous types du virus ont t identifis dans le srum des
patients, permettant le classement des virus en quatre srotypes. Sur tous les virus, le
dterminant antignique a est prsent au niveau de la boucle antignique entre les acides amins
124 et 147 de la petite protine de surface (S). Quant la diffrence entre les dterminants
exclusifs d/y et w/r, elle rsulte respectivement de la substitution dune lysine (K) en une
arginine (R) la position 122 ou 160. Ainsi quatre srotypes, adr, adw, ayw et ayr, toujours
utiliss aujourdhui, correspondent la combinaison des diffrents dterminants antigniques. La
dcouverte de dterminants additionnels a permis lidentification de quatre sous types diffrents
pour ayw (ayw1, ayw2, ayw3 et ayw4) et de deux pour adw (adw2 et adw4). La correspondance
entre les gnotypes et les srotypes ainsi que leurs diffrences gnomiques est indique dans le
tableau 4.

GENOTYPES / SEROTYPES

Gnotype Srotype prdominant Diffrences dans les ORF Longueur du gnome


(pb)
A Adw2 (ayw1) Insertion des acides amins 153 et 154 dans 3221
lantigne de capside (HBc).
B Adw2 (ayw1) 3215
C Adr et ayr 3215
D Ayw1, 2 et 3 Dltion des acides amins 1 11 du domaine 3182
Pre-S1.
E Ayw4 (adw 2) Dltion de lacide amin 11 du domaine Pre-S1. 3212
F Adw4 3215
G Adw2 Insertion de 12 acides amins dans lantigne 3248
HBc.
Dltion de lacide amin 11 du domaine Pre-S1.
H Adw4 3215
Tableau 4. Correspondances entre les gnotypes et les srotypes du VHB et prsentation des diffrences
gntiques principales entre les gnotypes (Schaefer, 2005; Schaefer, 2007). Les sous-types entre
parenthses sont rarement observs dans le gnotype correspondant (Kidd-Ljunggren et al, 2002). La
taille de rfrence du gnome du VHB est de 3215 nt.

Une des principales causes de linfection par le virus de lhpatite B avant la mise en
place de la vaccination consistait en la contamination prinatale des nourrissons. Ceci a conduit
regrouper les diffrents gnotypes dans diverses rgions du monde (Fig. 6) bien que des
migrations longues distances aient contribu casser ce type de rpartition gographique. Par
exemple, dans un pays comme les Etats Unis, dont la population est issue du mlange de

27
diffrents groupes ethniques, les huit gnotypes peuvent tre retrouvs, alors quen Europe,
uniquement deux gnotypes majoritaires (A et D) sont prsents.
La recombinaison entre diffrents gnotypes suite des infections multiples est
frquente. En moyenne, selon les tudes, on recenserait environ 12% de doubles infections et
0,9% de triples. Une double infection signifie quune personne a t contamine par deux
souches ou plus, soit simultanment par un porteur doublement infect, soit par plusieurs
porteurs. On parle de co-infection si toutes les souches de virus ont t acquises avant
lapparition dune sroconversion et de super-infection / r-infection lorsque le second virus est
acquis aprs une sroconversion. Parfois, les doubles infections conduisent lapparition
squentielle de diffrentes souches virales suite une rponse immunitaire spcifique ou un
effet variable des traitements contre les diffrents gnotypes du virus. Par exemple, il a t dcrit
quun traitement base dinterfron chez des patients majoritairement porteurs de virus de
gnotype A, pouvait provoquer un basculement vers le gnotype D chez ces malades (Gerner et
al, 1998; Hannoun et al, 2002). Si la co-infection peut conduire un change de matriel
gntique direct entre plusieurs gnotypes, le mcanisme de recombinaison est encore inconnu
(Schaefer, 2007). Cependant, de nombreux gnotypes hybrides ont t observs dans certaines
rgions du monde : A/C au Vietnam, C/D au Tibet, A/D en Afrique ou B/C en Asie. Des
recherches supplmentaires sont donc ncessaires afin de dterminer si les changes entre
gnotypes sont la consquence dune recombinaison gntique directe entre deux souches virales
ou si elles sont la consquence dune adaptation rapide du VHB un environnement gntique et
immunologique particulier associ certaines populations humaines (Schaefer, 2007). En effet,
limportante capacit de rplication du VHB qui permet la production de 3x1012 particules
virales par jour (Nowak et al, 1996) et le nombre derreurs lev engendr par la polymrase
virale, conduisent la production de gnomes viraux dont chaque nuclotide est substitu chaque
jour (Schaefer, 2007).
Dun point de vue clinique, il semblerait que la nature du gnotype puisse influencer la
svrit de la maladie. Une tude ancienne sur des chimpanzs visant tudier les diffrences
entre les gnotypes A, C et D, a en effet montr que des singes infects par les gnotypes A ou C
dveloppaient des hpatites aigus dans 33% des cas alors que 87% dentre eux en dveloppaient
lorsquils taient infects par le gnotype D (Tabor et al, 1983). Plus tard, il a t dcrit par de
nombreuses quipes que le gnotype C provoquerait des dommages hpatiques plus svres que
le gnotype B (Kao et al, 2000; Shiina et al, 1991a; Shiina et al, 1991b; Tsubota et al, 2001),
bien quil semblerait qu long terme, le risque de dvelopper ces pathologies soit similaire
(Sumi et al, 2003; Yuen et al, 2003). En ce qui concerne les gnotypes A et D, linfection par le
gnotype D serait associe des maladies plus svres ainsi quau dveloppement de CHC chez

28
de jeunes patients (Thakur et al, 2002). Globalement, puisque la majorit des tudes proviennent
dAsie du sud-est, les principales donnes concernent les gnotypes B et C. Il existe peu
dinformations sur les gnotypes actifs en Europe, en Amrique ou en Afrique. Des tudes
supplmentaires doivent donc tre ralises afin de caractriser les diffrences entre les huit
gnotypes (Schaefer, 2007). Dautre part, linduction de la chronicit serait variable selon le
gnotype, le A induirait plus de chronicit que les gnotypes B et C, alors que le gnotype D
serait associ de nombreuses hpatites aigus. Enfin, leffet des diffrents gnotypes sur
lefficacit de la vaccination et des traitements a t tudi. Si des expriences sur des singes
vaccins avec un gnotype et infects avec dautres gnotypes ont montr que ces derniers
taient protgs contre linfection, il est recommand de vacciner avec le gnotype prsent dans
rgion gographique. En effet, les premiers cas dchappement aprs la vaccination ont t
dcrits dans des rgions vaccines avec un gnotype A alors que le gnotype D tait
prdominant. Concernant une rponse gnotype dpendante aux traitements, peu de donnes sont
disponibles. Cependant, il a notamment t dmontr que le gnotype B rpondait mieux aux
interfrons que le gnotype C, et que sous lamivudine, le risque de dvelopper des rsistances
court terme tait plus lev avec le gnotype A quavec le gnotype D (Schaefer, 2007).

II. Virus satellite


Le virus de lhpatite D (VHD) nappartient pas la famille des hepadnaviridae, mais est
un virus satellite capable de se rpliquer uniquement en prsence du VHB auquel il emprunte les
protines denveloppe (Bonino et al, 1986; Bonino et al, 1984). Pour le moment, le VHD est le
seul agent sous viral connu infectant le rgne animal. Il a t class dans un nouveau genre de
virus, le genre delta virus. Plusieurs aspects lapparentent aux virodes des plantes, dont le
gnome est un ARN monocatnaire circulaire qui se rplique en cercle roulant dans le noyau de
la cellule infecte [pour revue, consulter les rfrences (Poisson et al, 1995; Rizzetto, 2009)].
Etant donn que les enveloppes du VHD et du VHB sont constitues des mmes
composants, il est probable que ces deux virus partagent certains points communs lors des
premires interactions avec la cellule cible. Par exemple, il a rcemment t dmontr que les 75
premiers acides amins de la grande protine de surface (L) taient ncessaires linfection du
VHD comme celle du VHB (Blanchet & Sureau, 2007), tout comme le dterminant de
linfectivit prsent dans la boucle antignique des protines denveloppe (Abou-Jaoude &
Sureau, 2007; Jaoude & Sureau, 2005; Salisse & Sureau, 2009).

29
Figure 7. A : Photo de microscopie lectronique montrant les diffrentes formes de particules virales
retrouves dans le srum des patients infects par le VHB. B : Photo de microscopie lectronique montrant
des particules virales compltes renfermant une nuclocapside. Source : Universit de Cape Town, Afrique
du Sud, http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html.

Figure 8. Schmatisation des particules subvirales (Gerlich et al, 1993). Les trois protines denveloppe sont
reprsentes : S pour la petite protine, M pour la protine moyenne, et L pour la grande protine. La taille des
particules sphriques, selon une tude de cryo-microscopie lectronique ralise en 2005, est de 20-23 nm.
CARACTERISTIQUES STRUCTURALES

I. Structure des particules virales compltes et des particules


subvirales
Lobservation du srum dun malade atteint dune hpatite virale B par microscopie
lectronique rvle la prsence de 3 types de particules virales morphologiquement diffrentes
(Fig. 7A). On distingue des particules virales compltes, dun diamtre de 42 nanomtres (nm)
(Fig. 7B) connues sous le nom de particules de Dane (Dane et al, 1970), et des particules dites
subvirales, trs excessivement reprsentes, de 20 nm de diamtre et de forme sphrique ou
filamenteuse. Les formes allonges, moins reprsentes, peuvent atteindre une longueur de
plusieurs centaines de nanomtres. Les formes sphriques, plus abondantes, peuvent atteindre le
nombre de 1013 copies/ml dans le sang dun malade, alors que les virus complets ny sont
prsents quau nombre de 104 109 copies/ml.

A. Particules subvirales
Les particules subvirales dont le titre dans le srum des patients peut atteindre un niveau
10 000 fois suprieur celui des virus complets (Bruss, 2007) sont des enveloppes
lipoprotiques vides constitues de lipides dorigine cellulaire et dantignes viraux de surface
(AgHBs) (Fig. 8) (Gerlich et al, 1993). Ces derniers correspondent trois glycoprotines
prsentes la surface des particules virales. On distingue la petite protine (S pour Small, aussi
appele protine majeure), la protine moyenne (M pour Medium) et enfin la grande protine (L
pour Large) (Heermann et al, 1984; Stibbe & Gerlich, 1983). Elles partagent toutes les trois, du
ct C-terminal, une squence commune en acides amins (AA) correspondant la petite
protine.
Les particules sphriques sont principalement composes de protines S avec quelques
protines M. La protine L nest prsente que dans les virions et les particules subvirales
filamenteuses (Heermann et al, 1984).
Lanalyse de la composition biochimique des particules subvirales a dmontr quelles
taient composes principalement de protines puisque les lipides ne constituent que 25% de leur
masse (Gavilanes et al, 1982). Ainsi le ratio lipides/protines de lenveloppe des particules est
trs faible (0,3 environ) compar celui dune membrane cellulaire classique qui est en moyenne
de 1. La nature des lipides qui composent lenveloppe virale est la suivante (Gavilanes et al,
1982):
67% de phospholipides,
15% de cholestrol,

30
Figure 9 : Reconstruction 3D de particules subvirales
issues de srum de souris transgniques exprimant la
protine S. La rsolution est de 12 . La barre dchelle
correspond 100 . La figure en bas gauche de chaque
structure reprsente la symtrie octadrique des particules
et montre leur orientation. (A) : Petite particule (20 nm).
(B) : Grande particule (23 nm). Source : (Gilbert et al,
2005).
14% desters de cholestrol,
3% de triglycrides.
En 2005, la structure tridimensionnelle de particules subvirales issues de srum de souris
transgniques exprimant la protine S du VHB a t dtermine par cryo-microscopie
lectronique (Gilbert et al, 2005). Cette tude a mis en vidence deux tailles de particules
subvirales diffrentes (Fig. 9) en accord avec une tude antrieure (Yamaguchi et al, 1998) qui
avait dmontr que selon la source (levure ou srum de patients) et la prparation des
chantillons, deux tailles de particules pouvaient tre retrouves, que leur forme tait ovode,
quelles taient vides et que leur surface tait interrompue par des pores.
Compte tenu de la similarit de structure entre les particules de taille diffrente, de leur
symtrie octadrique commune, de leur masse identique, et de la position de leurs axes ou
centres de symtrie, les auteurs ont formul une hypothse selon laquelle les deux types de
particules seraient forms partir dun nombre identique de sous-units protiques organises de
faon diffrente. Ces sous-units correspondent des dimres dantigne HBs capables de sauto
assembler en interagissant les uns avec les autres. Le nombre total de protines S par particule
est estime 48. Selon le type dinteraction entre les dimres, et donc selon la conformation des
protines S au moment de lassemblage des particules, la structure finale obtenue serait
diffrente, aboutissant des particules plus ou moins grande (Gilbert et al, 2005).
Lanalyse de la densit aux lectrons des particules a montr quelles ne contenaient pas de
rgion dont la densit tait caractristique dune bicouche lipidique. Ces rsultats sont en accord
avec un modle (Satoh et al, 2000) selon lequel les lipides des particules subvirales ne seraient
pas organiss en une bicouche lipidique classique, mais seraient figs de faon inhabituelle la
surface des particules par leur contact trs troit avec les protines.
Contrairement aux virions, les particules subvirales sont dpourvues de nuclocapside et
dADN viral, ce qui ne leur confre aucune capacit dinfection. Il a t suggr que ces
particules dfectives pourraient permettre aux virus dchapper au systme immunitaire en
saturant les anticorps neutralisants (Ganem, 1991; Seeger et al, 2007). Il a galement t propos
que ces particules contribueraient linstallation dune tolrance immunitaire vis vis du VHB
et permettraient ainsi le dveloppement dune infection chronique (Gerlich & Kann, 2005).
Mme si ces hypothses nont pas t vrifies exprimentalement, elles restent plausibles,
dautant plus quaucun rle na t attribu aux particules subvirales au cours du cycle viral
(Chai et al, 2008). En effet, la production de ces particules incompltes en une aussi grande
quantit laissait suspecter un rle au cours du cycle de multiplication du virus. Toutefois, seul un
rle au cours de ltape dinfection du DHBV a t mis en vidence. En faible quantit, les
particules subvirales du DHBV peuvent amplifier linfection en favorisant la rplication virale et

31
Figure 10. Schmatisation dune particule virale complte (Gerlich et al, 1993). Les trois protines denveloppe
sont reprsentes : S pour la petite protine, M pour la protine moyenne, et L pour la grande protine. La taille
des virions, selon une tude de cryo-microscopie lectronique ralise en 2007, est de 45 nm (Seitz et al, 2007).
lexpression de gnes viraux, alors quen quantit importante elles sont inhibitrices (Bruns et al,
1998). De plus, toujours pour le DHBV, il a t montr que seules des particules contenant la
grande protine pouvaient bloquer linfection (Klingmuller & Schaller, 1993), ceci tant en
accord avec le rle majeur de cette protine lors de linfection (Glebe & Urban, 2007). Il est
noter que ces rsultats sont en contradiction avec une tude rcente montrant que les particules
subvirales du VHB ninhibent pas le processus dinfection (Chai et al, 2008).

B. Particules virales compltes


1. Structure gnrale
Les particules compltes infectieuses (Fig. 7B et 10), ou particules de Dane (Dane et al,
1970), possdent une enveloppe lipoprotique dont lexacte composition en lipide est inconnue
puisquelle na t estime qu partir de celle des particules subvirales (Gavilanes et al, 1982).
Cependant, une tude rcente a dmontr que la prsence de cholestrol dans cette enveloppe
tait indispensable au processus dinfection, aprs ltape dabsorption des virus la surface des
cellules (Bremer et al, 2009). Leur enveloppe est enrichie en protines L comme celle des
particules filamenteuses, en contraste avec la composition de lenveloppe des particules
subvirales sphriques essentiellement constitue de protines S et de quelques protines M
(Heermann et al, 1984). Enfin, de la mme faon que dans les particules subvirales, les protines
de lenveloppe sont troitement associes les unes avec les autres via la mise en place de ponts
disulfures intra- et interchanes (Mangold et al, 1995; Wounderlich & Bruss, 1996).
Au cur de chaque virion, protge par lenveloppe virale, on retrouve une
nuclocapside denviron 30 nm de diamtre, compose dAgHBc, qui adopte une symtrie
icosadrique (Crowther et al, 1994; Wingfield et al, 1995) (Fig. 10). Aprs un traitement des
virus par un dtergent non ionique, cette nuclocapside devient accessible aux anticorps
anti-HBc bien quelle reste associe lenveloppe virale comme en tmoigne son immuno-
prcipitation par des anticorps anti-HBs. Pour librer compltement les nuclocapsides de leur
enveloppe, lutilisation additionnelle dun agent rducteur est ncessaire (Bruss & Ganem,
1991b) probablement pour rduire les ponts disulfures reliant les protines denveloppe entre
elles. En effet, ltude de la structure des virions par cryo-microscopie lectronique nayant pas
rvl de liaisons covalentes entre lenveloppe virale et la nuclocapside (Dryden et al, 2006;
Seitz et al, 2007), il est probable que les ponts disulfures entre les protines S, M et L permettent
llaboration dun rseau protique emprisonnant la capside et dont la rduction permettrait sa
libration.
Enfin, lintrieur de la nuclocapside, on retrouve non seulement le gnome viral
associ la polymrase virale (Bartenschlager & Schaller, 1992; Hirsch et al, 1990; Lott et al,

32
Figure 11. Reprsentation schmatique de la structure et des modifications post-traductionnelles des protines
de surface du VHB. Les diffrentes formes non glycosyles (p), monoglycosyles (gp), ou diglycosyles (ggp)
des protines S, M et L sont indiques droite de la figure. Les sites de N- (N-gly) et O-glycosylations (O-gly),
ainsi que leurs positions sur les acides amins des domaines S et Pre-S2 sont indiqus. AA: acide amin.

Figure 12. Topologie prdite des protines denveloppe du VHB. Topologie des protines S (A), M (B) et L
(C). Les cercles vides correspondent au site de N-glycosylation sur lasparagine 146 utilis dans 50% des
protines. Le cercle plein reprsente la N-glycosylation sur lasparagine 4 du domaine pre-S2 et le carr plein la
O-glycosylation sur sa thronine 37. Les petits traits correspondent aux cystines de la boucle antignique
engages dans des ponts disulfures (verts) et de la boucle cytoplasmique I libres (jaunes). Les astrisques
indiquent la position des sites potentiels de glycosylation du domaine Pre-S de la protine L. Les chiffres
indiquent la position des domaines Pre-S dans les protines L et M, et la position des domaines
transmembranaires dans la protine S, sachant que seule la position du domaine TM2 est clairement dfinie. Les
deux cylindres gris reprsentent les signaux topogniques I et II, correspondant globalement aux domaines TM1
et TM2.
2000; Lott et al, 2003) mais aussi des protines dorigine cellulaire telles que des protines
chaperon (Beck & Nassal, 2003; Hu et al, 2004; Hu & Seeger, 1996; Hu et al, 1997; Wang et al,
2002) et une srine/thronine kinase phosphorylant la protine HBc (Albin & Robinson, 1980;
Daub et al, 2002; Enomoto et al, 2006; Kann & Gerlich, 1994; Kau & Ting, 1998).

2. Lenveloppe virale
a. Caractristiques gnrales des protines S, M et L
Lenveloppe lipoprotique du virus de lhpatite B contient trois protines issues de la
traduction dun seul cadre de lecture possdant trois codons dinitiation diffrents et un seul
codon stop. Ainsi, les squences peptidiques de la petite protine denveloppe (S, 226 acides
amins et 24 kDa), de la protine moyenne (M, 281 acides amins et 30kDa) et de la grande
protine (L, 389 acides amins et 39 kDa pour le sous-type ayw) sont identiques dans leur
portion C-terminale (Fig. 11) (Heermann et al, 1984). La rgion C-terminale commune aux trois
protines de lenveloppe est appele domaine S, celle commune aux protines M et L correspond
au domaine Pre-S2 et celle spcifique la grande protine est la rgion Pre-S1. Dans le cas du
DHBV, seules deux protines majeures, S et L, sont dtectes. Elles possdent, comme pour le
VHB, une extrmit C-terminale commune (domaine S), alors que la protine L est prolonge
par la rgion Pre-S son extrmit N-terminale.
Lors de leur traduction, les protines de surface sont insres dans la membrane du
rticulum endoplasmique rugueux (RE) grce deux signaux topogniques (I et II), prsents
dans leur domaine S, qui dterminent lorientation des protines dans la membrane (Fig. 12)
(Bruss & Ganem, 1991a; Eble et al, 1986; Eble et al, 1987; Simon et al, 1988). Le modle actuel
concernant la topologie transmembranaire de la protine S consiste en lexposition luminale de
ses extrmits N- et C-terminales (ie. lextrieur des virions) (Bruss, 2007; Eble et al, 1986;
Eble et al, 1987; Stirk et al, 1992) (Fig. 12). La protine doit donc traverser au moins deux fois la
bicouche lipidique. Les logiciels de prdiction de structure secondaire prdisent lexistence de
quatre hlices transmembranaires dans le domaine S (Berting et al, 1995; Stirk et al, 1992), les
signaux I et II correspondant aux deux premiers domaines, appels TM1 et TM2, et la rgion
C-terminale (AA169-AA226 de la protine S) abritant les deux autres domaines, TM3 et TM4,
dont la fonction dancrage na pas t dmontre exprimentalement. Ces quatre domaines
transmembranaires dlimitent deux boucles cytoplasmiques (CYL-I et II) et une boucle
antignique (AGL) dont les positions respectives sont indiques dans la figure 12.

b. Position et caractristiques du premier domaine transmembranaire (TM1)


Si la position du second domaine transmembranaire est clairement dfinie entre les acides
amins 80 et 98 par les logiciels de prdiction de structure secondaire (Bruss, 2007), celle du

33
Figure 13. Profil dhydrophobicit de la protine L du VHB. Lchelle Kyte-Doolittle est beaucoup utilise
pour dlimiter des rgions hydrophobes au sein des protines. Les rgions dont le score est suprieur 0 sont
hydrophobes. La largeur de la fentre de calcul correspond au nombre dacides amins examins la fois pour
dterminer le score dun rsidu. La taille de la fentre doit tre adapte la taille de la rgion dont on veut
mettre en vidence lhydrophobicit. Classiquement, une fentre de 19-21 acides amins permet de mettre en
vidence clairement les domaines transmembranaires dont les rsidus ont gnralement un score suprieur 1,6.
La position des domaines transmembranaire est indique par les cadres en pointills. Hormis la position du
domaine TM2 trs hydrophobe, la position des autres domaines transmembranaires est indicative et nest pas
clairement dfinie. Les triangles noirs indiquent la position des codons dinitiations de la traduction des
protines L, M et S, respectivement. La signification du code de couleur est indique sur la figure. Logiciel :
CLC Main Workbench , version 5.1, Mac OS X.
domaine TM1 est variable selon la mthode de prdiction utilise et plusieurs positions sont
donc retrouves dans la littrature. Par exemple, en ne citant que quelques quipes travaillant sur
les protines denveloppe, on retrouve les positions suivantes :
(i) 11-28 (Prange et al, 1992; Prange & Streeck, 1995);
(ii) 8-28 (Berting et al, 2000; Chojnacki et al, 2005),
(iii) 7-28 (van Hemert et al, 2008),
(iv) 8-22 (Bruss, 2007),
(v) 4-24 (Blanchet & Sureau, 2006),
(vi) 7-22 (Eble et al, 1987), etc.
Cette variabilit peut probablement tre attribue plusieurs caractristiques du domaine
TM1, telles que son hydrophobicit globale relativement faible compare celle du domaine
TM2 (Fig. 13), la prsence dacides amins polaires (Gln 16 et Arg 24) dans sa squence et la
prsence de deux prolines aux positions 11 et 28. Selon les auteurs et selon les logiciels de
prdiction, la squence hydrophobe GFLG marque le dbut du domaine TM1, larginine dlimite
sa fin, ou bien les deux prolines dlimitent son dbut et sa fin. Au cours de ma thse, la position
arbitraire de rfrence que jai utilise correspond celle dtermine par la position des deux
prolines (AA 11 28) galement utilise par Reinhild Prange et prdite notamment par les
logiciels PHDrhtm (Rost et al, 1996) et NORSp (Liu & Rost, 2003). De faon
surprenante, il a t rapport que ce domaine transmembranaire pouvait tre cliv pH
physiologique, au sein des particules virales, par la chymotrypsine (site de coupure : Gln16) (Lu
et al, 1996), ainsi sa position dans lenveloppe virale reste discutable.

c. Topologie des boucles hydrophiles du domaine S


La premire boucle cytoplasmique (AA 29-79) spare les signaux topogniques I et II.
Cette boucle contient quatre rsidus cystines. Une analyse mutationnelle a dmontr que la
mutation de une trois des quatre cystines par une srine bloquait le mcanisme dassemblage
des particules subvirales (Mangold & Streeck, 1993), alors que ces cystines ne sont pas
impliques dans la formation de ponts disulfures (Wounderlich & Bruss, 1996). Le rle de cette
rgion dans ltape dassemblage viral sera dtaill dans le chapitre Assemblage et scrtion
des particules virales , page 89.
La seconde boucle hydrophile (AA 99 169 environ) est situe dans la lumire du RE
entre les domaines TM2 et TM3. Elle porte le principal dterminant antignique (a) des
antignes de surface qui se retrouve la surface des virions aprs le bourgeonnement des
particules virales au niveau de la membrane du RE. Elle est N-glycosyle in vivo sur lasparagine
146 dans environ 50% des protines denveloppe (Peterson et al, 1982) (Fig. 11 et 12). Selon un
travail ralis par Prange et Streek en 1995, la glycosylation partielle des protines S, M et L sur
34
cette asparagine pourrait tre explique par lorientation non uniforme des protines dans la
membrane du RE (Prange & Streeck, 1995). Dune part, lassociation in vitro des protines
glycosyles et non glycosyles des microsomes exclut lhypothse prcdemment formule
selon laquelle labsence de glycosylation proviendrait dun dfaut dinsertion des protines dans
la membrane du RE (Eble et al, 1986; Eble et al, 1990; Eble et al, 1987; Ostapchuk et al, 1994).
Dautre part, dans un modle bas sur lutilisation de microsomes, la boucle antignique des
protines glycosyles est protge contre un clivage par la trypsine sur larginine 122 alors que
celle des protines non glycosyles est seulement partiellement protge suggrant une
diffrence de topologie entre les deux formes. De manire surprenante, lajout de dtergent
solubilisant la membrane des microsomes, ne permet pas le clivage total des protines quelles
soient glycosyles ou non, suggrant que la susceptibilit variable des formes non glycosyles au
clivage ne dpende pas de leur orientation dans la membrane des microsomes mais plutt dun
encombrement strique. Aprs avoir valid ces rsultats en utilisant une protine S modifie pour
laquelle la corrlation entre le clivage par la trypsine et labsence de glycosylation est parfaite,
Prange et Streek ont propos un modle selon lequel la deuxime boucle hydrophile du domaine
S, situe entre les domaines TM2 et TM3, serait soit expose dans la lumire du RE pour les
formes glycosyles, soit prsente du ct cytoplasmique pour les formes non glycosyles. Le
maintien de cette double topologie lors des tapes dassemblage et de scrtion des particules na
pas t dmontr (Prange & Streeck, 1995). Toutefois, cette htrognit de structure
expliquerait parfaitement la glycosylation partielle des protines denveloppe observe in vitro et
in vivo, contrairement aux modles prcdents reprsentant la boucle antignique uniquement du
ct luminal (Eble et al, 1986; Eble et al, 1987; Ostapchuk et al, 1994). Ce modle est en accord
avec lhypothse de Tiollais et Wain-Hobson formule en 1984 selon laquelle la glycosylation
partielle des protines S pourrait tre explique par lexistence dun htrodimre compos de
deux molcules orientes de faon opposes (Tiollais & Wain-Hobson, 1984). Pour que la
boucle antignique soit expose du ct cytoplasmique de la membrane du RE, cela implique
soit que toute la structure soit inverse et donc que contrairement aux donnes exprimentales
actuelles (Eble et al, 1986; Eble et al, 1990; Simon et al, 1988), la boucle cytoplasmique I
(AA 29-79) soit transloque dans la lumire du rticulum (ce qui est possible pour le DHBV) ;
soit que les domaines TM2 et TM3 ne traversent pas la membrane mais restent accols au niveau
de la bicouche lipidique (Prange & Streeck, 1995). Il faut noter que in vivo, la topologie non
uniforme du domaine S mise en vidence par sa susceptibilit variable au clivage par la trypsine
est moins vidente, probablement du fait des nombreux ponts disulfures dans la boucle
antignique qui la rende rsistante aux coupures protolytiques (Huovila et al, 1992). En effet, le
domaine S des protines denveloppe contient de nombreux rsidus cystine contrairement au

35
domaine Pre-S. Les huit cystines de la boucle antignique permettent de relier les protines
denveloppe entre elles grce de nombreux ponts disulfures intra et interchanes (Mangold et
al, 1995; Wounderlich & Bruss, 1996) et sont galement impliques dans la formation et le
maintien de la structure du dterminant antignique (a) (Mangold & Streeck, 1993; Mangold et
al, 1995).

d. Topologie de la protine M
La protine M possde une topologie transmembranaire comparable celle de la protine
S (Fig. 12B). Le domaine Pre-S2 est transloqu dans la lumire du RE probablement grce
laction du signal I prsent dans son domaine S (Eble et al, 1990). Il est N-glycosyl sur
lasparagine 4 (Heermann et al, 1984; Stibbe & Gerlich, 1983) et O-glycosyl sur la thronine 37
dans la majorit des gnotypes (B-H) (Schmitt et al, 2004) (Fig. 11).

e. Topologie de la protine L
Jusquen 1994, il a t admis que lextrmit N-terminale de la protine L, comme celle
des protines S et M, tait transloque cotraductionnellement dans la lumire du RE grce au
signal I du domaine S. Les domaines Pre-S1 et Pre-S2 tant accessibles aux anticorps
monoclonaux et aux digestions enzymatiques (Heermann et al, 1984), il semblait logique que ces
rgions soient exposes lextrieur des particules virales et donc introduites dans la lumire du
RE pendant leur synthse. Ltude ralise par Ostapchuk et al en 1994 a dmontr que pendant
la synthse protique, la localisation du domaine Pre-S et du signal I de la protine L tait
cytosolique (Ostapchuk et al, 1994) (Fig. 12C). Cette observation a permis dexpliquer pourquoi
la protine L ntait pas glycosyle dans sa rgion Pre-S (Heermann et al, 1984), mais tait
myristoyle son extrmit N-terminale, les enzymes catalysant ces ractions tant luminales et
cytosoliques, respectivement. Toutefois quelques protines L sont O-glycosyles sur la thronine
37 du domaine Pre-S2 (Schmitt et al, 2004). La localisation cytosolique du domaine Pre-S a
ensuite t attribue un signal dinhibition de la translocation, localis entre les acides amins
70 et 94 du domaine Pre-S1 (sous-type ayw) (Bruss & Thomssen, 1994; Prange & Streeck,
1995), qui interagit avec une protine cytosolique, Hsc70, de la famille des protines chaperon
(Lambert & Prange, 2003; Loffler-Mary et al, 1997; Prange et al, 1999; Swameye & Schaller,
1997). A la vue de ces donnes, il est clairement tabli ce jour quenviron 50% des protines L
changent de conformation, aprs leur traduction, en transloquant leur domaine Pre-S du
cytoplasme vers la lumire du RE (Bruss et al, 1994; Guo & Pugh, 1997; Ostapchuk et al, 1994;
Prange & Streeck, 1995; Swameye & Schaller, 1997). Mme si le mcanisme de translocation
nest pas encore bien compris, on sait quil est indpendant des protines S et M et que la seule
rgion transmembranaire de la protine L ncessaire ce processus correspond au domaine TM2

36
Figure 14. Topologie prdite de la grande protine denveloppe du DHBV. Les domaines
transmembranaires TM1, TM2 et TM3 sont indiqus par des cylindres numrots 1, 2 et 3
respectivement. La rgion C-terminale des protines denveloppe du DHBV, indique par des pointills,
reste non caractrise et pourrait traverser la membrane plusieurs fois. (A) Topologie externe de la
protine L avec un domaine Pre-S transloqu et expos la surface des virions. (B) Topologie interne de
la protine L, avec les domaines Pre-S et TM1 disposs du ct cytoplasmique de la membrane du RE
juste aprs la synthse protique. (C) Topologie intermdiaire de la protine L dont le domaine Pre-S est
partiellement transloqu. Cette topologie serait prsente sur les virions (Guo & Pugh, 1997). (D)
Conformation mtastable de la protine L dont les domaines Pre-S et TM1 sont transloqus. La rgion
N-terminale du domaine Pre-S est reprsente interne car elle est rsistante aux coupures protolytiques,
cependant elle pourrait tre lextrieur des virions dans une conformation rsistante aux protases
(Grgacic & Schaller, 2000). Les flches reprsentent les sites de digestion la trypsine accessibles. Ext :
Extrieur, Int : Intrieur. Source : (Chojnacki et al, 2005).
(Lambert & Prange, 2001). Ces observations sont en contradiction avec lhypothse initiale selon
laquelle des oligomres de protines S formeraient des pores dans les membranes permettant au
domaine Pre-S1 de transloquer dans la lumire du RE (Berting et al, 1995; Bruss et al, 1994). De
plus, plusieurs tudes rcentes suggrent que la translocation seffectue au niveau du RE grce
des protines chaperon telles que Hsc70, Hsp40 et BiP, la dernire interagissant avec la forme
transloque du domaine Pre-S (Awe et al, 2008; Cho et al, 2003; Lambert & Prange, 2001;
Lambert & Prange, 2003). La topologie double du domaine Pre-S1, lextrieur des virions
(ePre-S), ou lintrieur des particules (iPre-S) rconcilie les deux fonctions de ce domaine qui
est impliqu dans les tapes dassemblage (Bruss, 2007) et dinfection du cycle viral (Glebe &
Urban, 2007).

f. Donnes de topologie obtenues avec le modle du DHBV


Des tudes complmentaires sur la topologie des protines denveloppe ont t ralises
avec le modle du DHBV. Bien que les rsultats issus de ces tudes ne puissent pas tre
directement appliqus aux protines de surface du VHB, ils suggrent une flexibilit importante
de la structure de la protine L. En effet, elle nadopterait pas seulement deux topologies, avec le
domaine Pre-S lintrieur ou lextrieur des virions, mais elle existerait dans au moins quatre
conformations caractrises par :
(i) un domaine Pre-S entirement cytoplasmique. Cette forme est prsente juste aprs la synthse
protique (Grgacic et al, 2000; Grgacic & Schaller, 2000; Guo & Pugh, 1997) (Fig. 14B);
(ii) un domaine Pre-S principalement lintrieur des virions, dont une petite partie en position
C-terminale serait expose la surface des particules et accessible aux protases (Grgacic &
Schaller, 2000; Guo & Pugh, 1997) (Fig. 14C). Cette forme correspondrait un intermdiaire,
prsent la surface des particules, entre les formes dont le domaine Pre-S est compltement
cytoplasmique et celle o le domaine est transloqu lextrieur des virions (Guo & Pugh,
1997) ;
(iii) un domaine Pre-S dont la rgion C-terminale est inaccessible aux protases du fait de son
insertion dans la membrane ou dun encombrement strique (Grgacic & Schaller, 2000). Cette
forme est associe la translocation, lextrieur des particules virales, du domaine TM1 et de
la partie N-terminale de la boucle cytoplasmique adjacente (Fig. 14D). Elle apparat aprs le
traitement des particules virales par un pH acide ou par un agent rducteur. Il faut noter que le
traitement rducteur provoque la formation de particules, non hydrophobes, restant infectieuses
alors que le traitement pH acide, aboutit la formation de particules hydrophobes et non
infectieuses, probablement du fait de leur agrgation. Cette conformation de la protine L
pourrait correspondre un intermdiaire non stable impliqu dans le processus de fusion
(Grgacic & Schaller, 2000);
37
(iv) un domaine Pre-S presque totalement lextrieur des virions sensible aux digestions
protolytiques (Fig. 14A). Seule lextrmit N-terminale du domaine Pre-S associe lacide
myristique resterait insre dans lenveloppe virale (Guo & Pugh, 1997). Cette hypothse est
supporte par le fait que des anticorps reconnaissant les 20 premiers acides amins du domaine
Pre-S ne reconnaissent pas la protine L la surface des virions (Neurath et al, 1986b; Persing et
al, 1987). Cependant, ce modle est en contradiction avec des donnes dmontrant que des
anticorps ayant pour cible les acides amins 12 23 du domaine Pre-S de la protine L du
DHBV sont capables dimmunoprcipiter des particules virales (Schmut, 2006).
Une autre particularit concernant la topologie de la protine L a t mise en vidence par
Grgacic et al en 2000 : la boucle cytoplasmique situe immdiatement aprs le domaine TM1
serait capable de traverser deux fois lenveloppe virale pour prsenter un pitope la surface des
particules virales (Fig. 14A et C). En effet, il est possible d immunoprcipiter des virions avec
un anticorps reconnaissant la boucle cytoplasmique (Grgacic et al, 2000).
La translocation du domaine Pre-S de la protine L du DHBV est dpendante de la
protine S (Grgacic, 2002; Grgacic et al, 2000) et dune petite protine S tronque (St) (Grgacic
& Anderson, 2005) contrairement ce qui a pu tre montr pour le VHB. Loligomrisation des
protines S via notamment leur domaine TM1 amphipatique pourrait permettre la formation de
pores dans lenveloppe virale participant la translocation de la rgion Pre-S (Grgacic, 2002;
Guo & Pugh, 1997). Ainsi, si les protines L des deux virus partagent certaines conformations
communes, le mcanisme qui permet leur translocation ne semble pas conserv. Il impliquerait
des protines cellulaires pour le VHB et des protines virales (S et St) et cellulaires pour le
DHBV.
En conclusion, ces tudes dmontrent une topologie dynamique des protines
denveloppe qui ne correspond probablement pas un seul modle. En effet, il apparat
clairement au cours du temps quil ny aurait pas que le domaine Pre-S dont la topologie serait
variable : (i) la premire boucle cytoplasmique de la protine L du DHBV traverserait
lenveloppe virale et se retrouverait lextrieur des virions ; (ii) le domaine TM1 de la protine
L du DHBV pourrait tre transloqu lextrieur des virions ; (iii) le domaine TM1 de la
protine L du VHB, accessible un clivage par la chymotrypsine, serait galement accessible
la surface des virus ; (iv) la boucle antignique non glycosyle des protines S, M et L du VHB
serait expose lintrieur des particules virales alors que la forme glycosyle serait expose
lextrieur ; la position des domaines TM3 et TM4 est encore indfinie.

3. Structure tridimensionnelle
Deux tudes rcentes de cryo-microscopie lectronique ralises en 2006 (Dryden et al,
2006) et 2007 (Seitz et al, 2007) ont permis dobserver lenveloppe virale avec une rsolution de
38
Figure 15. Modle 3D dune particule virale complte. Le modle est tabli partir de la reconstruction
tridimensionnelle par cryo-microscopie lectronique de lenveloppe virale (jaune) dune part ; et dune
nuclocapside (T=4) (bleu), au sein dun virion, contenant une molcule dADN viral double brin (rouge)
dautre part. A la surface de lenveloppe lipoprotique, on retrouve des projections de 30 de hauteur espaces
de 60 qui correspondent vraisemblablement aux domaines Pre-S de la protine L et Pre-S2 glycosyl de la
protine M. La capside arbore une symtrie icosadrique tout comme le gnome viral sous forme de cage
dodcadrique. Source : (Dryden et al, 2006).
28 et 22 respectivement. Ltude de Dryden et al a permis de mettre en vidence deux types
de virions, de taille diffrente, dans le srum des patients selon la capside quils contiennent
(T=3 ou T=4, cf. chapitre Nuclocapside , page 41). Les virions dits T3 , de plus petite
taille, reprsentent environ 10% des particules virales compltes. Aucune diffrence
morphologique ou fonctionnelle na t mise en vidence entre les deux types de particules. La
reconstruction tridimensionnelle des virions a permis didentifier, la surface de lenveloppe
virale, la prsence de projections dune hauteur de 30 environ et dont lespacement est proche
de 60 . Le volume de ces projections correspondrait une rgion protique de 14 KDa environ
pouvant tre attribue aux domaines ePre-S des protines L ou aux domaines Pre-S2 glycosyls
des protines M. On retrouve entre 160 et 200 projections la surface de chaque particule, alors
que le volume de lenveloppe peut contenir entre 370 et 400 domaines S (Dryden et al, 2006). Si
cette hypothse est exacte, cela signifie que 40 54% des protines de lenveloppe des virions
correspondent des protines L et M, la protine S correspondant alors 46-60 % des protines.
Daprs leur analyse de structure et compte tenu de lexistence de trois protines de surface
diffrentes, Dryden et ses collaborateurs ont mis lhypothse selon laquelle lorganisation de
lenveloppe virale, la diffrence de celle des nuclocapsides, ne suivrait pas une symtrie
icosadrique. Cependant, la rsolution relativement faible de leur reconstruction ne permet pas
dexclure la possibilit selon laquelle les domaines S des protines denveloppe arboreraient une
organisation icosadrique, comme cela a t dmontr par Seitz et al, et que seuls les domaines
extrieurs des protines L et M (projections) auraient une position variable incompatible avec
cette symtrie. Enfin, cette premire tude na pas russi mettre en vidence dinteractions
claires entre lenveloppe virale et la nuclocapside, confortant ainsi lhypothse selon laquelle
les deux types darchitectures nadopteraient pas la mme organisation. Un premier modle
reprsentant la structure tridimensionnelle des particules virales a t ralis grce cette tude.
Il regroupe les reconstructions de lenveloppe, de la nuclocapside et du gnome viral (Fig. 15).
En 2007, Seitz et ses collaborateurs ont identifi deux phnotypes de virions T4
morphologiquement diffrents (Seitz et al, 2007). Le premier phnotype est caractris par une
frontire quasiment invisible entre lenveloppe virale et la nuclocapside conduisant des
particules daspect compact. Le deuxime est caractris par un espace clairement dmarqu, de
faible densit aux lectrons, entre lenveloppe et la nuclocapside donnant des particules
espaces (gapped particles). Ces deux types de particules sont retrouvs en quantit comparable
dans le srum des patients, sont indistinguables par leur taille et ne peuvent pas tre spars par
leur densit. Un troisime type de virion, minoritaire, est constitu de particules chimriques
prsentant un mlange des deux phnotypes. La reconstruction 3D des particules compactes et
espaces a dmontr que malgr lassemblage compact des protines de surface, lenveloppe

39
Figure 16. Reprsentation des particules compactes (A et B) et des particules espaces (C) une
rsolution de 22 . La taille de la barre dchelle est de 100 . Source : (Seitz et al, 2007).

Figure 17. Organisation des antignes de surface dans lenveloppe virale. A-D : Chaque carte est ralise grce
lanalyse individuelle de 4 6 particules regroupes de par leurs caractristiques structurales communes. Cette
analyse repose sur la reprsentation des rgions transmembranaires des protines denveloppe de particules
compactes. E : La superposition des cartes A, B, C et D ne permet pas dobserver la structure organise de
lenveloppe virale, dmontrant la ncessit danalyser les particules virales individuellement. Source : (Seitz et
al, 2007).
virale possdait le profil dune bicouche lipidique classique, contrairement aux donnes obtenues
avec les particules subvirales (Gilbert et al, 2005). Le tri des particules selon les deux
phnotypes et selon lorientation des excroissances visibles la surface des nuclocapsides a
permis de raliser 3 cartes reprsentant la surface des particules virales (Fig. 16).
Les cartes A et B correspondent des particules compactes et la carte C une particule
espace dont la densit de lenveloppe virale, espace de la nuclocapside, est plus faible et donc
moins ordonne. Le contact entre lenveloppe virale et la nuclocapside se fait grce
linteraction entre les excroissances formes par les dimres dantignes de capside (HBc) et des
protrusions qui mergent de la face interne de lenveloppe. Lenveloppe des particules dont la
structure correspond celle de la carte A tablit plus de contacts avec la nuclocapside que celle
des virions rpertoris dans les cartes B et C (cf. chapitre Nuclocapside , page 41). Ainsi, le
nombre, la position et la taille des contacts entre lenveloppe et la capside, ainsi que la taille des
protrusions mergeant de lenveloppe varient entre les virions, suggrant une plasticit
importante de la liaison entre lenveloppe virale et la capside. Cette hypothse est cohrente avec
lexistence de plusieurs rgions de contact avec la capside sur les antignes de surface, au niveau
du domaine Pre-S (Bruss, 1997; Poisson et al, 1997) et de la premire boucle cytoplasmique du
domaine S (Loffler-Mary et al, 2000; Poisson et al, 1997).
Lorganisation prcise des antignes de surface dans lenveloppe virale a pu tre
dtermine grce lanalyse individuelle de particules (Seitz et al, 2007). En effet, la stratgie
consistant en lanalyse de plusieurs particules la fois, sans classement pralable, afin de
construire une structure moyenne nest pas adapte compte tenu de la plasticit de lenveloppe
qui provoque un bruit de fond important lorsque lon analyse plusieurs entits la fois (Fig. 17).
Pour dterminer la position des protines dans lenveloppe, lanalyse a t concentre sur
lobservation des domaines transmembranaires denses aux lectrons. Cette approche a permis
didentifier la sous-unit de base de lenveloppe virale. Elle correspond un dimre dantigne
HBs dont le nombre par particule est estim 180, soit 360 protines de surface par virions
correspondant lestimation basse de Dryden et al (Dryden et al, 2006). La faible densit
observe dans lespace entre lenveloppe et la nuclocapside des particules compactes et
espaces dans lequel on doit retrouver les excroissances de la capsides, les boucles
cytoplasmiques du domaine S et le domaine iPre-S de la protine L, soit environ 60% de
lespace, suggre que les rgions cytoplasmiques des protines de surface sorganisent en une
fine couche le long de la face interne de lenveloppe virale. Globalement, lanalyse montre que
lorganisation des dimres dAgHBs est la mme pour toutes les particules bien quelle ne soit
pas parfaitement superposable (Fig. 17).

40
Ainsi, la diffrence de Dryden et al, Stefan Seitz et ses collaborateurs ont russi a
identifier une relation spatiale entre la nuclocapside et lenveloppe virale dont lorganisation,
dicte par la capside, nest pas compltement variable mais plutt base sur une symtrie
icosadrique bien que lon puisse observer une variabilit dans lorientation de chaque
projection.
En conclusion, lenveloppe virale est donc constitue de dimres dAgHBs, dont
lorganisation est base sur une symtrie icosadrique comme celle de la capside du fait de
linteraction lectrostatique entre les dimres dAgHBc et dAgHBs. Lexistence des deux types
de virions, compacts et espacs, dont la densit de lenveloppe ainsi que sa capacit interagir
avec la nuclocapside est diffrente, na pas encore t explique, que ce soit dun point de vue
structural ou fonctionnel. Cependant, il semble que le matriel viral le plus infectieux purifi
partir de cultures cellulaires soit constitu quasi exclusivement des particules espaces suggrant
le rle fondamental de ce phnotype.

II. Nuclocapside
La protine core ou antigne HBc est la protine structurale majeure de la capside. Cette
protine, de 21 kDa et 183-185 acides amins selon les gnotypes, peut tre divise en 2 rgions:
(i) une rgion N-terminale de 149-151 acides amins qui possde un motif leucine
zipper" permettant la dimrisation de lAgHBc et son assemblage en une structure capsidique
(Chang et al, 1994; Gallina et al, 1989; Zhou et al, 1992). Les 144 premiers acides amins de la
protine de capside (domaine hydrophobe) suffisent la formation de capsides (Chang et al,
1994; Yang et al, 1994). Cette extrmit de la protine a t localise lextrieur des capsides
par des tudes de marquage ralises en microscopie lectronique (Conway et al, 1998; Zlotnick
et al, 1997).
(ii) une rgion C-terminale basique de 34 rsidus qui contient quatre domaines riches en
arginine qui ne sont pas impliqus dans la formation de la nuclocapside: le premier est
ncessaire lencapsidation de lARN prgnomique (matrice pour la synthse de lADN viral)
associ la polymrase virale (Hatton et al, 1992; Machida et al, 1991; Nassal, 1992; Yang et al,
1994) alors que les trois autres sont susceptibles dinteragir avec lADN viral (Gallina et al,
1989; Hatton et al, 1992; von Weizsacker et al, 1995; Yu & Summers, 1991). Cette extrmit de
la protine a t localise dans la lumire des capsides par des tudes de marquage ralises en
microscopie lectronique (Conway et al, 1998; Zlotnick et al, 1997).
Les analyses de cryo-microscopie lectronique et de cristallographie de la protine HBc
ont permis de dmontrer que lenveloppe des particules virales compltes entourait une capside
de 28 nm (T=3) ou 31 nm (T=4) de diamtre contenant respectivement 180 ou 240 antignes de

41
A B

Figure 18. A. Reconstruction 3D de capsides natives, contenant une molcule dADN viral, purifies partir de
foie de souris transgniques rpliquant le VHB. La structure des capsides purifies partir de virions est
identique (Dryden et al, 2006). B. Reprsentation de la structure cristallise des deux dimres de capside AB
(rouge et bleu) et CD (orange et vert) (Wynne et al, 1999) au sein de la reconstruction 3D dune particule
virale complte compacte (Seitz et al, 2007). Les acides amins chargs ngativement au sommet des
excroissances, en contact avec lenveloppe virale, sont reprsents en jaune.
capsides organiss en dimres (Bottcher et al, 1997; Conway et al, 1997; Crowther et al, 1994;
Dryden et al, 2006; Wynne et al, 1999; Zlotnick et al, 1999). Les deux types de capsides ont une
structure tridimensionnelle trs proche. Elles adoptent une symtrie icosadrique dont la
triangulation (T), qui correspond au nombre de triangle par face de licosadre (figure
gomtrique constitue de 12 sommets et 20 faces), est de 3 ou 4, le nombre de sous-units
constituant une capside tant gal 60T. A leur surface, les capsides comportent de nombreuses
excroissances ainsi que des pores dun diamtre de 12 et 15 , quelle que soit leur taille (Fig.
18A) (Bottcher et al, 1997; Conway et al, 1997; Crowther et al, 1994; Dryden et al, 2006;
Zlotnick et al, 1999).
Chaque excroissance correspond une structure coiled coil , constitue de 4 hlices ,
forme par linteraction entre les hlices lextrmit N-terminale des dimres dAgHBc
(Fig. 18B) (Bottcher et al, 1997; Conway et al, 1997; Wynne et al, 1999). La structure
cristallise une rsolution de 3,3 de lAgHBc (Wynne et al, 1999; Zlotnick et al, 1999) a
permis de localiser les diffrents acides amins de la protine dans la structure, notamment ceux
situs lextrmit des excroissances qui constituent le site antignique majeur de la capside et
qui seraient impliqus dans linteraction avec lenveloppe virale (Seitz et al, 2007) (Fig. 18B).
Selon lenvironnement des protines de capside dans la structure, on distingue quatre sous-types
de monomres HBc (A, B, C et D) dans la structure T=4, sorganisant en deux types de dimres
AB et CD (Bottcher et al, 1997; Conway et al, 1997; Wynne et al, 1999; Zlotnick et al, 1999)
(Fig. 18B). Les excroissances formes par ces dimres ninteragissent pas tout fait de la mme
faon avec lenveloppe virale. Le dimre AB est capable dtablir deux points de contact avec
lenveloppe des particules compactes de la carte A (Fig. 16) ou un seul avec lenveloppe des
particules compactes et espaces des cartes B et C. Le dimre CD ntablit quun seul point de
contact avec lenveloppe virale, quel que soit le type de particule. Il est possible dimaginer que
chaque dimre interagirait avec une rgion diffrente des protines denveloppe. Quoi quil en
soit, le nombre important dacides amins chargs ngativement la surface des excroissances
(Wynne et al, 1999) suggre que peu importe le dimre impliqu, le contact entre lenveloppe et
la nuclocapside se ferait via des liaisons lectrostatiques avec des rsidus basiques des protines
de surface (Seitz et al, 2007). Cependant, il est important de noter que les rsidus supposs
important pour lenveloppement de la nuclocapside ont t identifis la base des
excroissances dAgHBc par Ponsel et Bruss en 2003 (Ponsel & Bruss, 2003) et que ces rsidus
ne semblent pas tablir de contacts directs avec lenveloppe virale dans le modle propos par
Seitz et al, peut tre cause de la rsolution trop faible de leur reconstruction (22).

42
Figure 19. Structure du gnome du VHB. Les cercles intrieurs reprsentent le brin (-) complet de la molcule
dADN viral et le brin (+) incomplet. Le disque noir lextrmit 5 du brin (-) schmatise la polymrase virale
avec laquelle il interagit via une liaison covalente. Les deux traits verticaux joignant les brins (+) et (-)
correspondent aux rgions rptes DR1 et DR2. Les courbes fines et noires reprsentent les ARNs transcrits
partir du gnome viral, leur taille est indique en Kb. Il existe en fait deux ARNs de 3,5 Kb dmarrant avant et
aprs le codon dinitiation de la rgion pre-core. Les plus courts assurent une double fonction : ils correspondent
lADN prgnomique qui est encapsid et sert de substrat la synthse du brin (-) dADN ; ils permettent la
traduction de la protine de capside (core) et de la polymrase. Les plus long permettent la traduction de la
protine pr-core ou AgHBe. Tous les ARN se terminent au niveau du site unique de polyadnylation (polyA).
Les lignes colores paisses indiquent la position des cadres ouverts de lecture des protines virales dont le nom
est indiqu ct. Source : (Rehermann & Nascimbeni, 2005).
Concernant la rgion C-terminale riche en arginine de la protine HBc, en contact avec la
lumire de la capside, il est toujours estim quelle permet linteraction avec le gnome viral,
bien quelle nait pas t cristallise (Gallina et al, 1989; Nassal, 1992; Zlotnick et al, 1997).

III. Gnome viral


A. Structure
Le gnome du VHB est constitu dune petite molcule dADN de 3215 nuclotides,
(Hruska et al, 1977; Robinson & Greenman, 1974; Summers et al, 1975). Cest le plus petit
gnome de virus animal connu.
Sa structure est partiellement double brin : lADN viral consiste en un brin long de
polarit ngative (-) et de taille constante, qui correspond au brin codant, et en un brin court de
polarit positive (+) et de taille variable, qui possde la mme polarit que les ARNs messagers
viraux (Fig. 19). La portion double brin ne reprsente que 30 85% de la longueur totale du
gnome (Delius et al, 1983; Summers et al, 1975). La rgion simple brin peut tre complte
exprimentalement par lactivit polymrase endogne du virus, aboutissant un gnome
totalement double brin. Au cours de cette raction, lextrmit 3 hydroxyle du brin (+) sert
damorce alors que le brin (-) sert de matrice.
La forme du gnome viral retrouve dans les nuclocapsides est de type relaxe
circulaire. Malgr la prsence dune interruption dans le brin (-), la structure circulaire du
gnome est assure par lappariement des extrmits 5 des deux brins sur une longueur de 234
nuclotides (Sattler & Robinson, 1979) (Fig. 19). Cette rgion cohsive est dlimite par deux
squences directement rptes DR1 et DR2 (direct repeat) de 12 nuclotides, qui jouent un rle
dans la rplication virale.
La polymrase virale est lie de faon covalente lextrmit 5 du brin (-) (Bosch et al,
1988; Gerlich & Robinson, 1980) (Fig. 19), alors que lextrmit 5 du brin (+) comporte un
oligoribonuclotide servant damorce lors de la rplication virale (Lien et al, 1986; Seeger et al,
1986; Will et al, 1987).

B. Organisation gntique
Le clonage de lADN prsent dans les particules de Dane a permis de determiner la
squence complte du gnome viral en nuclotides (Galibert et al, 1979; Ono et al, 1983).
Lanalyse de cette squence a rvl une organisation gntique trs compacte o, non seulement
tous les nuclotides font partie intgrante dune rgion codante, mais aussi o plus de la moiti
du gnome est traduite dans deux phases de lecture diffrentes. Le chevauchement des gnes
permet ainsi au VHB daugmenter de 1,5 fois la capacit codante de son gnome. Mme si

43
plusieurs phases de lecture ouvertes potentielles existent sur les deux brins, seules quatre rgions
codantes fonctionnelles ont t mises en vidence sur le brin (-) (Fig. 19):
- la rgion P, qui stend sur 80% du gnome, code pour lADN polymrase virale ;
- la rgion Pre-S/S code pour les protines de lenveloppe. Cette rgion comporte
plusieurs codons initiateurs de la traduction (ATG) prsents dans une mme phase ouverte de
lecture. Le gne S, dlimit en 5 par le troisime ATG, code pour la protine S. Lorsque la
traduction est initie au second ATG, la protine M est synthtise. Cette protine M comporte
donc les rgions Pre-S2 et S. Enfin, linitiation partir du premier ATG gnre la production de
la protine L, constitue des rgions Pre-S1, Pre-S2 et S ;
- la rgion pr-C/C comporte deux codons initiateurs fonctionnels. Lutilisation du
premier aboutit la synthse dune protine non structurale soluble, scrte dans le srum :
lantigne HBe. La traduction partir du deuxime ATG produit la protine de structure de la
capside : lantigne HBc ou protine C ;
- la rgion X code pour une protine rgulatrice non structurale : la protine X.

44
Figure 20. Cycle viral du VHB
CYCLE VIRAL

Le cycle viral des hepadnavirus peut tre dcompos en 10 tapes fondamentales (Fig.
20) :
1. Lattachement : au moment de linfection, les virus sattachent la surface de la cellule
hte sans doute via un ou plusieurs co-rcepteurs membranaires.
2. La libration des nuclocapsides : aprs leur internalisation, les virus librent leur
nuclocapside dans le cytoplasme.
3. Ladressage nuclaire et la dcapsidation : les nuclocapsides migrent vers le noyau
dans lequel elles librent lADN viral.
4. La production de lADN superenroul : le gnome viral relax circulaire est complt.
Il en rsulte un ADN circulaire double brin complet superenroul (ADNccc).
5. La transcription : lARN polymrase II cellulaire transcrit un grand nombre de copies
du brin (-) de lADN superenroul, dont lARN prgnome.
6. La traduction : les transcrits sont transfrs dans le cytoplasme o ils sont traduits pour
produire les diffrentes protines virales.
7. La production des nuclocapsides et la synthse de lADN viral: lARN prgnome
est encapsid avec la polymrase virale. A lintrieur de cette structure, la synthse de lADN
viral est initie. La polymrase, qui possde une activit transcriptase inverse, rtro-transcrit
lARN en un brin (-) dADN. La matrice dARN est dtruite simultanment par lactivit RNAse
H de la polymrase. La polymrase virale assure ensuite linitiation de la synthse du second
brin (+).
8. Le recyclage des nuclocapsides : une partie des nuclocapsides peut tre recycle en
retournant au noyau afin damplifier le nombre de copies dADN superenroul.
9. Lassemblage des particules virales : les nuclocapsides nouvellement synthtises
bourgeonnent au niveau des membranes intracellulaires, o elles acquirent lenveloppe virale
pour former de nouveaux virions. Mme en absence de nuclocapside, la membrane contenant
les protines de surface virale bourgeonne spontanment pour former des particules subvirales.
10. La scrtion des particules virales : toutes les particules virales, vides ou compltes,
sont scrtes par la voie constitutive du transport vsiculaire

I. Attachement
La premire tape ncessaire ltablissement dune infection virale correspond
lattachement des virus sur une structure accessible la surface des cellules cibles.
Gnralement, le processus dattachement se fait en plusieurs tapes. Dans un premier temps, les

45
virus interagissent avec une ou plusieurs cibles via des interactions rversibles de faible nergie,
puis ils interagissent avec un ou plusieurs rcepteurs spcifiques via des interactions de haute
affinit permettant dactiver le processus de libration des nuclocapsides dans le cytosol via un
mcanisme de fusion ou de translocation la membrane plasmique ou la membrane des
endosomes.
Les donnes actuelles ne permettent pas de dfinir prcisment le droulement des
premires tapes de linfection, cest--dire lattachement des particules virales la surface des
hpatocytes par lintermdiaire dun ou de plusieurs co-rcepteurs, la pntration des virions
dans la cellule, la libration des nuclocapsides dans le cytosol, et enfin la pntration de lADN
viral dans le noyau. La restriction despce des hepadnavirus ainsi que lhpatotropisme des
virus suggrent lexistence dlments de rgulation spcifiques de lhte et du foie. Cependant,
la transfection dhpatocytes normaux de rat (Diot et al, 1992) ou dhpatomes de rat (Shih et al,
1989) par le gnome du VHB initie une rplication normale qui aboutit la scrtion de virus et
de particules subvirales. Cette rplication virale chez une espce non primate est galement
retrouve dans les hpatocytes de souris transgniques, capables de produire des particules
virales compltes (Guidotti et al, 1995; Yamamura et al, 1990). La spcificit despce du VHB
ne dpend donc pas de son incapacit se rpliquer chez une autre espce, mais relve plutt de
son incapacit infecter les cellules, sans doute par labsence de rcepteurs ou de facteurs
ncessaires ladsorption adquate et/ou linternalisation du virus. Corroborant cette
hypothse, Philipe Chouteau et al ont dmontr le rle de la rgion Pre-S1 de la protine L du
VHB, implique dans le processus dinfection, dans la spcificit despce (Chouteau et al,
2001).

A. Implication des protines de lenveloppe virale


Une des approches utilises pour comprendre le mcanisme dattachement et de
pntration du VHB consiste tudier la participation de ses protines de surface lors de
linfection. La dcouverte relativement rcente de deux modles dinfection efficaces par le
VHB correspondant la ligne hpatique HepaRG (Gripon et al, 2002) et aux hpatocytes
primaires de Tupaa Belangeri (Kock et al, 2001; Walter et al, 1996) a permis de rechercher plus
facilement la prsence de dterminants de linfectivit dans les protines denveloppe. Ces
modles remplacent aujourdhui souvent les cultures primaires dhpatocytes humains (Gripon et
al, 1993; Gripon et al, 1988) dont la disponibilit est limite et dont la susceptibilit linfection
est variable. Avant la mise en place de ces modles dinfection, la plupart des donnes
concernaient le modle du DHBV. Cependant, une transposition absolue des rsultats obtenus
pour le DHBV au VHB est impossible, cause de lexistence de divergences relativement

46
importantes entre ces deux virus. Ce risque dextrapolation est dautant plus rel pour
linteraction entre le virus et sa cellule hte, quune disparit notable existe entre les squences
des protines de surface du VHB et du DHBV (Mandart et al, 1984).

1. Fonctions du domaine Pre-S1


Limportance du domaine Pre-S1 dans linfection fut suggre ds 1986 suite une tude
ralise par Neurath et al, dmontrant quun peptide correspondant aux acides amins 10 36 du
domaine Pre-S1 de la protine L du VHB (gnotype D) pouvait se fixer la surface des cellules
HepG2 et inhiber la fixation du VHB sur ces cellules de la mme faon que des anticorps dirigs
contre ce peptide (Neurath et al, 1986b). Cependant, ce nest quen 1999 que les travaux de Le
Seyec et al ont dmontr clairement la ncessit pour linfectivit des acides amins 3 77 du
domaine Pre-S1 (Le Seyec et al, 1999). Une tude ralise en 2007 a confirm ces rsultats en
utilisant le modle du VHD. Ce dernier a permis danalyser la totalit du domaine Pre-S1 au
cours de linfectivit, y compris les rgions ncessaires lassemblage du VHB, puisque seule la
protine S est importante pour la morphogense du virus delta (Blanchet & Sureau, 2007). De
faon intressante, une tude rcente a permis de dmontrer que le domaine Pre-S1 adoptait une
organisation globale non structure, caractrise par la prsence de plusieurs motifs structurs
localiss dans les 40 premiers acides amins et dont la prsence pourrait servir de site de fixation
des rcepteurs (Chi et al, 2007). En accord avec cette hypothse, de nombreuses protines
cellulaires interagissant avec la rgion N-terminale du domaine Pre-S1 ont t dcrites comme
rcepteur du VHB, bien quaujourdhui aucune nait de rle prouv au cours de lentre virale.
En outre, deux tudes ont dmontr le rle indispensable, au cours de ltape dinfection,
de lacide myristique se greffant sur la glycine 2 du domaine Pre-S1 (Bruss et al, 1996b; Gripon
et al, 1995).
Un travail ralis au sein de notre quipe, en collaboration avec Stephan Urban, a permis
didentifier un peptide inhibiteur de linfection correspondant aux 77 premiers acides amins du
domaine Pre-S1 et incluant lacide myristique (Gripon et al, 2002). Mme des princubations
courtes de ce peptide, ou de peptides plus petits (AA 2-48), avec les cellules suffisent pour
bloquer linfection et rendre les cellules non infectables pendant plusieurs heures, suggrant que
les peptides se fixent la surface dun rcepteur sur les hpatocytes (Glebe et al, 2005; Gripon et
al, 2005). Cette hypothse est supporte par plusieurs expriences : lattachement spcifique des
peptides sur des hpatocytes primaires de Tupaa mais pas sur des hpatocytes de rat a t mis en
vidence par immunohistochimie (Glebe et al, 2005), des peptides marqus par la cyanine 3 se
fixent la surface dhpatocytes humains en culture primaire (Gripon et al, 2005), la fixation de
particules subvirales mixtes contenant les protines de surface L, M et S sur des hpatocytes
primaires de Tupaa peut tre inhibe spcifiquement par la princubation des cellules avec un
47
peptide myristoyl driv du domaine Pre-S1 du VHB (AA 2-48) alors quun peptide myristoyl
driv du DHBV (AA 2-44) na pas deffet (Glebe et al, 2005). Cependant, linhibition de la
fixation des particules virales requiert lutilisation de concentrations importantes de peptide,
contrairement linhibition de linfection, suggrant que laction des peptides sur le processus
dinfection ne passe pas par une diminution de ladsorption des virus la surface des
hpatocytes. Ces rsultats suggrent lexistence dune quantit importante de rcepteurs de faible
affinit pour le VHB la surface des hpatocytes pouvant tre occups par les peptides (Glebe et
al, 2005). Ces rcepteurs pourraient correspondre aux protoglycanes hparane sulfate puisque
lhparine, qui est capable de fixer les virus (Schulze et al, 2007) et dinhiber leur fixation sur
des cellules HepG2 et des hpatocytes primaires (Ying et al, 2002), peut inhiber linfection in
vitro (Leistner et al, 2008; Schulze et al, 2007). Cependant, des concentrations quivalentes,
lhparine peut bloquer compltement linfection alors quelle ninhibe que de 50 70 %
lattachement des virus sur les cellules (Leistner et al, 2008; Schulze et al, 2007). Ainsi, les
peptides, comme lhparine, sont capables de bloquer le processus dinfection des
concentrations pour lesquelles ils ne permettent pas de bloquer lattachement des virus aux
cellules, suggrant que leur action ne passe pas par linhibition de ladsorption des virus la
surface des cellules. Linfection par le DHBV peut aussi tre inhibe spcifiquement par un
peptide driv de lextrmit N-terminale du domaine Pre-S de sa protine L. Linhibition
respecte la spcificit despce puisque ce peptide ninhibe pas linfection par le VHB (Urban &
Gripon, 2002), confirmant limplication du domaine Pre-S1 dans la spcificit dhte du VHB
(Chouteau et al, 2001). La prsence de lacide myristique lextrmit N-terminale des peptides
est cruciale pour obtenir une inhibition efficace de linfection (Glebe et al, 2005; Gripon et al,
2005), ce qui conforte les donnes dmontrant son importance pour linfectivit. De plus, les
auteurs prcdents ont dmontr que laugmentation de la longueur et donc de lhydrophobicit
de la chaine lipidique associe aux peptides augmentait leur pouvoir inhibiteur. Si le rle
ncessaire de lacide myristique et du domaine Pre-S1 au cours de linfection est clairement
tabli, leur fonction prcise lors de lattachement ou dune tape ultrieure de lentre virale est
encore inconnue. De faon intressante, lexposition dun acide myristique aprs ltape
dattachement de certains virus non envelopps est ncessaire leur mcanisme dentre (Hogle,
2002; Liemann et al, 2002).

Les nombreuses donnes obtenues grce la mutagense et la caractrisation des


peptides inhibiteurs de linfection ont permis de cartographier diffrentes rgions du domaine
Pre-S1 selon leur importance et leur fonction prsume (Fig. 21) :
- les 7 premiers acides amins sont indispensables linfectivit des virus probablement parce

48
Figure 21. Rgions des protines denveloppe ncessaires linfection : (i) Myr = Acide myristique (Bruss et
al, 1996; Gripon et al, 1995) ; (ii) Rgions 1-10 et 21-31 (vert) du domaine Pre-S1 impliques dans la spcificit
despce (Chouteau et al, 2001) ; (iii) Rgion 1-77 du domaine Pre-S1 (bleu) ncessaire linfection (Blanchet
& Sureau, 2007; Le Seyec et al, 1999) et probablement implique dans ltape dattachement (Barrera et al,
2005; Glebe et al, 2005; Gripon et al, 2005) ; (iv) Rgion 268-319 de la boucle antignique de la protine S
(rouge) dlimitant un motif conformationnel ncessaire ltape dinfection (Salisse & Sureau, 2009).
quils sont ncessaires la myristoylation (Le Seyec et al, 1999).
- les acides amins 8 75 sont indispensables linfectivit du VHB et du VHD (Blanchet &
Sureau, 2007; Le Seyec et al, 1999).
- Parmi les 75 premiers rsidus, les acides amins 2 48 constituent probablement le site de
fixation du VHB sur son rcepteur (Barrera et al, 2005; Glebe et al, 2005; Gripon et al, 2005). En
effet, cette rgion est indispensable et suffisante pour obtenir une efficacit optimale dinhibition
de linfection par les peptides drivs du domaine Pre-S1. Le motif DPAF, correspondant aux
acides amins 20 23 de cette rgion doit jouer un rle important lors de linfection des cellules
HepaRG car sa dltion dans le peptide PreS/2-48myr (AA 2-48 du domaine Pre-S1 myristoyl)
inhibe fortement le pouvoir inhibiteur de ce peptide. Les 18 premiers acides amins des peptides
sont insuffisants pour obtenir une bonne inhibition de linfection, mais ils sont ncessaires leur
activit. En effet, la squence 19 48 du domaine Pre-S1, myristoyle artificiellement sur la
leucine 19, ne bloque pas linfection des cellules HepaRG. La rgion 2-18 du domaine Pre-S1
doit donc tre implique dans la reconnaissance directe du rcepteur, ou dans le maintien de la
distance entre lacide myristique et le site de fixation au rcepteur (Gripon et al, 2005). Par
ailleurs, une tude ralise avec le modle du VHD a dmontr que la rgion comprise entre les
acides amins 5 et 20 du domaine Pre-S1 correspondait la squence minimale ncessaire pour
inhiber linfection du virus delta, suggrant que ces acides amins seraient directement impliqus
dans linteraction avec le rcepteur du virus (Barrera et al, 2005). Enfin, une tude
complmentaire mene par Glebe et al et utilisant comme modle le VHB et les hpatocytes
primaires de Tupaa a permis de complter et de confirmer la majorit de ces donnes (Glebe et
al, 2005). Lanalyse du pouvoir inhibiteur de peptides dont la rgion C-terminale a t dlte de
faon croissante a permis de cartographier les rgions importantes pour lactivit des peptides et
par extrapolation pour linfectivit. Alors que le peptide preS/2-48myr prsente lactivit
inhibitrice la plus forte, les peptides dlts ont une activit de plus en plus faible plus la dltion
est grande. Le plus petit peptide, preS/2-8myr, prsente une activit inhibitrice trs faible mais
toujours dtectable, et un peptide de 10 acides amins supplmentaires, preS/2-18myr, est
beaucoup plus actif (x30 ) suggrant limportance des acides amins 10 18. De faon
intressante, lajout de 10 autres rsidus pour obtenir le peptide preS/2-28myr, naugmente pas
lactivit dinhibition. Enfin, laddition des acides amins 29 38, puis 39 48, augmente
squentiellement le pouvoir inhibiteur des peptides. Ces donnes ont donc permis de dlimiter
deux rgions importantes pour bloquer linfection des hpatocytes de Tupaa par le VHB : le
domaine 2-18, dont les acides amins 9 18 sont les plus importants, et le domaine 29-48. De
plus, en accord avec les tudes de Gripon et al et de Barrera et al, les 18 premiers acides amins
du domaine Pre-S1 sont indispensables au blocage de linfection car un peptide myristoyl

49
comportant les rsidus 19 48 du domaine Pre-S1 ne prsente quune trs faible activit
dinhibition. Ainsi, parmi les deux squences interfrant avec linfection, la 2-18 est
indispensable et la 29-48 est accessoire (Glebe et al, 2005). Enfin, une tude mene par Engelke
et al a vrifi que la rgion 9-18 tait essentielle pour linfectivit des virions et identifi trois
acides amins (11, 12 et 13) dans cette rgion qui sont cruciaux pour linhibition de linfection.
Des virus mutants dont la protine L est mute au niveau de ces rsidus ne sont pas infectieux
(Engelke et al, 2006). Tous ces rsultats sont de plus conforts par la forte conservation de la
rgion 9-18 par rapport au reste de la squence 1-48. Malgr la concordance des rsultats de ces
tudes, le motif DPAF (AA 20-23), reconnu par lanticorps neutralisant anti-Pre-S1 MA18/7,
nest pas important pour lactivit des peptides sur les hpatocytes de Tupaa alors quil est
important pour le blocage de linfection sur les cellules de la ligne HepaRG. Pourtant,
lanticorps MA18/7 neutralise linfection sur les deux types de cellules. Si cette rgion du
domaine Pre-S1 est implique dans linteraction du virus avec son rcepteur, on peut imaginer
que le rcepteur sur les hpatocytes de Tupaa possde des sites de fixation pour les domaines 9-
18 et 28-48 comparables ceux du rcepteur humain mais un site de fixation pour le domaine
20-27 diffrent (Glebe et al, 2005).
- Les acides amins 49 75, bien quindispensables linfection, ne sont pas ncessaires dans les
peptides pour inhiber linfection et diminuent mme leur activit. Ils pourraient tre impliqus
dans le masquage du site de fixation au rcepteur avant ltape dattachement, ou permettre la
stabilisation de linteraction entre le virus et son rcepteur. Dans le modle du DHBV, un tel
mcanisme dattachement des virus leur rcepteur, la carboxypeptidase D, en deux tapes, a t
mis en vidence. Dans un premier temps, linteraction des virus avec la carboxypeptidase D, se
fait grce une hlice localise dans la rgion C-terminale du domaine Pre-S, puis le complexe
est stabilis par une structure localise dans la rgion N-terminale du domaine Pre-S (Urban et
al, 2000).
- La squence au del des 75 premiers rsidus ne comporte pas de dterminants de linfectivit
(Blanchet & Sureau, 2007; Le Seyec et al, 1999). Cependant, cette rgion du domaine Pre-S1, en
plus du domaine Pre-S2, pourrait avoir un rle despacement entre lextrmit N-terminale du
domaine Pre-S1 et le premier domaine transmembranaire du domaine S. En effet, Blanchet et
Sureau ont observ que des dltions de taille croissante dans cette rgion inhibaient linfectivit
des virus de faon croissante (Blanchet & Sureau, 2007).

Trs rcemment, une tude ralise par Yann Le Duff et al a permis dtudier la
complmentarit lors de linfection entre lacide myristique, les rsidus 2-48 et enfin les rsidus
49-75 du domaine Pre-S1. En produisant des virus chimres dont lenveloppe virale contient des

50
protines L diffrentes, chacune mute dans une des rgions prcdentes, ils ont dmontr que
ces rgions devaient se trouver sur une mme protine L afin que les virus conservent leur
pouvoir infectieux (Le Duff et al, 2009). Ces rsultats illustrent donc la ncessit dune
coopration en cis (au sein dune mme protine), durant le mcanisme dentre, entre lacide
myristique et les rgions 2-48 et 49-75. En accord avec leurs rsultats et avec les donnes
prexistants dans la littrature, les auteurs ont propos le modle suivant : les acides amins 2
48 du domaine Pre-S1, possiblement avec lassistance de lacide myristique, constitueraient le
site de fixation au rcepteur la surface des hpatocytes, et les rsidus 49 75 dune mme
protine L pourraient soit initier linteraction avec le rcepteur soit la stabiliser. A la diffrence
des rgions prcdentes du domaine Pre-S1, le dterminant de linfectivit prsent dans la boucle
antignique du domaine S des protines denveloppe (cf. chapitre suivant Fonctions du
domaine S , page 52) (Salisse & Sureau, 2009) nest pas ncessaire, dans la protine L, pour le
processus dinfection (Le Duff et al, 2009). De ce fait, si ce dterminant doit interagir avec le
domaine Pre-S1 lors du processus dentre, il est probable quil interagisse en trans avec ce
domaine, via la protine S. Alternativement, il est galement possible que ces deux dterminants
agissent indpendamment lun de lautre lors du processus dinfection. Cette dernire hypothse
est en accord avec des rsultats ayant dmontr un effet plus important des mutations dans le
domaine S lorsquelles sont introduites dans la protine S plutt que dans la protine L dont la
quantit est trs minoritaire dans lenveloppe virale (Le Duff et al, 2009). De plus, les auteurs de
cette tude ont dmontr que lintroduction dune mutation dltre dans le dterminant de la
boucle antignique, dans une proportion de protine S quivalente au nombre de protines L
estim par virion, avait le mme effet sur linfectivit que la mme mutation lorsquelle est
introduite dans la protine L. Ce rsultat conforte donc lhypothse selon laquelle le dterminant
de linfectivit de la boucle antignique aurait le mme rle dans les protines S et L, et que
leffet des mutations dans ce dterminant serait corrl la quantit relative des protines S et L
dans lenveloppe virale.

2. Fonctions du domaine Pre-S2


La protine M nest pas ncessaire pour linfectivit du VHB et du VHD (Fernholz et al,
1993; Santantonio et al, 1992; Sureau et al, 1994) bien que des anticorps dirigs contre le
domaine Pre-S2 inhibent linfection (Glebe et al, 2003; Neurath et al, 1986a). Cependant, le
domaine Pre-S2 tant prsent la fois dans les protines M et L, il est probable que les anticorps
anti-Pre-S2 inhibent linfectivit des virions en bloquant le domaine Pre-S de la protine L. Cette
hypothse est supporte par lobservation quun anticorps (Q19/10) reconnaissant
spcifiquement le domaine Pre-S2 glycosyl sur lasparagine 4 de la protine M (Fig. 11), induit
une inhibition de linfection modre compar aux autres anticorps anti-Pre-S2 qui reconnaissent
51
les protines M et L (Glebe et al, 2003). Toutefois, le domaine Pre-S2 de la protine L ne
comporte pas de dterminant de linfectivit et nest donc pas ncessaire ltape dentre du
cycle viral (Blanchet & Sureau, 2007; Le Seyec et al, 1998). En 2006, un motif de translocation
(TLM), localis lextrmit C-terminale du domaine Pre-S2, a t dcrit pour son implication
dans la libration des nuclocapsides dans le cytosol (Stoeckl et al, 2006). Limplication de ce
motif lors du processus dinfection a ensuite t carte par trois tudes (Blanchet & Sureau,
2007; Gudima et al, 2007; Lepere et al, 2007) dont une, ralise pendant ma thse, sera prsente
dans la partie rsultat de ce manuscrit.

3. Fonctions du domaine S
Le fait que la fixation, sur des hpatocytes de Tupaa, de particules subvirales contenant
des protines L, M et S, puisse tre inhibe spcifiquement par des peptides drivs du domaine
Pre-S1, suggre que la protine S nest pas implique dans ltape dattachement (Glebe et al,
2005). De plus, des particules subvirales recombinantes exprimant une protine de fusion Pre-
S1/S, ainsi que des particules subvirales enrichies en domaine Pre-S1 purifies partir de srum,
sont capables de se fixer efficacement sur des hpatocytes primaires de Tupaa (Glebe et al,
2003; Glebe et al, 2005) contrairement des particules ne contenant que la protine S (Glebe et
al, 2005). Cependant, ces rsultats obtenus en utilisant des hpatocytes primaires de Tupaa ne
refltent peut tre pas directement le processus naturel dinfection dhpatocytes humains par le
VHB. En effet, puisquil a t suggr que la reconnaissance du rcepteur la surface des
hpatocytes de Tupaa par le domaine Pre-S1 du VHB pourrait tre lgrement diffrente de la
reconnaissance du rcepteur des hpatocytes humains (cf. chapitre Fonctions du domaine
Pre-S1 , page 47), on peut imaginer que lattachement du VHB sur des cellules humaines fasse
intervenir le domaine S alors que ce dernier nest pas impliqu dans ladsorption des virus sur
des cellules de Tupaa.
En accord avec cette dernire hypothse, plusieurs arguments suggrent limplication de
la protine S, ou du domaine S, au cours de lentre virale. Premirement, des anticorps
reconnaissant le domaine S, utiliss dans les vaccins, sont capables de neutraliser linfection in
vitro et in vivo (Glebe et al, 2003; Iwarson et al, 1985; Ogata et al, 1999; Shearer et al, 1998).
Deuximement, en contradiction avec les tudes de Glebe et al, certaines donnes suggrent que
la protine S pourrait tre implique dans ltape dattachement. En 2001, Nir Paran et al
russissent infecter des cellules de la ligne HepG2 cultives en prsence de DMSO dont la
prsence stimulerait la fixation des particules virales la surface des cellules. Bien que le
domaine Pre-S1 soit le principal lment impliqu dans cet attachement, les auteurs dmontrent
que des particules ne contenant plus les domaines Pre-S1 et Pre-S2 sont capables dinteragir avec
les cellules HepG2. De plus, un peptide driv du domaine Pre-S1 (AA 10 36), interagissant
52
avec les cellules HepG2 de la mme faon que le domaine Pre-S1 entier, ninhibe pas
compltement la fixation de particules subvirales contenant de la protine S sur ces cellules,
suggrant que la protine S soit implique dans lattachement des particules virales (Paran et al,
2001). Nanmoins, linfection des cellules HepG2 nayant pas t reproduite par dautres
quipes, la pertinence de ces rsultats peut tre remise en doute. Une autre tude a dmontr
rcemment, en contradiction avec des rsultats suggrant que le VHB interagirait, grce son
domaine Pre-S1 uniquement, avec des protoglycanes hparane sulfate (cf. chapitre
Implication des protines cellulaires et autres , page 54) (Leistner et al, 2008; Schulze et al,
2007), que des particules subvirales composes de protine S uniquement interagissaient aussi
bien avec lhparine que des particules contenant des protines L (Chai et al, 2008). Ainsi, si les
protoglycanes hparane sulfate sont impliqus dans lattachement des virus aux hpatocytes
comme le suggrent les tudes de Glebe et al, Leistner et al, et Schulze et al, ces rsultats
suggrent que la protine S joue un rle dans cette tape du cycle viral.
Si la fonction prcise du domaine S, reste controverse au cours de ltape dattachement
du VHB, trois tudes rcentes ralises par lquipe de Camille Sureau ont permis didentifier
clairement un dterminant de linfectivit dans la boucle antignique de ce domaine (Fig. 21)
(Abou-Jaoude & Sureau, 2007; Jaoude & Sureau, 2005; Salisse & Sureau, 2009). Une quatrime
tude, ralise par Yann Le Duff et al a dmontr que ce dterminant tait ncessaire au
processus dinfection uniquement dans la protine S, et que sa prsence tait facultative dans la
protine L probablement du fait de la quantit majoritaire de la protine S dans lenveloppe
virale (Le Duff et al, 2009). Ce dterminant de linfectivit est dpendant de la conformation de
la boucle antignique et chevauche en partie le dterminant antignique (a). Il est constitu des 7
cystines prsentes entre les positions 121 et 149 (Abou-Jaoude & Sureau, 2007) et des rsidus
P105, V106, P108, I110, T118, G119, P120, R122, T123, K141, P142, T148 et W156 (Salisse &
Sureau, 2009) (la position 1 correspondant au premier acide amin du domaine S). Les cystines
jouent un rle central dans la fonction de ce dterminant de linfectivit. Leur engagement dans
des ponts disulfures, ainsi que lexposition pour certaines dun groupement SH libre, est
indispensable linfectivit du VHD puisque le prtraitement des virus par des agents rducteurs
ou des agents alkylants, modifiant respectivement ces deux environnements des cystines est
inhibiteur de linfection (Abou-Jaoude & Sureau, 2007). Deux hypothses principales, en accord
avec lensemble de leurs rsultats, ont t formules par les auteurs quant au rle de ce nouveau
dterminant de linfectivit :
(i) il pourrait interagir avec un rcepteur la surface des hpatocytes tel que les
protoglycanes hparane sulfate puisque ltude ralise par Chai et al suggre que la protine S
interagit aussi bien avec lhparine que le domaine Pre-S1 (Chai et al, 2008). Les rsidus chargs

53
positivement du dterminant (R122 et K141) pourraient interagir avec les charges ngatives des
hparanes sulfates. Cette hypothse est galement en accord avec les rsultats de Nir Paran
suggrant le rle de la protine S, en plus de celui de la protine L, dans lattachement (Paran et
al, 2001). Lexistence dun dterminant conformationnel de linfectivit dans la boucle
antignique de la protine S est galement supporte par lobservation quun anticorps
monoclonal reconnaissant un pitope conformationnel dans cette boucle est plus inhibiteur de
linfection quun anticorps y reconnaissant un pitope linaire (Glebe et al, 2003).
(ii) les cystines ainsi que les rsidus leur proximit dans la structure tridimensionnelle
de la boucle antignique pourraient jouer un rle lors de la libration des nuclocapsides. En
effet, les cystines tant impliques dans la formation de ponts disulfures consolidant
lenveloppe virale, leur isomrisation pourrait constituer une tape cl dans la rorganisation de
lenveloppe afin de librer les nuclocapsides dans le cytosol via un mcanisme de fusion ou de
translocation. Ainsi, la modification de la structure de la boucle antignique par des approches
gntiques ou biochimiques pourrait inhiber linfectivit en altrant le rseau de ponts disulfures,
par exemple en crant des liaisons illgitimes entre des cystines pouvant empcher le
dsassemblage de lenveloppe virale. Il est important de noter quune activit dissulfide
isomrase (dtruisant les ponts disulfures) nest pas requise la surface des cellules HepaRG
pour leur infection par le VHD, puisque leur incubation avec des agents (ne traversant pas la
membrane plasmique) rducteurs, alkylants ou des inhibiteurs des protines dissulfide isomrase
ne modifie par leur susceptibilit linfection. Ceci implique donc que la rduction des ponts
disulfures de lenveloppe ait lieu lintrieur des cellules ou que lactivit dissulfide isomrase
soit porte par les protines denveloppe elle mme. Bien que le motif CXXC (AA 121-124)
prsent dans la boucle antignique soit caractristique du site catalytique des protines dissulfide
isomrase, le fait que ce motif puisse tre altr par des dltions ou des insertions sans modifier
linfectivit du VHD signifie que, si elle existe, lactivit isomrase des protines denveloppe ne
dpend pas de cette squence (Abou-Jaoude & Sureau, 2007).

B. Implication de protines cellulaires et autres


Depuis les annes 80, de nombreuses quipes ont cherch identifier des molcules
interagissant avec les composants molculaires prsents la surface du virus. Ainsi, un grand
nombre de protines cellulaires et extracellulaires, issues du srum ou de la matrice
extracellulaire, ont t isoles. Mme si ces protines ont souvent t dcrites comme le
rcepteur au VHB, aucune na pour le moment t relie de faon irrfutable linfection.
Toutefois, leur participation ventuelle au mcanisme dadressage du virus aux hpatocytes reste

54
Figure 22. Principaux partenaires protiques, ou autres, capables dinteragir avec les protines denveloppe du
VHB. La rgion dinteraction est indique par le trait reliant chaque partenaire aux protines denveloppe. La
rgion 10-36 du domaine Pre-S1 interagissant avec de nombreuses molcules est reprsente par une boite grise.
possible. Les principaux candidats rcepteurs du VHB ainsi que les molcules interagissant avec
le virus (Fig. 22) sont regroups ci-aprs de la faon suivante :
Rgion du VHB implique dans linteraction entit de lhte implique dans linteraction
Description de linteraction.

Pre-S1 (AA10-36) Cellules HepG2


Un peptide synthtique correspondant aux acides amins 10 36 du domaine Pre-S1 interagit la surface des
cellules HepG2 et inhibe lattachement du VHB sur ces cellules. Linteraction peptide/HepG2 ou virus /HepG2
est inhibe par des anticorps dirigs contre le peptide capables de se lier aux virus natifs (Neurath et al, 1986b).

Pre-S1 (AA19-25) Foie Humain


Des particules subvirales recombinantes contenant le domaine Pre-S1 interagissent avec la membrane plasmique des
cellules du foie humain. Lattachement des particules est inhib par un anticorps monoclonal reconnaissant les
acides amins 19 25 du domaine Pre-S1 (Pontisso et al, 1989b).

Pre-S1 (AA10-36) Rcepteur aux Immunoglobulines A (IgA)


- La squence peptidique entre les rsidus 10 et 36 du domaine Pre-S1 possde une forte homologie avec un
segment dune rgion constante de la chane lourde des IgA humaines (Neurath & Strick, 1990).
- Les IgA entrent en comptition avec la fixation du VHB sur des isolats de membranes plasmiques issus de foie
humain, suggrant leur attachement sur une molcule membranaire commune prsente dans le foie (Pontisso et al,
1992).

Pre-S1 (AA10-36) Protine p31


Une glycoprotine de 34 kDa (31 kDa non glycosyle) a t isole partir de cellules HepG2 grce son affinit
pour un peptide comprenant les AA 10 36 du domaine Pre-S1 (Dash et al, 1992).

Pre-S1 (AA10-36) Interleukine 6 (IL6)


- Un peptide comprenant les acides amins 10 36 du domaine Pre-S1 interagit avec lIL6 mais pas avec les
interleukines 3, 5 et 7 (Neurath et al, 1992b).
- Des cellules CHO transfectes par lADNc de lIL6 acquirent des sites de fixation pour le peptide 10-36 (Neurath
et al, 1992a).

Pre-S1 (AA10-36) Protine p44 Squamous Cell Carcinoma Antigen 1 (SCCA1)


- Une protine de 44 KDa (HBV-BP) prsentant une forte homologie avec SCCA1, qui appartient la famille des
inhibiteurs de srine protase, a t isole grce son interaction avec les acides amins 10 36 du domaine Pre-S1.
La protine recombinante HBV-BP ainsi que des anticorps dirigs contre cette protine inhibent lattachement et
linternalisation du VHB dans des hpatocytes humains (De Falco et al, 2001).
- Des bio-nanocapsules, composes de protine L, interagissent avec une protine recombinante correspondant
SCCA1. Cette dernire inhibe la fixation des nanocapsules sur des cellules hpatiques. La surexpression de SCCA1
dans des hpatocytes de rats transgniques augmente laccumulation des bio-nanocapsules dans les hpatocytes
(Kasuya et al, 2008).

55
- Cependant, des formes solubles de SCCA1, ou des anticorps dirigs contre cette protine, ninhibent pas
linfection in vitro (Gripon, travaux non publis).

Pre-S1 (AA1-9 ; AA61-79) Protine p80 (GRP78/BiP)


- Une protine de 80 kDa (p80) issue de lysat de cellules HepG2 ou dhpatocytes humains se fixe de faon
spcifique sur des protines de fusion Pre-S1/GST (Ryu et al, 2000). Deux rgions du domaine Pre-S1 cruciales
pour linfection sont indispensables pour lattachement p80 : (i) AA 1 9, (ii) AA 61 79.
- Cette protine correspond une protine chaperon de la famille de HSC70, nomme GRP78 ou BiP. Il semblerait
finalement quelle soit implique dans le processus contrlant la conformation de la protine L ou dans lassemblage
des protines denveloppe (Cho et al, 2003).

Pre-S1 Protine p35 ou Glycraldhyde-3-phosphate-dshydrognase (GAPDH)


- Une protine de 35 KDa a t purifie grce des anticorps anti-idiotype reconnaissant la partie variable dun
anticorps monoclonal dirige contre les AA 10 36 du domaine Pre-S1 (Petit et al, 1992).
- Cette protine prsente des homologies avec la GAPDH (Duclos-Vallee et al, 1998).

Pre-S1/Pre-S2 Protine p50 (HBV BF)


La reconnaissance des rgions Pre-S par des anticorps monoclonaux est inhibe par une protine srique de 50 kDa
donnant un marquage membranaire au niveau des hpatocytes sur une coupe de foie humain en immunohistochimie
(Budkowska et al, 1993). Cette protine est une protase de la famille des mtalloprotinases matricielles qui permet
de cliver la protine M (Budkowska et al, 1997). Cependant, ni la p50, ni lEDTA, inhibiteurs de ces
mtalloprotinases, ninfluencent lefficacit dinfection des hpatocytes humains en cultures primaires (Gripon,
travaux non publis).

Pre-S1 - Nascent Polypeptide-Associated Complex Alpha Polypeptide (NACA)


La protine NACA a t isole par un criblage en double hybride entre le domaine Pre-S1 et une banque dADNc de
foie humain (Li et al, 2005).

Pre-S1/VHB dsialyl - Rcepteur aux asialoglycoprotines (ASGPR)


- Le VHB est capable de se lier, via le domaine Pre-S1, lASGPR qui est une lectine spcifique du foie permettant
linternalisation des glycoprotines dsialyles du sang dans les hpatocytes (Treichel et al, 1994).
- Les cellules HepG2 et HuH7 (ASGPR+) sont capables dinternaliser le VHB contrairement aux cellules COS
(ASPGR-) (Treichel et al, 1997).
- Le VHB dsialyl (dglycosyl) interagit plus fortement avec les cellules HepG2 que le VHB natif mais ninfecte
pas ces cellules, il peut tre internalis par des hpatocytes humains en culture primaire (Glebe & Gerlich, 2004).
- Le traitement des virus par des sialidases (appartenant la famille des glycosilases) augmente lattachement des
virus (dsialyls) sur les cellules HepG2 et conduirait leur infection via lASGPR (Owada et al, 2006).
- Cependant, lasialofetuin, qui est capable de saturer lASGPR, ninhibe pas linfection dhpatocytes humains en
culture primaire (Gripon, travaux non publis).

Pre-S1 Protoglycane Hparane Sulfate


- Des colonnes dhparines permettent daccrocher et de purifier le VHB du srum humain (Zahn & Allain, 2005).

56
- Lhparine et le dextran sulfate bloquent la fixation des particules virales la surface des cellules HepG2 et des
hpatocytes humains en culture primaire (Ying et al, 2002).
- Lattachement du VHB sur les cellules de la ligne HepaRG et leur infection peut tre inhibe par :
(i) des glycosaminoglycanes (GAG) solubles tels que lhparine et le dextran sulfate,
(ii) le traitement des cellules avec du chlorate de sodium qui inhibe la sulfatation des GAGs,
(iii) llimination des GAGs de la surface des cellules par un traitement enzymatique (Schulze et al, 2007).
- Le clivage de la rgion Pre-S des particules virales et subvirales par la trypsine inhibe leur fixation sur les colonnes
dhparine, suggrant un rle du domaine Pre-S et non du domaine S dans lattachement (Schulze et al, 2007).
- Le degr de sulfatation des GAGs semble jouer un rle dans le processus dattachement, ceci permettant peut tre
au virus de cibler prfrentiellement le foie dont les GAGs prsentent des particularits de sulfatation (Schulze et al,
2007).
- Le Polythylne glycol qui permet damplifier linfection des hpatocytes humains et des cellules HepaRG par le
VHB augmente la liaison des particules virales lhparine (Schulze et al, 2007).
- Ces donnes ont t confirmes par ltude de Leistner et al utilisant comme modle dinfection les hpatocytes
primaires de Tupaa (Leistner et al, 2008). Ces auteurs suggrent limplication du domaine Pre-S1 et non du
domaine S dans lattachement aux GAGs car leur tude prcdente a montr que des particules subvirales, produites
dans des levures et composes seulement de protines S, ne se fixaient par aux hpatocytes primaires de Tupaa
contrairement des particules subvirales contenant une protine de fusion S/Pre-S1 qui se comportent comme des
particules sriques (Glebe et al, 2005).

Pre-S1/S Hparine
- Des particules subvirales produites in vitro dans des cellules HuH7 constitues soit de protines S, soit des
protines S et L se lient efficacement et de faon quivalentes des billes dhparines. Ces rsultats sont en
contradiction avec les tudes de Schulze et al et Leistner et al (dcrites ci-dessus) puisquils suggrent que la liaison
lhparine nest pas dpendante du domaine Pre-S1 mais peut se faire via la protine S (Chai et al, 2008).
- De plus, lincapacit de particules subvirales en excs, peu importe leur composition, inhiber linfection
dhpatocytes humains en culture primaire, mne les auteurs remettre en question le rle de lhparine comme
rcepteur ncessaire la fixation et linfection par le VHB (Chai et al, 2008). Cependant, ils nexcluent pas la
possibilit selon laquelle linfection ncessiterait dans un premier temps lattachement du virus sur les GAGs, puis
linteraction du domaine Pre-S1 avec un rcepteur spcifique.

Pre-S1 (AA10-36) - Squence consensus (WTXWW), Lipoprotine lipase (LPL)


- Des protines de fusion exprimant le domaine Pre-S ont t utilises comme appt pour analyser une banque de
phage display compose de peptides alatoires. Les peptides purifis interagissant avec la rgion 10-36 du domaine
Pre-S1 prsentent la squence consensus suivante : WTXWW (Deng et al, 2007).
- La recherche de cibles contenant la squence consensus par alignement de squence ainsi que lanalyse des
proprits biochimiques des protines identifies a permis disoler la LPL. Elle est capable de capturer des particules
virales issues de srum humain et dinduire lattachement du virus sur des cellules lexprimant sa surface (Deng et
al, 2007).
- De faon intressante, les protoglycanes hparane sulfate sont un des rcepteurs de la LPL qui pourrait donc y
permettre la fixation du VHB. Sa prsence la surface des cellules peut tre limine par un traitement lhparine,
elle mme capable dinhiber linfection par le VHB. Cependant, linteraction du VHB aux protoglycanes ne doit

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pas passer uniquement par la LPL car des particules subvirales produites in vitro par des cellules HuH7 et des
levures sont capables de se lier lhparine (Chai et al, 2008; Glebe et al, 2005) alors que la LPL est synthtise
dans des tissus extra hpatiques. Nanmoins, elle pourrait participer au transport du virus sur les protoglycanes
prsents la surface des hpatocytes.

Pre-S2 (AA3-15) Albumine polymrise


- Il existe la surface du VHB un site dattachement lalbumine polymrise (Imai et al, 1979; Thung et al, 1989).
Ce site est localis dans la rgion Pre-S2. La membrane plasmique des cellules de foie humain contient des sites de
fixation pour le domaine Pre-S2 du VHB via lalbumine polymrise (Machida et al, 1983; Pontisso et al, 1989a).
Cependant, mme si lalbumine se polymrise in vivo grce lactivit enzymatique des transglutaminases, la forme
polymrise naturellement, mimant celle obtenue par un traitement la glutaraldhyde, est trs minoritaire par
rapport lalbumine native (Krone et al, 1990), qui inhibe lattachement de lalbumine polymrise aux AgHBs
(Ishihara et al, 1987) concentration physiologique.
- Des anticorps monoclonaux reconnaissant les acides amins 3 15 du domaine Pre-S2 inhibent la fixation des
virus lalbumine polymrise (Sobotta et al, 2000) et inhibent partiellement linfection dhpatocytes primaires de
Tupaa par le VHB (Glebe et al, 2003).
- Cependant, un excs dalbumine humaine ninhibe pas linfection in vitro dhpatocytes humains (Gripon, travaux
non publis).

Pre-S2 (AA1-7) Fibronectine


Un anticorps anti-idiotype mimant la rgion N-terminale glycosyle du domaine Pre-S2 de la protine M (AA 1 7)
reconnat la fibronectine prsente dans les sinusodes hpatique. Seules des particules subvirales contenant la rgion
Pre-S2 se fixent spcifiquement la fibronectine (Budkowska et al, 1995).

S Apolipoprotine H (ApoH)
Lapolipoprotine H interagit avec diffrents types de particules subvirales, quelles soient issues de srum ou
produites in vitro. Le domaine S des protines de lenveloppe serait responsable de cette interaction spcifique qui
est inhibe par un anticorps anti-HBs. Lhypothse de la participation de lApoH au cours de linfection consiste
supposer que le virus sattache lApoH prsente la surface des particules lipoprotiques du srum et que le
complexe est ensuite captur par les hpatocytes dans le cadre du mtabolisme des lipides (Mehdi et al, 1994).

S Annexine V (ou Endonexine II)


- Lannexine V, qui est une protine capable de fixer les phospholipides, interagit avec des particules subvirales
exclusivement constitues de protines S. Lannexine V de rat ne lie pas les particules subvirales, et ninhibe pas
leur interaction avec des hpatocytes humains, contrairement lannexine V humaine suggrant que linteraction est
spcifique despce (Hertogs et al, 1993).
- La surexpression dannexine V humaine dans des cellules dhpatome de rat rend ces cellules susceptibles
linfection par le VHB (Gong et al, 1999).
- Cependant, laffinit de liaison de lannexine V et de lApo H pour les particules subvirales serait due, non pas
une reconnaissance spcifique de la rgion S, mais plutt leur affinit connue pour les molcules lipidiques
(Neurath & Strick, 1994). En effet, ces deux candidats perdent leur proprit de liaison aux AgHBs, si ces derniers

58
sont pralablement dbarrasss de leurs lipides. Par ailleurs, des fragments Fab danticorps anti-HBs ninhibent pas
la fixation des particules subvirales sur lannexine V ou sur lApo H.

AgHBs Rcepteur la transferrine


Les lymphocytes T cytotoxiques peuvent capturer grce leur rcepteur la transferrine des AgHBs extracellulaires
lis la transferrine soluble (Franco et al, 1992; Gagliardi et al, 1994). Cependant, un excs de transferrine ou
danticorps dirigs contre la transferrine ou son rcepteur, na aucun effet sur lefficacit dinfection (Gripon,
travaux non publis).

Jusqu ce jour, hormis pour les hparanes sulfates, la fonctionnalit de lattachement du


virus aux molcules cites ci-dessus, lors de linfection, na pas t dmontre. Afin dinfirmer
ou de confirmer limplication relle de ces protines (ou autres) au cours du processus
dinfection, des anticorps dirigs contre ces rcepteurs potentiels ou un excs de leur forme
soluble, doivent tre tests pour leur capacit neutraliser linfection. Par ailleurs, une autre
piste intressante pour identifier le rcepteur du VHB concerne la restriction de linfection du
virus des cellules hautement diffrencies. Notamment, seules les cellules HepaRG
diffrencies en prsence de DMSO sont susceptibles linfection alors que les mmes cellules
non diffrencies ne peuvent pas tre infectes (Gripon et al, 2002). Bien que la diffrenciation
de ces cellules naugmente pas leur capacit de fixation du virus (Glebe & Urban, 2007), on peut
imaginer que le mcanisme dentre du virus puisse dpendre de rcepteurs diffrents dont
certains sont prsents sur les cellules non diffrencies et que la diffrenciation permette
lexpression de tous les rcepteurs ncessaires linfection, expliquant que bien quaucune
diffrence dattachement ne soit observe, seules les cellules diffrencies puissent tre
infectes.

C. Attachement du DHBV
Lenveloppe virale du DHBV est constitue de deux protines denveloppe, la protine S
(17 KDa) et la protine L (35 KDa). Comme pour le VHB, la protine L est myristoyle sur la
position 2 de son domaine Pre-S. Contrairement au VHB, ce dernier est en plus phosphoryl,
principalement sur la srine 118 (Borel et al, 1998; Grgacic & Anderson, 1994; Rothmann et al,
1998). Aucune de ces modifications nest ncessaire aux processus de scrtion et dassemblage.
Cependant, alors que la mutation dans les sites de phosphorylation ninhibe pas linfectivit
(Grgacic et al, 1998), la suppression du site de myristoylation gnre des mutants non infectieux
(Macrae et al, 1991).
Le rle du domaine Pre-S de la protine L du DHBV au cours de lentre virale a dabord
t dmontr par des expriences de comptition de linfection entre le virus et des particules
subvirales. En effet, ces expriences ont montr que linfection des hpatocytes primaires de

59
canard par le DHBV pouvait tre inhibe par des particules subvirales composes de protine L
et non par des particules composes de protine S (Klingmuller & Schaller, 1993). De plus,
seules les particules contenant le domaine Pre-S interagissent avec les hpatocytes.
Par la suite, Kuroki et al, ont identifi une protine membranaire de 180 KDa qui est
immunoprcipite avec les particules virales du DHBV (Kuroki et al, 1994). Ils ont dmontr
que linteraction entre cette protine et les particules virales se faisait via le domaine Pre-S
uniquement et quelle pouvait tre inhibe spcifiquement par des anticorps neutralisants
anti-PreS. La poursuite de ces travaux a permis de dterminer la nature de la gp180 ou p170
(pour la forme non glycosyle). Il sagit dune carboxypeptidase rsidente de lappareil
trans-Golgi appele carboxypeptidase D (CPD) (Kuroki et al, 1995; Tong et al, 1995). La CPD
de canard (dCPD), comme les autres carboxypeptidases D identifies aujourdhui, est constitue
de : (i) trois domaines extracellulaires (A, B et C) homologues aux carboxypeptidases E qui sont
aussi exposes dans la lumire de lappareil de Golgi, (ii) dun domaine transmembranaire, et
(iii) dune rgion C-terminale cytoplasmique hautement conserve ncessaire au maintien de la
protine dans le rseau trans-Golgien (Eng et al, 1999; Kuroki et al, 1995). Le domaine C, situ
proximit de la rgion transmembranaire de la CPD et ne possdant pas dactivit enzymatique,
est responsable de linteraction de trs haute affinit avec le DHBV (Kuroki et al, 1995;
Spangenberg et al, 2001; Urban, 2004; Urban et al, 2000). Cependant, malgr son homologie
avec le domaine C de la dCPD, le domaine C des CPD humaines et murines ninteragit pas avec
le domaine Pre-S du DHBV (Ishikawa et al, 1998). De faon intressante, Spangenberg et al ont
dmontr que lintroduction dune rgion N-terminale du domaine C de la dCPD dans le
domaine C de la CPD humaine permettait cette dernire dinteragir avec le domaine Pre-S du
DHBV, suggrant ainsi le rle de la CPD dans la spcificit despce des hepadnavirus
(Spangenberg et al, 2001). La rgion du domaine Pre-S implique dans linteraction avec la
dCPD a t identifie grce lutilisation de peptides drivs du domaine Pre-S capables
dinhiber linfection in vitro par le DHBV. Lutilisation de tels peptides, dlts aux extrmits
ou en position interne, a permis de localiser la rgion ncessaire linhibition de linfection entre
les rsidus 30 et 115 du domaine Pre-S. Ensuite, la corrlation troite entre la capacit des
peptides inhiber linfection et leur capacit lier la dCPD a permis de dduire que la rgion 30-
115 du domaine Pre-S bloquait linfection en ciblant la dCPD la surface des hpatocytes
(Breiner et al, 1998; Urban et al, 1998). Les nombreuses tudes menes pour identifier la rgion
minimale du domaine Pre-S ncessaire la fixation de la CPD ont permis de dlimiter cette
rgion entre les rsidus 87 et 115 (Breiner et al, 1998; Ishikawa et al, 1994; Tong et al, 1995;
Urban et al, 1999; Urban et al, 2000). La squence en position N-terminale de cette rgion, entre
les acides amins 30 et 86 contribue la stabilit de linteraction entre le domaine Pre-S et la

60
CPD, et permet ainsi la mise en place dune interaction extrmement stable entre les deux
molcules (Urban et al, 2000).
De faon intressante, un peptide correspondant au domaine Pre-S du HHBV (virus du
Hron), dont la squence diffre denviron 50 % de celle du domaine Pre-S du DHBV, est
capable de bloquer linfection par le DHBV en interagissant avec la dCPD et ce malgr la
spcificit despce observe entre ces deux avihepadnavirus. Ainsi, si lincapacit
dattachement des avihepadnavirus une CPD mammalienne peut expliquer leur incapacit
infecter les mammifres, leur attachement ce rcepteur ne peut expliquer la spcificit despce
observe entre les avihepadnavirus (Urban et al, 1998). Dans une tude ultrieure, Urban et
Gripon ont dmontr quun peptide myristoyl driv de la rgion N-terminale du domaine Pre-
S1 (AA 2-41) de la protine L du DHBV, chevauchant la rgion implique dans la spcificit
dhte entre le DHBV et le HHBV (AA 22-37) (Ishikawa & Ganem, 1995) mais nincluant pas
le site de fixation la CPD, tait capable dinhiber spcifiquement linfection dhpatocytes
primaires de canard par le DHBV (Urban & Gripon, 2002). De faon surprenante, alors quun
peptide quivalent humain ne bloque pas linfection par le DHBV comme cela tait anticip, un
peptide driv du domaine Pre-S du HHBV linhibe fortement. Malgr ces rsultats, puisque la
rgion du domaine Pre-S qui est ncessaire linhibition de linfection par ces peptides
correspond la rgion implique dans la spcificit despce entre le DHBV et le HHBV, les
auteurs suggrent que ltape du cycle viral cible par les peptides est celle implique dans la
spcificit dhte entre les virus. Le fait que le domaine Pre-S du HHBV permette dinhiber
linfection dhpatocytes primaires par le DHBV, signifie quil peut, comme le domaine Pre-S
du DHBV, interagir avec un rcepteur (autre que la CPD) sur les hpatocytes de canard. Ainsi, si
la fixation sur ce rcepteur ne dtermine pas la spcificit despce entre le DHBV et le HHBV,
lincapacit du second infecter les hpatocytes de canard doit tre associe une tape
ultrieure lattachement des virus sur ce rcepteur telle quun clivage protolytique ou un
changement de conformation (Urban & Gripon, 2002). Par ailleurs, des anticorps reconnaissant
la rgion 12-23 des peptides drivs de lextrmit N-terminale du domaine Pre-S sont capables
dinhiber linfection par le DHBV sans affecter la liaison avec la CPD, et dimmunoprcipiter les
particules virales, dmontrant le rle crucial de cette rgion lors de linfection et son exposition
la surface des virions (Schmut, 2006).
En conclusion, les donnes concernant ltape dattachement du DHBV sont beaucoup
plus compltes que celles concernant le VHB. Notamment, lidentification de la dCPD comme
rcepteur de haute affinit pour le DHBV constitue une dcouverte majeure dans la
comprhension de lentre virale de ce virus. De nombreux rsultats ont permis de valider cette
protine cellulaire comme candidat rcepteur :

61
1. Des peptides drivs du domaine Pre-S capables dinteragir avec la dCPD inhibent
linfection des hpatocytes primaires de canard par le DHBV (Breiner et al, 1998; Urban et al,
1998).
2. La forme soluble de la dCPD, ainsi que des anticorps dirigs contre cette protine,
bloquent linfection par le DHBV (Ishikawa et al, 1998; Urban et al, 2000).
3. Alors que la transduction de la dCPD sauvage dans des hpatocytes primaires de canard
augmente le niveau dinfection, la transduction dun mutant de la dCPD, dont lendocytose est
inhibe, abolit linfection par le DHBV dans les cellules transduites, suggrant que lendocytose
du DHBV via linternalisation de la dCPD est ncessaire linfection (Breiner & Schaller,
2000). La transduction de rcepteurs mutants dont le transport vers les lysosomes est augment
par rapport au rcepteur sauvage est galement dfavorable pour linfection, signifiant que les
virus doivent tre transports dans les endosomes lors du processus dinfection mais pas au del.
4. La dCPD est sous exprime dans les cellules infectes suite lexpression des protines de
lenveloppe virale, ce qui permettrait dempcher la superinfection des hpatocytes par le DHBV
(Breiner et al, 2001).
5. Des mutants du DHBV porteurs de mutations uniques empchant leur fixation la dCPD
ne sont pas infectieux (Glebe & Urban, 2007).
Cependant, la dCPD nest probablement pas le seul rcepteur du DHBV puisque la
transfection de cellules non susceptibles linfection, capables de rpliquer le gnome viral, par
un vecteur dexpression de cette protine ne permet pas dinfecter les cellules transfectes
(Breiner et al, 1998). Ces rsultats sont cohrents avec les donnes de Urban et Gripon qui ont
identifi des peptides, correspondant lextrmit N-terminale du domaine Pre-S1, capables
dinhiber linfection par le DHBV probablement en se fixant sur un rcepteur des hpatocytes
autre que la dCPD (Urban & Gripon, 2002). Ainsi, la fonction prcise de la dCPD au cours de
lentre virale est encore inconnue ainsi que le moment et le lieu auquel elle intervient, soit la
surface des cellules pour fixer les virus, soit lintrieur des cellules pour induire la libration
des nuclocapsides dans le cytosol.
Aprs lidentification de la carboxypeptidase D comme rcepteur du DHBV, Li et al ont
identifi une protine de 120 kDa (p120) correspondant la sous-unit P de la glycine
dcarboxylase (GDC), retrouve prfrentiellement dans le foie, le pancras et les reins, et qui
est capable dinteragir avec le domaine Pre-S du DHBV lorsque ce dernier est cliv en position
C- ou N-terminale (Li et al, 1999; Li et al, 1996). Linactivation de cette protine, qui a t
localise en partie la surface des cellules, dans des hpatocytes primaires de canard grce des
ARNs interfrents diminue leur susceptibilit linfection. De ce fait, il a t suggr que la
p120 pourrait agir comme un cofacteur ncessaire linfection du DHBV aprs le clivage

62
protolytique de la protine L (Li et al, 2004). Toutefois, son rle lors de linfection par le
DHBV nest probablement pas indispensable car un virus mutant incapable dinteragir avec cette
protine demeure compltement infectieux (Schmut, 2006).
Pour conclure, jusqu aujourdhui, aucun rle na t attribu la protine S des protines
denveloppe du DHBV au cours de lentre virale contrairement ce qui a t dmontr pour le
VHB (Salisse & Sureau, 2009). Cependant, le dterminant de linfectivit identifi dans le
domaine S des protines denveloppe du VHB, qui pourrait tre impliqu dans ltape
dattachement, tant localis dans la boucle antignique, ce rsultat nest pas surprenant car la
protine S du DHBV, plus petite que celle du VHB, ne possde pas dhomologie de squence
avec le VHB dans la rgion de la boucle antignique (Glebe & Urban, 2007).

II. Libration des nuclocapsides


A. Compartiment cellulaire
1. Cas du DHBV
Bien que linfection des hpatocytes primaires de canard par le DHBV soit trs efficace si
lon considre le nombre de cellules infectes dans une culture (100 %), les connaissances sur
le mode dinternalisation des particules virales et leur trafic lintrieur des cellules avant la
libration des nuclocapsides sont limites. On peut citer trois raisons majeures pour expliquer
les nombreux points dinterrogation ayant toujours trait cette tape du cycle viral : (i) les
hpatocytes primaires ne peuvent pas tre transfects efficacement, rendant les tudes utilisant
des dominants ngatifs de protines impliques dans le trafic intracellulaire difficiles ; (ii) la
quantit de virus internalise dans les cellules infectes est trs faible mme lorsque le nombre
de virus par cellule (multiplicit dinfection) est trs lev au moment de linfection. Ainsi,
lobservation de la voie dinternalisation emprunte par les virus dans les hpatocytes requiert
des mthodes de microscopie fluorescence trs sensibles (Chojnacki et al, 2005) ; (iii) compte
tenu des limites prcdentes, de nombreuses tudes sont ralises en utilisant des drogues
interfrant avec lacidification des endosomes et le trafic vsiculaire. Ainsi, selon le protocole
(dose, dure dincubation, modle cellulaire) et les drogues utilises, les conclusions issues de
ces tudes sont parfois diffrentes et contradictoires (Offensperger et al, 1991; Rigg & Schaller,
1992). Cependant, la majorit des rsultats concernant le trafic intracellulaire des virus a t
obtenue grce lutilisation de ces drogues. Les principales molcules utilises dans les
diffrentes tudes ainsi que leurs fonctions sont rsumes ci-dessous :
Le chlorure dammonium (NH4Cl) et la chloroquine sont deux bases faibles
lysosomotropiques qui perturbent le gradient de pH entre le cytoplasme et les endosomes et
lysosomes. Elles permettent ainsi laugmentation du pH dans ces compartiments.

63
La monensine est un agent lysosomotropique qui bloque l'acidification des endosomes et
le transport intracellulaire des protines. Cest un ionophore pouvant former des complexes avec
les ions sodium et les protons.
La bafilomycine A1 et la concanamycine A sont des inhibiteurs des v-ATPase (vacuolar
type ATPase) qui sont des pompes protons capables de crer un gradient de protons entre deux
compartiments, en hydrolysant de l'ATP. Ces dernires sont prsentes dans la membrane des
vsicules d'exocytose et d'endocytose, dans celle des lysosomes, des endosomes et des vsicules
de l'appareil de Golgi. Elles maintiennent un pH acide dans ces compartiments. Linhibition de
leur fonctionnement engendre non seulement un problme dacidification dans les
compartiments concerns mais galement un blocage de la formation et de la maturation des
vsicules de transport endosomales partir des endosomes prcoces (Clague et al, 1994;
Yoshimori et al, 1991), bloquant ainsi le transport vers les endosomes tardifs.
La brfeldine A est un antibiotique, produit par des champignons, qui prsente une
activit anti-virale. Elle interfre avec le transfert des protines entre le RE et lappareil de Golgi
en inhibant le transport vers lappareil de Golgi, ce qui aboutit laccumulation des protines
dans le RE. Elle cible un facteur dchange du GTP dont lactivit est ncessaire la formation
des vsicules de transport entre certains compartiments cellulaires (Lippincott-Schwartz et al,
1991).
La wortmannine est un inhibiteur irrversible des phosphatidyl-inositol-3-kinases (PI-3K)
qui sont des kinases cellulaires, phosphorylant des lipides, impliques dans le trafic vsiculaire.
Les vsicules dendocytose formes aprs invagination de la membrane plasmique sont diriges
vers des endosomes prcoces avec lesquels elles fusionnent. Dans ces compartiments seffectue
un tri slectif entre les molcules qui seront dgrades et adresses aux endosomes tardifs, et
celles qui seront recycles vers la membrane plasmique directement ou via des endosomes de
recyclage. Les inhibiteurs des PI-3K tels que la wortmannine (peu spcifique) inhibent le
recyclage depuis les endosomes prcoces et galement le trafic entre les endosomes tardifs et les
lysosomes (Reaves et al, 1996).
Le nocodazole est une drogue qui inhibe la polymrisation des microtubules. Elle inhibe
donc le transport vsiculaire dpendant des microtubules et provoque notamment laccumulation
de matriel entre les endosomes prcoces et les endosomes tardifs, dans des vsicules de
transport entre ces deux compartiments (Bayer et al, 1998).

Lutilisation des agents lysosomotropiques (NH4Cl, Chloroquine et Monensine) a conduit


dans un premier temps lobtention de rsultats contradictoires quant au rle du pH dans
lentre du DHBV. En effet, tandis que Offensperger et al observaient un effet inhibiteur de ces

64
agents sur linfection, suggrant que lacidification des endosomes tait ncessaire lentre
virale (Offensperger et al, 1991), Rigg et Schaller dmontraient le contraire (Rigg & Schaller,
1992). Cependant, il est important de noter que dans ltude de Offensperger et al, les cellules
taient traites pendant plusieurs jours par les drogues conduisant probablement des effets non
spcifiques et indirects comme cela a t dmontr ensuite par Kock et al (Kock et al, 1996a).
En effet, ces derniers ont observ dune part que linfection par le DHBV ntait pas inhibe par
le NH4Cl et donc tait indpendante de lacidification des endosomes, et dautre part que le
traitement prolong des hpatocytes par cette drogue diminuait progressivement leur capacit de
rplication du gnome viral. Lentre du DHBV tant indpendante du pH, les auteurs ont voulu
dterminer si lendocytose des particules virales tait ncessaire pour quelles librent leur
nuclocapside. Lendocytose est un mcanisme actif ncessitant de lnergie, dpendant de
lATP, qui peut tre bloqu par des inhibiteurs de la synthse de lATP tels que lazide de
sodium. Ils ont donc test leffet de la dpltion en nergie sur linfection par le DHBV en
traitant des hpatocytes primaires de canard par cette drogue. Leurs rsultats suggrent que
linfection ncessite lendocytose des virus contrairement a ce qui est observ pour un virus
contrle fusionnant la membrane plasmique mme en prsence de la drogue, excluant ainsi un
effet toxique et non spcifique de cette dernire (Kock et al, 1996a). Lhypothse dune entre
virale indpendante de lacidification des endosomes mais dpendante de lendocytose propose
par ces auteurs est originale par rapport aux mcanismes dentre connus dautres virus
(Harrison, 2008; Kielian & Rey, 2006), cependant une tude rcente mene par Funk et al a
conduit la mme conclusion (Funk et al, 2006). Dans un premier temps, ces auteurs ont
dmontr en 2004, que linfection par le DHBV tait initie par lattachement dun petit nombre
de virus ( 10 par cellules) la surface des hpatocytes mme lorsque la quantit de virus
utilise permet de fixer en thorie plus de 1000 virus par cellule. Dans un deuxime temps ils ont
dmontr que les particules subvirales se fixaient galement spcifiquement aux hpatocytes
comme les virions et quil y avait environ 1x104 sites de fixation par cellule pour lensemble des
particules virales, suggrant que le nombre de rcepteurs la surface des hpatocytes est limit
(Funk et al, 2004). Ensuite ils ont dmontr que linternalisation des virus fixs se faisait en
moins de 3 heures. Puisque lADNccc nest retrouv dans le noyau des cellules infectes que 20
heures aprs ltape dattachement (Kock & Schlicht, 1993), et que 3 heures suffisent
linternalisation des virus fixs, les auteurs ont suggr que la dure du trafic intracellulaire des
virus permettant la libration de lADN viral (ADNrc) dans le noyau, devait tre de plusieurs
heures, ce qui est trs long par rapport des cintiques dentre connues dautres virus. Enfin, ils
ont dmontr que le succs de linfection ncessitait un transport vsiculaire des virus dpendant
des microtubules et indpendant des microfilaments dactine (Funk et al, 2004). Dans leur tude

65
de 2006, la mme quipe a test leffet de nombreuses drogues sur linfection dhpatocytes
primaires par le DHBV afin de complter ces rsultats (Funk et al, 2006). Les donnes quils ont
obtenues ainsi que leurs conclusions sont rsumes ci-dessous :
Les agents lysosomotropiques tels que le NH4Cl et la Monensine ninhibent pas linfection.
Lentre du DHBV semble indpendante de lacidification des endosomes.
Aprs avoir incub les virus sur les cellules 4C pour permettre leur attachement, les
auteurs ont remis les cellules en culture 37C pendant diffrents temps avant de raliser un
fractionnement subcellulaire afin de localiser lADN viral dans la cellule.
3 heures aprs le passage 37C, 100 % des virus (ADN viral) sont prsents dans les
endosomes.
6 heures aprs le passage 37C, quelques molcules dADN viral sont retrouves dans
le cytoplasme mais la majorit reste dans les endosomes.
9 heures aprs le passage 37C, la quantit dADN viral dans le cytoplasme est en
augmentation. La quantit totale dADN viral dans les cellules augmente toujours
proportionnellement au temps dincubation 37C avec les virus signifiant que ces derniers
continuent a tre internaliss. De faon intressante, la protine L contrairement lADN
viral, nest retrouve que dans les endosomes, peu importe le moment de lanalyse. De plus,
sa quantit globale diminue entre 6 heures et 9 heures dincubation, suggrant quaprs son
accumulation dans les endosomes entre 3 et 6 heures, elle est transporte dans un
compartiment cellulaire ou elle est dgrade. LADN viral, par contre, nest pas dgrad dans
cette fentre de temps. Des tudes de microscopie lectronique sur les fractions endosomales
9 heures aprs la fixation des virus ont permis dobserver des particules virales intactes
lintrieur des vsicules endosomales et des structures plus petites, sans enveloppe,
correspondant probablement des nuclocapsides nues. Les endosomes contenant les
particules virales peuvent tre immunoprcipits avec des anticorps dirigs contre la protine
Rab5 dont la prsence est caractristique des endosomes prcoces.
La wortmannine ninhibe pas linfection par le DHBV. Cette drogue inhibe, entre
autre, le transport entre les endosomes et les lysosomes.
La libration des nuclocapsides dans le cytoplasme ne ncessiterait donc pas le
transit des virus par les lysosomes.
La brfeldine A qui dsorganise lappareil de Golgi et inhibe galement le trafic
entre les endosomes et les lysosomes, ninhibe pas linfection par le DHBV.
Le transport des virus vers lappareil de Golgi nest pas ncessaire linfection.
La bafilomycine A1 et la concanamycine A, qui bloquent le transport vsiculaire
partir des endosomes prcoces ainsi que leur acidification, inhibent linfection par le DHBV

66
avant la libration de lADN viral dans le noyau. De plus, le traitement par la bafilomycine
A1 engendre laccumulation de protine L et dADN viral, donc de virus, dans les
endosomes.
Puisque lacidification des endosomes nest pas ncessaire linfection, laction
de ces drogues doit passer par linhibition du transport vsiculaire. Ainsi, linfection par le
DHBV ncessiterait un transport vsiculaire des virus, partir des endosomes prcoces,
dpendant de lactivit des V-ATPase.
Le nocodazole, qui bloque le transport entre les endosomes prcoces et tardifs, inhibe
linfection par le DHBV et provoque laccumulation de virus dans la fraction endosomale.
La libration des nuclocapsides du DHBV ncessite un transport vsiculaire
entre les endosomes.
La bafilomycine A1, en bloquant le fonctionnement des v-ATPase, inhibe limport
de protons dans les endosomes et en consquence modifie le potentiel lectrique de la membrane
des endosomes (Sonawane et al, 2002). Afin de dterminer si la perturbation de ce paramtre est
importante pour linfection, en plus de la perturbation du trafic vsiculaire, de nouvelles
expriences ont t ralises. Leffet dun traitement simultan des cellules avec de la
bafilomycine A1 et un ionophore tel que la monensine qui est capable de restaurer le potentiel de
membrane perturb par la bafilomycine (Malecki et al, 2002) a t test. Ce traitement permet de
restaurer partiellement linfectivit du DHBV qui tait inhibe par la bafilomycine A1.
Le potentiel de membrane des endosomes joue un rle dans linfection par le DHBV.

En conclusion, lentre du DHBV ncessiterait donc lendocytose des virus, leur adressage
dans les endosomes prcoces et leur transport partir de ces derniers vers un compartiment
toujours inconnu ne correspondant ni aux lysosomes, ni lappareil de golgi. De plus, le
mcanisme permettant la libration des nuclocapsides dans le cytosol serait indpendant de
lacidification des endosomes mais ncessiterait le maintien du potentiel de membrane au sein de
ces organites.

Par une autre approche, en suivant lendocytose des particules virales par microscopie
confocale, Chojnacki et al semblent avoir identifi le compartiment cellulaire au sein duquel la
libration des nuclocapsides aurait lieu. Aprs leur fixation sur les hpatocytes 4C, les virus
sont internaliss et peuvent tre colocaliss dans les endosomes, prcoce et tardifs probablement,
avec de la transferrine marque, ce qui est en accord avec les tudes de Kock et al et Funk et al
(Funk et al, 2006; Funk et al, 2004; Kock et al, 1996a). Linfection peut tre inhibe par la
bafilomycine A1 lorsque celle-ci est ajoute ds le dbut de linfection, confirmant le rle du

67
trafic endosomal lors de lentre virale. Le blocage de linfection diminue progressivement
lorsque la bafilomycine est ajoute avec un temps de latence aprs la fixation des virus, et son
effet disparat compltement si elle ajoute 8h aprs la fixation des virus, suggrant que tous les
virus ont t transport, probablement dans les endosomes tardifs compte tenu de leur
colocalisation avec de la transferrine marque, au bout de 8 heures aprs le dbut de leur
internalisation (Chojnacki et al, 2005). Cependant, les auteurs ne prsentent aucune preuve
directe du passage des virus dans les endosomes tardifs telle que la colocalisation des virions
avec des marqueurs spcifiques de ces compartiments (par exemple LAMP1). Toutefois, en
accord avec les tudes de Funk et al, ces rsultats suggrent que le trafic intracellulaire des
particules virales est un processus long pouvant tre bloqu par un inhibiteur du transport
vsiculaire entre les endosomes prcoces et les endosomes tardifs (Funk et al, 2006; Funk et al,
2004). De plus, puisque les agents lysosomotropiques tels que le NH4CL et la chloroquine ne
bloquent pas linfection par le DHBV (Kock et al, 1996a; Rigg & Schaller, 1992), alors quils
sont capables de neutraliser le pH dans les endosomes prcoces (puisquils bloquent linfection
par le Semliki Forest virus), Chojnacki et al suggrent que la libration des nuclocapsides de
lenveloppe virale du DHBV se ferait grce un mcanisme de fusion dans les endosomes
tardifs dont le pH ne serait pas neutralis par ces agents. En effet, des virus dont le peptide de
fusion de la protine L est mut restent bloqus dans les endosomes et peuvent tre colocaliss
avec la transferrine sans doute suite un blocage du mcanisme de fusion (cf. chapitre Les
protines de fusion des hepadnaviridae , page 76) (Chojnacki et al, 2005). Enfin, les rsultats de
cette tude dmontrent que le mcanisme de fusion serait potentialis par un pH acide mais
pourrait galement avoir lieu un pH neutre. Le modle propos par ces auteurs qui est en
accord avec la majorit des tudes concernant le trafic intracellulaire des particules virales est
donc le suivant : (i) attachement des virus sur leur rcepteur la surface des hpatocytes, (ii)
endocytose des particules virales, (iii) transport des virus des endosomes prcoces vers les
endosomes tardifs, (iv) changement de conformation de la protine L, facilit par un pH acide,
ncessaire linduction du mcanisme de fusion, (v) fusion entre lenveloppe virale et la
membrane des endosomes tardifs aboutissant la libration des nuclocapsides dans le
cytoplasme.

2. Cas du VHB
En comparaison avec le modle du DHBV, le nombre de travaux publis ayant vis
identifier la voie utilise par le VHB pour entrer dans les hpatocytes est trs limit. La
principale tude sur ce sujet a t ralise en 1997 par Hagelstein et al. Daprs ce travail,
lentre du VHB serait indpendante de lacidification des endosomes puisque linfection
dhpatocytes humains en culture primaire par le VHB nest pas bloque par un prtraitement
68
des virus pH acide et quelle nest pas affecte par la prsence dagents lysosomotropiques
(Hagelstein et al, 1997).

B. Mcanisme
Aprs leur adsorption la surface des cellules et leur internalisation, les virus doivent
librer leur nuclocapside dans le cytoplasme afin que le processus dinfection se poursuive.
Deux mcanismes, la translocation ou la fusion, pourraient tre impliqus dans cette tape du
cycle viral :

1. Translocation
Une squence peptidique prsente dans le domaine Pre-S2 des protines denveloppe des
hepadnavirus, capable de traverser les membranes cellulaires grce un mcanisme indpendant
de lnergie, a t identifie en 2000 par Oess et Hildt (Oess & Hildt, 2000). Cette squence,
nomme translocation motif (TLM) est localise entre les acides amins 41 et 52 du domaine
Pre-S2 du VHB. La structure du TLM correspond une hlice amphipatique capable dinduire
le transfert, travers les membranes, de peptides, dacides nucliques, et de protines qui y sont
fusionns, via un mcanisme indpendant de lnergie et de la reconnaissance dun rcepteur
(Hafner et al, 2003; Oess & Hildt, 2000; Saher & Hildt, 1999). Le mcanisme de translocation
est encore mal connu. De nombreuses protines capables de traverser les membranes et
contenant un motif comparable au TLM ont t identifies dans la littrature. Ces protines
contiennent un motif peptidique de type cell penetrating peptide (CPP) leur permettant de
traverser les membranes. Deux grands types de CPPs peuvent tre distingus dun point de vue
structural, les polycations riches en rsidus arginines et les hlices amphipatiques [pour revue,
consulter la rfrence (Heitz et al, 2009)]. Ces peptides sont particulirement tudis dans les
domaines de la thrapie gnique et de la vectorisation des mdicaments du fait de leur proprit
de transfert intracellulaire de molcules.

a. Cas du DHBV
La protine L du DHBV contient deux motifs de translocations localiss entre les rsidus
20 et 31 (TLM1) et 42 et 53 (TLM2) du domaine Pre-S (Stoeckl et al, 2006). Grce une tude
de mutagense, consistant en la dltion simple ou simultane des TLMs, Stoeckl et al ont
dmontr que les TLMs ntaient pas indispensables au mcanisme dassemblage viral. A
linverse, la dltion de ces motifs inhibe compltement linfection des hpatocytes primaires de
canard par le DHBV. Des tests dattachement des particules virales la surface des hpatocytes
primaires, ainsi que la quantification des virus internaliss 3 heures aprs leur fixation la
surface des cellules suggrent que les TLMs jouent un rle aprs lendocytose des particules
virales. Comme nous lavons vu dans le chapitre prcdent, il est probable que linfection par le
69
Figure 23. Modle reprsentant le mcanisme de translocation par lequel les virus libreraient leur
nuclocapside dans le cytoplasme des cellules infectes. Aprs la reconnaissance dun rcepteur la surface des
cellules, les virus sont internaliss puis adresss aux endosomes. Le pH acide ainsi que les protases de ces
compartiments intracellulaires induisent un changement de conformation des protines denveloppe qui permet
lexposition du motif de translocation du domaine Pre-S2 la surface des particules. Les virus peuvent alors
traverser la membrane des endosomes afin de se retrouver dans le compartiment cytoplasmique dont
lenvironnement rducteur permet la dissociation des ponts disulfures de lenveloppe virale qui devient alors
accessible aux protases cytoplasmiques. Source : (Stoeckl et al, 2006).
DHBV ncessite lendocytose des virus et leur transport vers les endosomes tardifs. En se basant
sur ces donnes, Stoeckl et al ont ralis des expriences afin de tester lhypothse selon laquelle
les TLMs pourraient tre impliqus dans la libration des virus des endosomes afin quils
atteignent le compartiment cytoplasmique. Ils ont observ que dix heures aprs linfection, les
virus dont les TLMs avaient t dlts saccumulaient dans la fraction endosomale des cellules,
et que contrairement aux virus sauvages, on ne les retrouvait pas dans la fraction cytoplasmique.
Ces rsultats leur ont permis de dmontrer que la libration des virus internaliss, partir des
endosomes, ncessitait la fonctionnalit des TLMs. Des expriences dimmuno-prcipitation
avec des anticorps dirigs contre les TLMs ont ensuite permis de dmontrer que les particules
virales natives nexposaient pas leur surface les TLMs, empchant ainsi leur translocation au
niveau de la membrane plasmique. Leur exposition ncessite le passage des virus dans le
compartiment endosomal dans lequel un ou plusieurs clivages protolytiques sont ncessaires.
Lensemble de ces rsultats a permis dlaborer un nouveau modle concernant le mcanisme
dentre du DHBV, selon lequel les virus sont internaliss, adresss vers les endosomes dans
lesquels un clivage protolytique permettrait lexposition leur surface des TLMs, puis librs
dans le cytoplasme grce un mcanisme de translocation (Fig. 23). Une fois dans le
cytoplasme, il est probable que lenvironnement rducteur de ce compartiment permette la
rduction des ponts disulfures de lenveloppe et affecte les interactions nuclocapside protines
de surface, librant ainsi les capsides de lenveloppe virale afin quelles soient adresses au
noyau des cellules.

b. Cas du VHB
Aprs avoir dmontr le rle des TLMs de la protine L du DHBV lors de linfection,
Stoeckl et al ont voulu confirmer leurs rsultats dans le modle du VHB. Pour cela, ils ont
incub des particules virales pendant 1 heure avec un lysat dendosomes de cellules HepG2, puis
ont utilis ces particules pour infecter des cellules HuH7 normalement non susceptibles
linfection. Linfection de prs de 40 % des cellules HuH7 dans ces conditions suggre que
lexposition du TLM, prsent dans le domaine Pre-S2 des protines L et M du VHB, a permis la
translocation des virus directement la membrane plasmique et ainsi a permis linfection des
cellules (Stoeckl et al, 2006). Lobtention de rsultats comparables avec le modle du DHBV
renforce lhypothse selon laquelle le TLM est ncessaire linfection. Cependant, ces rsultats
dmontrent le rle du TLM du domaine Pre-S2 du VHB de faon indirecte sans utiliser de virus
dont le TLM est dlt pour infecter des cellules susceptibles linfection telles que des
hpatocytes primaires ou des cellules HepaRG. De plus, Le Seyec et al ont dmontr dans une
tude ralise en 1998 que la squence abritant le TLM, dans la protine L, ntait pas implique
dans les tapes dassemblage et dinfection (Le Seyec et al, 1998). Le TLM de la protine M
70
nayant pas t dlt dans cette tude, une partie de mon travail de thse a consist vrifier le
rle du TLM du domaine Pre-S2 des protines denveloppe du VHB lors de ltape dinfection.
Les rsultats de ce travail constituent le premier chapitre de la partie rsultats de ce
manuscrit. En parallle de notre tude, deux quipes ont voulu vrifier le rle du TLM du VHB
lors de linfection. Ces tudes ont dmontr en accord avec nos rsultats que le TLM prsent
dans le domaine Pre-S2 des protines L et M ntait pas ncessaire au processus dinfection par
le VHB ou le VHD (Blanchet & Sureau, 2007; Gudima et al, 2007).

2. Fusion
Aprs l'adsorption des virus la surface des cellules grce linteraction de leurs
protines de surface avec un ou plusieurs rcepteurs cellulaires, les virus envelopps doivent
classiquement librer leur nuclocapside dans le cytoplasme des cellules cibles grce un
mcanisme de fusion entre l'enveloppe virale et une membrane cellulaire [pour revue, consulter
la rfrence (Harrison, 2008)]. Le processus de fusion membranaire suppose plusieurs tapes
dfavorables d'un point de vue nergtique. Il ncessite le rapprochement de l'enveloppe virale et
de la membrane plasmique, dfavorable du fait des forces de rpulsions lectrostatiques qui
s'exercent entre les deux membranes, mais aussi du fait de la prsence de molcules d'eau qui
interfrent dans le rapprochement des deux membranes lipidiques. De mme, la fusion
membranaire est elle-mme nergtiquement coteuse puisqu'elle ncessite la dstabilisation de
la structure ordonne des deux bicouches lipidiques. L'nergie ncessaire la fusion est fournie
par les glycoprotines d'enveloppe, qui passent lors du processus de fusion, d'une conformation
pr-fusionnelle mtastable, une conformation post-fusionnelle plus stable et donc
nergtiquement plus favorable.
A ce jour, deux mcanismes permettant de dclencher ce changement de conformation
aboutissant la fusion entre l'enveloppe virale et la membrane cytoplasmique ont t dcrits,
selon les virus :
Pntration pH-indpendante : le changement de conformation est induit par
l'interaction entre un rcepteur membranaire et une protine d'enveloppe ; la fusion a
lieu directement au niveau de la membrane plasmique.
Pntration pH-dpendante : suite ltape dattachement, une protine de l'enveloppe
interagit avec un rcepteur cellulaire qui oriente le virus vers une voie d'endocytose.
Au niveau de l'endosome, l'acidification du milieu entrane la protonation de certains
rsidus de la glycoprotine, qui la dstabilise et dclenche le changement de
conformation l'origine du processus de fusion.
Selon lorganisation et la conformation des protines de surface et le mcanisme de fusion
impliqu, trois grandes classes de protines de fusion ont t identifies. Les protines
71
denveloppe du VHB ne semblent pas y avoir leur place compte tenu de leur structure prsume
qui est trs diffrente de celle des protines de fusion connues.

a. Les protines de fusion de classe I


Lhmagglutinine (HA) du virus de la grippe de type A (Orthomyxoviridae) constitue le
prototype des protines de fusion de classe I. Elle a t la premire protine de fusion pour
laquelle des donnes structurales ont t disponibles. Ds 1981, la structure de son domaine
extracellulaire a t cristallise dans une conformation pr-fusionnelle (Wilson et al, 1981).
Treize ans plus tard, la mme protine a t cristallise dans sa conformation post-fusionnelle
(Bullough et al, 1994). La comparaison de ces deux structures a permis didentifier les
changements de conformation induits par le mcanisme de fusion [pour revue, consulter la
rfrence (Harrison, 2008)]. Depuis, l'tude de nombreuses protines de fusion virales a permis
de mettre en vidence des similitudes de structure et de mcanisme ractionnel entre les
protines de fusion des virus appartenant aux familles des Paramyxoviridae, des Filoviridae, des
Retroviridae et des Coronaviridae. Les protines de surface de ces virus, dites de classe I,
partagent plusieurs proprits (Kielian & Rey, 2006) telles que :
- La maturation des protines de fusion implique le clivage dun prcurseur de haut poids
molculaire en deux sous-units (ex : La protine HA est clive pour gnrer les sous-
units HA1 et HA2).
- lhlice est la structure secondaire majoritaire de ces protines.
- le changement de conformation lors de la fusion provoque la transition entre un trimre
mtastable de protines de fusion et un trimre plus stable des mmes protines.
- Le mcanisme de fusion fait intervenir une structure trimrique de type coiled-coil
qui permet le repliement des protines de fusion.
- Le peptide de fusion est localis, dans la majorit des cas, lextrmit N-terminale
dune des sous-units protiques (ex : HA2).
Le mcanisme de fusion mis en place par les protines de fusion de classe I peut tre
illustr par la description de celui de la protine de fusion HA, bien que des variations existent
selon les virus, notamment concernant le dclenchement de la fusion (pH dpendant ou
indpendant). Les diffrentes tapes permettant daboutir au processus de fusion induit par la
protine HA sont les suivantes (Harrison, 2008):
1) Le prcurseur des glycoprotines de surface (HA0), sous forme de trimre, doit tre cliv
lors de la maturation des virions pour donner deux sous-units, HA1 et HA2, jouant chacune un
rle distinct lors de lentre virale.
2) La sous-unit HA1, qui porte la fonction de reconnaissance du rcepteur permet la
fixation des virus la surface des cellules et leur endocytose.
72
3) Le pH acide du compartiment endosomal provoque des changements de conformation
irrversibles des sous-units HA1 et HA2 l'origine de la fusion membranaire entre la
membrane endosomale et l'enveloppe virale. Avant le choc de pH, lextrmit N-terminale de
HA2, qui correspond au peptide de fusion, est cache dans une poche hydrophobe. A pH acide,
la protonation de certains rsidus situs dans la niche hydrophobe, occupe par le peptide
fusogne, dstabilise l'interaction entre le peptide de fusion et les rsidus de la niche. De plus, la
protonation dune histidine fait apparatre une charge positive qui engendre un effet rpulsif sur
l'extrmit NH4+ charge du peptide de fusion, induisant son expulsion de la poche.
4) Le peptide de fusion est alors projet vers la membrane phospholipidique de la cellule
cible, dans laquelle il s'ancre du fait de sa nature hydrophobe. La sous-unit HA2 relie ainsi
l'enveloppe virale la membrane de la cellule cible.
5) Dans un deuxime temps, la sous-unit HA2 se replie sur elle-mme grce la formation
dune structure en "6-helix bundle" (coiled-coil constitu de 6 hlices). Les extrmits C-
terminale et N-terminale de la protine se rapprochent et prennent une orientation antiparallle.
Ce repliement conduit au rapprochement des membranes, ainsi que des domaines
transmembranaires et des peptides de fusion, afin dinduire la fusion membranaire qui passe par
de multiples intermdiaires lipidiques comme le stade d'hmifusion, avant daboutir la
formation d'un pore.
6) Bien que les donnes soient encore peu prcises, il semble qu'un minimum de trois
trimres d'HA soit ncessaire la formation d'un pore fonctionnel. Le pore form permet alors la
libration des nuclocapsides dans le compartiment cytoplasmique afin que linfection se
poursuive.

b. Les protines de fusion de classe II


Les virus appartenant aux familles des Togaviridae (ex : semliki forest virus ) et
Flaviviridae (ex : virus de lhpatite C, virus de la dengue) contiennent des glycoprotines
d'enveloppe dotes dune activit de fusion, dont la structure est trs diffrente de celle des
protines de fusion de classe I. Elles ont t regroupes sous le nom de protines de fusion de
classe II. Toutes les protines de fusion de classe II dcrites ce jour induisent la fusion
membranaire par un mcanisme dpendant du pH. Comme pour les protines de classe I, la
fusion des bicouches phospholipidiques est l'aboutissement dun processus au cours duquel des
changements de conformation des protines de fusion conduisent la dstabilisation
membranaire. Les principales caractristiques des protines de fusion de type II peuvent tre
rsumes de la faon suivante (Kielian & Rey, 2006) :
- La maturation des protines de fusion implique le clivage dun partenaire protique
(protine compagnon).
73
- le feuillet est la structure secondaire majoritaire de ces protines.
- le changement de conformation lors la fusion provoque la transition entre un dimre
(homodimre ou htrodimre selon les virus) mtastable et un homotrimre plus stable de
protines de fusion.
- Le mcanisme de fusion fait intervenir un trimre de domaines en pingle cheveux
riches en feuillets .
- Le peptide de fusion correspond une boucle de fusion interne cache dans la structure
dimrique des protines de fusion.
Globalement, le mcanisme de fusion engendr par les protines de fusion de type II est
le suivant [pour revue, consulter les rfrences (Harrison, 2008; Kielian & Rey, 2006)] : (i) aprs
la fixation des virus la surface des cellules et leur endocytose, le pH acide des endosomes
induit un rarrangement important des protines de surface qui conduit la dissociation des
dimres et lexposition de la boucle de fusion; (ii) le pH acide et la prsence de cholestrol
dans la membrane cellulaire cible permet lancrage membranaire de la boucle de fusion ; (iii)
les protines de fusion alignes paralllement les unes aux autres et reliant lenveloppe virale
une membrane cellulaire forment alors un homotrimre ; (iv) les homotrimres se replient sur
eux mme afin de rapprocher lenveloppe virale de la bicouche lipidique cellulaire. La
coopration entre plusieurs trimres de protines joue un rle important lors de cette tape ; (v)
le rapprochement progressif des domaines transmembranaires et des boucles de fusion aboutit
progressivement la fusion membranaire en passant par de multiples intermdiaires lipidiques
comme le stade d'hmifusion, avant d'arriver la formation d'un pore.

c. Les protines de fusion de classe III :


Des donnes structurales rcentes suggrent l'existence d'une troisime classe de protines
de fusion dont les membres incluent les protines de fusion des rhabdoviridae (VSV, virus de la
stomatite vsiculeuse), herpesviridae (ex : HSV-1, virus herpes simplex de type 1) et
baculoviridae [pour revue, consulter la rfrence (Backovic & Jardetzky, 2009)]. En 2006, les
structures de lectodomaine (domaine expos la surface des virus) de la protine de fusion G du
VSV, et de la glycoprotine gB du HSV-1 ont t dtermines, et ont rvl une homologie de
structure non anticipe entre ces deux protines compte tenu du fait quelles ne partagent pas
dhomologie de squence. Les structures secondaires et lorganisation des domaines de ces
protines sont trs similaires. Alors quelles contiennent une structure trimrique centrale de type
coiled-coil , caractristique des protines de fusion de type I, elles contiennent galement trois
domaines principalement constitus de feuillets et leur peptide de fusion est interne sous forme
dune boucle de fusion, ce qui est caractristique des protines de fusion de classe II. Du fait que
ces protines partagent des proprits des protines de fusion de classe I et II, il a t suggr
74
que ces protines dfinissaient une troisime catgorie, la classe III, de protines fusognes.
Malgr les diffrences de structure avec les protines des classes I et II, le mcanisme de fusion
induit par les protines de fusion de classe III est comparable a celui induit par les protines des
classes I et II. Globalement, pour chaque classe de protine, la rorganisation des protines de
fusion fournit lnergie ncessaire pour dclencher un mcanisme de fusion entre lenveloppe
virale et une membrane cellulaire grce au rapprochement du domaine transmembranaire, ancr
dans lenveloppe, et de la boucle (ou peptide) de fusion enchsse dans la membrane cellulaire.

d. Proprit des peptides de fusion


De nombreux critres peuvent tre utiliss pour caractriser les peptides de fusion. Si
aucun dentre eux nest absolu, leur combinaison permet de prdire lexistence dun peptide de
fusion dans une protine. Leur caractristique la plus marque concerne le caractre hydrophobe
de ces peptides, ncessaire leur fonction dinteraction avec les bicouches lipidiques. En outre,
ils contiennent gnralement une quantit leve de rsidus glycine et alanine. Dans le cas des
protines de fusion virales, la prsence de mutations dans leur squence, capables dinhiber le
pouvoir infectieux des virions, est un argument quant leur fonction lors de lentre virale. De
plus, des peptides synthtiques dont la squence correspond celle dun peptide de fusion ont
une activit fusogne in vitro. Ils sont capables de dstabiliser les bicouches lipidiques et
peuvent parfois induire le mlange des membranes de liposome (lipid mixing) ainsi que la
formation de pores dans ces derniers conduisant la libration de leur contenu (liposome
leakage). Le tableau 5 rsume les caractristiques des peptides de fusion des protines de classe
I, II et III.

Protine de fusion Proprits du peptide de fusion


Classe I - Squence conserve au sein de la mme famille de virus
- Localisation gnralement en position N-terminale de la sous-unit transmembranaire
(ex : HA2, gp41)
- Riche en rsidus glycine et alanine
- Contient des rsidus hydrophobes aromatiques tels que la phnylalanine
- Contient un tripeptide conserv : Phe xGly
- Insertion dans la membrane cible sous forme dune hlice amphipatique
(Harrison, 2008; Kielian & Rey, 2006)

Classe II - Squence trs conserve au sein de la mme famille de virus


- Localisation interne dans les protines de fusion, sous forme dune boucle de fusion
- La boucle de fusion est localise lextrmit dune tige protique compose de
feuillets
- Riche en rsidus glycines
- Riche en acides amins hydrophobes aromatiques tels que le tryptophane et la

75
1 23

Figure 24. Squence du peptide de fusion putatif des protines denveloppe du VHB (AA 1-23 du domaine S)
(Rodriguez-Crespo et al, 1994) et de la squence PEST qui est une rgion susceptible de contenir des sites de
clivage protolytique impliqus dans lexposition du peptide de fusion des protines L et M (Lu et al, 1996).
phnylalanine
- Contient quelques rsidus chargs positivement ou ngativement (Asp, Glu, Arg et lys)
- Prsence de rsidus cystines impliqus dans la formation de ponts disulfures importants
pour la structure de la boucle de fusion
(Harrison, 2008; Kielian & Rey, 2006; Lavillette et al, 2007)

Classe III - Squence pas systmatiquement conserve pour les virus de la mme famille (ex :
herpesviridae)
- Localisation interne dans les protines de fusion, en deux parties, correspondant donc
deux boucles de fusion.
- Les boucles de fusion sont exposes la surface des protines de fusion
- La composition en acides amins est trs variable selon les familles de virus. Des rsidus
tryptophane, tyrosine et alanine sont importants dans les peptides des protines VSV G,
HSV-1 gB, et EBV gB (herpesviridae et rhabdoviridae). Au contraire, des rsidus leucine,
phnylalanine, alanine, srine et acide aspartique sont importants dans les boucles de
fusion de la protine gp64 des baculovirus.
(Backovic & Jardetzky, 2009)

Tableau 5. Caractristiques des peptides de fusion

e. Les protines de fusion des hepadnaviridae


En 1994, une quipe espagnole a identifi, par homologie de squence, un peptide de
fusion putatif lextrmit N-terminale de la protine S du VHB (Rodriguez-Crespo et al, 1994).
Il est constitu des 23 premiers acides amins de la protine S et est interrompu par un rsidu
charg, une arginine, en position 24 (Fig. 24). Sa taille comparable celle des peptides de fusion
dautres protines virales, labsence de signal de glycosylation sa proximit, son orientation
avec une extrmit N-terminale prdite lextrieur des virus et une extrmit C-terminale
transmembranaire ainsi que son hydrophobicit en font un candidat potentiel comme peptide de
fusion. De plus, sa squence est conserve parmi les hepadnaviridae. Elle est relativement riche
en rsidus glycines et contient un tripeptide Phe-x-Gly, retrouv dans de nombreux peptides de
fusion des protines de classe I. Enfin, il semble que la distribution des acides amins de ce
peptide de fusion soit comparable celle des acides amins du peptide de fusion de la protine
GP41 du VIH, avec globalement les acides amins volumineux et hydrophobes reposant sur une
face de lhlice, et les acides amins plus petits et hydrophiles reposant sur lautre face. Cette
distribution des acides amins est due la prsence dun motif heptad repeat au niveau de ce
peptide de fusion, qui consiste en la rptition tous les 4 et 3 acides amins (4-3-4-3-4 etc.) de
rsidus hydrophobes. Ce motif confre un caractre amphipatique au peptide de fusion, avec une
face de lhlice plus hydrophobe que lautre (Rodriguez-Crespo et al, 1994). Cette proprit peut
tre importante lors dinteractions entre des domaines protiques en induisant la formation de

76
structure coiled-coils , ou lors dinteractions entre une protine et une bicouche lipidique (ex :
peptide de fusion de la protine HA2).
Ensuite, la mme quipe a tent danalyser le rle du peptide de fusion putatif des
protines denveloppe du VHB en synthtisant un peptide correspondant aux 16 premiers acides
amins de la protine S. Ce peptide est capable dinteragir avec des phospholipides et cette
interaction est favorise pH acide. Il permet le mlange de la membrane de liposomes (lipid
mixing) pH neutre, et de faon plus importante, pH acide (Rodriguez-Crespo et al, 1995). Il
est galement capable de dstabiliser suffisamment la membrane de liposomes pour librer leur
contenu (liposome leakage). Enfin, ce peptide est capable dinduire une hmolyse (fuite
dhmoglobine), 10 fois plus importante pH acide qu pH neutre, en dstabilisant la
membrane de globules rouges. Ces rsultats supportent le rle de lextrmit N-terminale de la
protine S du VHB lors dun processus de fusion qui aurait lieu pH acide aprs lendocytose
des virus. Cependant, le fait que lactivit des peptides soit potentialise pH acide ne reflte pas
ncessairement le mcanisme de fusion ayant lieu lors du cycle viral. En effet, les peptides de
fusion du VIH et du VIS (virus de limmunodficience des singes) qui induisent un mcanisme
de fusion lors de linfection, pH neutre, au niveau de la membrane plasmique, ont une activit
fusogne potentialise in vitro pH acide (Larsen et al, 1990; Larsen et al, 1993).
La caractrisation de la structure de ce peptide, par dichrosme circulaire et par
spectroscopie infrarouge avec transform de Fourrier, a permis de dmontrer que la structure
majoritaire de ce peptide dans un solvant organique favorable la formation dhlices , le
trifluoroethanol, correspondait une structure en hlice malgr la prsence de la proline en
position 11 (Rodriguez-Crespo et al, 1996). Plus le pourcentage deau ajout avec le solvant est
augment, plus la structure des peptides change et soriente vers la formation de feuillets
formant des agrgats. Ces agrgats, obtenus avec des concentrations leves de peptide, peuvent
tre dissocis grce des dtergents anioniques, tels que le cholate de sodium, qui permettent de
solubiliser les peptides en solution aqueuse tout en conservant leur structure en feuillets . La
capacit des peptides a former la fois des hlices et des feuillets selon leur environnement
reflte une certaine flexibilit conformationelle de leur structure pouvant tre importante pour
leur activit fusogne (Hofmann et al, 2004). Les mmes rsultats sont obtenus pH 5 et pH 7.
Afin de vrifier la conformation du peptide dans un environnement lipidique, la structure des
peptides a t analyse en prsence de phospholipides. Dans ces conditions, comme en prsence
de dtergent, les peptides adoptent plutt une structure en feuillets pouvant correspondre la
structure active du peptide lorsquil interagit avec les bicouches lipidiques. Les peptides arborent
cette conformation pour des ratios phospholipides/peptide faibles et levs. Ces rsultats
divergent des donnes concernant la structure du peptide de fusion de la protine HA2 du virus

77
influenza, dont la conformation en prsence de phospholipides correspond une structure en
hlice (Ishiguro et al, 1993; Lear & DeGrado, 1987). Cependant, ces rsultats sont hautement
dpendants des conditions exprimentales puisque selon le type de phospholipide et le ratio
peptide/lipide utilis, la structure des peptides est modifie. Par exemple, le peptide de fusion des
protines de surface du VIH interagit avec des phospholipides sous forme dhlice un ratio
peptide/lipide faible, et sous forme de feuillets un ratio peptide/lipide plus lev (Rafalski et
al, 1990). La flexibilit de structure des peptides de fusion, potentiellement importante pour leur
activit, complique donc linterprtation de ces rsultats et lidentification de la structure quils
adoptent au sein de la protine de fusion lorsquils sont envoys dans la membrane de la cellule
cible.
Des tudes comparables ont ensuite t menes sur des peptides de fusion synthtiques
drivs des protines de surface du DHBV et du WHV (Rodriguez-Crespo et al, 1999). Ces
peptides interagissent de faon pH indpendante avec les lipides et sont capables dinduire le
mlange de la membrane de liposome ainsi que la fuite de leur contenu. Leur activit fusogne
est suprieure celle du peptide du VHB puisque pour un effet comparable lors dun test
mesurant la fuite du contenu de liposomes, il faut utiliser 70 M de peptide driv du VHB
contre 4 M et 1 M des peptides drivs du WHV et du DHBV, respectivement. Quant la
structure de ces peptides, en prsence de trifluorothanol, ils tendent sorganiser plutt sous la
forme dhlices que sous la forme de feuillets . En revanche, en prsence de phospholipides,
ils se comportent diffremment. Alors que le peptide driv des protines du DHBV adopte
principalement une structure en feuillets , celui driv des protines denveloppe du WHV
adopte majoritairement une structure en hlice . En conclusion, comme pour le peptide driv
des protines de surface du VHB, ces peptides semblent dots dune plasticit structurale qui
leur permet dadopter diffrentes structures selon les conditions exprimentales.
Deux autres tudes soutiennent lexistence dun peptide de fusion lextrmit
N-terminale du domaine S des protines denveloppe du VHB. La premire, ralise par Lu et al
en 1996, suggre quun clivage protolytique en amont du peptide de fusion dans les protines L
et M permettrait lexposition du peptide dans ces protines afin de dclencher un processus de
fusion (Lu et al, 1996). Ces auteurs ont dmontr que des particules virales dont les domaines
Pre-S1 et Pre-S2 taient limins grce un clivage protolytique par la V8 protase, qui coupe
au niveau de lacide glutamique en position 2 du domaine S, taient capables dinfecter des
cellules HepG2 normalement non susceptibles linfection, possiblement en induisant la fusion
des virus la membrane plasmique de ces cellules. Ces expriences suggrent lexistence dun
mcanisme de fusion dpendant dun clivage protolytique et du pH acide, puisque les
expriences dinfection ont t ralises en incubant les cellules pH 5,5. Le traitement des virus

78
avec de la chymotrypsine, qui clive les particules virales la fin du peptide de fusion, gnre
quant lui des particules virales non infectieuses. Lhypothse propose par les auteurs est la
suivante : linfection par le VHB ncessiterait la mise en place dun processus de fusion pH
acide, dpendant du peptide de fusion prsent lextrmit N-terminale du domaine S des
protines M et L. Lactivation de ce peptide passerait par son exposition la surface des
particules virales grce un clivage protolytique liminant les domaines Pre-S. Le clivage
aurait lieu au niveau dune squence riche en rsidus proline, acide glutamique, serine et
thronine, dite squence PEST , localise en amont du peptide de fusion dans la rgion ou la
V8 protase possde son site de clivage (Fig. 24). Cependant, labsence de reproductibilit de
tels rsultats par dautres quipes, et notre incapacit reproduire les expriences de clivage des
virus par la V8 protase (Philippe Gripon, travaux non publies) soulvent des doutes quant la
pertinence de ces rsultats.
Enfin, une tude plus rcente ralise par Berting et al a mis en vidence la capacit dune
rgion du peptide de fusion putatif, localise entre la glycine 7 et la leucine 15 (Fig. 24),
induire un processus dhmifusion lorsquelle remplace une partie du peptide de fusion de la
protine HA2 du virus influenza (Berting et al, 2000). Ces rsultats suggrent que le peptide de
fusion putatif des protines denveloppe du VHB est capable dinitier un processus de fusion
lorsquil est insr dans la squence dune protine de fusion.
Un aspect important permettant de dterminer le rle du peptide de fusion au cours de
lentre virale consiste vrifier son implication lors de ltape dinfection. Une tude ralise
avec le modle du DHBV a permis de rvler limportance du peptide de fusion putatif de la
protine L de ce virus lors de linfection, dans une tape ultrieure la reconnaissance du
rcepteur et lendocytose des virus (Chojnacki et al, 2005). Dans un premier temps, cette tude
a dmontr que linfection dhpatocytes primaires par le DHBV ncessitait le transport des
virus des endosomes prcoces vers les endosomes tardifs (cf. chapitre Libration des
nuclocapsides , page 63). Ensuite, les auteurs ont observ que la substitution dacides amins
localiss sur la face la plus hydrophobe du domaine TM1, chevauchant le peptide de fusion
putatif dcrit par Rodriguez-Crespo et al, bloquait linfection des hpatocytes primaires par le
DHBV lorsquelles taient introduites dans la protine L. Au contraire, les mmes mutations
introduites dans la protine S nimbibent pas linfectivit des virions suggrant que seul le
peptide de fusion de la protine L joue un rle lors de ltape dinfection. Toutefois, de faon
surprenante, la mme quipe avait dmontr dans une tude antrieure, que les substitutions
prcdentes introduites dans la protine S affectaient la translocation du domaine Pre-S de la
protine L (Grgacic, 2002). Aussi, il nous a paru surprenant que des mutations affectant
lexposition du domaine Pre-S lextrieur des virions ninhibent pas le processus dinfection.

79
Quoi quil en soit, afin didentifier le rle du domaine TM1 de la protine L lors de linfection,
des tests dattachement la carboxypeptidase D ont t raliss. Ils ont permis de dmontrer que
ce domaine ntait pas impliqu dans la reconnaissance de ce rcepteur. De plus, la
colocalisation de virus mutants, dont le domaine TM1 est mut, avec de la transferrine marque
au niveau des endosomes suggre quil nest pas ncessaire non plus lendocytose des virions
(Chojnacki et al, 2005). Les auteurs ont donc mis lhypothse selon laquelle il serait impliqu
dans un processus de fusion entre lenveloppe virale et la membrane des endosomes. Cette
dernire hypothse est supporte par des tests de fusion in vitro ayant dmontr que des peptides,
dont les rsidus importants pour linfectivit des virions ont t muts, ne dstabilisaient pas la
membrane de liposomes contrairement au peptide sauvage correspondant. La mise en place dun
test de fusion entre des particules virales et des liposomes serait intressante afin de comparer
lactivit fusogne des virus sauvages et mutants. Contrairement au DHBV, le rle du peptide de
fusion chevauchant le domaine TM1 des protines denveloppe du VHB na pas t valu au
cours de linfection. Ce travail, prsent dans le chapitre des rsultats, constitue la deuxime
partie de mes travaux de recherche.
Rcemment, Nuez et al ont dmontr que des domaines Pre-S recombinants non
myristoyls (Pre-S1 + Pre-S2) taient capables dinteragir avec des liposomes (Nunez et al,
2009). De plus, ces protines recombinantes ont la proprit dinduire le mlange de la
membrane de liposomes ainsi que la fuite de leur contenu indpendamment du pH. Ces rsultats
suggrent que le domaine Pre-S des protines denveloppe du VHB pourrait tre impliqu dans
un processus de fusion. Cependant, cette tude na pas permis didentifier une courte squence
dacides amins responsable de cette proprit du domaine Pre-S.

III. Adressage nuclaire et dcapsidation


Comme cela a t dcrit dans le chapitre prcdent, il semble que les hepadnaviridae
entrent dans les cellules grce un transport vsiculaire mais que linfection ne ncessite pas
lacidification dun compartiment cellulaire. Ltape de translocation ou de fusion entre
lenveloppe virale et une membrane intracellulaire conduit ensuite la libration des
nuclocapsides dans le cytoplasme. Celles-ci sont alors achemines jusquau noyau des cellules
afin dinitier les premires tapes de la rplication du gnome viral (Tuttleman et al, 1986).
Aprs leur libration dans le cytoplasme, laccumulation des nuclocapsides autour du noyau
ncessite 15 minutes, suggrant leur prise en charge par un transport actif puisque la diffusion
ncessiterait environ 1 heure (Rabe et al, 2006). Lexistence dun transport actif est supporte
par le fait que laccumulation des nuclocapsides au niveau de lenveloppe nuclaire ainsi que la
libration du gnome viral puissent tre inhibes par le nocodazole, qui est une drogue induisant

80
la dpolarisation des microtubules (Rabe et al, 2006). Le rle de ces derniers a t confirm dans
deux tudes utilisant des systmes exprimentaux diffrents consistant soit en lutilisation de
capsides dont la rgion N-terminale des protines de capside a t fusionne un TLM afin
quelles pntrent dans des hpatocytes primaires humain, soit en linjection de nuclocapsides
dans le cytoplasme dovocytes de Xenopus laevis (Brandenburg et al, 2005; Pante & Kann,
2002). Par ailleurs, la deuxime approche a permis dobserver, grce la microscopie
lectronique, linteraction entre les nuclocapsides et les complexes des pores nuclaires (CPN).
Ces rsultats sont en accord avec lanalyse de squence de la protine de capside qui a rvl la
prsence dun NLS (nuclear localization signal) dans sa rgion C-terminale (Eckhardt et al,
1991; Yeh et al, 1990), ainsi que des sites de phosphorylation (Schlicht et al, 1989; Yeh & Ou,
1991; Yu & Summers, 1994). De faon non surprenante, du fait de la prsence dune squence
NLS, il a t dmontr que lattachement des nuclocapsides lenveloppe nuclaire tait
dpendant des importines et (Kann et al, 1999). Cependant, la squence C-terminale de
lantigne HBc abritant le NLS nest expose ni la surface de nuclocapsides contenant de
lARN viral produites dans E. Coli, ni dans des nuclocapsides produites dans des cellules
eucaryotes ne contenant pas la polymrase virale (Rabe et al, 2003; Zlotnick et al, 1997). En
consquence, ces capsides ninteragissent pas avec le noyau des cellules. Pour que le NLS soit
expos, la rgion C-terminale des protines HBc doit tre phosphoryle. Ainsi, des
nuclocapsides contenant une molcule dARN viral, ayant t phosphoryles in vitro par la
protine kinase C, sont capables dinteragir avec les CPN (Kann et al, 1999). Cette liaison
spcifique peut tre inhibe par des anticorps dirigs contre les CPN ainsi que par des peptides
de synthse correspondant au NLS ou la squence C-terminale de lantigne HBc.
Plus rcemment, il a t dmontr que lexposition de la rgion C-terminale de la
protine de capside la surface des particules tait en fait lie la maturation du gnome viral,
elle mme corrle la phosphorylation de cette rgion (Rabe et al, 2003). En effet, des capsides
drives de virus qui contiennent un gnome mature sont capables de librer leur ADN viral
ainsi que les protines de capsides dsassembles dans le nucloplasme alors que des capsides
qui ne contiennent pas de gnome mature atteignent la cage (basket) des CPN, grce la
prsence de quelques NLS exposs leur surface, mais ne librent pas leur gnome immature
dans le nucloplasme. Lensemble de ces rsultats suggre lexistence de deux mcanismes de
rgulation de limport nuclaire des nuclocapsides : (i) la maturation du gnome viral, de
lARN prgnomique lADN partiellement double brin, saccompagne dune phosphorylation
progressive des protines de capside qui exposent alors leur NLS afin dtre transportes vers les
CPN, puis (ii) aprs la fixation des nuclocapsides sur les pores nuclaires via les importines,
seules les capsides contenant un gnome viral totalement mature librent leur contenu, alors que

81
les autre restent fixes dans la cage des CPN (Rabe et al, 2003). Une des hypothses permettant
dexpliquer ce deuxime point de contrle suggre que les capsides matures exposent plus de
NLS leur surface que les immatures et que cela leur permet dinteragir avec plus de rcepteurs
de transport nuclaire (importines) afin de progresser dans le rseau hydrophobe des pores
nuclaires et dinteragir avec des facteurs ncessaires la libration de lADN viral. Il est
possible dimaginer que ce mcanisme permette daugmenter lefficacit dinfection par le VHB,
en ne librant dans le noyau des cellules infectes que des gnomes matures et en permettant aux
autres de complter leur maturation au sein de la nuclocapside.

IV. Conversion de lADN relax circulaire en ADN superenroul


Le gnome du VHB prsent dans les particules virales infectieuses correspond une
molcule dADN relaxe circulaire (ADNrc) partiellement bicatnaire. Les principales
caractristiques de lADNrc sont : (i) le brin dADN ngatif est complet alors que le brin positif
est incomplet, (ii) lextrmit 5 du brin ngatif est associe de faon covalente la polymrase
virale, et (iii) lextrmit 5 du brin positif correspond un oligonuclotide dARN, issu de
lARN prgnomique, qui sert damorce la synthse du brin positif. Cet ADNrc est libr dans
le noyau des cellules par les nuclocapsides et sert de matrice pour la fabrication dune nouvelle
forme dADN, appele ADNccc, pour covalently closed circle DNA qui sert lui mme de
matrice la transcription des ARNs viraux par lARN polymrase II cellulaire (Miller &
Robinson, 1984). La formation de lADNccc ncessite llimination des modifications
prcdentes, la synthse dun brin positif complet ainsi que la ligation covalente de chaque brin
dADN. Cet ADNccc ou ADN superenroul est synthtis durant les premiers jours qui suivent
linfection (Gripon et al, 1993; Tuttleman et al, 1986). Le mcanisme permettant la conversion
entre lADNrc et lADNccc est encore mal connu. Il semblerait cependant, daprs les rsultats
dune tude ralise avec le modle du DHBV, que lactivit de la polymrase virale ne soit pas
ncessaire sa fabrication (Kock & Schlicht, 1993). Toutefois, des rsultats plus rcents utilisant
des hpatocytes de Tupaa comme modle dinfection (Kock et al, 2001; von Weizsacker et al,
2004), ont dmontr que la formation dADNccc pouvait tre fortement rduite par linhibition
de lactivit reverse transcriptase de la polymrase virale (Kock et al, 2003). Finalement, ces
rsultats suggrent donc un rle de la polymrase virale, qui pourrait par exemple tre implique
dans le prolongement du brin dADN positif.
Des hpatocytes infects par un hepadnavirus contiennent entre 5 et 50 copies dADNccc
ou plus (Zhu et al, 2001), sous forme de minichromosomes associs des protines de type
histone (Bock et al, 1994; Bock et al, 2001; Newbold et al, 1995). Lamplification du nombre de
copies dADNccc au sein des cellules infectes par le DHBV a lieu grce la fabrication de

82
nouveaux gnomes sous forme dADNrc, qui comme le gnome ayant initialement permis
linfection, sont imports dans le noyau et transforms en ADNccc (Tuttleman et al, 1986; Wu et
al, 1990). Le nombre lev de copies dADNccc dans les cellules ainsi que sa dure de vie
importante contribuent au maintien du gnome viral dans les cellules infectes mme en
prsence de traitements antiviraux (Ganem & Prince, 2004). De faon intressante, il semble que
lamplification du nombre de copies dADNccc dans les cellules infectes par le DHBV sarrte
lorsque la quantit de protines denveloppe produite est suffisamment importante. Ainsi, aprs
leur encapsidation, les nouveaux gnomes produits ne sont plus recycls dans le noyau des
cellules mais sont envelopps par les protines de surface afin de fabriquer de nouveaux virions
qui seront secrts hors de la cellule (Summers et al, 1990).
Ce phnomne de recyclage des nuclocapsides na pas t retrouv dans les hpatocytes
humains infects in vitro par le VHB. Aprs une infection, lapparition progressive de lADNccc
suit la disparition des formes relaxes circulaires issues des virus qui ont pntr dans la cellule.
Aucune amplification nest dtecte par la suite (Gripon et al, 1993). Ces rsultats ont t
confirms rcemment par ltude de Hantz et al utilisant comme modle dinfection les cellules
de la ligne HepaRG (Hantz et al, 2009). Par ailleurs, il a galement t observ que linhibition
de synthse de la protine L dans des hpatocytes humains infects ninfluenait pas le taux
dADNccc (Le Seyec et al, travaux non publis).

V. Transcription virale
A. Structures et fonctions des transcrits viraux
Deux classes de transcrits viraux se distinguent par la comparaison de leur taille avec
celle du gnome viral. Ceux de taille suprieure appartiennent la classe des transcrits
gnomiques et ceux de taille infrieure constituent la classe des transcrits subgnomiques. Tous
les transcrits viraux sont de polarit (+), comportent une coiffe leur extrmit 5 et possdent
une extrmit 3 identique puisque le VHB ne possde quun seul site de polyadnylation
localis dans la squence codante du gne de la capside. Les transcrits subgnomiques ne
subissent pas dpissage, contrairement aux transcrits gnomiques. Les ARNs viraux issus dun
pissage ont t dtects au niveau du srum ou du foie de patients infects ou dans des cellules
transfectes, mais leur rle au cours du cycle viral ainsi que leur effet sur les aspects cliniques de
linfection demeure incertain (Chen et al, 1989; Lee et al, 2008; Rosmorduc et al, 1995; Su et al,
1989a; Su et al, 1989b; Suzuki et al, 1989; Wu et al, 1991).
- Les transcrits gnomiques :
Deux catgories de transcrits gnomiques (de taille gale environ 3.5 kb) se
distinguent par leur extrmit 5 situe de part et dautre du codon initiateur (ATG) de la rgion

83
pre-C (Fig. 19) (Will et al, 1987; Yaginuma et al, 1987). Les transcrits initis en amont de cet
ATG codent pour lantigne HBe. Les ARNs initis en aval assurent une double fonction. En
tant quARNs messagers, ils codent pour la protine structurale de la capside et pour la
polymrase virale. En tant quARNs prgnomes, ils sont encapsids puis servent de matrice
pour la synthse de lADN viral (Enders et al, 1987).

- Les transcrits subgnomiques :


Les transcrits subgnomiques fonctionnent exclusivement en tant quARNs messagers
pour la traduction des protines de lenveloppe et de la protine X. Deux promoteurs contrlent
la transcription des ARNs codants pour les protines de surface. Le promoteur Pre-S1 initie la
transcription dun ARN de 2,4 kb dont lextrmit 5 se situe en amont des rgions Pre-S. Il sert
principalement lexpression de la protine L et de faon accessoire lexpression des protines
M et S (Gallina et al, 1992; Sheu & Lo, 1992; Standring et al, 1986). Le promoteur S, quant
lui, dirige la transcription dARNs de 2,1 kb qui dbutent, soit en amont, soit en aval du codon
initiateur de la protine M (Cattaneo et al, 1983; Standring et al, 1984). Les transcrits courts,
issus de ce promoteur, ne codent que pour la protine S alors que les transcrits longs assurent la
traduction des protines M et S.

B. Mcanisme et rgulation de la transcription


Les ARNs viraux sont transcrits partir du brin ngatif de lADN superenroul grce
lARN polymrase II cellulaire. La circularit de lADNccc permet la synthse des ARNs
subgnomiques et des ARNs gnomiques de taille suprieure au gnome viral. Lors de la
transcription des diffrents gnes viraux, le signal de polyadnylation doit tre contrl. En effet,
puisque le mme signal de polyadnylation est prsent aux deux extrmits redondantes des
ARNs gnomiques, la synthse de ces ARNs ncessite que le complexe transcriptionnel ignore le
signal au premier passage puis lutilise au second passage. Lusage de ce site de polyadnylation
est en fait conditionn par des squences rgulatrices absentes de lextrmit 5 des ARNs
gnomiques car elles sont localises juste en amont du site dinitiation de leur transcription
(Russnak & Ganem, 1990).
La transcription des gnes viraux est notamment rgule par quatre promoteurs, deux
enhancers et un lment de rponse aux glucocorticodes (GRE) (Tur-Kaspa et al, 1986; Tur-
Kaspa et al, 1988).
- Les promoteurs viraux :
Le promoteur S permet lexpression dun transcrit de 2,1 kb dont la prsence est
favorise dans des cellules hpatocytaires. Cette expression prfrentielle rsulte de linfluence
de lenhancer II (Lopez-Cabrera et al, 1991; Zhou & Yen, 1990). De faon intressante, le

84
promoteur S est activ par une voie de signalisation intracellulaire induite par un stress au niveau
du rticulum endoplasmique (RE) (Xu et al, 1997b). Ce serait par cette voie dactivation que la
protine L contrlerait le ratio entre les diffrentes protines de surface, en agissant sur la
synthse des protines M et S. En effet, une surexpression de la protine L conduit la rtention
des protines de lenveloppe virale dans la lumire du RE (Ou & Rutter, 1987; Persing et al,
1986; Xu et al, 1997a; Xu et al, 1997b). Le stress induit par laccumulation de la protine L
activerait le promoteur S pour rtablir un ratio correct entre les protines de surface, autorisant
nouveau leur scrtion.
Le promoteur Pre-S1 est un promoteur faible qui permet lexpression dun transcrit de 2,4
kb. Ce promoteur est trs peu actif dans des cellules non hpatocytaires. Son hpato-spcificit
rsulte essentiellement de son interaction avec le facteur transcriptionnel HNF-1 (Hepatocyte
Nuclear Factor-1) retrouv principalement dans les hpatocytes diffrencis (Chang et al, 1989;
Courtois et al, 1988).
Le promoteur C qui contrle la transcription des ARNs gnomiques est comme le
promoteur Pre-S1, spcifique des cellules hpatocytaires. Cette spcificit tissulaire dpend en
partie de facteurs transcriptionnels principalement hpatiques tels que HNF-4.
Le promoteur X rgule la transcription dun transcrit de 0,9 Kb qui code pour lantigne
HBx (Zheng et al, 1994). Il contient des sites de fixation pour des facteurs de transcriptions
ubiquitaires et hpato-spcifiques. Le suppresseur de tumeur p53 interagit avec ce promoteur et
rprime son expression (Takada et al, 1996).
- Les enhancers viraux :
Deux enhancers ont t identifis dans le gnome viral, de par leur capacit influencer
positivement lexpression des gnes viraux indpendamment de leur position et de leur
orientation.
Lenhancer I, localis entre le gne S et le gne X (Guo et al, 1991; Shaul et al, 1985), stimule
lexpression de tous les gnes viraux (Hu & Siddiqui, 1991).
Lenhancer II se situe dans la phase ouverte de lecture du gne X (Yee, 1989; Yuh & Ting,
1990). Il joue le rle dactivateur hpato-spcifique du promoteur C et du promoteur S (Hu &
Siddiqui, 1991).
- Llment de rgulation post-transcriptionnelle :
Tous les transcrits viraux contiennent un lment de rgulation post-transcriptionnelle
(HPRE pour HBV Post-transcriptional Regulatory Element) situ dans la rgion de lenhancer I
et du gne X (Donello et al, 1996). Cet lment favorise laccumulation des transcrits du gne S
dans le cytoplasme (Huang & Liang, 1993; Huang & Yen, 1994). Il nintervient, ni sur le niveau
de transcription, ni sur la stabilit des ARNs, mais il favorise le passage des transcrits non

85
pisss du noyau au cytoplasme. En plus de sa fonction dexport nuclaire, le HPRE contient un
lment enhancer de lpissage (Heise et al, 2006). Une tude rcente a permis de dterminer,
par rsonnance magntique nuclaire, une partie de sa structure (Schwalbe et al, 2008).

VI. Traduction et maturation des protines


A. Polymrase virale
Le cadre ouvert de lecture codant pour la protine P, ou polymrase virale, couvre prs de
80% du gnome des hepadnavirus. Les particules virales ne contiennent quune seule protine P
par particule probablement du fait de sa liaison covalente avec le gnome viral (Bartenschlager
& Schaller, 1992). La polymrase possde 3 domaines fonctionnels impliqus dans la rplication
et un domaine non essentiel :
- lextrmit N-terminale ou TP (Terminal Protein) permet la liaison covalente de la protine
avec lextrmit 5 du brin (-) dADN (Bartenschlager & Schaller, 1988; Lanford et al, 1997) ;
- le domaine SPACER nest pas indispensable aux activits de la polymrase car lintroduction
de substitutions, dltions et insertions dans cette rgion naffecte en rien son fonctionnement
(Radziwill et al, 1990) ;
- la rgion ADN polymrase / transcriptase inverse contient un motif peptidique (YMDD)
important pour lactivit de transcription inverse (Argos, 1988) ;
- le domaine RNAse H est responsable de la dgradation de lARN prgnome lors de la
synthse du brin (-) de lADN viral (Radziwill et al, 1990).

B. Antigne de la capside et antigne e


Lantigne HBc est la protine structurale majeure de la capside (cf. chapitre
Nuclocapside , page 41). Elle possde une extrmit C-terminale basique permettant sa
liaison lADN viral (Gallina et al, 1989; Petit & Pillot, 1985). Les protines HBc sont capables
de sorganiser spontanment pour former une capside, mme en absence dARN prgnome.
Lassociation spontane de ces protines est un processus dpendant de la concentration en
protines de capside (Seifer et al, 1993; Zhou et al, 1992).
Linitiation de la traduction en 5 de la squence pre-C, situe en amont du gne C et
dans le mme cadre de lecture (Fig. 19), aboutit la synthse dune protine pre-C. La prsence
de cette squence supplmentaire en position N-terminale de la protine HBc, correspondant
un peptide signal, dirige la protine vers le RE afin quelle soit scrte hors de la cellule. Au
cours de ce processus, la protine perd son extrmit C-terminale basique (Jean-Jean et al, 1989;
Standring et al, 1988; Wang et al, 1991). Finalement, cest une protine de 16 kDa, nomme
antigne HBe, que lon retrouve dans le srum des malades. La fonction exacte de cette protine

86
na pas t dtermine, mais elle semble non indispensable la rplication virale in vitro (Tong
et al, 1991).

C. Protine X
La protine X (HBx) a t dcouverte en 1985 grce lidentification danticorps dirigs
contre des pitopes de cette protine (Kay et al, 1985). Elle est suspecte de jouer un rle
important dans le dveloppement des hpatocarcinomes associs au VHB (cf. chapitre VHB et
carcinome hpatocellulaire , page 18). La protine X est un rgulateur multifonctionnel qui
module la transcription, la transduction du signal, le cycle cellulaire, les voies de dgradation des
protines, lapoptose et la stabilit gntique en interagissant directement ou indirectement avec
des facteurs cellulaires [pour revue, consulter la rfrence (Tang et al, 2006)]. Elle permet
daugmenter lexpression des gnes du VHB ainsi que la rplication virale en agissant comme un
coactivateur transcriptionnel collaborant avec des facteurs de transcription cellulaire. Ainsi, son
inactivation grce des mthodes utilisant des ARNs interfrents diminue la transcription et la
rplication du VHB. De fait, le dveloppement dantiviraux ciblant la protine X pourrait en
thorie permettre de limiter la rplication virale et de diminuer le dveloppement
dhpatocarcinomes associs au VHB.

D. Protines de lenveloppe virale


Lenveloppe des particules virales contient 3 types de protines de surface (cf. chapitre
Lenveloppe virale , page 33) code partir dun mme cadre ouvert de lecture possdant 3
codons dinitiation de la traduction. La protine majoritaire (S) est constitue exclusivement de
la rgion S, commune aux 3 protines de surface, qui comprend 226 AA. Elle assure leur
ancrage dans la bicouche lipidique de lenveloppe virale ou dans la membrane du RE, l o elles
sont synthtises. La protine moyenne (M) possde 55 AA N-terminaux supplmentaires,
correspondant la rgion Pre-S2. Enfin, la grande protine (L) comporte en plus des rgions S et
Pre-S2, une rgion Pre-S1 de 108 AA son extrmit N-terminale (gnotype D).

VII. Encapsidation et synthse de lADN viral


A. Encapsidation de lARN prgnome
Avant dtre rtrotranscrit, lARN prgnomique est enferm avec la polymrase virale
dans les nuclocapsides composes de protine HBc. Son encapsidation fait intervenir une
structure en pingle cheveux prsente son extrmit 5, appele signal dencapsidation ou
epsilon (). En plus de sa fonction premire, le signal est impliqu dans lactivation de la
polymrase virale et permet dinitier la synthse dADN par transcription inverse [pour revue,
consulter la rfrence (Beck & Nassal, 2007)]. Etant donn que les ARNs gnomiques ont une

87
taille suprieure celle du gnome viral, leurs deux extrmits possdent des squences
nucliques communes. Or cest dans cette rgion que se situe le signal . Les ARNs gnomiques
ont donc un signal chacune de leurs extrmits. Cependant, on sait que seul le signal en 5 est
fonctionnel. Cette observation explique pourquoi les ARNs subgnomiques, qui nont quune
seule squence en 3, ne sont pas encapsids.
La premire tape dencapsidation consiste en la reconnaissance du signal par
lextrmit N-terminale de la polymrase virale (Bartenschlager & Schaller, 1992; Junker-
Niepmann et al, 1990). Cette liaison ARN/protine est indispensable lencapsidation du
complexe. Ensuite, lextrmit C-terminale libre de la polymrase interagirait directement ou
indirectement avec des protines HBc (Hirsch et al, 1990; Pollack & Ganem, 1994). Cette
interaction entre les deux protines virales (P et C) suffirait initier lencapsidation sachant que
les protines HBc sassemblent spontanment sous forme de capside.
Comme nous lavons vu prcdemment, il existe deux catgories dARNs gnomiques,
or seuls les plus courts sont encapsids et servent de matrice la synthse dADN. La
discrimination entre ces deux types de transcrits gnomiques seffectuerait simplement grce la
prsence de lAUG du pre-C sur les ARNs les plus longs. En effet, une simple mutation qui
dtruit ce codon initiateur rend ces ARNs susceptibles lencapsidation (Nassal et al, 1990).
Ainsi, Nassal et ses collaborateurs en ont conclu que la capacit du signal a tre traduit tait un
lment dcisif permettant de dterminer si un ARN contenant le signal devait tre encapsid
ou non. On peut imaginer que le ribosome qui a dbut la traduction vient dstabiliser la
structure secondaire du signal . Au niveau des ARNs prgnomes, qui interagissent
prfrentiellement avec la polymrase issue de leur propre traduction (Nassal et al, 1990),
linitiation de la traduction en aval du signal ne dstabiliserait pas la structure secondaire.

B. Synthse de lADN viral


Une fois le complexe protine/ARN encapsid, la polymrase virale assure la production
de lADN viral [pour revue, consulter les rfrences (Beck & Nassal, 2007; Nassal, 2008)]. Au
dbut du processus, la polymrase, situe au niveau du signal en 5 de lARN prgnome,
synthtise un oligonuclotide de quatre bases (Wang & Seeger, 1993). Le complexe
oligonuclotide/polymrase est transfr au niveau de lextrmit 3 de lARN qui comporte une
squence complmentaire aux quatre bases, appele rgion DR1 (Direct Repeat). Ensuite,
llongation du brin (-) de lADN par transcription inverse est initie grce la lecture, de 3 en
5, de lARN prgnomique. LARN est dgrad de faon simultane la synthse de lADN par
lactivit RNAse H de la polymrase virale, lexception dun petit fragment correspondant aux
nuclotides de lextrmit 5 de lARN prgnome. Cette petite squence dARN, qui contient la

88
rgion DR1, est transfre lextrmit 5 du brin (-) de lADN grce sa complmentarit avec
une rgion appele DR2. Elle sert alors damorce la synthse du brin (+) (Lien et al, 1986;
Seeger et al, 1986) dont llongation ncessite rapidement une circularisation de lADN car la
polymrase est dj rendue lextrmit 5 du brin (-). La circularisation seffectue par
lappariement de lextrmit 3 du brin (+) nouvellement synthtis avec lextrmit 3
complmentaire du brin (-), grce aux rgions DR. La polymrase sarrte avant la synthse
complte de ce deuxime brin, ceci aboutissant la formation dun ADN viral circulaire, relax,
partiellement double brin que lon retrouve dans les virions excrts.

VIII. Assemblage et scrtion des particules virales


A. Particules subvirales
Il a t montr que le gne S contenait toute linformation ncessaire lassemblage et
la scrtion des particules subvirales. En effet, des cellules transfectes avec un vecteur
dexpression de la protine S produisent des particules subvirales morphologiquement identiques
celles retrouves dans le srum. Les protines S sont dabord synthtises dans la membrane du
RE puis se dimrisent permettant ainsi la formation de ponts disulfures au niveau de certains
rsidus cystines. Toutefois, ces ponts disulfures ne sont pas indispensables la formation des
particules subvirales (Wounderlich & Bruss, 1996). Les protines forment ensuite des particules
subvirales dans la lumire du RE par invagination de la membrane (Huovila et al, 1992;
Roingeard & Sureau, 1998). Les particules sont alors excrtes hors de la cellule par exocytose.
Une tude ralise en 2007 par Patient et al a dmontr, grce des analyses de microscopie
lectronique, que les particules subvirales formes partir de protine S sauto-assemblaient
dans la lumire du rticulum endoplasmique sous forme de longs filaments branchs,
contrairement au modle prsum selon lequel la protine S permettrait de former directement de
petites particules sphriques (Patient et al, 2007). Ces longs filaments sont ensuite organiss et
associs les uns aux autres sous forme de structures ressemblant des cristaux afin dtre
transports dans des vsicules drives du RE, vers le compartiment intermdiaire entre
lappareil de Golgi et le RE (ERGIC). A lintrieur du compartiment ERGIC, ils sont librs et
relchs, et leur forme ainsi que leur taille empche alors leur progression dans la voie de
scrtion. Cette progression requiert leur conversion en petites particules sphriques qui a lieu
spontanment lorsque lon purifie ces filaments par chromatographie daffinit (Patient et al,
2007). Ce mode de formation des particules subvirales composes de protine S a galement t
rapport par une autre tude (Liou et al, 2008). Concernant la grande protine, la moyenne se
comportant plutt comme la protine S (Huovila et al, 1992), des filaments sont galement
retrouvs dans les cellules lexprimant, et leur accumulation peut engendrer lapoptose des

89
lexprimant, et leur accumulation peut engendrer lapoptose des cellules suite un stress du RE
(Foo et al, 2002). Ces filaments, retrouvs dans la lumire du RE, sont plus petits que ceux
forms par la protine S et ne sont pas transports dans des vsicules bourgeonnant du RE
(Patient et al, 2007). Ils sont transports moins efficacement jusquau ERGIC expliquant
potentiellement la rtention intracellulaire des particules composes de protine L. En effet, si la
protine L nest pas ncessaire lassemblage des particules subvirales, sa prsence a
dimportantes rpercussions sur ce mcanisme. Sa surexpression est capable dinhiber de faon
dose dpendante la libration des particules subvirales (Cheng et al, 1986; Kuroki et al, 1989; Ou
& Rutter, 1987; Persing et al, 1986; Standring et al, 1986) et des virions (Bruss & Ganem,
1991a). Dans un modle de souris transgniques contenant les gnes codant pour les protines de
surface, lexpression excessive de la protine L conduit laccumulation, dans la lumire du RE
des hpatocytes, de particules subvirales filamenteuses riches en protine L (Chisari et al, 1987).
Labsence de tels filaments dans la lumire de lappareil de Golgi suggre que leur progression
travers la voie de scrtion serait gne par leur taille anormalement longue, en accord avec les
observations rcentes de Patient et al. La rgion N-terminale du domaine Pre-S1 est ncessaire
la proprit de rtention de la protine L. En effet, la dltion des 19 premiers AA de la rgion
Pre-S1 (gnotype D) suffit favoriser la scrtion de la protine L (Kuroki et al, 1989), mais
uniquement en prsence de protine S (Bruss et al, 1996a). Lacide myristique participe aussi
la rtention (Prange et al, 1991). De faon intressante, lorsquun signal de translocation est
ajout lextrmit N-terminale de la rgion Pre-S1, les protines L, alors dans la conformation
ePre-S, sont scrtes mme en absence des protines S et M (Bruss & Vieluf, 1995; Gallina et
al, 1995; Prange et al, 1995). Par microscopie lectronique, des particules subvirales ont t
observes dans la lumire du compartiment pr-Golgien de cellules nexprimant que la protine
L (Xu et al, 1997a). Ces donnes indiquent que la rtention de la protine L rsulterait dune
interaction avec une protine prsente dans la lumire du compartiment pr-Golgien. La
calnexine, appartenant la famille des protines chaperon, est une protine candidate qui co-
immunoprcipite avec la protine L (Xu et al, 1997a), ou avec la protine M glycosyle dans sa
rgion Pre-S2 (Werr & Prange, 1998).
De faon intressante, une tude a rcemment suggr que la formation des particules
subvirales et des virons pourrait emprunter des voies diffrentes. En effet, alors que la formation
et la production des virions ncessiterait la fonctionnalit de protines impliques dans la
formation des compartiments endosomaux tardifs de type corps multi vsiculaires , dont la
lumire est riche en petites vsicules, la production des particules subvirales utiliserait une voie
diffrente (Watanabe et al, 2007). Jusqu ce jour, les virus identifis utilisant des fonctions
ncessaires la formation des corps multi vsiculaires pour leur bourgeonnement, sont des virus

90
ARN assembls au niveau de la membrane plasmique tels que le VIH. Il est donc intressant de
dcouvrir quun virus bourgeonnant dans un compartiment intracellulaire tel que le VHB puisse
galement utiliser une telle fonction. A la vue de ces rsultats, il apparat donc que la formation
des particules subvirales et des virions implique un mcanisme diffrent et quil faille donc
prendre des prcautions dans lextrapolation aux virus complets, des rsultats issus de ltude des
particules subvirales. Par exemple, on peut imaginer que la composition lipidique des virions,
dduite de celle des particules virales soit errone. Cette hypothse est cohrente avec les
donnes structurales rcentes sur les particules subvirales (Gilbert et al, 2005) et les virions
(Dryden et al, 2006; Seitz et al, 2007), ayant mis en vidence une organisation diffrente des
lipides entre ces particules.

B. Particules virales compltes


Des tudes par microscopie lectronique ont montr que lassemblage des virus
seffectuait au niveau des membranes intracellulaires, et non pas au niveau de la membrane
plasmique (Kamimura et al, 1981; Roingeard et al, 1990). Les nuclocapsides doivent interagir
avec les protines de surface insres dans la membrane du RE. Le mcanisme exact de cette
tape dassemblage des virions na pas encore t compltement lucid, mais il a t dmontr
que les protines S et L y tait indispensables, contrairement la protine M (Bruss & Ganem,
1991b; Fernholz et al, 1993; Ueda et al, 1991). La topologie de la protine L joue un rle
important dans la formation des particules de Dane. En effet, une protine L fusionne un
signal de scrtion dans sa rgion N-terminale, nexistant que dans la conformation ePre-S, peut
tre scrte sous forme de particules subvirales (Prange et al, 1995), mais ne permet pas la
formation de virions (Bruss & Vieluf, 1995). Ces rsultats illustrent le rle de la conformation
iPre-S, dans laquelle la protine L expose son domaine Pre-S du cot cytoplasmique, lors de
lenveloppement des nuclocapsides. En accord avec ces donnes, une rgion dinteraction avec
les nuclocapsides, ncessaire lassemblage des virions, a t identifie entre les acides amins
92 et 113 du domaine Pre-S (gnotype D) de la protine L (Blanchet & Sureau, 2007; Bruss,
1997; Le Seyec et al, 1999). La substitution de deux rsidus conscutifs dans cette rgion par des
alanines inhibe lenveloppement des nuclocapsides. De plus, cette interaction du domaine Pre-S
avec la nuclocapside est supporte par des expriences in vitro ayant dmontr la capacit de
peptides drivs du domaine Pre-S se fixer sur des capsides recombinantes ou drives du foie
dindividus infects (Poisson et al, 1997). Une autre rgion des protines denveloppe, localise
entre les deux premiers domaines transmembranaires et expose du ct cytoplasmique de la
membrane du RE, pourrait tre importante pour linteraction avec les nuclocapsides. En effet de
petites dltions dans la rgion C-terminale de cette boucle cytoplasmique (CYL I) inhibent la

91
formation des virions mais pas des particules subvirales (Loffler-Mary et al, 2000). Toutefois,
des mutations ponctuelles introduites dans cette rgion ne sont pas suffisantes pour bloquer
lassemblage des virions (Bruss, 2007). De plus, une tude rcente ralise par Blanchet et
Sureau a prsent des rsultats contradictoires ceux de Loffler-Mary et al puisque ces auteurs
nont pu identifier de mutations dans la premire boucle cytoplasmique des protines
denveloppe autorisant la scrtion des particules subvirales mais inhibant lassemblage des
virions (Blanchet & Sureau, 2006). Des sites de liaisons sur les protines de capside pour les
protines denveloppe ont galement t identifis par des analyses de mutagense. Ainsi, onze
mutations ponctuelles localises la base des excroissances formes par les dimres dAgHBc
(cf. chapitre Nuclocapsides , page 41) inhibent lenveloppement des nuclocapsides (Ponsel
& Bruss, 2003). De faon surprenante, des mutations lextrmit des pics des capsides nont
pas deffet sur leur enveloppement. Cependant, des peptides interagissant avec lextrmit de ces
pics bloquent la formation de virions (Bottcher et al, 1998; Dyson & Murray, 1995), en accord
avec les observations structurales de Seitz et al suggrant un rle important des acides amins
chargs lextrmit des pics pour linteraction avec les protines denveloppe (Seitz et al,
2007).
Contrairement de nombreux virus envelopps, on ne retrouve pas de protines de lhte
dans lenveloppe des particules virales du VHB, et mme les protines de surface du DHBV ne
sy incorporent pas. Par contre, la protine L du WHV est capable de substituer, bien quavec
une faible efficacit, la protine L du VHB pour lassemblage des virions (Gerhardt & Bruss,
1995). Ces rsultats illustrent limportance des interactions spcifiques entre les protines virales
pour la scrtion des particules subvirales et des virions.
Par ailleurs, tous les virions contiennent un gnome viral constitu dADN circulaire
partiellement double brin. Il a t dmontr que seules les nuclocapsides dont la polymrase a
synthtis au moins le premier brin dADN du gnome viral, pouvaient tre enveloppes. En
accord avec ces observations, une mutation qui inhibe lactivit de transcription inverse de la
polymrase virale empche lenveloppement des nuclocapsides (Gerelsaikhan et al, 1996; Wei
et al, 1996). Le mcanisme permettant dexpliquer cette observation est encore mal connu. Pour
le DHBV, il a t dmontr que comme les capsides de virions, des capsides matures dont la
protine HBc nest pas hyperphosphoryle, sattachaient aux membranes intracellulaires
indpendamment des protines denveloppe (Mabit & Schaller, 2000). A linverse, les capsides
immatures sont hyperphosphoryles et ninteragissent pas avec les membranes. Ces observations
suggrent que la discrimination entre les capsides matures et immatures ne ferait pas intervenir
les protines denveloppe mais aurait lieu lors du transport des capsides vers les sites
dassemblage.

92
O BJECTIFS DE LA THESE

Le mcanisme dentre du virus de lhpatite B dans sa cellule hte, lhpatocyte, est


toujours inconnu. En effet, malgr les nombreuses tudes entreprises, le rcepteur du virus, la
voie dinternalisation quil emprunte ainsi que le mcanisme permettant la libration des
nuclocapsides dans le cytoplasme des cellules infectes nont pas t identifis. Ceci peut en
partie sexpliquer par le manque de modle dinfection in vitro jusque la fin des annes 1980. En
effet, le premier modle dinfection, consistant en des hpatocytes humains cultivs en culture
primaire, fut dcouvert en 1988 au sein de notre laboratoire par Philippe Gripon et al (Gripon et
al, 1988). Cependant, bien que ce modle permette dobtenir une infection efficace et
reproductible depuis 1993 (Gripon et al, 1993), la disponibilit des hpatocytes primaires ainsi
que la qualit variable des prparations en font un modle dlicat utiliser. Ce nest finalement
qu partir de 2002 que les dcouvertes se sont acclres, grce la dcouverte de la premire
ligne infectable par le VHB, la ligne HepaRG (Gripon et al, 2002). Ces deux modles
dinfection ont notamment permis de dcouvrir limportance du domaine Pre-S1 de la protine L
lors de ltape dinfection (Blanchet & Sureau, 2007; Le Seyec et al, 1999) et sa probable
implication dans la reconnaissance du rcepteur viral (Barrera et al, 2005; Glebe et al, 2005;
Gripon et al, 2005), ainsi que la prsence dun dterminant de linfectivit dans la boucle
antignique du domaine S des protines denveloppe (Abou-Jaoude & Sureau, 2007; Jaoude &
Sureau, 2005; Salisse & Sureau, 2009).
La recherche de rgions des protines denveloppe ncessaires au processus dinfection
constitue une stratgie pour mieux comprendre le mcanisme dentre virale. Une telle approche
a permis de dterminer le rle crucial du domaine Pre-S1 lors du processus dinfection (Le Seyec
et al, 1999) et a men au dveloppement de peptides drivs de ce domaine capables de bloquer
linfection par le VHB in vitro (Gripon et al, 2005) et in vivo (Petersen et al, 2008). Ainsi, cette
stratgie a permis la dcouverte dune nouvelle molcule antivirale capable de bloquer trs
efficacement le mcanisme dentre du VHB. A la vue du succs de cette approche, notre
objectif a t dutiliser les modles dinfection prcdents, pour tudier les premires tapes de
linfection, en tentant didentifier de nouvelles rgions des protines de lenveloppe virale
impliques dans ce processus. Pour cela, une mthodologie base sur lintroduction de mutations
ponctuelles ou de dltions au sein des gnes viraux codant pour les protines virales de surface
a t choisie. Limpact de ces modifications a t analys sur les tapes dexpression des
protines mutes, de production de virus, puis sur le pouvoir infectieux des virions scrts.
Le mcanisme permettant la libration des nuclocapsides dans le cytoplasme des
cellules infectes na toujours pas t lucid. En ce qui concerne le DHBV, deux hypothses qui

93
coexistent toujours ont t proposes. La premire suggre que les particules virales entires
traverseraient la membrane des endosomes grce un mcanisme de translocation et que la
dgradation de lenveloppe virale dans le cytoplasme permettrait alors la libration des
nuclocapsides (Stoeckl et al, 2006). La seconde suggre quun mcanisme de fusion entre
lenveloppe virale et la membrane des endosomes tardifs permettrait cette libration (Chojnacki
et al, 2005). Concernant le VHB, aucune exprience dinfection avec des virus mutants na t
ralise pour valider ou invalider ces hypothses. Ainsi, le rle lors de linfection du motif de
translocation (TLM) prsent dans le domaine Pre-S2 des protines denveloppe ainsi que du
peptide de fusion localis lextrmit N-terminale du domaine S na pas t dtermin. Nous
nous sommes donc attachs analyser le rle de ces deux motifs au cours du processus dentre
virale.
Dans un premier temps, nous avons tudi le rle du motif de translocation (TLM)
prsent dans le domaine Pre-S2 des protines de surface du VHB. Il a t dmontr, grce une
approche visant introduire des dltions conscutives dans le domaine Pre-S2, que ce domaine
ntait pas indispensable dans la protine L au cours du processus dinfection (Le Seyec et al,
1998). Par ailleurs, la protine M ntant pas indispensable au processus dinfection (Fernholz et
al, 1993), la prsence de ce motif dans la protine M est galement facultative lors du processus
dinfection. Toutefois, on ne peut exclure quun mcanisme de complmentation permette de
muter le TLM soit dans la protine L, soit dans la protine M sans affecter le processus
dinfection. Nous avons donc dcid danalyser le pouvoir infectieux de virus dont le TLM tait
mut dans ces deux protines (Article I).
Dans un second temps, nous avons analys le rle du peptide de fusion putatif des
protines de surface du VHB, localis lextrmit N-terminale du domaine S, lors du processus
dinfection. Ce peptide de fusion, capable dinduire la fusion de liposomes in vitro (Rodriguez-
Crespo et al, 1995), est indispensable au processus dinfection dans le modle du DHBV
(Chojnacki et al, 2005). En effet, la substitution dacides amins hydrophobes dans sa squence
par des rsidus alanine inhibe le processus dinfection. Compte tenu de ces rsultats, nous avons
dcid dvaluer le rle du peptide de fusion putatif du VHB lors de linfection grce
lintroduction de dltions conscutives dans sa squence. Par ailleurs, nous avons dcid
dintroduire ces dltions soit dans la protine S, soit dans les protines L et M afin dtudier
leurs rles sparment. Nous avons analys leffet des mutations sur lexpression des protines,
lassemblage des virions et sur le pouvoir infectieux des virus mutants (Article II).

94
R ESULTATS

PARTIE I : ANALYSE DU ROLE DU MOTIF DE TRANSLOCATION PRESENT DANS LE


DOMAINE PRE-S2 DES PROTEINES DENVELOPPE DU VHB LORS DE LETAPE
DINFECTION

I. Introduction
Pour infecter sa cellule cible, le VHB doit interagir avec un rcepteur la surface des
hpatocytes, puis librer sa nuclocapside dans le compartiment cytoplasmique. En 1994,
Rodriguez-Crespo et al ont identifi un peptide de fusion putatif lextrmit N-terminale de la
protine S du VHB qui pourrait permettre ce processus grce un mcanisme de fusion entre
lenveloppe virale et une membrane cellulaire (Rodriguez-Crespo et al, 1994). Alors quaucune
exprience ne prouve son rle au cours de linfection par le VHB, il semble que ce peptide de
fusion soit ncessaire au maintien de linfectivit des virions du DHBV (Chojnacki et al, 2005).
En 2006, Stoeckl et al ont propos une hypothse alternative la fusion impliquant un motif de
translocation (TLM) localis lextrmit C-terminale du domaine Pre-S2 des protines
denveloppe (Stoeckl et al, 2006). Le TLM est un domaine de 12 acides amins capable
dinduire le transfert, travers des membranes, de protines qui y sont fusionnes. Ce transfert
est indpendant de lnergie et de la reconnaissance dun rcepteur (Oess & Hildt, 2000; Stoeckl
et al, 2006). Daprs cette hypothse, aprs ladsorption des virus la surface des hpatocytes et
leur internalisation dans les endosomes, le TLM serait expos la surface des virus grce un
changement de conformation des protines denveloppe afin que ces derniers traversent la
membrane des endosomes et se retrouvent dans le cytoplasme. Le rle du TLM dans ltape
dentre du VHB a t suggr par des expriences ayant dmontr que lexposition artificielle
du TLM la surface des virions pouvait induire linfection de cellules de la ligne HuH7
normalement rfractaires linfection (Stoeckl et al, 2006). Cependant aucune exprience na t
ralise afin dtudier la capacit de virus, dont le TLM est non fonctionnel, infecter des
hpatocytes humains. De plus, ds 1998, une tude ralise par notre quipe avait dmontr que
le TLM de la protine L du VHB ntait pas ncessaire linfectivit des virions (Le Seyec et al,
1998). Toutefois, dans cette tude, le TLM tait toujours prsent dans la protine M, qui bien que
non ncessaire au processus dinfection, pouvait fournir en trans un TLM fonctionnel
responsable de linfectivit des virus ayant perdu leur TLM uniquement dans la protine L. Afin
de complter ces rsultats, nous avons dcid danalyser le pouvoir infectieux de virus dont le
TLM des protines L et M a t dtruit.

95
II. Stratgie exprimentale
Afin dtudier le rle du TLM lors du processus dinfection, nous avons introduit dans le
domaine Pre-S2 des protines L et M, des mutations correspondant des dltions conscutives
de 10 acides amins entre les rsidus 114 et 163 (numrotation dans la protine L) (Le Seyec et
al, 1998). Ces dltions couvrent la totalit du domaine Pre-S2 lexception de ses cinq premiers
acides amins qui sont ncessaires au processus dassemblage viral. Pour produire des virus
sauvages ou muts, des cellules de la ligne dhpatome HepG2 ont t cotransfectes avec (i)
un gnome viral du VHB dficient pour la production de protines denveloppe, (ii) un plasmide
codant pour la protine S et (iii) un plasmide codant pour les protines L et M mutes ou
sauvages. Les virus produits sont scrts et rcolts dans le surnageant de culture des cellules
transfectes. Ils sont ensuite concentrs 50 fois dans des inocula dont le titre est dtermin par
PCR quantitative. Globalement, les virus de chaque inoculum sont capturs au fond de plaques
multi-puits grce un anticorps monoclonal reconnaissant le domaine Pre-S1, puis leur ADN est
purifi et quantifi grce des amorces de PCR permettant lamplification dune rgion du gne
de capside. Pour analyser le pouvoir infectieux des virus mutants, des hpatocytes primaires ont
t infects avec les diffrents inocula et le niveau dinfection a t dtermin grce la
quantification dune part des ARNm viraux intracellulaires et dautre part de lAgHBe scrt
dans le surnageant de culture des cellules infectes, 10 jours aprs linfection. Afin de prendre en
compte les variations du nombre de particules virales entre les diffrents inocula, les rsultats
dinfection sont rapports la quantit de virus utilise pour chaque infection.

III. Rsultats et discussion


Ce travail a permis de confirmer que le domaine Pre-S2 des protines L et M,
lexception de ses cinq premiers acides amins, ntait pas ncessaire au processus dassemblage
viral. Lanalyse du pouvoir infectieux des virus mutants a ensuite permis didentifier une rgion
dans le domaine Pre-S2, entre les rsidus 114 et 133 (numrotation dans la protine L), agissant
comme un fort modulateur de linfection. En effet, alors que la dltion des dix premiers acides
amins de cette rgion augmente lgrement lassemblage viral et diminue fortement linfectivit
des virus, la dltion des dix rsidus suivant diminue lgrement lassemblage et augmente
linfectivit dun facteur 3 environ. La caractrisation plus prcise du rle de cette rgion lors du
processus dinfection ncessiterait lanalyse de nouvelles mutations telles que des substitutions
uniques ou combines. Finalement, concernant les trois dernires dltions, dont deux dtruisent
le TLM, nous avons clairement dmontr que les virus porteurs de ces mutations taient capables
dinfecter des hpatocytes humains en culture primaire avec la mme efficacit que les virus
sauvages. Ces donnes dmontrent que le TLM prsent dans le domaine Pre-S2 des protines

96
denveloppe du VHB nest impliqu ni dans le processus dassemblage viral ni dans le processus
dinfection. De plus, cette conclusion est supporte par deux autres tudes ayant dmontr que le
TLM du domaine Pre-S2 ntait pas ncessaire linfectivit du VHD (Gudima et al, 2007) et du
VHB (Blanchet & Sureau, 2007). Ainsi, alors que ce motif semble ncessaire linfectivit du
DHBV (Stoeckl et al, 2006), il nest pas important pour linfection du VHB. Toutefois, nos
donnes ne peuvent exclure la possibilit quun autre TLM fonctionnel dans les protines de
surface du VHB, non identifi, puisse permettre la translocation des virus sauvages et muts.
Nanmoins limplication dun peptide de fusion lors de lentre virale, en accord avec des
donnes obtenues avec le modle du DHBV (Chojnacki et al, 2005), semble probable et a t
analyse dans la deuxime partie des rsultats (Article II).

IV. Article I

Lepre C, Rgeard M, Le Seyec J, Gripon P


The translocation motif of hepatitis B virus envelope proteins is dispensable for infectivity
J Virol. 2007 Jul ; 81(14):7816-8. PubMed PMID: 17494068

97
PARTIE II : ANALYSE DU ROLE DU PEPTIDE DE FUSION PUTATIF DES PROTEINES
DENVELOPPE DU VHB LORS DE LETAPE DINFECTION

I. Introduction
Dans la premire partie des rsultats, nous avons vu que le mcanisme permettant la
libration des nuclocapsides dans le cytoplasme des cellules infectes par le VHB, ne
correspondait pas un processus de translocation dpendant du TLM localis dans le domaine
Pre-S2 des protines de surface. Lexistence dun mcanisme de fusion entre lenveloppe virale
et une membrane cellulaire constitue une hypothse alternative la translocation. En effet, un
peptide de fusion putatif a t identifi lextrmit N-terminale du domaine S des protines
denveloppe grce son homologie de squence avec dautres peptides de fusion viraux
(Rodriguez-Crespo et al, 1994). Cette squence, soit N-terminale dans la protine S ou interne
dans les protines L et M, est conserve parmi les hepadnaviridae et possde des caractristiques
structurales et fonctionnelles communes avec dautres peptides de fusion (Rodriguez-Crespo et
al, 1995; Rodriguez-Crespo et al, 1999). Dans les protines L et M, une squence PEST
contenant probablement plusieurs sites de clivage protolytique a t identifie en amont de ce
peptide de fusion (Lu et al, 1996). Un clivage dans cette squence pourrait permettre lactivation
du peptide de fusion. Dans cette tude, nous avons dcid danalyser le rle du peptide de fusion
putatif et de la squence PEST du VHB lors de ltape dinfection.

II. Stratgie exprimentale


Afin dtudier le rle du peptide de fusion et de la squence PEST lors de lentre virale,
nous avons construit une srie de virus mutants dont les protines denveloppe comportent des
dltions contigus dans ces rgions, puis nous avons analys le pouvoir infectieux des virus in
vitro en infectant des cellules de la ligne HepaRG. Lintroduction de mutations soit dans les
protines L et M, ou dans la protine S seule nous a permis dtudier le rle de ces protines
sparment. Pour tudier le rle du peptide de fusion localis lextrmit N-terminale du
domaine S et dont la squence chevauche partiellement le domaine TM1, nous avons choisi de
dlter des groupes dacides amins en fonction de leur hydrophobicit. Ainsi, nous avons
dcoup la rgion dintrt en clusters dune part dacides amins hydrophobes et dautre part de
rsidus neutres ou polaires. Pour chaque mutant, nous avons analys le niveau dexpression
intra- et extracellulaire des protines denveloppe mutes, la scrtion dantignes HBs, la
production de virus et linfectivit.
Pour produire des virus sauvages ou muts, des cellules de la ligne dhpatome HepG2
ont t cotransfectes avec (i) un gnome viral du VHB dficient pour la production de protines
denveloppe, (ii) un plasmide codant pour la protine S sauvage ou mute et (iii) un plasmide
98
codant pour les protines L et M sauvages ou mutes. Les virus produits ont t rcolts dans le
surnageant de culture des cellules transfectes et concentrs 50 fois dans des inocula dont le titre
a t dtermin par PCR quantitative suite la purification des particules virales grce des
anticorps dirigs contre le domaine Pre-S1. Pour analyser le pouvoir infectieux des virus
mutants, des cellules diffrencies de la ligne HepaRG ont t infectes avec les diffrents
inocula et le niveau dinfection a t dtermin grce la quantification de lAgHBe scrt dans
le surnageant de culture des cellules infectes, 10 jours aprs linfection. Afin de prendre en
compte les variations du nombre de particules virales entre les diffrents inocula, les rsultats
dinfection ont t rapports la quantit de virus utilise pour chaque infection.

III. Rsultats
Dans un premier temps, cette tude nous a permis de dmontrer que les clusters
hydrophobes du domaine TM1 de la protine S taient ncessaires lexpression de cette
protine. De plus, les dltions ne perturbant pas lexpression de la protine, principalement
celles ciblant des rsidus polaires, et permettant un assemblage viral comparable celui des virus
sauvages, nont pas deffet sur linfectivit des virions suggrant que le rle principal du
domaine TM1 de la protine S soit dassurer une bonne expression de cette protine.
Dans un deuxime temps, puisque les dltions introduites dans la protine S
empchaient soit la synthse protique et lassemblage viral, ou navaient pas deffet sur
linfectivit des virions, nous avons analys leffet des mmes mutations lorsquelles sont
introduites dans les protines L et M. Nous avons observ que toutes les mutations, y compris
celles liminant les clusters de rsidus hydrophobes, permettaient une bonne expression des
protines ainsi que leur scrtion. Concernant la production de virus, nous avons dmontr que
lextrmit N-terminale du domaine S des protines L et M ntait pas ncessaire lassemblage
viral lexception de quatre acides amins, ILTI, la fin du domaine TM1 dont la dltion
bloque compltement la production de particules virales compltes. De manire plus importante,
nous avons identifi deux clusters dacides amins hydrophobes (HC), LLVL (HC1) et FFLL
(HC2), ainsi que deux rsidus polaires adjacents, une thronine et une arginine, dans le domaine
TM1 dont la prsence est indispensable pour le maintien de linfectivit des virions.
Afin de confirmer ces rsultats, et dcarter un artfact d la prsence de dltions dans
les protines denveloppe, nous avons analys le rle des clusters hydrophobes et des rsidus
thronine et arginine du domaine TM1 en les substituant par des alanines. Ainsi, nous avons
confirm le rle des deux premiers clusters, HC1 et HC2, lors du processus dinfection ;
dmontr que le troisime cluster de rsidus hydrophobes du domaine TM1, ILTI (HC3), dont la
substitution en quatre alanines permet un assemblage viral contrairement sa dltion, tait

99
galement crucial pour le maintien de linfectivit des virions ; et enfin que la substitution des
rsidus thronine et arginine par deux alanines naffectait pas linfectivit des virus suggrant
que la nature de ces deux acides amins ne serait pas dterminante mais que leur position qui
permet despacer les clusters HC2 et HC3 serait importante. De faon intressante, lanalyse de
mutants supplmentaires nous a permis de dmontrer que le cluster HC3 tait probablement
ncessaire au processus dinfection uniquement dans les protines L et M. En effet, la
substitution des deux isoleucines de ce cluster dans les protines L et M inhibe linfectivit des
virions de plus de 90 % alors que les mmes mutations introduites dans la protine S nont pas
deffet significatif. Bien que cela doivent encore tre dmontr pour les deux premiers clusters
hydrophobe, si le domaine TM1 joue un rle lors de linfection uniquement dans les protines L
et M, probablement en tant que peptide de fusion, il doit agir soit sous la forme dune boucle de
fusion interne, soit tre expos lextrmit N-terminale des protines grce un clivage
protolytique. La squence PEST, susceptible de contenir des sites de clivage protolytiques
pourrait permettre cette exposition. Afin de vrifier cette hypothse, nous avons analys leffet
de sa dltion sur le pouvoir infectieux des virus et dmontr que cette squence ntait
indispensable ni au processus dassemblage ni au processus dinfection du VHB.

IV. Discussion
Afin dtudier le rle du peptide de fusion putatif et de la squence PEST des protines
denveloppe lors du processus dinfection, nous avons introduit des mutations dans ces motifs
soit dans la protine S seule, soit dans les protines L et M. Cette stratgie nous a permis
dobserver que le domaine TM1 de la protine S tait important pour lexpression de cette
protine, en accord avec une tude antrieure (Prange et al, 1992). A loppos lorsque les mmes
dltions furent introduites dans les protines L et M, lexpression de ces protines ne fut pas
inhibe. Compte tenu du fait que les 32 premiers rsidus du domaine S ont t dcrits comme un
peptide signal non cliv permettant linsertion cotraductionnelle de la protine S dans la
membrane du RE (Eble et al, 1986; Eble et al, 1987), nous navons pas t surpris que des
mutations dans cette rgion affectent la synthse ou la stabilit de la protine S. Au contraire, il
tait logique que lexpression de la protine L ne soit pas affecte puisque dans la conformation
iPre-S de cette protine, le domaine TM1 est expos du ct cytoplasmique de la membrane du
RE suggrant que son activit de transfert cotraductionnel nest pas requise dans cette protine.
De faon plus importante, ce travail a permis de dmontrer limportance, pour
linfectivit des virions, de trois clusters de rsidus hydrophobes dans le domaine TM1 des
protines L et M. Les deux premiers clusters, HC1 et HC2, sont inclus dans la squence du
peptide de fusion putatif identifi par Rodriguez-Crepo et al en 1994. Limplication du domaine

100
TM1 dans ltape dattachement ou de fusion de lentre virale doit cependant encore tre
dtermine. En effet, puisque la protine L est probablement implique dans ltape dadsorption
des virus aux cellules, et que nous ne disposons pas de test dattachement au rcepteur, toujours
inconnu, nous ne pouvons exclure que nos mutations affectent cette tape initiale de lentre
virale. Nanmoins, plusieurs arguments tels que lhydrophobicit des rsidus ncessaires
linfection suggrent un rle du domaine TM1 lors du processus de fusion. Les rsultats de
plusieurs tudes antrieures sont en accord avec cette hypothse. En effet, il a t dmontr que
des peptides synthtiques dont la squence correspond aux 16 premiers acides amins du
domaine S et contient le premier cluster hydrophobe du domaine TM1, taient capables de
dstabiliser la membrane de liposomes in vitro (Rodriguez-Crespo et al, 1995). De plus, Berting
et al ont dmontr quune partie du peptide de fusion putatif, incluant galement le premier
cluster hydrophobe, pouvait induire un processus dhmifusion lorsquelle remplaait le peptide
de fusion de la protine HA2 (Berting et al, 2000).
De faon intressante nous avons remarqu que les deux isoleucines du troisime cluster
hydrophobe ntaient pas indispensables linfectivit des virions dans la protine S alors
quelles ltaient dans les protines L et M. La protine M ntant pas ncessaire au processus
dinfection, ces rsultats suggrent que le troisime cluster hydrophobe du domaine TM1 nest
important quau sein de la protine L. Il est alors tentant dmettre lhypothse que tous les
clusters hydrophobes de ce domaine, bien que ncessaires la synthse de la protine S et dont
leffet sur linfectivit na pu tre test, ne joue un rle dans lentre virale que dans la protine
L. Linsertion de mutations ponctuelles dans ces clusters, qui naffecteraient pas la synthse de la
protine S, permettrait de vrifier cette hypothse. De plus, celle-ci est supporte par des
rsultats obtenus avec le modle du DHBV, dont le mcanisme dentre virale ferait intervenir
un mcanisme de fusion dpendant du domaine TM1 de la protine L uniquement (Chojnacki et
al, 2005). La position interne du peptide de fusion dans cette protine ainsi que nos rsultats qui
ont exclu la ncessit dun clivage protolytique dans la squence PEST suggrent que le
dterminant de linfectivit que nous avons identifi, sil est impliqu dans un mcanisme de
fusion, agirait plutt comme une boucle de fusion.
Pour tre impliqu directement dans le processus dentre virale, le domaine TM1 doit
pouvoir tre expos la surface des particules virales. Cependant, les modles actuels localisent
ce domaine soit lintrieur des virions dans la conformation iPre-S de la protine L, soit insr
dans la bicouche lipidique de lenveloppe virale. Lhydrophobicit relativement faible du
domaine TM1, compare celle dautres domaines transmembranaires, est compatible avec
lexistence de ces deux topologies. Aussi, il est possible dimaginer que ce domaine puisse tre
transloqu lextrieur des virions lors du processus dentre. Cette hypothse est supporte par

101
une tude de Grgacic et Schaller ayant dmontr, dans le modle du DHBV, quun pH acide
permettait la translocation et lexposition du domaine TM1 de la protine L la surface des
virions (Grgacic & Schaller, 2000). Ainsi, le dterminant de linfectivit du domaine TM1 du
VHB pourrait directement interagir avec la membrane dune cellule cible. Lanalyse de la
topologie de la protine L du VHB, ainsi que la mise au point dun test de fusion permettant de
comparer la capacit de virus mutants et sauvages induire un processus de fusion permettrait de
tester ces hypothses et constituent les perspectives de ce travail.

V. Article II

Lepre-Douard C, Trotard M, Le Seyec J, Gripon P


The First Transmembrane Domain of the Hepatitis B Virus Large Envelope Protein is Crucial for
Infectivity
J Virol. 2009 Nov; 83(22):11819-29 PubMed PMID: 19740987

102
D ISCUSSION GENERALE ET P ERSPECTIVES

Depuis la dcouverte de lagent infectieux responsable des hpatites virales B, des


progrs considrables ont t raliss dans la comprhension des bases molculaires du cycle
viral du VHB. Pourtant, les premires tapes de linfection demeurent mystrieuses. En effet, le
rcepteur du virus, la voie dinternalisation quil emprunte ainsi que le mcanisme lui permettant
de librer sa nuclocapside dans le cytoplasme des cellules infectes nont pas t identifis.
Contrairement un grand nombre de virus envelopps dont les protines de fusion partagent
plusieurs caractristiques communes permettant leur regroupement dans trois grandes classes de
protines de fusion (Harrison, 2008), les protines de surface du VHB semblent uniques. De ce
fait, les mcanismes dentre remarquablement bien caractriss pour ces trois classes de
protines, en partie grce la rsolution de la structure tridimensionnelle des protines de fusion,
ne peuvent tre transposs au cycle du VHB. Plusieurs caractristiques des protines
denveloppe du VHB en font des entits originales par rapport aux autres protines de fusion
virales : (i) leur poids molculaire modeste, (ii) leurs nombreux segments transmembranaires,
(iii) la petite taille de leurs domaines extracellulaires, (iv) leur capacit tre scrtes sous
forme de particules subvirales, et (v) leur organisation extrmement compacte dans lenveloppe
virale. Toutefois, ltude dun virus de la mme famille infectant les canards, le DHBV, a permis
de comprendre de nombreuses tapes du cycle du VHB et notamment les mcanismes complexes
de la rplication virale. Concernant le processus dentre virale, les donnes disponibles sont
beaucoup plus abondantes dans ce modle animal que dans celui du VHB. En effet, le rcepteur
du DHBV, la carboxypeptidase D ainsi quun corcepteur, la gp120, ont pu tre identifis. Aprs
leur adsorption la surface des cellules, les virus sont internaliss et vraisemblablement
transports dans les endosomes prcoces et tardifs. Ensuite, la libration des nuclocapsides dans
le cytoplasme des hpatocytes infects se ferait grce un mcanisme de translocation des
particules virales entires travers la membrane des endosomes (Stoeckl et al, 2006) ou grce
un mcanisme de fusion entre lenveloppe virale et une membrane cellulaire (Chojnacki et al,
2005). Cependant, compte tenu de la grande spcificit despce des hepadnavirus et du degr de
conservation relativement faible entre les protines de surface des avi- et orthohepadnavirus, il
est possible que le mcanisme dentre du DHBV et du VHB soit diffrent. Par exemple, il ne
semble pas que lhomologue humain de la carboxypeptidase D soit impliqu dans le mcanisme
dentre du VHB puisquaucune tude na pu impliquer cette molcule dans le processus
dinfection du VHB. Il apparait donc essentiel de vrifier lensemble des dcouvertes obtenues
grce au modle du DHBV, en utilisant le modle du VHB. Dans ce contexte, lobjectif de ma
thse a t danalyser le rle lors de linfection de deux motifs des protines denveloppe du

103
Figure 25. Squence des peptides de fusion du VHB et du DHBV.
HC, Hydrophobic cluster. Source : (Chojnacki et al, 2005).
VHB, un motif de translocation (TLM) et un peptide de fusion, possiblement impliqus dans le
mcanisme dentre du DHBV.
Dans un premier temps, nous avons analys le rle au cours du cycle viral, du TLM
prsent dans le domaine Pre-S2 des protines L et M du VHB. Il a t suggr que ce motif
permettrait la translocation des virus entiers travers la membrane des endosomes afin quils
librent ensuite leur nuclocapside dans le cytoplasme des cellules infectes (Stoeckl et al,
2006). De plus, les mmes auteurs ont observ que des motifs quivalents taient ncessaires au
processus dentre du DHBV. Toutefois, nos rsultats ont permis de dmontrer que ce motif
ntait pas ncessaire aux processus dassemblage et dinfection du VHB (Lepere et al, 2007), en
accord avec les conclusions de trois autres tudes (Blanchet & Sureau, 2007; Gudima et al, 2007;
Le Seyec et al, 1998). Ainsi, ce motif ncessaire au mcanisme dentre du DHBV ne semble
pas avoir de fonction dans les protines denveloppe du VHB. Cependant, il est important de
noter que la protine L du DHBV, la diffrence de celle du VHB, contient deux TLMs dans sa
rgion Pre-S. De plus ces TLMs sont localiss dans la premire moiti du domaine Pre-S de la
protine L, correspondant la rgion du domaine Pre-S1 ncessaire linfection du VHB, entre
les rsidus 20-31 et 42-53 (Stoeckl et al, 2006). Au vu de ces diffrences, il nest donc pas
surprenant que ces motifs distants aient un rle distinct chez le DHBV et le VHB. Si la libration
des nuclocapsides dans le cytoplasme des cellules infectes ne passe pas par un mcanisme de
translocation des virus entiers travers la membrane des endosomes, un mcanisme de fusion
entre lenveloppe virale et une membrane cellulaire pourrait tre impliqu.
Nous avons donc dcid danalyser le rle du peptide de fusion putatif des protines
denveloppe du VHB au cours de ltape dentre virale. Ce dernier, localis lextrmit
N-terminale du domaine S des protines S, M et L, prsente des homologies de squence avec
les peptides de fusion des protines de fusion de classe I (Rodriguez-Crespo et al, 1994). Sa
position, N-terminale dans la protine S et interne dans les protines L et M nous a amen
tudier sa fonction sparment dans ces protines. Ainsi, notre travail a permis de dmontrer que
trois clusters hydrophobes du domaine TM1 (AA 11-28), dont la squence chevauche
partiellement celle du peptide de fusion (AA 1-23), taient ncessaires dans les protines L et M
pour le maintien de linfectivit des virions. Ces clusters de quatre rsidus, nomms HC1
(LLVL), HC2 (FFLL) et HC3 (ILTI) contiennent trois ou quatre acides amins hydrophobes.
Leur position et leur squence, comme celle de lensemble du peptide de fusion, est conserve
entre le VHB et le DHBV bien que les clusters hydrophobes dans le domaine TM1 du DHBV
soient un peu plus larges (Fig. 25). Ainsi, nous avons montr que le peptide de fusion situ
lextrmit N-terminale du domaine S des protines L et M tait ncessaire ltape dinfection
du VHB, comme cela a t montr dans le modle du DHBV, en accord avec limportante

104
Figure 26. Taux de remplacement des acides amins dans les protines de surface et dans la polymrase
virale. Le nombre de remplacement a t dtermin pour chaque rsidu (axe des ordonns) (van Hemert et
al, 2008). Ligne bleue : Variabilit dans la squence de la polymrase virale. Ligne verte : Variabilit
dans la squence des protines de surface. Une pente positive indique une rgion soumise une variabilit
et une pente ngative reflte une conservation. La position des acides amins dans la protine S est
donne sur laxe des abscisses. Les hlices au dessus du graphique reprsentent les quatre domaines
transmembranaires du domaine S. En bas : agrandissement de la rgion du domaine TM1. Source : (van
Hemert et al, 2008).
conservation de cette rgion. Toutefois, bien que la conservation dune rgion des protines
denveloppe, entre les gnotypes du VHB ou entre les hepadnaviridae, puisse indiquer le rle
fondamental de cette rgion lors du cycle viral, il ne faut pas oublier que le cadre ouvert de
lecture de la polymrase virale chevauche la totalit de celui codant pour les protines de
surface. De fait, dans la majorit des cas, lorsquun domaine est conserv dans la polymrase ou
dans les protines de surface, la deuxime protine est elle aussi conserve en consquence de la
pression de slection impose par le domaine conserv (van Hemert et al, 2008) (Fig. 26).
Cependant, cette observation nest pas systmatique puisquune rgion peut tre conserve dans
la polymrase et soumise une variabilit dans les protines de surface, ou vice versa. Par
exemple, alors que le motif YMDD de la polymrase virale, prsent au cur du site catalytique
de lenzyme, est relativement conserv, la squence sous-jacente dans la protine S est sujette
une importante variation (van Hemert et al, 2008) (Fig. 26). De faon trs intressante, cette
caractristique confre probablement au site catalytique de la polymrase une libert dvolution,
importante pour son chappement aux inhibiteurs nuclotidiques. Le mme type de situation est
observ dans la boucle antignique des protines de surface. En effet, alors que le dterminant
(a) est relativement bien conserv dans ces protines, la rgion sous jacente dans la polymrase
virale est soumise a une importante variabilit, permettant ainsi au dterminant (a) de sadapter
et de modifier son antignicit en fonction de la rponse immunitaire laquelle il est soumis. De
plus, parfois, lapparition de mutations dans la rgion chevauchante entre les protines de surface
et la polymrase virale peut avoir des rpercussions positives sur les deux protines influenant
lvolution de la maladie et la rponse au traitement ou la vaccination (Torresi, 2002). Dans ce
contexte, nous avons essay danalyser la conservation du domaine TM1 en tenant compte de la
squence de la polymrase virale sous jacente. Nous avons pu remarquer, que sa squence tait
conserve tout le long du domaine TM1 (Fig. 26). Cette observation nest pas surprenante si lon
considre que le domaine TM1 est localis au tout dbut de la rgion transcriptase inverse de la
polymrase (juste aprs la rgion spacer ) prsentant des homologies de squence avec la
transcriptase inverse de rtrovirus tels que le VIH (Das et al, 2001). Concernant le domaine TM1
du DHBV, il est lui aussi localis dans la rgion transcriptase inverse de la polymrase virale,
une vingtaine dacides amins aprs la rgion spacer . Ainsi, bien quil soit tentant dimaginer
que la conservation de ce domaine reflte son importance au cours du cycle des hepadnaviridae,
on ne peut exclure que sa squence soit conserve cause de celle de la polymrase virale.
Toutefois, lorsque lon observe avec attention le profil de conservation du domaine TM1 (Fig.
26, agrandissement), on remarque que ce dernier est relativement variable et que deux rgions,
correspondant aux clusters hydrophobes 1 et 3, sont particulirement conserves, alors que le
deuxime cluster, comme les deux rgions polaires, est soumis une variabilit relativement

105
importante. Ainsi, cette observation suggre que les clusters hydrophobes 1 et 3 constituent des
motifs cl au sein du domaine TM1, do leur conservation plus importante par rapport au reste
de la squence. De faon trs intressante, ces donnes supportent nos rsultats puisque nous
avons dmontr que ces deux clusters semblaient plus important pour linfectivit que le
deuxime cluster hydrophobe, et que les rgions polaires ntaient pas ncessaire au processus
dinfection.
Il a t dmontr que seul le peptide de fusion de la protine L du DHBV jouait un rle
lors de ltape dentre virale (Chojnacki et al, 2005), alors que la mme squence dans la
protine S ntait pas implique et jouait plutt un rle dans le maintien de la conformation et de
la stabilit de la protine (Grgacic, 2002). Des rsultats comparables obtenus dans le modle du
VHB ont dmontr que des dltions introduites dans le domaine TM1 de la protine S
affectaient lexpression de cette protine (Prange et al, 1992). Ces donnes supportent nos
rsultats puisque nous avons galement observ que lintroduction de dltions dans le domaine
TM1 de la protine S affectaient son expression alors que des modifications identiques
introduites dans les protines L et M naffectaient pas lexpression de ces protines mais
inhibaient le processus dinfection. De plus, des mutations ponctuelles introduites dans le
troisime cluster hydrophobe, HC3, du domaine TM1 naffectant pas la synthse des protines S,
M et L, ont un effet sur linfectivit seulement lorsquelles sont introduites dans les protines L
et M (Lepere-Douard et al, 2009). Il semble donc que le dterminant de linfectivit que nous
avons identifi lextrmit N-terminale du domaine S des protines denveloppe joue un rle
diffrent dans la protine S dune part o il est ncessaire lexpression de cette protine, et dans
les protines L et M dautre part o il est essentiel au mcanisme dentre, que ce soit dans le
modle du VHB ou dans celui du DHBV. Nous pouvons galement suggrer que seul le peptide
de fusion de la protine L du VHB est ncessaire au processus dinfection puisque des virus
dpourvu de protine M sont toujours infectieux (Fernholz et al, 1993). Si le dterminant de
linfectivit prsent dans le domaine TM1 de la protine L est impliqu dans un mcanisme de
fusion au cours du cycle viral, il doit soit agir soit sous forme dune boucle de fusion, comme
dans les protines de fusion de classe II et III, soit sous la forme dun peptide de fusion
N-terminal, comme dans les protines de fusion de classe I, condition que le domaine Pre-S le
prcdent ait t limin grce un clivage protolytique. Puisque la squence PEST, qui
contient probablement plusieurs sites de clivage protolytiques qui pourraient permettre
lexposition du peptide de fusion dans les protine L et M (Lu et al, 1996), nest pas
indispensable au processus dinfection, il nous parat plus probable que le peptide de fusion
agisse comme une boucle de fusion. Si la conservation importante de la squence du domaine
TM1 entre les diffrents membres des hepadnaviridae ainsi que la conservation de son rle lors

106
du processus dinfection suggrent que ce domaine pourrait tre impliqu dans une mme
fonction pour lensemble des virus de la famille, il est important de noter quil exerce un rle
diffrent chez le VHB et le DHBV dans le mcanisme de translocation du domaine Pre-S. En
effet, la translocation du domaine Pre-S de la protine L du VHB est indpendant de la protine
S et ne requiert que le domaine le TM2 de la protine L (Lambert & Prange, 2001), alors que
pour le DHBV, la translocation fait intervenir la protine S (Grgacic et al, 2000) et son domaine
TM1 (Grgacic, 2002).
Une diffrence de topologie entre la protine S et les protines L et M pourrait expliquer
leur rle diffrent au cours de lentre virale. En 2000, Grgacic et Schaller ont identifi une
nouvelle topologie de la protine L du DHBV, qui apparat suite un traitement des particules
virales par un pH acide, et implique lexposition du domaine TM1 la surface des particules
virales (Grgacic & Schaller, 2000). Lanalyse approfondie de la topologie de la protine L du
VHB en tudiant son accessibilit des anticorps et des protases constitue un des objectifs
majeurs pour la poursuite de mon travail de thse afin de comprendre comment les clusters
hydrophobes du domaine TM1 pourraient tre impliqus lors du processus dinfection. Une des
difficults de ce projet repose sur lidentification des conditions ncessaires la modification de
la topologie de la protine L. De nombreux paramtres, tels que le pH, lenvironnement
rducteur, la prsence de certains lipides, de protines chaperon ou de corcepteurs pourraient
influencer ce mcanisme. De faon intressante, la dcouverte des conditions conduisant un
changement de conformation de la protine L serait trs informative quant la nature du
compartiment cellulaire au sein duquel ce changement de topologie pourrait avoir lieu. Dans la
partie de lintroduction concernant la structure des protines denveloppe du VHB ou du DHBV,
nous avons pu voir que les modles topologiques actuels ne reprsentaient probablement quune
partie des conformations possibles des protines denveloppe. Des recherches complmentaires
dans ce domaine permettront trs probablement de mieux comprendre le mcanisme dentre et
peut tre enfin dexpliquer le profil de glycosylation atypique de ces protines dont seulement la
moiti est glycosyle dans la boucle antignique du domaine S. Comme cela a t dmontr pour
le domaine Pre-S de la protine L, il est possible dimaginer que le domaine S des protines
denveloppe soit capable dadopter plusieurs topologies expliquant le profil de glycosylation de
ces protines, comme cela fut suggr par des expriences de Prange et al en 1995 (Prange &
Streeck, 1995).
Concernant lorganisation des clusters hydrophobes au sein du domaine TM1, les clusters
1 et 3 semblant plus importants pour le processus dinfection que le deuxime cluster (Lepere-
Douard et al, 2009), nous nous sommes demand quelle position ils pouvaient adopter au sein
dune structure tridimensionnelle de la protine S, reconstitue in silico, dans laquelle le

107
Figure 27. Modle in silico de la structure 3D de la protine S.
En haut : Reprsentation des structures secondaires de la protine.
En bas : Reprsentation des atomes sous forme de sphres. Les diffrentes rgions de
la protine S sont indiques approximativement ainsi que les clusters hydrophobes
(HC1, 2 et 3) du domaine TM1. Fichier source pour les reconstructions : (van Hemert
et al, 2008). Logiciel : iMOL V0.4, MAC OS X.
domaine TM1 est reprsent sous forme dune boucle (van Hemert et al, 2008). Bien que ce
modle prsente des limites telles que le fait de ne pas tenir compte de lenvironnement lipidique
des molcules, il nous a sembl intressant que le domaine TM1 y soit reprsent sous la forme
dune boucle, alors quun domaine plus hydrophobe tel que le domaine TM2 y est reprsent
sous la forme attendue dune hlice linaire (Fig. 27). Cependant, malgr cette conformation, les
clusters 1 et 3 sont distants lun de lautre alors que nous aurions pu imaginer que la prsence
dune boucle aurait permis leur rapprochement. Pour cela, il aurait fallu que le coude de la
boucle prenne place au niveau du deuxime cluster hydrophobe moins important pour
linfectivit, et dont les deux phnylalanines peuvent tre substitues par des alanines dans les
protines L et M sans affecter le processus dinfection (donnes non publies). Dans cette
topologie, les rsidus polaires dune part et hydrophobes dautre part du domaine TM1
interagiraient les uns avec les autres et les clusters hydrophobes 1 et 3, sous forme dun dimre,
pourraient sancrer dans une membrane lipidique afin de la dstabiliser. Une autre reprsentation
de la protine S, dans laquelle les atomes sont schmatiss par des sphres permet de visualiser
la position des clusters hydrophobes la surface de la protine (Fig. 27). De faon intressante,
dans cette reprsentation, il semble que les rsidus des clusters 1 et 3 soient plus exposs et
regroups la surface de la protine que ceux du cluster 2. Cependant, en absence de lipides, il
est trs difficile dimaginer quelle topologie peut adopter le domaine TM1 et ses clusters
hydrophobes. Pour que ce type danalyse permette de comprendre comment les clusters entrent
en action lors du mcanisme dentre virale, la rsolution de la structure relle des protines
denveloppe, et non seulement de la protine S, doit tre ralise. De plus, si les protines de
surface du VHB se comportent comme les protines de fusion connues, plusieurs structures
devront tre tablies, avant et aprs le processus de fusion. La rsolution de la structure
tridimensionnelle des protines par diffraction aux rayons X ncessite dans un premier temps
lobtention de cristaux de protines. La cristallisation des protines membranaires, telles que les
protines de surface du VHB, reprsente un dfi majeur de la biologie structurale. En effet
malgr le rle fondamental de ces protines dans les mcanismes biologiques, les protines
membranaires ne reprsentent quune centaine de membres parmi les milliers de structures
protiques disponibles ce jour. La dtermination des structures lchelle atomique des
protines membranaires se heurte aux difficults des tapes de cristallisation plus complique
que celle des protines solubles et encore trs mal matrise (Petsko et al, 2008). Ainsi, la
dtermination de la structure des protines denveloppe du VHB par cette technique semble
compromise, compte tenu des nombreux domaines hydrophobes de ces protines. Cependant, le
poids molculaire modeste de ces protines permettrait peut tre la rsolution de leur structure
par rsonnance magntique nuclaire (RMN). En effet, cette technique peut tre utilise pour

108
rsoudre la structure de protines, relativement petites (< 50-100 kDa), dont la cristallisation est
difficile, condition que ces dernires puissent tre dissoutes des concentrations suffisamment
leves sans agrgation (Petsko et al, 2008). Contrairement aux images cristallographiques qui
sont statiques, la RMN permet dtudier la flexibilit des protines sur une chelle de temps
donne. Les particules subvirales du VHB tant des structures compactes contenant peu de
lipides (Gilbert et al, 2005), on peut imaginer que la purification de ces particules des
concentrations leves permettrait danalyser la structure des protines de surface par RMN. Le
dveloppement dun tel projet, trs intressant, ncessiterait la mise en place dune collaboration
avec des spcialistes de biologie structurale.
Des donnes dans la littrature suggrent que la nature amphipatique du domaine TM1,
provoque par la prsence dun motif heptad repeat, lui permettrait dinteragir par une de ses
faces avec une bicouche lipidique et ainsi peut tre dinduire un mcanisme de fusion (Grgacic
& Schaller, 2000; Rodriguez-Crespo et al, 1994). Cependant, nos rsultats suggrent que cette
structure nest pas implique dans le processus dinfection. En effet, la substitution simple ou
multiple des acides amins hydrophobes de lheptad repeat par des alanines ninhibe pas le
processus dinfection et seul deux acides amins de ce motif, lisoleucine 188 et lisoleucine 191
(numrotation dans la protine L), situs la fin du domaine TM1 dans le troisime cluster
hydrophobe, sont ncessaires dans la protine L pour le maintien de linfectivit des virions.
Ainsi, nous avons dmontr que lorganisation des acides amins en clusters hydrophobes
dans le domaine TM1 tait indispensable au processus dinfection contrairement leur
organisation en heptad repeat . La squence situe en aval du troisime cluster hydrophobe,
dans la premire boucle cytoplasmique, est riche en acides amins hydrophobes aromatiques et
pourrait galement jouer un rle lors de linfection. En effet, lanalyse de la composition des
peptides de fusion des protines de fusion de classe I, II ou III rvle la prsence de nombreux
rsidus aromatiques dans leur squence (cf. chapitre Proprits des peptides de fusion , page
75). Afin de vrifier cette possibilit, nous avons introduit des dltions dans cette squence. Des
rsultats prliminaires nous ont permis de montrer que dans les protines L et M, certains rsidus
de cette rgion (C-terminale au domaine TM1), ne correspondants pas aux rsidus aromatiques,
taient important pour le processus dinfection. Au contraire, la mme rgion dans la protine S
semble plutt importante pour le processus dassemblage viral ou pour la synthse protique.
Rcemment, un autre motif de fusion a t identifi dans le domaine Pre-S des protines
denveloppe (Nunez et al, 2009). Afin de vrifier le rle de cette rgion et du domaine TM1 lors
dun processus de fusion, nous souhaitons dvelopper un test de fusion entre des particules
virales purifies et des liposomes afin de comparer la capacit de virus mutants et sauvages
induire un mcanisme de fusion. De la mme faon que pour lanalyse des conditions

109
ncessaires au dclenchement dun changement de conformation de la protine L, lidentification
des conditions ncessaires linduction dun mcanisme de fusion entre des virus sauvages et
des liposomes reprsente probablement la plus grande difficult de ce travail. En effet, de
nombreux paramtres, tels que le pH, lenvironnement rducteur ou encore la prsence de
partenaires protiques spcifiques de certains compartiments cellulaires peuvent influencer le
mcanisme de fusion. En attendant les rsultats des tests de fusions, plusieurs possibilits
concernant le rle des domaines Pre-S et TM1 au cours du processus de fusion peuvent tre
imagines :
(i) deux peptides de fusion, un localis dans le domaine Pre-S et lautre dans le domaine
TM1, agissent de concert pour dstabiliser la membrane dune cellule cible ;
(ii) un des domaines reste ancr dans lenveloppe virale alors que lautre est envoy dans
la membrane de la cellule cible, et chaque domaine dstabilise la bicouche lipidique dans
laquelle il est insr afin de promouvoir une fusion entre ces deux membranes. En effet, il a t
dmontr pour les protines de fusion connues que le domaine transmembranaire de ces
protines jouait un rle primordial lors du mcanisme de fusion afin de rapprocher lenveloppe
virale de la membrane de la cellule cible (Harrison, 2008) ;
(iii) les deux domaines sont impliqus dans le processus de fusion, mais un dentre eux
seulement joue le rle de peptide de fusion et lautre est indispensable pour le changement de
conformation des protines permettant son exposition. Par exemple, suite une rorganisation de
la protine L aprs ladsorption des virus la surface des cellules et leur internalisation, on peut
imaginer que des acides amins hydrophobes du domaine Pre-S, ou lacide myristique situ
son extrmit N-terminale, sortent dune poche hydrophobe gnre par le domaine TM1 afin de
sinsrer dans la membrane dune cellule cible ;
(iv) le domaine Pre-S ne joue aucun rle lors du processus de fusion et permet seulement
lattachement des virus sur leur rcepteur alors que le domaine TM1, expos la surface des
virus grce une rorganisation de lenveloppe virale, est impliqu dans le processus de fusion ;
(v) les domaines Pre-S et TM1 sont impliqus dans ltape dadsorption des virus la
surface des cellules et ne jouent aucun rle lors de la fusion.
Une tude trs rcente ralise par Le Duff et al, a utilis une stratgie originale pour
dmontrer que les diffrentes rgions du domaine Pre-S1 ncessaires lentre virale, a savoir
lacide myristique, les rsidus 2-48 probablement impliqus dans la reconnaissance du rcepteur
et les rsidus 48-75 possiblement impliqus dans la stabilisation de linteraction initiale avec le
rcepteur, devaient agir de manire cooprative en cis (sur la mme protine) lors de lentre
virale (Le Duff et al, 2009). En effet, ils ont dmontr que des virus chimres dont une partie des
protines L tait mute dans une des rgions prcdentes et lautre dans une rgion diffrente,

110
perdaient leur infectivit. Si le processus dentre virale ncessite une interaction entre les
domaines Pre-S1 et TM1 dune mme protine L, ce type dexprience, savoir la construction
de virus mutants dont une partie des protines L est dlte dans le domaine Pre-S1 et lautre
dans un cluster hydrophobe du domaine TM1, conduirait la production de virus non infectieux.
Au contraire, si ces deux rgions de la protine L sont indpendantes, une complmentation en
trans entre les protines L mutes permettrait dobtenir des virus infectieux. La ralisation de
telles expriences est un projet pour complter les rsultats de mon travail de thse. En effet, de
telles expriences pourraient nous permettre dtudier dventuelles interactions entre le domaine
Pre-S1, lacide myristique et les clusters hydrophobes du domaine TM1.
A la vue de lensemble de nos rsultats et des donnes publies concernant le mcanisme
dentre du DHBV, le modle qui nous parat le plus probable pour le mcanisme dentre du
VHB est le suivant :
1) Les virus sadsorbent la surface des hpatocytes grce des liaisons de faible affinit
avec des rcepteurs tels que les protoglycanes hparane sulfate. Cette interaction fait
intervenir soit le domaine Pre-S1 uniquement, soit le domaine S uniquement, soit ces
deux domaines simultanment.
2) Les virus interagissent avec un ou plusieurs rcepteurs de haute affinit la surface des
hpatocytes via le domaine Pre-S1 de la protine L. Les acides amins 2-48 initient le
processus dinteraction et les rsidus 48-75 le stabilisent.
3) Les virus attachs leur(s) rcepteur(s) sont internaliss dans un compartiment
intracellulaire dont lenvironnement induit un changement de conformation des protines
denveloppe. Le ou les dclencheurs de ce processus sont encore inconnus et pourraient
consister en un changement du pH, une activit rductrice, une composition lipidique
particulire des membranes intracellulaires, ou encore en la prsence dun corcepteur
dans un compartiment intracellulaire cible.
4) Le changement de conformation des protines de surface permet lexposition du domaine
TM1 la surface des particules virales, ce qui permet son interaction avec une membrane
cible et sa dstabilisation conduisant la fusion. Le domaine TM2, fortement ancr dans
lenveloppe virale grce son hydrophobicit importante permet le rapprochement entre
la membrane cellulaire et lenveloppe virale.
5) Le processus de fusion conduit la libration des nuclocapsides dans le compartiment
cytoplasmique et ces dernires sont adresses au noyau des cellules.

Bien que ce modle soit encore thorique, lidentification de nouveaux dterminants de


linfectivit dans les protines de surface du VHB, tels que le domaine TM1 de la protine L ou

111
la boucle antignique de la protine S sont des dcouvertes rcentes importantes qui permettent
dmettre de nouvelles hypothses quant au mcanisme dentre adopt par le VHB.
Lidentification de la fonction de ces dterminants, devrait permettre de prciser le modle
propos et constitue, pour le domaine TM1, la perspective principale de ce travail. Suite la
dcouverte du rle du domaine Pre-S1 lors de ltape dinfection, en 1999 par Le Seyec et al au
sein de notre laboratoire (Le Seyec et al, 1999), son implication dans ltape dattachement au
rcepteur du virus a t fortement suggre grce lutilisation de peptides drivs de ce
domaine capables de bloquer le mcanisme dinfection in vitro (Barrera et al, 2005; Glebe et al,
2005) et in vivo (Petersen et al, 2008). De la mme faon, maintenant que le rle cl du domaine
TM1 lors du processus dinfection a t mis en vidence, nous esprons que sa caractrisation
permettra de mieux comprendre le mcanisme dentre du virus.

112
R EFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Abou-Jaoude G, Sureau C (2007) Entry of hepatitis delta virus requires the conserved cysteine residues of the
hepatitis B virus envelope protein antigenic loop and is blocked by inhibitors of thiol-disulfide exchange. J Virol
81(23): 13057-13066

AFSSAPS (2002) Vaccination contre l'hpatite B. Communiqu de Presse

AFSSAPS, ANAES, INSERM (2004) Vaccination contre le virus de lhpatite B et sclrose en plaques : tat des
lieux Audition publique

Ahn SH, Park YN, Park JY, Chang HY, Lee JM, Shin JE, Han KH, Park C, Moon YM, Chon CY (2005) Long-term
clinical and histological outcomes in patients with spontaneous hepatitis B surface antigen seroclearance. J Hepatol
42(2): 188-194

Albin C, Robinson WS (1980) Protein kinase activity in hepatitis B virus. J Virol 34(1): 297-302

Almeida JD, Rubenstein D, Stott EJ (1971) New antigen-antibody system in Australia-antigen-positive hepatitis.
Lancet 2(7736): 1225-1227

Argos P (1988) A sequence motif in many polymerases. Nucleic Acids Res 16(21): 9909-9916

Awe K, Lambert C, Prange R (2008) Mammalian BiP controls posttranslational ER translocation of the hepatitis B
virus large envelope protein. FEBS Lett 582(21-22): 3179-3184

Backovic M, Jardetzky TS (2009) Class III viral membrane fusion proteins. Curr Opin Struct Biol 19(2): 189-196

Bancroft WH, Mundon FK, Russell PK (1972) Detection of additional antigenic determinants of hepatitis B antigen.
J Immunol 109(4): 842-848

Barrera A, Guerra B, Notvall L, Lanford RE (2005) Mapping of the hepatitis B virus pre-S1 domain involved in
receptor recognition. J Virol 79(15): 9786-9798

Bartenschlager R, Schaller H (1988) The amino-terminal domain of the hepadnaviral P-gene encodes the terminal
protein (genome-linked protein) believed to prime reverse transcription. Embo J 7(13): 4185-4192

Bartenschlager R, Schaller H (1992) Hepadnaviral assembly is initiated by polymerase binding to the encapsidation
signal in the viral RNA genome. EMBO J 11(9): 3413-3420

Bayer N, Schober D, Prchla E, Murphy RF, Blaas D, Fuchs R (1998) Effect of bafilomycin A1 and nocodazole on
endocytic transport in HeLa cells: implications for viral uncoating and infection. J Virol 72(12): 9645-9655

Beasley RP, Hwang LY, Lin CC, Chien CS (1981) Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus. A prospective
study of 22 707 men in Taiwan. Lancet 2(8256): 1129-1133

Beck J, Nassal M (2003) Efficient Hsp90-independent in vitro activation by Hsc70 and Hsp40 of duck hepatitis B
virus reverse transcriptase, an assumed Hsp90 client protein. J Biol Chem 278(38): 36128-36138

Beck J, Nassal M (2007) Hepatitis B virus replication. World J Gastroenterol 13(1): 48-64

Berting A, Fischer C, Schaefer S, Garten W, Klenk HD, Gerlich WH (2000) Hemifusion activity of a chimeric
influenza virus hemagglutinin with a putative fusion peptide from hepatitis B virus. Virus research 68(1): 35-49

Berting A, Hahnen J, Kroger M, Gerlich WH (1995) Computer-aided studies on the spatial structure of the small
hepatitis B surface protein. Intervirology 38(1-2): 8-15

Blanchet M, Sureau C (2006) Analysis of the cytosolic domains of the hepatitis B virus envelope proteins for their
function in viral particle assembly and infectivity. J Virol 80(24): 11935-11945

113
Blanchet M, Sureau C (2007) Infectivity determinants of the hepatitis B virus pre-S domain are confined to the N-
terminal 75 amino acid residues. J Virol 81(11): 5841-5849

Blumberg BS (1977) Australia antigen and the biology of hepatitis B. Science 197(4298): 17-25

Blumberg BS (2002) The discovery of the hepatitis B virus and the invention of the vaccine: a scientific memoir. J
Gastroenterol Hepatol 17 Suppl: S502-503

Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S (1965) A "new" antigen in leukemia sera. JAMA 191: 541-546

Blumberg BS, Gerstley BJ, Hungerford DA, London WT, Sutnick AI (1967) A serum antigen (Australia antigen) in
Down's syndrome, leukemia, and hepatitis. Ann Intern Med 66(5): 924-931

Bock CT, Schranz P, Schroder CH, Zentgraf H (1994) Hepatitis B virus genome is organized into nucleosomes in
the nucleus of the infected cell. Virus Genes 8(3): 215-229

Bock CT, Schwinn S, Locarnini S, Fyfe J, Manns MP, Trautwein C, Zentgraf H (2001) Structural organization of
the hepatitis B virus minichromosome. Journal of molecular biology 307(1): 183-196

Bonino F, Heermann KH, Rizzetto M, Gerlich WH (1986) Hepatitis delta virus: protein composition of delta
antigen and its hepatitis B virus-derived envelope. J Virol 58(3): 945-950

Bonino F, Hoyer B, Shih JW, Rizzetto M, Purcell RH, Gerin JL (1984) Delta hepatitis agent: structural and
antigenic properties of the delta- associated particle. Infect Immun 43(3): 1000-1005

Borel C, Sunyach C, Hantz O, Trepo C, Kay A (1998) Phosphorylation of DHBV pre-S: identification of the major
site of phosphorylation and effects of mutations on the virus life cycle. Virology 242(1): 90-98

Bosch V, Bartenschlager R, Radziwill G, Schaller H (1988) The duck hepatitis B virus P-gene codes for protein
strongly associated with the 5'-end of the viral DNA minus strand. Virology 166(2): 475-485

Bottcher B, Tsuji N, Takahashi H, Dyson MR, Zhao S, Crowther RA, Murray K (1998) Peptides that block hepatitis
B virus assembly: analysis by cryomicroscopy, mutagenesis and transfection. EMBO J 17(23): 6839-6845

Bottcher B, Wynne SA, Crowther RA (1997) Determination of the fold of the core protein of hepatitis B virus by
electron cryomicroscopy. Nature 386(6620): 88-91

Brandenburg B, Stockl L, Gutzeit C, Roos M, Lupberger J, Schwartlander R, Gelderblom H, Sauer IM,


Hofschneider PH, Hildt E (2005) A novel system for efficient gene transfer into primary human hepatocytes via
cell-permeable hepatitis B virus-like particle. Hepatology (Baltimore, Md 42(6): 1300-1309

Brechot C, Pourcel C, Louise A, Rain B, Tiollais P (1980) Presence of integrated hepatitis B virus DNA sequences
in cellular DNA of human hepatocellular carcinoma. Nature 286(5772): 533-535

Brechot P, Saigo K, Murakami Y, Chami M, Gozuacik D, Mugnier C, Lagorce D, Brechot C (2003) Hepatitis B
virus-related insertional mutagenesis occurs frequently in human liver cancers and recurrently targets human
telomerase gene. Oncogene 22(25): 3911-3916

Breiner KM, Schaller H (2000) Cellular receptor traffic is essential for productive duck hepatitis B virus infection. J
Virol 74(5): 2203-2209

Breiner KM, Urban S, Glass B, Schaller H (2001) Envelope protein-mediated down-regulation of hepatitis B virus
receptor in infected hepatocytes. J Virol 75(1): 143-150

Breiner KM, Urban S, Schaller H (1998) Carboxypeptidase D (gp180), a Golgi-resident protein, functions in the
attachment and entry of avian hepatitis B viruses. J Virol 72(10): 8098-8104

Bremer CM, Bung C, Kott N, Hardt M, Glebe D (2009) Hepatitis B virus infection is dependent on cholesterol in
the viral envelope. Cell Microbiol 11(2): 249-260

Bruns M, Miska S, Chassot S, Will H (1998) Enhancement of hepatitis B virus infection by noninfectious subviral
particles. J Virol 72(2): 1462-1468

114
Bruss V (1997) A short linear sequence in the pre-S domain of the large hepatitis B virus envelope protein required
for virion formation. J Virol 71(12): 9350-9357

Bruss V (2007) Hepatitis B virus morphogenesis. World J Gastroenterol 13(1): 65-73

Bruss V, Ganem D (1991a) Mutational analysis of hepatitis B surface antigen particle assembly and secretion. J
Virol 65(7): 3813-3820

Bruss V, Ganem D (1991b) The role of envelope proteins in hepatitis B virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A
88(3): 1059-1063

Bruss V, Gerhardt E, Vieluf K, Wunderlich G (1996a) Functions of the large hepatitis B virus surface protein in
viral particle morphogenesis. Intervirology 39(1-2): 23-31

Bruss V, Hagelsten J, Gerhardt E, Galle PR (1996b) Myristylation of the large surface protein is required for
hepatitis B virus in vitro infectivity. Virology 218(2): 396-399

Bruss V, Lu X, Thomssen R, Gerlich WH (1994) Post-translational alterations in transmembrane topology of the


hepatitis B virus large envelope protein. EMBO J 13(10): 2273-2279

Bruss V, Thomssen R (1994) Mapping a region of the large envelope protein required for hepatitis B virion
maturation. J Virol 68(3): 1643-1650

Bruss V, Vieluf K (1995) Functions of the internal pre-S domain of the large surface protein in hepatitis B virus
particle morphogenesis. J Virol 69(11): 6652-6657

Budkowska A, Bedossa P, Groh F, Louise A, Pillot J (1995) Fibronectin of human liver sinusoids binds hepatitis B
virus: identification by an anti-idiotypic antibody bearing the internal image of the pre-S2 domain. J Virol 69(2):
840-848

Budkowska A, Maillard P, Theret N, Groh F, Possehl C, Topilko A, Crainic R (1997) Activation of the envelope
proteins by a metalloproteinase enables attachment and entry of the hepatitis B virus into T-lymphocyte. Virology
237(1): 10-22

Budkowska A, Quan C, Groh F, Bedossa P, Dubreuil P, Bouvet JP, Pillot J (1993) Hepatitis-B Virus (HBV)
Binding Factor in Human Serum - Candidate for a Soluble Form of Hepatocyte HBV Receptor. J Virol 67(7): 4316-
4322

Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC (1994) Structure of influenza haemagglutinin at the pH of
membrane fusion. Nature 371(6492): 37-43

Cals P (2001) Vaccination anti-hpatite B et effets secondaires graves : ne pas confondre squence et consquence.
Gastroenterol Clin Biol 25: 859-862

Cattaneo R, Will H, Hernandez N, Schaller H (1983) Signals regulating hepatitis B surface antigen transcription.
Nature 305(5932): 336-338

Chai N, Chang HE, Nicolas E, Han Z, Jarnik M, Taylor J (2008) Properties of subviral particles of hepatitis B virus.
J Virol 82(16): 7812-7817

Chan HL, Sung JJ (2006) Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus. Semin Liver Dis 26(2): 153-161

Chang C, Zhou S, Ganem D, Standring DN (1994) Phenotypic mixing between different hepadnavirus nucleocapsid
proteins reveals C protein dimerization to be cis preferential. J Virol 68(8): 5225-5231

Chang HK, Wang BY, Yuh CH, Wei CL, Ting LP (1989) A liver-specific nuclear factor interacts with the promoter
region of the large surface protein gene of human hepatitis B virus. Mol Cell Biol 9(11): 5189-5197

Chang SF, Netter HJ, Bruns M, Schneider R, Frolich K, Will H (1999) A new avian hepadnavirus infecting snow
geese (Anser caerulescens) produces a significant fraction of virions containing single-stranded DNA. Virology
262(1): 39-54

115
Chen PJ, Chen CR, Sung JL, Chen DS (1989) Identification of a doubly spliced viral transcript joining the separated
domains for putative protease and reverse transcriptase of hepatitis B virus. J Virol 63(10): 4165-4171

Cheng KC, Smith GL, Moss B (1986) Hepatitis B virus large surface protein is not secreted but is immunogenic
when selectively expressed by recombinant vaccinia virus. J Virol 60(2): 337-344

Chi SW, Kim DH, Lee SH, Chang I, Han KH (2007) Pre-structured motifs in the natively unstructured preS1
surface antigen of hepatitis B virus. Protein Sci 16(10): 2108-2117

Chien YC, Jan CF, Kuo HS, Chen CJ (2006) Nationwide hepatitis B vaccination program in Taiwan: effectiveness
in the 20 years after it was launched. Epidemiol Rev 28: 126-135

Chisari FV (2000) Rous-Whipple Award Lecture. Viruses, immunity, and cancer: lessons from hepatitis B. Am J
Pathol 156(4): 1117-1132

Chisari FV, Filippi P, Buras J, McLachlan A, Popper H, Pinkert CA, Palmiter RD, Brinster RL (1987) Structural
and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proc Natl
Acad Sci U S A 84(19): 6909-6913

Chisari FV, Klopchin K, Moriyama T, Pasquinelli C, Dunsford HA, Sell S, Pinkert CA, Brinster RL, Palmiter RD
(1989) Molecular pathogenesis of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus transgenic mice. Cell 59(6): 1145-
1156

Chisari FV, Pinkert CA, Milich DR, Filippi P, McLachlan A, Palmiter RD, Brinster RL (1985) A transgenic mouse
model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state. Science 230(4730): 1157-1160

Cho DY, Yang GH, Ryu CJ, Hong HJ (2003) Molecular chaperone GRP78/BiP interacts with the large surface
protein of hepatitis B virus in vitro and in vivo. J Virol 77(4): 2784-2788

Chojnacki J, Anderson DA, Grgacic EV (2005) A hydrophobic domain in the large envelope protein is essential for
fusion of duck hepatitis B virus at the late endosome. J Virol 79(23): 14945-14955

Chouteau P, Le Seyec J, Cannie I, Nassal M, Guguen-Guillouzo C, Gripon P (2001) A short N-proximal region in
the large envelope protein harbors a determinant that contributes to the species specificity of human hepatitis B
virus. J Virol 75(23): 11565-11572

Clague MJ, Urbe S, Aniento F, Gruenberg J (1994) Vacuolar ATPase activity is required for endosomal carrier
vesicle formation. J Biol Chem 269(1): 21-24

Coffin CS, Michalak TI (1999) Persistence of infectious hepadnavirus in the offspring of woodchuck mothers
recovered from viral hepatitis. J Clin Invest 104(2): 203-212

Conway JF, Cheng N, Zlotnick A, Stahl SJ, Wingfield PT, Steven AC (1998) Localization of the N terminus of
hepatitis B virus capsid protein by peptide-based difference mapping from cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad
Sci U S A 95(25): 14622-14627

Conway JF, Cheng N, Zlotnick A, Wingfield PT, Stahl SJ, Steven AC (1997) Visualization of a 4-helix bundle in
the hepatitis B virus capsid by cryo-electron microscopy. Nature 386(6620): 91-94

Cougot D, Neuveut C, Buendia MA (2005) HBV induced carcinogenesis. J Clin Virol 34 Suppl 1: S75-78

Courtois G, Baumhueter S, Crabtree GR (1988) Purified hepatocyte nuclear factor 1 interacts with a family of
hepatocyte-specific promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 85(21): 7937-7941

Crowther RA, Kiselev NA, Bottcher B, Berriman JA, Borisova GP, Ose V, Pumpens P (1994) Three-dimensional
structure of hepatitis B virus core particles determined by electron cryomicroscopy. Cell 77(6): 943-950

Dane DS, Cameron CH, Briggs M (1970) Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated
hepatitis. Lancet 1(7649): 695-698

Daniels D, Grytdal S, Wasley A (2009) Surveillance for acute viral hepatitis - United States, 2007. MMWR Surveill
Summ 58(3): 1-27

116
Das K, Xiong X, Yang H, Westland CE, Gibbs CS, Sarafianos SG, Arnold E (2001) Molecular modeling and
biochemical characterization reveal the mechanism of hepatitis B virus polymerase resistance to lamivudine (3TC)
and emtricitabine (FTC). J Virol 75(10): 4771-4779

Dash S, Rao KVS, Panda SK (1992) Receptor for Pre-S1(21-47) Component of Hepatitis-B Virus on the Liver Cell
- Role in Virus Cell Interaction. Journal of medical virology 37(2): 116-121

Daub H, Blencke S, Habenberger P, Kurtenbach A, Dennenmoser J, Wissing J, Ullrich A, Cotten M (2002)


Identification of SRPK1 and SRPK2 as the major cellular protein kinases phosphorylating hepatitis B virus core
protein. J Virol 76(16): 8124-8137

De Falco S, Ruvoletto M, Verdoliva A, Ruvo M, Raucci A, Marino M, Senatore S, Cassani G, Alberti A, Pontisso
P, Fassina G (2001) Cloning and expression of a novel hepatitis B virus binding protein from HepG2 cells. J Biol
Chem 276(39): 36613-36623

Delius H, Gough NM, Cameron CH, Murray K (1983) Structure of the hepatitis B virus genome. J Virol 47(2): 337-
343

Deng Q, Zhai JW, Michel ML, Zhang J, Qin J, Kong YY, Zhang XX, Budkowska A, Tiollais P, Wang Y, Xie YH
(2007) Identification and characterization of peptides that interact with hepatitis B virus via the putative receptor
binding site. J Virol 81(8): 4244-4254

Desmyter J, De Groote J, Desmet VJ, Billiau A, Ray MB, Bradburne AF, Edy VG, De Somer P (1976)
Administration of human fibroblast interferon in chronic hepatitis-B infection. Lancet 2(7987): 645-647

Diot C, Gripon P, Rissel M, Guguen-Guillouzo C (1992) Replication of hepatitis-B virus in differentiated adult rat
hepatocytes transfected with cloned viral DNA. Journal of medical virology 36(2): 93-100

Donello JE, Beeche AA, Smith GJr, Lucero GR, Hope TJ (1996) The hepatitis B virus posttranscriptional regulatory
element is composed of two subelements. J Virol 70(7): 4345-4351

Dryden KA, Wieland SF, Whitten-Bauer C, Gerin JL, Chisari FV, Yeager M (2006) Native hepatitis B virions and
capsids visualized by electron cryomicroscopy. Mol Cell 22(6): 843-850

Duclos-Vallee JC, Capel F, Mabit H, Petit MA (1998) Phosphorylation of the hepatitis B virus core protein by
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein kinase activity. The Journal of general virology 79 ( Pt 7):
1665-1670

Dunsford HA, Sell S, Chisari FV (1990) Hepatocarcinogenesis due to chronic liver cell injury in hepatitis B virus
transgenic mice. Cancer Res 50(11): 3400-3407

Dyson MR, Murray K (1995) Selection of peptide inhibitors of interactions involved in complex protein assemblies:
association of the core and surface antigens of hepatitis B virus. Proc Natl Acad Sci U S A 92(6): 2194-2198

EASL (2009) EASL Clinical Practice Guidelines: management of chronic hepatitis B. J Hepatol 50(2): 227-242

Eble BE, Lingappa VR, Ganem D (1986) Hepatitis B surface antigen: an unusual secreted protein initially
synthesized as a transmembrane polypeptide. Mol Cell Biol 6(5): 1454-1463

Eble BE, Lingappa VR, Ganem D (1990) The N-terminal (pre-S2) domain of a hepatitis B virus surface
glycoprotein is translocated across membranes by downstream signal sequences. J Virol 64(3): 1414-1419

Eble BE, MacRae DR, Lingappa VR, Ganem D (1987) Multiple topogenic sequences determine the transmembrane
orientation of the hepatitis B surface antigen. Mol Cell Biol 7(10): 3591-3601

Eckhardt SG, Milich DR, McLachlan A (1991) Hepatitis B virus core antigen has two nuclear localization
sequences in the arginine-rich carboxyl terminus. J Virol 65(2): 575-582

El-Serag HB (2004) Hepatocellular carcinoma: recent trends in the United States. Gastroenterology 127(5 Suppl 1):
S27-34

Enders GH, Ganem D, Varmus HE (1987) 5'-terminal sequences influence the segregation of ground squirrel
hepatitis virus RNAs into polyribosomes and viral core particles. J Virol 61(1): 35-41

117
Eng FJ, Varlamov O, Fricker LD (1999) Sequences within the cytoplasmic domain of gp180/carboxypeptidase D
mediate localization to the trans-Golgi network. Mol Biol Cell 10(1): 35-46

Engelke M, Mills K, Seitz S, Simon P, Gripon P, Schnolzer M, Urban S (2006) Characterization of a hepatitis B and
hepatitis delta virus receptor binding site. Hepatology (Baltimore, Md 43(4): 750-760

Enomoto M, Sawano Y, Kosuge S, Yamano Y, Kuroki K, Ohtsuki K (2006) High phosphorylation of HBV core
protein by two alpha-type CK2-activated cAMP-dependent protein kinases in vitro. FEBS Lett 580(3): 894-899

Evans AA, O'Connell AP, Pugh JC, Mason WS, Shen FM, Chen GC, Lin WY, Dia A, M'Boup S, Drame B, London
WT (1998) Geographic variation in viral load among hepatitis B carriers with differing risks of hepatocellular
carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 7(7): 559-565

Fernholz D, Galle PR, Stemler M, Brunetto M, Bonino F, Will H (1993) Infectious Hepatitis-B Virus Variant
Defective in Pre-S2 Protein Expression in a Chronic Carrier. Virology 194(1): 137-148

Ferrari C, Missale G, Boni C, Urbani S (2003) Immunopathogenesis of hepatitis B. J Hepatol 39 Suppl 1: S36-42

Foo NC, Ahn BY, Ma X, Hyun W, Yen TS (2002) Cellular vacuolization and apoptosis induced by hepatitis B virus
large surface protein. Hepatology (Baltimore, Md 36(6): 1400-1407

Fourel G, Couturier J, Wei Y, Apiou F, Tiollais P, Buendia MA (1994) Evidence for long-range oncogene activation
by hepadnavirus insertion. Embo J 13(11): 2526-2534

Fourel G, Trepo C, Bougueleret L, Henglein B, Ponzetto A, Tiollais P, Buendia MA (1990) Frequent activation of
N-myc genes by hepadnavirus insertion in woodchuck liver tumours [see comments]. Nature 347(6290): 294-298

Franco A, Paroli M, Testa U, Benvenuto R, Peschle C, Balsano F, Barnaba V (1992) Transferrin receptor mediates
uptake and presentation of hepatitis B envelope antigen by T lymphocytes. J Exp Med 175(5): 1195-1205

Funk A, Mhamdi M, Hohenberg H, Will H, Sirma H (2006) pH-independent entry and sequential endosomal sorting
are major determinants of hepadnaviral infection in primary hepatocytes. Hepatology (Baltimore, Md 44(3): 685-
693

Funk A, Mhamdi M, Lin L, Will H, Sirma H (2004) Itinerary of hepatitis B viruses: delineation of restriction points
critical for infectious entry. J Virol 78(15): 8289-8300

Funk A, Mhamdi M, Will H, Sirma H (2007) Avian hepatitis B viruses: molecular and cellular biology,
phylogenesis, and host tropism. World J Gastroenterol 13(1): 91-103

Gagliardi MC, Nisini R, Benvenuto R, De Petrillo G, Michel ML, Barnaba V (1994) Soluble transferrin mediates
targeting of hepatitis B envelope antigen to transferrin receptor and its presentation by activated T cells. Eur J
Immunol 24(6): 1372-1376

Galibert F, Mandart E, Fitoussi F, Tiollais P, Charnay P (1979) Nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome
(subtype ayw) cloned in E. coli. Nature 281(5733): 646-650

Gallina A, Bonelli F, Zentilin L, Rindi G, Muttini M, Milanesi G (1989) A recombinant hepatitis B core antigen
polypeptide with the protamine- like domain deleted self-assembles into capsid particles but fails to bind nucleic
acids. J Virol 63(11): 4645-4652

Gallina A, De Koning A, Rossi F, Calogero R, Manservigi R, Milanesi G (1992) Translational modulation in


hepatitis B virus preS-S open reading frame expression. The Journal of general virology 73: 139-148

Gallina A, Gazina E, Milanesi G (1995) A C-terminal PreS1 sequence is sufficient to retain hepatitis B virus L
protein in 293 cells. Virology 213(1): 57-69

Ganem D (1991) Assembly of hepadnaviral virions and subviral particles. Current topics in microbiology and
immunology 168: 61-83

Ganem D, Prince AM (2004) Hepatitis B virus infection--natural history and clinical consequences. N Engl J Med
350(11): 1118-1129

118
Gavilanes F, Gonzalez-Ros JM, Peterson DL (1982) Structure of hepatitis B surface antigen. Characterization of the
lipid components and their association with the viral proteins. J Biol Chem 257(13): 7770-7777

Gerelsaikhan T, Tavis JE, Bruss V (1996) Hepatitis B virus nucleocapsid envelopment does not occur without
genomic DNA synthesis. J Virol 70(7): 4269-4274

Gerhardt E, Bruss V (1995) Phenotypic mixing of rodent but not avian hepadnavirus surface proteins into human
hepatitis B virus particles. J Virol 69(2): 1201-1208

Gerlich WH, Kann M (2005) Hepatitis B. In B W J Mahy and V ter Meulen (ed), Topley and Wilson's microbiology
and microbial infections ASM Press, Washington, DC 2

Gerlich WH, Lu X, Heermann KH (1993) Studies on the Attachment and Penetration of Hepatitis-B Virus. J
Hepatol 17( Suppl. 3): S10-S14

Gerlich WH, Robinson WS (1980) Hepatitis B virus contains protein attached to the 5' terminus of its complete
DNA strand. Cell 21(3): 801-809

Gerner PR, Friedt M, Oettinger R, Lausch E, Wirth S (1998) The hepatitis B virus seroconversion to anti-HBe is
frequently associated with HBV genotype changes and selection of preS2-defective particles in chronically infected
children. Virology 245(1): 163-172

Gilbert RJ, Beales L, Blond D, Simon MN, Lin BY, Chisari FV, Stuart DI, Rowlands DJ (2005) Hepatitis B small
surface antigen particles are octahedral. Proc Natl Acad Sci U S A 102(41): 14783-14788

Giles JP, McCollum RW, Berndtson LW, Jr., Krugman S (1969) Relation of Australia-SH antigen to the
willowbrook MS-2 strain. N Engl J Med 281(3): 119-122

Glebe D (2007) Recent advances in hepatitis B virus research: a German point of view. World J Gastroenterol
13(1): 8-13

Glebe D, Aliakbari M, Krass P, Knoop EV, Valerius KP, Gerlich WH (2003) Pre-s1 antigen-dependent infection of
Tupaia hepatocyte cultures with human hepatitis B virus. J Virol 77(17): 9511-9521

Glebe D, Gerlich WH (2004) Study of the endocytosis and intracellular localization of subviral particles of hepatitis
B virus in primary hepatocytes. Methods Mol Med 96: 143-151

Glebe D, Urban S (2007) Viral and cellular determinants involved in hepadnaviral entry. World J Gastroenterol
13(1): 22-38

Glebe D, Urban S, Knoop EV, Cag N, Krass P, Grun S, Bulavaite A, Sasnauskas K, Gerlich WH (2005) Mapping of
the hepatitis B virus attachment site by use of infection-inhibiting preS1 lipopeptides and tupaia hepatocytes.
Gastroenterology 129(1): 234-245

Gocke DJ, Kavey NB (1969) Hepatitis antigen. Correlation with disease and infectivity of blood-donors. Lancet
1(7605): 1055-1059

Goldstein ST, Zhou F, Hadler SC, Bell BP, Mast EE, Margolis HS (2005) A mathematical model to estimate global
hepatitis B disease burden and vaccination impact. Int J Epidemiol 34(6): 1329-1339

Gong ZJ, De Meyer S, van Pelt J, Hertogs K, Depla E, Soumillion A, Fevery J, Yap SH (1999) Transfection of a rat
hepatoma cell line with a construct expressing human liver annexin V confers susceptibility to hepatitis B virus
infection. Hepatology (Baltimore, Md 29(2): 576-584

Greenberg HB, Pollard RB, Lutwick LI, Gregory PB, Robinson WS, Merigan TC (1976) Effect of human leukocyte
interferon on hepatitis B virus infection in patients with chronic active hepatitis. N Engl J Med 295(10): 517-522

Grethe S, Heckel JO, Rietschel W, Hufert FT (2000) Molecular epidemiology of hepatitis B virus variants in
nonhuman primates. J Virol 74(11): 5377-5381

119
Grgacic EV (2002) Identification of structural determinants of the first transmembrane domain of the small envelope
protein of duck hepatitis B virus essential for particle morphogenesis. The Journal of general virology 83(Pt 7):
1635-1644

Grgacic EV, Anderson DA (1994) The large surface protein of duck hepatitis B virus is phosphorylated in the pre-S
domain. J Virol 68(11): 7344-7350

Grgacic EV, Anderson DA (2005) St, a truncated envelope protein derived from the S protein of duck hepatitis B
virus, acts as a chaperone for the folding of the large envelope protein. J Virol 79(9): 5346-5352

Grgacic EV, Kuhn C, Schaller H (2000) Hepadnavirus envelope topology: insertion of a loop region in the
membrane and role of S in L protein translocation. J Virol 74(5): 2455-2458

Grgacic EV, Lin B, Gazina EV, Snooks MJ, Anderson DA (1998) Normal phosphorylation of duck hepatitis B virus
L protein is dispensable for infectivity. The Journal of general virology 79 ( Pt 11): 2743-2751

Grgacic EV, Schaller H (2000) A metastable form of the large envelope protein of duck hepatitis B virus: low-pH
release results in a transition to a hydrophobic, potentially fusogenic conformation. J Virol 74(11): 5116-5122

Gripon P, Cannie I, Urban S (2005) Efficient inhibition of hepatitis B virus infection by acylated peptides derived
from the large viral surface protein. J Virol 79(3): 1613-1622

Gripon P, Diot C, Guguen-Guillouzo C (1993) Reproducible High Level Infection of Cultured Adult Human
Hepatocytes by Hepatitis-B Virus - Effect of Polyethylene Glycol on Adsorption and Penetration. Virology 192(2):
534-540

Gripon P, Diot C, Theze N, Fourel I, Loreal O, Brechot C, Guguen-Guillouzo C (1988) Hepatitis B virus infection
of adult human hepatocytes cultured in the presence of dimethyl sulfoxide. J Virol 62(11): 4136-4143

Gripon P, Le Seyec J, Rumin S, Guguen-Guillouzo C (1995) Myristylation of the hepatitis B virus large surface
protein is essential for viral infectivity. Virology 213(2): 292-299

Gripon P, Rumin S, Urban S, Le Seyec J, Glaise D, Cannie I, Guyomard C, Lucas J, Trepo C, Guguen-Guillouzo C
(2002) Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc Natl Acad Sci U S A 99(24): 15655-15660

Gudima S, Meier A, Dunbrack R, Taylor J, Bruss V (2007) Two Potentially Important Elements of the Hepatitis B
Virus Large Envelope Protein are Dispensable for the Infectivity of Hepatitis Delta Virus. J Virol

Guidotti LG, Matzke B, Schaller H, Chisari FV (1995) High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice. J
Virol 69(10): 6158-6159

Guo JT, Pugh JC (1997) Topology of the large envelope protein of duck hepatitis B virus suggests a mechanism for
membrane translocation during particle morphogenesis. J Virol 71(2): 1107-1114

Guo WT, Bell KD, Ou JH (1991) Characterization of the hepatitis B virus EnhI enhancer and X promoter complex.
J Virol 65(12): 6686-6692

Hafner A, Brandenburg B, Hildt E (2003) Reconstitution of gene expression from a regulatory-protein-deficient


hepatitis B virus genome by cell-permeable HBx protein. EMBO reports 4(8): 767-773

Hagelstein J, Fathinejad F, Stremmel W, Galle PR (1997) pH-independent uptake of hepatitis B virus in primary
human hepatocytes. Virology 229(1): 292-294

Hannoun C, Krogsgaard K, Horal P, Lindh M (2002) Genotype mixtures of hepatitis B virus in patients treated with
interferon. J Infect Dis 186(6): 752-759

Hantz O, Allaudeen HS, Ooka T, De Clercq E, Trepo C (1984) Inhibition of human and woodchuck hepatitis virus
DNA polymerase by the triphosphates of acyclovir, 1-(2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranosyl)-5-iodocytosine
and E-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine. Antiviral Res 4(4): 187-199

Hantz O, Parent R, Durantel D, Gripon P, Guguen-Guillouzo C, Zoulim F (2009) Persistence of the hepatitis B virus
covalently closed circular DNA in HepaRG human hepatocyte-like cells. The Journal of general virology 90(Pt 1):
127-135

120
Harrison SC (2008) Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol 15(7): 690-698

Hassan MM, Hwang LY, Hatten CJ, Swaim M, Li D, Abbruzzese JL, Beasley P, Patt YZ (2002) Risk factors for
hepatocellular carcinoma: synergism of alcohol with viral hepatitis and diabetes mellitus. Hepatology (Baltimore,
Md 36(5): 1206-1213

Hatton T, Zhou S, Standring DN (1992) RNA- and DNA-binding activities in hepatitis B virus capsid protein: a
model for their roles in viral replication. J Virol 66(9): 5232-5241

Havens JW (1946) Period of infectivity of patients with homologous serum jaundice and routes of infection in this
disease. J Exp Med 83

Heermann KH, Goldmann U, Schwartz W, Seyffarth T, Baumgarten H, Gerlich WH (1984) Large surface proteins
of hepatitis B virus containing the pre-s sequence. J Virol 52(2): 396-402

Heise T, Sommer G, Reumann K, Meyer I, Will H, Schaal H (2006) The hepatitis B virus PRE contains a splicing
regulatory element. Nucleic Acids Res 34(1): 353-363

Heitz F, Morris MC, Divita G (2009) Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to
therapeutics. Br J Pharmacol 157(2): 195-206

Hertogs K, Leenders WP, Depla E, De Bruin WC, Meheus L, Raymackers J, Moshage H, Yap SH (1993)
Endonexin II, present on human liver plasma membranes, is a specific binding protein of small hepatitis B virus
(HBV) envelope protein. Virology 197(2): 549-557

Hildt E, Munz B, Saher G, Reifenberg K, Hofschneider PH (2002) The PreS2 activator MHBs(t) of hepatitis B virus
activates c-raf-1/Erk2 signaling in transgenic mice. EMBO J 21(4): 525-535

Hildt E, Saher G, Bruss V, Hofschneider PH (1996a) The hepatitis B virus large surface protein (LHBs) is a
transcriptional activator. Virology 225(1): 235-239

Hildt E, Urban S, Eckerskorn C, Hofschneider PH (1996b) Isolation of highly purified, functional carboxy-
terminally truncated hepatitis B virus middle surface protein activators from eucaryotic expression systems.
Hepatology (Baltimore, Md 24(3): 502-507

Hildt E, Urban S, Hofschneider PH (1995) Characterization of essential domains for the functionality of the MHBst
transcriptional activator and identification of a minimal MHBst activator. Oncogene 11(10): 2055-2066

Hildt E, Urban S, Lauer U, Hofschneider PH, Kekule AS (1993) ER-localization and functional expression of the
HBV transactivator MHBst. Oncogene 8(12): 3359-3367

Hirota K, Sherker AH, Omata M, Yokosuka O, Okuda K (1987) Effects of adenine arabinoside on serum and
intrahepatic replicative forms of duck hepatitis B virus in chronic infection. Hepatology (Baltimore, Md 7(1): 24-28

Hirsch RC, Lavine JE, Chang LJ, Varmus HE, Ganem D (1990) Polymerase gene products of hepatitis B viruses are
required for genomic RNA packaging as wel as for reverse transcription. Nature 344(6266): 552-555

Hofmann MW, Weise K, Ollesch J, Agrawal P, Stalz H, Stelzer W, Hulsbergen F, de Groot H, Gerwert K, Reed J,
Langosch D (2004) De novo design of conformationally flexible transmembrane peptides driving membrane fusion.
Proc Natl Acad Sci U S A 101(41): 14776-14781

Hogle JM (2002) Poliovirus cell entry: common structural themes in viral cell entry pathways. Annu Rev Microbiol
56: 677-702

Hruska JF, Clayton DA, Rubenstein JL, Robinson WS (1977) Structure of hepatitis B Dane particle DNA before
and after the Dane particle DNA polymerase reaction. J Virol 21(2): 666-672

Hsu T, Moroy T, Etiemble J, Louise A, Trepo C, Tiollais P, Buendia MA (1988) Activation of c-myc by woodchuck
hepatitis virus insertion in hepatocellular carcinoma. Cell 55(4): 627-635

Hu J, Flores D, Toft D, Wang X, Nguyen D (2004) Requirement of heat shock protein 90 for human hepatitis B
virus reverse transcriptase function. J Virol 78(23): 13122-13131

121
Hu J, Seeger C (1996) Hsp90 is required for the activity of a hepatitis B virus reverse transcriptase. Proc Natl Acad
Sci U S A 93(3): 1060-1064

Hu J, Toft DO, Seeger C (1997) Hepadnavirus assembly and reverse transcription require a multi-component
chaperone complex which is incorporated into nucleocapsids. EMBO J 16(1): 59-68

Hu KQ, Siddiqui A (1991) Regulation of the hepatitis B virus gene expression by the enhancer element I. Virology
181(2): 721-726

Huang J, Liang TJ (1993) A novel hepatitis B virus (HBV) genetic element with Rev response element-like
properties that is essential for expression of HBV gene products. Mol Cell Biol 13(12): 7476-7486

Huang ZM, Yen TS (1994) Hepatitis B virus RNA element that facilitates accumulation of surface gene transcripts
in the cytoplasm. J Virol 68(5): 3193-3199

Huovila AP, Eder AM, Fuller SD (1992) Hepatitis B surface antigen assembles in a post-ER, pre-Golgi
compartment. J Cell Biol 118(6): 1305-1320

Iloeje UH, Yang HI, Su J, Jen CL, You SL, Chen CJ (2006) Predicting cirrhosis risk based on the level of
circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology 130(3): 678-686

Imai M, Yanase Y, Nojiri T, Miyakawa Y, Mayumi M (1979) A receptor for polymerized human and chimpanzee
albumins on hepatitis B virus particles co-occurring with HBeAg. Gastroenterology 76(2): 242-247

INVS (2007) Prvalence des hpatites B et C en France en 2004.

INVS (2009) Calendrier des vaccinations et recommandations vaccinales 2009 selon lavis du Haut conseil de la
sant publique. Bulletin pidmiologique hebdomadaire

Ishiguro R, Kimura N, Takahashi S (1993) Orientation of fusion-active synthetic peptides in phospholipid bilayers:
determination by Fourier transform infrared spectroscopy. Biochemistry 32(37): 9792-9797

Ishihara K, Waters JA, Pignatelli M, Thomas HC (1987) Characterisation of the polymerised and monomeric human
serum albumin binding sites on hepatitis B surface antigen. Journal of medical virology 21(1): 89-95

Ishikawa T, Ganem D (1995) The pre-S domain of the large viral envelope protein determines host range in avian
hepatitis B viruses. Proc Natl Acad Sci USA 92(14): 6259-6263

Ishikawa T, Kuroki K, Lenhoff R, Summers J, Ganem D (1994) Analysis of the binding of a host cell surface
glycoprotein to the preS protein of duck hepatitis B virus. Virology 202(2): 1061-1064

Ishikawa T, Murakami K, Kido Y, Ohnishi S, Yazaki Y, Harada F, Kuroki K (1998) Cloning, functional expression,
and chromosomal localization of the human and mouse gp180-carboxypeptidase D-like enzyme. Gene 215(2): 361-
370

Iwarson S, Tabor E, Thomas HC, Goodall A, Waters J, Snoy P, Shih JW, Gerety RJ (1985) Neutralization of
hepatitis B virus infectivity by a murine monoclonal antibody: an experimental study in the chimpanzee. Journal of
medical virology 16(1): 89-96

Jaoude GA, Sureau C (2005) Role of the antigenic loop of the hepatitis B virus envelope proteins in infectivity of
hepatitis delta virus. J Virol 79(16): 10460-10466

Jean-Jean O, Levrero M, Will H, Perricaudet M, Rossignol JM (1989) Expression mechanism of the hepatitis B
virus (HBV) C gene and biosynthesis of HBe antigen. Virology 170(1): 99-106

Jehn (1885) Eine Ikterusepidemie in wahrscheinlichem. Zusammenhang mit vorausgegangener revaccination. Dtsch
Med Wochenschr 11

Junker-Niepmann M, Bartenschlager R, Schaller H (1990) A short cis-acting sequence is required for hepatitis B
virus pregenome encapsidation and sufficient for packaging of foreign RNA. Embo J 9(10): 3389-3396

122
Kamimura T, Yoshikawa A, Ichida F, Sasaki H (1981) Electron microscopic studies of Dane particles in
hepatocytes with special reference to intracellular development of Dane particles and their relation with HBeAg in
serum. Hepatology (Baltimore, Md 1(5): 392-397

Kann M, Gerlich WH (1994) Effect of core protein phosphorylation by protein kinase C on encapsidation of RNA
within core particles of hepatitis B virus. J Virol 68(12): 7993-8000

Kann M, Sodeik B, Vlachou A, Gerlich WH, Helenius A (1999) Phosphorylation-dependent binding of hepatitis B
virus core particles to the nuclear pore complex. J Cell Biol 145(1): 45-55

Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS (2000) Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with
chronic hepatitis B. Gastroenterology 118(3): 554-559

Kaplan PM, Greenman RL, Gerin JL, Purcell RH, Robinson WS (1973) DNA polymerase associated with human
hepatitis B antigen. J Virol 12(5): 995-1005

Kasuya T, Nomura S, Matsuzaki T, Jung J, Yamada T, Tatematsu K, Okajima T, Tanizawa K, Kuroda S (2008)
Expression of squamous cell carcinoma antigen-1 in liver enhances the uptake of hepatitis B virus envelope-derived
bio-nanocapsules in transgenic rats. FEBS J 275(22): 5714-5724

Kau JH, Ting LP (1998) Phosphorylation of the core protein of hepatitis B virus by a 46-kilodalton serine kinase. J
Virol 72(5): 3796-3803

Kay A, Mandart E, Trepo C, Galibert F (1985) The HBV HBX gene expressed in E. coli is recognised by sera from
hepatitis patients. Embo J 4(5): 1287-1292

Kidd-Ljunggren K, Miyakawa Y, Kidd AH (2002) Genetic variability in hepatitis B viruses. The Journal of general
virology 83(Pt 6): 1267-1280

Kielian M, Rey FA (2006) Virus membrane-fusion proteins: more than one way to make a hairpin. Nat Rev
Microbiol 4(1): 67-76

Klingmuller U, Schaller H (1993) Hepadnavirus infection requires interaction between the viral pre-S domain and a
specific hepatocellular receptor. J Virol 67(12): 7414-7422

Kock J, Baumert TF, Delaney WEt, Blum HE, von Weizsacker F (2003) Inhibitory effect of adefovir and
lamivudine on the initiation of hepatitis B virus infection in primary tupaia hepatocytes. Hepatology (Baltimore, Md
38(6): 1410-1418

Kock J, Borst EM, Schlicht HJ (1996a) Uptake of duck hepatitis B virus into hepatocytes occurs by endocytosis but
does not require passage of the virus through an acidic intracellular compartment. J Virol 70(9): 5827-5831

Kock J, Nassal M, MacNelly S, Baumert TF, Blum HE, von Weizsacker F (2001) Efficient infection of primary
tupaia hepatocytes with purified human and woolly monkey hepatitis B virus. J Virol 75(11): 5084-5089

Kock J, Schlicht HJ (1993) Analysis of the earliest steps of hepadnavirus replication: genome repair after infectious
entry into hepatocytes does not depend on viral polymerase activity. J Virol 67(8): 4867-4874

Kock J, Theilmann L, Galle P, Schlicht HJ (1996b) Hepatitis B virus nucleic acids associated with human peripheral
blood mononuclear cells do not originate from replicating virus. Hepatology (Baltimore, Md 23(3): 405-413

Koike K, Tsutsumi T, Fujie H, Shintani Y, Kyoji M (2002) Molecular mechanism of viral hepatocarcinogenesis.
Oncology 62 Suppl 1: 29-37

Korba BE, Brown TL, Wells FV, Baldwin B, Cote PJ, Steinberg H, Tennant BC, Gerin JL (1990) Natural history of
experimental woodchuck hepatitis virus infection: molecular virologic features of the pancreas, kidney, ovary, and
testis. J Virol 64(9): 4499-4506

Korba BE, Cote PJ, Gerin JL (1988a) Mitogen-induced replication of woodchuck hepatitis virus in cultured
peripheral blood lymphocytes. Science 241(4870): 1213-1216

Korba BE, Cote PJ, Shapiro M, Purcell RH, Gerin JL (1989a) In vitro production of infectious woodchuck hepatitis
virus by lipopolysaccharide-stimulated peripheral blood lymphocytes. J Infect Dis 160(4): 572-576

123
Korba BE, Cote PJ, Wells FV, Baldwin B, Popper H, Purcell RH, Tennant BC, Gerin JL (1989b) Natural history of
woodchuck hepatitis virus infections during the course of experimental viral infection: molecular virologic features
of the liver and lymphoid tissues. J Virol 63(3): 1360-1370

Korba BE, Gowans EJ, Wells FV, Tennant BC, Clarke R, Gerin JL (1988b) Systemic distribution of woodchuck
hepatitis virus in the tissues of experimentally infected woodchucks. Virology 165(1): 172-181

Korba BE, Wells F, Tennant BC, Cote PJ, Gerin JL (1987) Lymphoid cells in the spleens of woodchuck hepatitis
virus-infected woodchucks are a site of active viral replication. J Virol 61(5): 1318-1324

Korba BE, Wells F, Tennant BC, Yoakum GH, Purcell RH, Gerin JL (1986) Hepadnavirus infection of peripheral
blood lymphocytes in vivo: woodchuck and chimpanzee models of viral hepatitis. J Virol 58(1): 1-8

Krone B, Lenz A, Heermann KH, Seifer M, Lu XY, Gerlich WH (1990) Interaction between hepatitis B surface
proteins and monomeric human serum albumin. Hepatology (Baltimore, Md 11(6): 1050-1056

Kuroki K, Cheung R, Marion PL, Ganem D (1994) A Cell Surface Protein That Binds Avian Hepatitis B Virus
Particles. J Virol 68(4): 2091-2096

Kuroki K, Eng F, Ishikawa T, Turck C, Harada F, Ganem D (1995) gp180, a host cell glycoprotein that binds duck
hepatitis B virus particles, is encoded by a member of the carboxypeptidase gene family. J Biol Chem 270(25):
15022-15028

Kuroki K, Russnak R, Ganem D (1989) Novel N-terminal amino acid sequence required for retention of a hepatitis
B virus glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Mol Cell Biol 9(10): 4459-4466

Lambert C, Prange R (2001) Dual topology of the hepatitis B virus large envelope protein: determinants influencing
post-translational pre-S translocation. J Biol Chem 276(25): 22265-22272

Lambert C, Prange R (2003) Chaperone action in the posttranslational topological reorientation of the hepatitis B
virus large envelope protein: Implications for translocational regulation. Proc Natl Acad Sci U S A 100(9): 5199-
5204

Lanford RE, Chavez D, Brasky KM, Burns RB, 3rd, Rico-Hesse R (1998) Isolation of a hepadnavirus from the
woolly monkey, a New World primate. Proc Natl Acad Sci U S A 95(10): 5757-5761

Lanford RE, Notvall L, Lee H, Beames B (1997) Transcomplementation of nucleotide priming and reverse
transcription between independently expressed TP and RT domains of the hepatitis B virus reverse transcriptase. J
Virol 71(4): 2996-3004

Larsen CE, Alford DR, Young LJ, McGraw TP, Duzgunes N (1990) Fusion of simian immunodeficiency virus with
liposomes and erythrocyte ghost membranes: effects of lipid composition, pH and calcium. The Journal of general
virology 71 ( Pt 9): 1947-1955

Larsen CE, Nir S, Alford DR, Jennings M, Lee KD, Duzgunes N (1993) Human immunodeficiency virus type 1
(HIV-1) fusion with model membranes: kinetic analysis and the role of lipid composition, pH and divalent cations.
Biochim Biophys Acta 1147(2): 223-236

Lauer U, Weiss L, Hofschneider PH, Kekule AS (1992) The hepatitis B virus pre-S/S(t) transactivator is generated
by 3' truncations within a defined region of the S gene. J Virol 66(9): 5284-5289

Lavanchy D (2004) Hepatitis B virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention
and control measures. J Viral Hepat 11(2): 97-107

Lavillette D, Pecheur EI, Donot P, Fresquet J, Molle J, Corbau R, Dreux M, Penin F, Cosset FL (2007)
Characterization of fusion determinants points to the involvement of three discrete regions of both E1 and E2
glycoproteins in the membrane fusion process of hepatitis C virus. J Virol 81(16): 8752-8765

Le Bouvier GL, McCollum RW, Hierholzer WJ, Jr., Irwin GR, Krugman S, Giles JP (1972) Subtypes of Australia
antigen and hepatitis-B virus. JAMA 222(8): 928-930

124
Le Duff Y, Blanchet M, Sureau C (2009) The pre-S1 and antigenic loop infectivity determinants of the hepatitis B
virus envelope proteins are functionally independent. J Virol

Le Seyec J, Chouteau P, Cannie I, Guguen-Guillouzo C, Gripon P (1998) Role of the Pre-S2 domain of the large
envelope protein in Hepatitis B Virus assembly and infectivity. J Virol 72(7): 5573-5578

Le Seyec J, Chouteau P, Cannie I, Guguen-Guillouzo C, Gripon P (1999) Infection process of the hepatitis B virus
depends on the presence of a defined sequence in the pre-S1 domain. J Virol 73(3)

Lear JD, DeGrado WF (1987) Membrane binding and conformational properties of peptides representing the NH2
terminus of influenza HA-2. J Biol Chem 262(14): 6500-6505

Lee GH, Wasser S, Lim SG (2008) Hepatitis B pregenomic RNA splicing--the products, the regulatory mechanisms
and its biological significance. Virus research 136(1-2): 1-7

Leistner CM, Gruen-Bernhard S, Glebe D (2008) Role of glycosaminoglycans for binding and infection of hepatitis
B virus. Cell Microbiol 10(1): 122-133

Lepere C, Regeard M, Le Seyec J, Gripon P (2007) The translocation motif of hepatitis B virus envelope proteins is
dispensable for infectivity. J Virol 81(14): 7816-7818

Lepere-Douard C, Trotard M, Le Seyec J, Gripon P (2009) The First Transmembrane Domain of the Hepatitis B
Virus Large Envelope Protein is Crucial for Infectivity. J Virol

Lew YY, Michalak TI (2001) In vitro and in vivo infectivity and pathogenicity of the lymphoid cell-derived
woodchuck hepatitis virus. J Virol 75(4): 1770-1782

Li D, Wang XZ, Ding J, Yu JP (2005) NACA as a potential cellular target of hepatitis B virus preS1 protein. Dig
Dis Sci 50(6): 1156-1160

Li J, Tong S, Lee HB, Perdigoto AL, Spangenberg HC, Wands JR (2004) Glycine decarboxylase mediates a
postbinding step in duck hepatitis B virus infection. J Virol 78(4): 1873-1881

Li J, Tong S, Wands JR (1999) Identification and expression of glycine decarboxylase (p120) as a duck hepatitis B
virus pre-S envelope-binding protein. J Biol Chem 274(39): 27658-27665

Li JS, Tong SP, Wands JR (1996) Characterization of a 120-kilodalton pre-S-binding protein as a candidate duck
hepatitis B virus receptor. J Virol 70(9): 6029-6035

Li L, Dixon R, Gu X, JE N (1998) Comparison of the sequences of the Grey Teal, Maned Duck and Duck hepatitis
B viruses. In The Molecular biology of Hepatitis B Virus University of California San Diego 13

Liaw YF, Chu CM (2009) Hepatitis B virus infection. Lancet 373(9663): 582-592

Liemann S, Chandran K, Baker TS, Nibert ML, Harrison SC (2002) Structure of the reovirus membrane-penetration
protein, Mu1, in a complex with is protector protein, Sigma3. Cell 108(2): 283-295

Lien JM, Aldrich CE, Mason WS (1986) Evidence that a capped oligoribonucleotide is the primer for duck hepatitis
B virus plus-strand DNA synthesis. J Virol 57(1): 229-236

Liou W, Sung YJ, Tao MH, Lo SJ (2008) Morphogenesis of the hepatitis B virion and subviral particles in the liver
of transgenic mice. J Biomed Sci 15(3): 311-316

Lippincott-Schwartz J, Yuan L, Tipper C, Amherdt M, Orci L, Klausner RD (1991) Brefeldin A's effects on
endosomes, lysosomes, and the TGN suggest a general mechanism for regulating organelle structure and membrane
traffic. Cell 67(3): 601-616

Liu J, Rost B (2003) NORSp: Predictions of long regions without regular secondary structure. Nucleic Acids Res
31(13): 3833-3835

Llovet JM, Burroughs A, Bruix J (2003) Hepatocellular carcinoma. Lancet 362(9399): 1907-1917

125
Loffler-Mary H, Dumortier J, Klentsch-Zimmer C, Prange R (2000) Hepatitis B virus assembly is sensitive to
changes in the cytosolic S loop of the envelope proteins. Virology 270(2): 358-367

Loffler-Mary H, Werr M, Prange R (1997) Sequence-specific repression of cotranslational translocation of the


hepatitis B virus envelope proteins coincides with binding of heat shock protein Hsc70. Virology 235(1): 144-152

Lofgren B, Nordenfelt E, Oberg B (1989) Inhibition of RNA- and DNA-dependent duck hepatitis B virus DNA
polymerase activity by nucleoside and pyrophosphate analogs. Antiviral Res 12(5-6): 301-310

Lok AS (2002) Chronic hepatitis B. N Engl J Med 346(22): 1682-1683

Lok AS, McMahon BJ (2007) Chronic hepatitis B. Hepatology (Baltimore, Md 45(2): 507-539

London WT, Sutnick AI, Blumberg BS (1969) Australia antigen and acute viral hepatitis. Ann Intern Med 70(1): 55-
59

Lopez-Cabrera M, Letovsky J, Hu KQ, Siddiqui A (1991) Transcriptional factor C/EBP binds to and transactivates
the enhancer element II of the hepatitis B virus. Virology 183(2): 825-829

Lott L, Beames B, Notvall L, Lanford RE (2000) Interaction between hepatitis B virus core protein and reverse
transcriptase. J Virol 74(24): 11479-11489

Lott L, Notvall L, Lanford RE (2003) Transcomplementation of core and polymerase functions of the woolly
monkey and human hepatitis B viruses. Virology 308(2): 330-339

Lu X, Block TM, Gerlich WH (1996) Protease-induced infectivity of hepatitis B virus for a human hepatoblastoma
cell line. J Virol 70(4): 2277-2285

Lupberger J, Hildt E (2007) Hepatitis B virus-induced oncogenesis. World J Gastroenterol 13(1): 74-81

Lrman (1885) Eine Ikterusepidemie. Berlin Klin Wschr 22: 20-23

Mabit H, Schaller H (2000) Intracellular hepadnavirus nucleocapsids are selected for secretion by envelope protein-
independent membrane binding. J Virol 74(24): 11472-11478

MacCallum FO BW (1944) Transmission of infective hepatitis to human volunteers. Lancet 2: 228

MacCullum F (1947) Homologous serum hepatitis. Lancet 2: 691-692

Machida A, Kishimoto S, Ohnuma H, Miyamoto H, Baba K, Oda K, Nakamura, T., Miyakawa Y, Mayumi M
(1983) A hepatitis B surface antigen polypeptide (P31) with the receptor for polymerized human as well as
chimpanzee albumins. Gastroenterology 85(2): 268-274

Machida A, Ohnuma H, Tsuda F, Yoshikawa A, Hoshi Y, Tanaka T, Kishimoto S, Akahane Y, Miyakawa Y,


Mayumi M (1991) Phosphorylation in the carboxyl-terminal domain of the capsid protein of hepatitis B virus:
evaluation with a monoclonal antibody. J Virol 65(11): 6024-6030

Macrae DR, Bruss V, Ganem D (1991) Myristylation of a duck hepatitis B virus envelope protein is essential for
infectivity but not for virus assembly. Virology 181(1): 359-363

Madden CR, Finegold MJ, Slagle BL (2000) Expression of hepatitis B virus X protein does not alter the
accumulation of spontaneous mutations in transgenic mice. J Virol 74(11): 5266-5272

Magnius LO, Espmark A (1972a) A new antigen complex co-occurring with Australia antigen. Acta Pathol
Microbiol Scand [B] Microbiol Immunol 80(2): 335-337

Magnius LO, Espmark JA (1972b) New specificities in Australia antigen positive sera distinct from the Le Bouvier
determinants. J Immunol 109(5): 1017-1021

Mahoney FJ (1999) Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection. Clin Microbiol
Rev 12(2): 351-366

126
Malecki J, Wiedlocha A, Wesche J, Olsnes S (2002) Vesicle transmembrane potential is required for translocation to
the cytosol of externally added FGF-1. EMBO J 21(17): 4480-4490

Mandart E, Kay A, Galibert F (1984) Nucleotide sequence of a cloned duck hepatitis B virus genome: comparison
with woodchuck and human hepatitis B virus sequences. J Virol 49(3): 782-792

Mangold CM, Streeck RE (1993) Mutational analysis of the cysteine residues in the hepatitis B virus small envelope
protein. J Virol 67(8): 4588-4597

Mangold CM, Unckell F, Werr M, Streeck RE (1995) Secretion and antigenicity of hepatitis B virus small envelope
proteins lacking cysteines in the major antigenic region. Virology 211(2): 535-543

Marion PL, Oshiro LS, Regnery DC, Scullard GH, Robinson WS (1980) A virus in Beechey ground squirrels that is
related to hepatitis B virus of humans. Proc Natl Acad Sci U S A 77(5): 2941-2945

Mason WS, Seal G, Summers J (1980) Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human
hepatitis B virus. J Virol 36(3): 829-836

Maupas P, Goudeau A, Coursaget P, Drucker J, Bagros P (1976) Immunisation against hepatitis B in man. Lancet
1(7974): 1367-1370

Maupas P, Goudeau A, Coursaget P, Drucker J, Bagros P (1978) Hepatitis B vaccine: efficacy in high-risk settings,
a two-year study. Intervirology 10(3): 196-208

McDonald S (1908) Acute yellow atrophy. Edinb Med J 15

Mehdi H, Kaplan MJ, Anlar FY, Yang X, Bayer R, Sutherland K, Peeples ME (1994) Hepatitis B virus surface
antigen binds to apolipoprotein H. J Virol 68(4): 2415-2424

Menne S, Cote PJ (2007) The woodchuck as an animal model for pathogenesis and therapy of chronic hepatitis B
virus infection. World J Gastroenterol 13(1): 104-124

Meyer M, Caselmann WH, Schluter V, Schreck R, Hofschneider PH, Baeuerle PA (1992) Hepatitis B virus
transactivator MHBst: activation of NF-kappa B, selective inhibition by antioxidants and integral membrane
localization. EMBO J 11(8): 2991-3001

Michalak TI, Mulrooney PM, Coffin CS (2004) Low doses of hepadnavirus induce infection of the lymphatic
system that does not engage the liver. J Virol 78(4): 1730-1738

Michalak TI, Pardoe IU, Coffin CS, Churchill ND, Freake DS, Smith P, Trelegan CL (1999) Occult lifelong
persistence of infectious hepadnavirus and residual liver inflammation in woodchucks convalescent from acute viral
hepatitis. Hepatology (Baltimore, Md 29(3): 928-938

Miller RH, Robinson WS (1984) Hepatitis B virus DNA forms in nuclear and cytoplasmic fractions of infected
human liver. Virology 137(2): 390-399

Montalto G, Cervello M, Giannitrapani L, Dantona F, Terranova A, Castagnetta LA (2002) Epidemiology, risk


factors, and natural history of hepatocellular carcinoma. Ann N Y Acad Sci 963: 13-20

Mulrooney PM, Michalak TI (2003) Quantitative detection of hepadnavirus-infected lymphoid cells by in situ PCR
combined with flow cytometry: implications for the study of occult virus persistence. J Virol 77(2): 970-979

Mulrooney-Cousins PM, Michalak TI (2007) Persistent occult hepatitis B virus infection: experimental findings and
clinical implications. World J Gastroenterol 13(43): 5682-5686

Nassal M (1992) The arginine-rich domain of the hepatitis B virus core protein is required for pregenome
encapsidation and productive viral positive-strand DNA synthesis but not for virus assembly. J Virol 66(7): 4107-
4116

Nassal M (2008) Hepatitis B viruses: reverse transcription a different way. Virus research 134(1-2): 235-249

Nassal M, Junker-Niepmann M, Schaller H (1990) Translational inactivation of RNA function: discrimination


against a subset of genomic transcripts during HBV nucleocapsid assembly. Cell 63(6): 1357-1363

127
Naumann H, Schaefer S, Yoshida CF, Gaspar AM, Repp R, Gerlich WH (1993) Identification of a new hepatitis B
virus (HBV) genotype from Brazil that expresses HBV surface antigen subtype adw4. The Journal of general
virology 74 ( Pt 8): 1627-1632

Neefe JR SJJ, Gellis SS (1945) Homologous serum hepatitis and infectious (epidemic) hepatitis. Am J Med Sci 210:
561-575

Neurath AR, Kent SB, Parker K, Prince AM, Strick N, Brotman B, Sproul P (1986a) Antibodies to a synthetic
peptide from the preS 120-145 region of the hepatitis B virus envelope are virus neutralizing. Vaccine 4(1): 35-37

Neurath AR, Kent SB, Strick N, Parker K (1986b) Identification and chemical synthesis of a host cell receptor
binding site on hepatitis B virus. Cell 46(3): 429-436

Neurath AR, Strick N (1990) Antigenic mimicry of an immunoglobulin A epitope by a hepatitis B virus cell
attachment site. Virology 178(2): 631-634

Neurath AR, Strick N (1994) The putative cell receptors for hepatitis B virus (HBV), annexin V, and apolipoprotein
H, bind to lipid components of HBV. Virology 204(1): 475-477

Neurath AR, Strick N, Li YY (1992a) Cells Transfected with Human Interleukin-6 cDNA Acquire Binding Sites for
the Hepatitis-B Virus Envelope Protein. J Exp Med 176(6): 1561-1569

Neurath AR, Strick N, Sproul P (1992b) Search for hepatitis-B virus cell receptors reveals binding sites for
interleukin-6 on the virus envelope protein. J Exp Med 175(2): 461-469

Newbold JE, Xin H, Tencza M, Sherman G, Dean J, Bowden S, Locarnini S (1995) The covalently closed duplex
form of the hepadnavirus genome exists in situ as a heterogeneous population of viral minichromosomes. J Virol
69(6): 3350-3357

Ni YH, Huang LM, Chang MH, Yen CJ, Lu CY, You SL, Kao JH, Lin YC, Chen HL, Hsu HY, Chen DS (2007)
Two decades of universal hepatitis B vaccination in taiwan: impact and implication for future strategies.
Gastroenterology 132(4): 1287-1293

Nordenfelt E, Lofgren B, Chattopadhyaya J, Oberg B (1987) Inhibition of hepatitis B virus DNA polymerase by 3'-
azido-3'-deoxythymidine triphosphate but not by its threo analog. Journal of medical virology 22(3): 231-236

Norder H, Ebert JW, Fields HA, Mushahwar IK, Magnius LO (1996) Complete sequencing of a gibbon hepatitis B
virus genome reveals a unique genotype distantly related to the chimpanzee hepatitis B virus. Virology 218(1): 214-
223

Nowak MA, Bonhoeffer S, Hill AM, Boehme R, Thomas HC, McDade H (1996) Viral dynamics in hepatitis B virus
infection. Proc Natl Acad Sci U S A 93(9): 4398-4402

Nunez E, Yelamos B, Delgado C, Gomez-Gutierrez J, Peterson DL, Gavilanes F (2009) Interaction of preS domains
of hepatitis B virus with phospholipid vesicles. Biochim Biophys Acta 1788(2): 417-424

Oess S, Hildt E (2000) Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surface
antigens. Gene therapy 7(9): 750-758

Offensperger WB, Offensperger S, Walter E, Blum HE, Gerok W (1991) Inhibition of duck hepatitis B virus
infection by lysosomotropic agents. Virology 183(1): 415-418

Ogata N, Cote PJ, Zanetti AR, Miller RH, Shapiro M, Gerin J, Purcell RH (1999) Licensed recombinant hepatitis B
vaccines protect chimpanzees against infection with the prototype surface gene mutant of hepatitis B virus.
Hepatology (Baltimore, Md 30(3): 779-786

Okochi K, Murakami S (1968) Observations on Australia antigen in Japanese. . Vox Sang 15: 374-385

Ono Y, Onda H, Sasada R, Igarashi K, Sugino Y, Nishioka K (1983) The complete nucleotide sequences of the
cloned hepatitis B virus DNA; subtype adr and adw. Nucleic Acids Res 11(6): 1747-1757

128
Ostapchuk P, Hearing P, Ganem D (1994) A Dramatic Shift in the Transmembrane Topology of a Viral Envelope
Glycoprotein Accompanies Hepatitis B Viral Morphogenesis. EMBO J 13(5): 1048-1057

Ou JH, Rutter WJ (1987) Regulation of secretion of the hepatitis B virus major surface antigen by the preS-1
protein. J Virol 61(3): 782-786

Owada T, Matsubayashi K, Sakata H, Ihara H, Sato S, Ikebuchi K, Kato T, Azuma H, Ikeda H (2006) Interaction
between desialylated hepatitis B virus and asialoglycoprotein receptor on hepatocytes may be indispensable for viral
binding and entry. J Viral Hepat 13(1): 11-18

Pante N, Kann M (2002) Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.
Mol Biol Cell 13(2): 425-434

Paran N, Geiger B, Shaul Y (2001) HBV infection of cell culture: evidence for multivalent and cooperative
attachment. EMBO J 20(16): 4443-4453

Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P (2001) Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer
94(2): 153-156

Patient R, Hourioux C, Sizaret PY, Trassard S, Sureau C, Roingeard P (2007) Hepatitis B virus subviral envelope
particle morphogenesis and intracellular trafficking. J Virol 81(8): 3842-3851

Paul JR HJW, Sabin AB, Philip CB (1945) Transmission experiments in serum jaundice and infectious hepatitis.
JAMA 128: 911-915

Persing DH, Varmus HE, Ganem D (1986) Inhibition of secretion of hepatitis B surface antigen by a related
presurface polypeptide. Science 234(4782): 1388-1391

Persing DH, Varmus HE, Ganem D (1987) The preS1 protein of hepatitis B virus is acylated at its amino terminus
with myristic acid. J virol 61: 1672-1677

Petersen J, Dandri M, Mier W, Lutgehetmann M, Volz T, von Weizsacker F, Haberkorn U, Fischer L, Pollok JM,
Erbes B, Seitz S, Urban S (2008) Prevention of hepatitis B virus infection in vivo by entry inhibitors derived from
the large envelope protein. Nat Biotechnol 26(3): 335-341

Peterson DL, Nath N, Gavilanes F (1982) Structure of hepatitis B surface antigen. Correlation of subtype with
amino acid sequence and location of the carbohydrate moiety. J Biol Chem 257(17): 10414-10420

Petit MA, Capel F, Dubanchet S, Mabit H (1992) PreS1-Specific Binding Proteins as Potential Receptors for
Hepatitis B Virus in Human Hepatocytes. Virology 187(1): 211-222

Petit MA, Pillot J (1985) HBc and HBe antigenicity and DNA-binding activity of major core protein P22 in hepatitis
B virus core particles isolated from the cytoplasm of human liver cells. J Virol 53(2): 543-551

Petsko GA, Ringe D, Sanlaville C, Charmot-Bensimon D (2008) Structure et fonction des protines. De Boeck
Universit Rdacteur Dominique Charmot-Bensimon,

Poisson F, Roingeard P, Goudeau A (1995) Le virus de l'hpatite delta : un mode de rplication bien singulier. m/s
11: 1379-1387

Poisson F, Severac A, Hourioux C, Goudeau A, Roingeard P (1997) Both pre-S1 and S domains of hepatitis B virus
envelope proteins interact with the core particle. Virology 228(1): 115-120

Pollack JR, Ganem D (1994) Site-specific RNA binding by a hepatitis B virus reverse transcriptase initiates two
distinct reactions: RNA packaging and DNA synthesis. J Virol 68(9): 5579-5587

Pollicino T, Squadrito G, Cerenzia G, Cacciola I, Raffa G, Craxi A, Farinati F, Missale G, Smedile A, Tiribelli C,
Villa E, Raimondo G (2004) Hepatitis B virus maintains its pro-oncogenic properties in the case of occult HBV
infection. Gastroenterology 126(1): 102-110

Ponsel D, Bruss V (2003) Mapping of amino acid side chains on the surface of hepatitis B virus capsids required for
envelopment and virion formation. J Virol 77(1): 416-422

129
Pontisso P, Petit MA, Bankowski MJ, Peeples ME (1989a) Human liver plasma membranes contain receptors for
the hepatitis B virus pre-S1 region and, via polymerized human serum albumin, for the pre-S2 region. J Virol 63(5):
1981-1988

Pontisso P, Ruvoletto MG, Gerlich WH, Heermann KH, Bardini R, Alberti A (1989b) Identification of an
attachment site for human liver plasma membranes on hepatitis B virus particles. Virology 173(2): 522-530

Pontisso P, Ruvoletto MG, Tiribelli C, Gerlich WH, Ruol A, Alberti A (1992) The preS1 domain of hepatitis B
virus and IgA cross-react in their binding to the hepatocyte surface. The Journal of general virology 73(Pt 8): 2041-
2045

Prange R, Clemen A, Streeck RE (1991) Myristylation is involved in intracellular retention of hepatitis B virus
envelope proteins. J Virol 65(7): 3919-3923

Prange R, Nagel R, Streeck RE (1992) Deletions in the hepatitis B virus small envelope protein: effect on assembly
and secretion of surface antigen particles. J Virol 66(10): 5832-5841

Prange R, Streeck RE (1995) Novel transmembrane topology of the hepatitis B virus envelope proteins. EMBO J
14(2): 247-256

Prange R, Werr M, Birkner M, Hilfrich R, Streeck RE (1995) Properties of modified hepatitis B virus surface
antigen particles carrying preS epitopes. The Journal of general virology 76 ( Pt 9): 2131-2140

Prange R, Werr M, Loffler-Mary H (1999) Chaperones involved in hepatitis B virus morphogenesis. Biol Chem
380(3): 305-314

Prassolov A, Hohenberg H, Kalinina T, Schneider C, Cova L, Krone O, Frolich K, Will H, Sirma H (2003) New
hepatitis B virus of cranes that has an unexpected broad host range. J Virol 77(3): 1964-1976

Prince AM (1968) An antigen detected in the blood during the incubation period of serum hepatitis. Proc Natl Acad
Sci U S A 60(3): 814-821

Pult I, Netter HJ, Frhlich K, Kaleta EF, Will H (1998) Identification, structural, and functional analysis of a new
avian hepadnavirus from storks (STHBV). In "The Molecular Biology of Hepatitis B viruses" August 30-
September 3, San Diego: 2

Purcell RH, London WT, McAuliffe VJ, Palmer AE, Kaplan PM, Gerin JL, Wagner J, Popper H, Lvovsky E, Wong
DC, Levy HB (1976) Modification of chronic hepatitis-B virus infection in chimpanzees by administration of an
interferon inducer. Lancet 2(7989): 757-761

Rabe B, Glebe D, Kann M (2006) Lipid-mediated introduction of hepatitis B virus capsids into nonsusceptible cells
allows highly efficient replication and facilitates the study of early infection events. J Virol 80(11): 5465-5473

Rabe B, Vlachou A, Pante N, Helenius A, Kann M (2003) Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of
the viral genome. Proc Natl Acad Sci U S A 100(17): 9849-9854

Radziwill G, Tucker W, Schaller H (1990) Mutational analysis of the hepatitis B virus P gene product: domain
structure and RNase H activity. J Virol 64(2): 613-620

Rafalski M, Lear JD, DeGrado WF (1990) Phospholipid interactions of synthetic peptides representing the N-
terminus of HIV gp41. Biochemistry 29(34): 7917-7922

Reaves BJ, Bright NA, Mullock BM, Luzio JP (1996) The effect of wortmannin on the localisation of lysosomal
type I integral membrane glycoproteins suggests a role for phosphoinositide 3-kinase activity in regulating
membrane traffic late in the endocytic pathway. J Cell Sci 109 ( Pt 4): 749-762

Rehermann B (2003) Immune responses in hepatitis B virus infection. Semin Liver Dis 23(1): 21-38

Rehermann B, Nascimbeni M (2005) Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat Rev
Immunol 5(3): 215-229

Rigg RJ, Schaller H (1992) Duck hepatitis B virus infection of hepatocytes is not dependent on low pH. J Virol
66(5): 2829-2836

130
Rizzetto M (2009) Hepatitis D: thirty years after. J Hepatol 50(5): 1043-1050

Robinson WS, Greenman RL (1974) DNA polymerase in the core of the human hepatitis B virus candidate. J Virol
13(6): 1231-1236

Rodriguez-Crespo I, Gomez-Gutierrez J, Encinar JA, Gonzalez-Ros JM, Albar JP, Peterson DL, Gavilanes F (1996)
Structural properties of the putative fusion peptide of hepatitis B virus upon interaction with phospholipids. Circular
dichroism and Fourier-transform infrared spectroscopy studies. Eur J Biochem 242(2): 243-248

Rodriguez-Crespo I, Gomez-Gutierrez J, Nieto M, Peterson DL, Gavilanes F (1994) Prediction of a putative fusion
peptide in the S protein of hepatitis B virus. The Journal of general virology 75 ( Pt 3): 637-639

Rodriguez-Crespo I, Nunez E, Gomez-Gutierrez J, Yelamos B, Albar JP, Peterson DL, Gavilanes F (1995)
Phospholipid interactions of the putative fusion peptide of hepatitis B virus surface antigen S protein. The Journal of
general virology 76(Pt 2): 301-308

Rodriguez-Crespo I, Nunez E, Yelamos B, Gomez-Gutierrez J, Albar JP, Peterson DL, Gavilanes F (1999)
Fusogenic activity of hepadnavirus peptides corresponding to sequences downstream of the putative cleavage site.
Virology 261(1): 133-142

Roingeard P, Lu SL, Sureau C, Freschlin M, Arbeille B, Essex M, Romet-Lemonne JL (1990) Immunocytochemical


and electron microscopic study of hepatitis B virus antigen and complete particle production in hepatitis B virus
DNA transfected HepG2 cells. Hepatology (Baltimore, Md 11(2): 277-285

Roingeard P, Sureau C (1998) Ultrastructural analysis of hepatitis B virus in HepG2-transfected cells with special
emphasis on subviral filament morphogenesis. Hepatology (Baltimore, Md 28(4): 1128-1133

Rosmorduc O, Petit MA, Pol S, Capel F, Bortolotti F, Berthelot P, Brechot C, Kremsdorf D (1995) In vivo and in
vitro expression of defective hepatitis B virus particles generated by spliced hepatitis B virus RNA. Hepatology
(Baltimore, Md 22(1): 10-19

Rost B, Fariselli P, Casadio R (1996) Topology prediction for helical transmembrane proteins at 86% accuracy.
Protein Sci 5(8): 1704-1718

Rothmann K, Schnolzer M, Radziwill G, Hildt E, Moelling K, Schaller H (1998) Host cell-virus cross talk:
phosphorylation of a hepatitis B virus envelope protein mediates intracellular signaling. J Virol 72(12): 10138-
10147

Russnak R, Ganem D (1990) Sequences 5' to the polyadenylation signal mediate differential poly(A) site use in
hepatitis B viruses. Genes Dev 4(5): 764-776

Ryu CJ, Cho DY, Gripon P, Kim HS, Guguen-Guillouzo C, Hong HJ (2000) An 80-kilodalton protein that binds to
the pre-S1 domain of hepatitis B virus. J Virol 74(1): 110-116

Saher G, Hildt E (1999) Activation of c-Raf-1 kinase signal transduction pathway in alpha(7) integrin-deficient
mice. J Biol Chem 274(39): 27651-27657

Salisse J, Sureau C (2009) A function essential to viral entry underlies the hepatitis B virus "a" determinant. J Virol

Santantonio T, Jung MC, Schneider R, Fernholz D, Milella M, Monno L, Pastore G, Pape GR, Will H (1992)
Hepatitis-B Virus Genomes That Cannot Synthesize Pre-S2 Proteins Occur Frequently and as Dominant Virus
Populations in Chronic Carriers in Italy. Virology 188(2): 948-952

Satoh O, Imai H, Yoneyama T, Miyamura T, Utsumi H, Inoue K, Umeda M (2000) Membrane structure of the
hepatitis B virus surface antigen particle. J Biochem 127(4): 543-550

Sattler F, Robinson WS (1979) Hepatitis B viral DNA molecules have cohesive ends. J Virol 32(1): 226-233

Schaefer S (2005) Hepatitis B virus: significance of genotypes. J Viral Hepat 12(2): 111-124

Schaefer S (2007) Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol 13(1): 14-21

131
Schlicht HJ, Bartenschlager R, Schaller H (1989) The duck hepatitis B virus core protein contains a highly
phosphorylated C terminus that is essential for replication but not for RNA packaging. J Virol 63(7): 2995-3000

Schluter V, Meyer M, Hofschneider PH, Koshy R, Caselmann WH (1994) Integrated hepatitis B virus X and 3'
truncated preS/S sequences derived from human hepatomas encode functionally active transactivators. Oncogene
9(11): 3335-3344

Schmitt S, Glebe D, Tolle TK, Lochnit G, Linder D, Geyer R, Gerlich WH (2004) Structure of pre-S2 N- and O-
linked glycans in surface proteins from different genotypes of hepatitis B virus. The Journal of general virology
85(Pt 7): 2045-2053

Schmut N (2006) Analysis of Carboxypeptidase D-independent and -dependent steps in the duck hepatitis B virus
infection. http://wwwubuni-heidelbergde/archiv/6552

Schulze A, Gripon P, Urban S (2007) Hepatitis B virus infection initiates with a large surface protein-dependent
binding to heparan sulfate proteoglycans. Hepatology (Baltimore, Md 46(6): 1759-1768

Schwalbe M, Ohlenschlager O, Marchanka A, Ramachandran R, Hafner S, Heise T, Gorlach M (2008) Solution


structure of stem-loop alpha of the hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element. Nucleic Acids Res
36(5): 1681-1689

Sebton M (2004) Risques, Scurit sanitaire et processus de dcision. Collection Mdecine des Risques Edit par
Elsevier SAS

Seeger C, Ganem D, Varmus HE (1986) Biochemical and genetic evidence for the hepatitis B virus replication
strategy. Science 232(4749): 477-484

Seeger C, Zoulim F, Mason WS (2007) Hepadnaviruses. In D M Knipe (ed), Fields virology, 5th ed Lippincott
Williams & Wilkins, Philadelphia, PA: 2977-3030

Seifer M, Zhou S, Standring DN (1993) A micromolar pool of antigenically distinct precursors is required to initiate
cooperative assembly of hepatitis B virus capsids in Xenopus oocytes. J Virol 67(1): 249-257

Seitz S, Urban S, Antoni C, Bottcher B (2007) Cryo-electron microscopy of hepatitis B virions reveals variability in
envelope capsid interactions. EMBO J 26(18): 4160-4167

Senior JR, Sutnick AI, Goeser E, London WT, Dahlke MB, Blumberg BS (1974) Reduction of post-transfusion
hepatitis by exclusion of Australia antigen from donor blood in an urban public hospital. Am J Med Sci 267(3): 171-
177

Shaul Y, Rutter WJ, Laub O (1985) A human hepatitis B viral enhancer element. Embo J 4(2): 427-430

Shearer MH, Sureau C, Dunbar B, Kennedy RC (1998) Structural characterization of viral neutralizing monoclonal
antibodies to hepatitis B surface antigen. Mol Immunol 35(18): 1149-1160

Sheu SY, Lo SJ (1992) Preferential ribosomal scanning is involved in the differential synthesis of the hepatitis B
viral surface antigens from subgenomic transcripts. Virology 188(1): 353-357

Shibuya K, Mathers CD, Boschi-Pinto C, Lopez AD, Murray CJ (2002) Global and regional estimates of cancer
mortality and incidence by site: II. Results for the global burden of disease 2000. BMC Cancer 2: 37

Shih CH, Li LS, Roychoudhury S, Ho MH (1989) In vitro propagation of human hepatitis B virus in a rat hepatoma
cell line. Proc Natl Acad Sci U S A 86(16): 6323-6327

Shiina S, Fujino H, Kawabe T, Tagawa K, Unuma T, Yoneyama M, Ohmori T, Suzuki S, Kurita M, Ohashi Y
(1991a) Relationship of HBsAg subtypes with HBeAg/anti-HBe status and chronic liver disease. Part II: Evaluation
of epidemiological factors and suspected risk factors of liver dysfunction. Am J Gastroenterol 86(7): 872-875

Shiina S, Fujino H, Uta Y, Tagawa K, Unuma T, Yoneyama M, Ohmori T, Suzuki S, Kurita M, Ohashi Y (1991b)
Relationship of HBsAg subtypes with HBeAg/anti-HBe status and chronic liver disease. Part I: Analysis of 1744
HBsAg carriers. Am J Gastroenterol 86(7): 866-871

132
Simon K, Lingappa VR, Ganem D (1988) Secreted hepatitis B surface antigen polypeptides are derived from a
transmembrane precursor. J Cell Biol 107(6 Pt 1): 2163-2168

Sirma H, Weil R, Rosmorduc O, Urban S, Israel A, Kremsdorf D, Brechot C (1998) Cytosol is the prime
compartment of hepatitis B virus X protein where it colocalizes with the proteasome. Oncogene 16(16): 2051-2063

Sobotta D, Sominskaya I, Jansons J, Meisel H, Schmitt S, Heermann KH, Kaluza G, Pumpens P, Gerlich WH
(2000) Mapping of immunodominant B-cell epitopes and the human serum albumin-binding site in natural hepatitis
B virus surface antigen of defined genosubtype. The Journal of general virology 81(Pt 2): 369-378

Sonawane ND, Thiagarajah JR, Verkman AS (2002) Chloride concentration in endosomes measured using a
ratioable fluorescent Cl- indicator: evidence for chloride accumulation during acidification. J Biol Chem 277(7):
5506-5513

Spangenberg HC, Lee HB, Li J, Tan F, Skidgel R, Wands JR, Tong S (2001) A short sequence within domain C of
duck carboxypeptidase D is critical for duck hepatitis B virus binding and determines host specificity. J Virol
75(22): 10630-10642

Sprengel R, Kaleta EF, Will H (1988) Isolation and characterization of a hepatitis B virus endemic in herons. J Virol
62(10): 3832-3839

Sprengel R, Kuhn C, Will H, Schaller H (1985) Comparative sequence analysis of duck and human hepatitis B virus
genomes. Journal of medical virology 15(4): 323-333

Staib F, Hussain SP, Hofseth LJ, Wang XW, Harris CC (2003) TP53 and liver carcinogenesis. Hum Mutat 21(3):
201-216

Standring DN, Ou JH, Masiarz FR, Rutter WJ (1988) A signal peptide encoded within the precore region of
hepatitis B virus directs the secretion of a heterogeneous population of e antigens in Xenopus oocytes. Proc Natl
Acad Sci U S A 85(22): 8405-8409

Standring DN, Ou JH, Rutter WJ (1986) Assembly of viral particles in Xenopus oocytes: pre-surface-antigens
regulate secretion of the hepatitis B viral surface envelope particle. Proc Natl Acad Sci USA 83(24): 9338-9342

Standring DN, Rutter WJ, Varmus HE, Ganem D (1984) Transcription of the hepatitis B surface antigen gene in
cultured murine cells initiates within the presurface region. J Virol 50(2): 563-571

Stibbe W, Gerlich WH (1983) Structural relationships between minor and major proteins of hepatitis B surface
antigen. J Virol 46(2): 626-628

Stirk HJ, Thornton JM, Howard CR (1992) A topological model for hepatitis B surface antigen. Intervirology 33(3):
148-158

Stoeckl L, Funk A, Kopitzki A, Brandenburg B, Oess S, Will H, Sirma H, Hildt E (2006) Identification of a
structural motif crucial for infectivity of hepatitis B viruses. Proc Natl Acad Sci U S A 103(17): 6730-6734

Su TS, Lai CJ, Huang JL, Lin LH, Yauk YK, Chang CM, Lo SJ, Han SH (1989a) Hepatitis B virus transcript
produced by RNA splicing. J Virol 63(9): 4011-4018

Su TS, Lui WY, Lin LH, Han SH, FK Pe (1989b) Analysis of hepatitis B virus transcripts in infected human livers.
Hepatology (Baltimore, Md 9(2): 180-185

Sumi H, Yokosuka O, Seki N, Arai M, Imazeki F, Kurihara T, Kanda T, Fukai K, Kato M, Saisho H (2003)
Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease. Hepatology (Baltimore,
Md 37(1): 19-26

Summers J, Mason WS (1982) Replication of the genome of a hepatitis B--like virus by reverse transcription of an
RNA intermediate. Cell 29(2): 403-415

Summers J, O'Connell A, Millman I (1975) Genome of hepatitis B virus: restriction enzyme cleavage and structure
of DNA extracted from Dane particles. Proc Natl Acad Sci U S A 72(11): 4597-4601

133
Summers J, Smith PM, Horwich AL (1990) Hepadnavirus envelope proteins regulate covalently closed circular
DNA amplification. J Virol 64(6): 2819-2824

Summers J, Smolec JM, Snyder R (1978) A virus similar to human hepatitis B virus associated with hepatitis and
hepatoma in woodchucks. Proc Natl Acad Sci U S A 75(9): 4533-4537

Sureau C, Guerra B, Lee H (1994) The middle hepatitis B virus envelope protein is not necessary for infectivity of
hepatitis delta virus. J Virol 68(6): 4063-4066

Suzuki T, Masui N, Kajino K, Saito I, Miyamura T (1989) Detection and mapping of spliced RNA from a human
hepatoma cell line transfected with the hepatitis B virus genome. Proc Natl Acad Sci U S A 86(21): 8422-8426

Swameye I, Schaller H (1997) Dual topology of the large envelope protein of duck hepatitis B virus: determinants
preventing pre-S translocation and glycosylation. J Virol 71(12): 9434-9441

Tabor E, Purcell RH, London WT, Gerety RJ (1983) Use of and interpretation of results using inocula of hepatitis B
virus with known infectivity titers. J Infect Dis 147(3): 531-534

Takada S, Kaneniwa N, Tsuchida N, Koike K (1996) Hepatitis B virus X gene expression is activated by X protein
but repressed by p53 tumor suppressor gene product in the transient expression system. Virology 216(1): 80-89

Tang H, Oishi N, Kaneko S, Murakami S (2006) Molecular functions and biological roles of hepatitis B virus x
protein. Cancer Sci 97(10): 977-983

Tao PZ, Lofgren B, Lake-Bakaar D, Johansson NG, Datema R, Oberg B (1988) Inhibition of human hepatitis B
virus DNA polymerase and duck hepatitis B virus DNA polymerase by triphosphates of thymidine analogs and
pharmacokinetic properties of the corresponding nucleosides. Journal of medical virology 26(4): 353-362

Testut P, Renard CA, Terradillos O, Vitvitski-Trepo L, Tekaia F, Degott C, Blake J, Boyer B, Buendia MA (1996)
A new hepadnavirus endemic in arctic ground squirrels in Alaska. J Virol 70(7): 4210-4219

Thakur V, Guptan RC, Kazim SN, Malhotra V, Sarin SK (2002) Profile, spectrum and significance of HBV
genotypes in chronic liver disease patients in the Indian subcontinent. J Gastroenterol Hepatol 17(2): 165-170

Thorgeirsson SS, Grisham JW (2002) Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Nat Genet 31(4):
339-346

Thung SN, Wang DF, Fasy TM, Hood A, Gerber MA (1989) Hepatitis B surface antigen binds to human serum
albumin cross-linked by transglutaminase. Hepatology (Baltimore, Md 9(5): 726-730

Tiollais P, Wain-Hobson S (1984) In Chisari, FV (ed), Advances in Hepatitis B Research Masson Publishing, New
York, NY: 9-20

Tong S, Li J, Wands JR (1995) Interaction between duck hepatitis B virus and a 170-kilodalton cellular protein is
mediated through a neutralizing epitope of the pre- S region and occurs during viral infection. J Virol 69(11): 7106-
7112

Tong SP, Diot C, Gripon P, Li J, Vitvitski L, Trepo C, Guguen-Guillouzo C (1991) In vitro replication competence
of a cloned hepatitis B virus variant with a nonsense mutation in the distal pre-C region. Virology 181(2): 733-737

Torresi J (2002) The virological and clinical significance of mutations in the overlapping envelope and polymerase
genes of hepatitis B virus. J Clin Virol 25(2): 97-106

Treichel U, Meyer zum Buschenfelde KH, Dienes HP, Gerken G (1997) Receptor-mediated entry of hepatitis B
virus particles into liver cells. Arch Virol 142(3): 493-498

Treichel U, Zumbuschenfelde KHM, Stockert RJ, Poralla T, Gerken G (1994) The asialoglycoprotein receptor
mediates hepatic binding and uptake of natural hepatitis B virus particles derived from viraemic carriers. The
Journal of general virology 75( Part 11): 3021-3029

Tsubota A, Arase Y, Ren F, Tanaka H, Ikeda K, Kumada H (2001) Genotype may correlate with liver
carcinogenesis and tumor characteristics in cirrhotic patients infected with hepatitis B virus subtype adw. Journal of
medical virology 65(2): 257-265

134
Tur-Kaspa R, Burk RD, Shaul Y, Shafritz DA (1986) Hepatitis B virus DNA contains a glucocorticoid-responsive
element. Proc Natl Acad Sci U S A 83(6): 1627-1631

Tur-Kaspa R, Shaul Y, Moore DD, Burk RD, Okret S, Poellinger L, Shafritz DA (1988) The glucocorticoid receptor
recognizes a specific nucleotide sequence in hepatitis B virus DNA causing increased activity of the HBV enhancer.
Virology 167(2): 630-633

Tuttleman JS, Pourcel C, Summers J (1986) Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in
hepadnavirus-infected cells. Cell 47(3): 451-460

Twu JS, Schloemer RH (1987) Transcriptional trans-activating function of hepatitis B virus. J Virol 61(11): 3448-
3453

Ueda K, Tsurimoto T, Matsubara K (1991) Three envelope proteins of hepatitis B virus: large S, middle S, and
major S proteins needed for the formation of Dane particles. J Virol 65(7): 3521-3529

Urban S (2004) Binding of duck carboxypeptidase D to duck hepatitis B virus. Methods Mol Med 95: 199-212

Urban S, Breiner KM, Fehler F, Klingmuller U, Schaller H (1998) Avian hepatitis B virus infection is initiated by
the interaction of a distinct pre-S subdomain with the cellular receptor gp180. J Virol 72(10): 8089-8097

Urban S, Gripon P (2002) Inhibition of duck hepatitis B virus infection by a myristoylated pre-S peptide of the large
viral surface protein. J Virol 76(4): 1986-1990

Urban S, Kruse C, Multhaup G (1999) A soluble form of the avian hepatitis B virus receptor. Biochemical
characterization and functional analysis of the receptor ligand complex. J Biol Chem 274(9): 5707-5715

Urban S, Schwarz C, Marx UC, Zentgraf H, Schaller H, Multhaup G (2000) Receptor recognition by a hepatitis B
virus reveals a novel mode of high affinity virus-receptor interaction. EMBO J 19(6): 1217-1227

van Hemert FJ, Zaaijer HL, Berkhout B, Lukashov VV (2008) Mosaic amino acid conservation in 3D-structures of
surface protein and polymerase of hepatitis B virus. Virology 370(2): 362-372

Vaudin M, Wolstenholme AJ, Tsiquaye KN, Zuckerman AJ, Harrison TJ (1988) The complete nucleotide sequence
of the genome of a hepatitis B virus isolated from a naturally infected chimpanzee. The Journal of general virology
69 ( Pt 6): 1383-1389

Visvanathan K, Lewin SR (2006) Immunopathogenesis: role of innate and adaptive immune responses. Semin Liver
Dis 26(2): 104-115

von Weizsacker F, Kock J, MacNelly S, Ren S, Blum HE, Nassal M (2004) The tupaia model for the study of
hepatitis B virus: direct infection and HBV genome transduction of primary tupaia hepatocytes. Methods Mol Med
96: 153-161

von Weizsacker F, Wieland S, Blum HE (1995) Identification of two separable modules in the duck hepatitis B
virus core protein. J Virol 69(4): 2704-2707

Walter E, Keist R, Niederost B, Pult I, Blum HE (1996) Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro
and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md 24(1): 1-5

Wang GH, Seeger C (1993) Novel mechanism for reverse transcription in hepatitis B viruses. J Virol 67(11): 6507-
6512

Wang J, Lee AS, Ou JH (1991) Proteolytic conversion of hepatitis B virus e antigen precursor to end product occurs
in a postendoplasmic reticulum compartment. J Virol 65(9): 5080-5083

Wang X, Grammatikakis N, Hu J (2002) Role of p50/CDC37 in hepadnavirus assembly and replication. J Biol
Chem 277(27): 24361-24367

Waris G, Siddiqui A (2003) Regulatory mechanisms of viral hepatitis B and C. J Biosci 28(3): 311-321

135
Warren KS, Heeney JL, Swan RA, Heriyanto, Verschoor EJ (1999) A new group of hepadnaviruses naturally
infecting orangutans (Pongo pygmaeus). J Virol 73(9): 7860-7865

Watanabe T, Sorensen EM, Naito A, Schott M, Kim S, Ahlquist P (2007) Involvement of host cellular
multivesicular body functions in hepatitis B virus budding. Proc Natl Acad Sci U S A 104(24): 10205-10210

Wei Y, Fourel G, Ponzetto A, Silvestro M, Tiollais P, Buendia MA (1992) Hepadnavirus integration: mechanisms
of activation of the N-myc2 retrotransposon in woodchuck liver tumors. J Virol 66(9): 5265-5276

Wei Y, Tavis JE, Ganem D (1996) Relationship between viral DNA synthesis and virion envelopment in hepatitis B
viruses. J Virol 70(9): 6455-6458

Weller IV, Carreno V, Fowler MJ, Monjardino J, Makinen D, Thomas HC, Sherlock S (1982) Acyclovir inhibits
hepatitis B virus replication in man. Lancet 1(8266): 273

Werr M, Prange R (1998) Role for calnexin and N-linked glycosylation in the assembly and secretion of hepatitis B
virus middle envelope protein particles. J Virol 72(1): 778-782

WHO (1991) Rapport du 14me Groupe consultatif mondial. WHO/EPI/GEN/921

WHO (1993) Rapport d'activits pour l'anne 1992. Englobant les recommandations formules par le groupe
consultatif mondial en octobre 1992. WHO/EPI/GEN/931

WHO. (2002) Hepatitis B. In response Docdsa (ed.), WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:Hepatitis B, Vol.


http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf.

WHO (2004) Comit consultatif mondial sur la scurit des vaccins de l'Organisation mondiale de la Sant: rponse
l'article de Hernn et al. intitul "Vaccin Hpatite B recombinant et risque de sclrose en plaques" et publi le 14
septembre 2004 dans la revue Neurology.

WHO (2008) Hpatite B. Aide mmoire Mise jour en 2008 204

Will H, Reiser W, Weimer T, Pfaff E, Buscher M, Sprengel R, Cattaneo R, Schaller H (1987) Replication strategy
of human hepatitis B virus. J Virol 61(3): 904-911

Wilson IA, Skehel JJ, Wiley DC (1981) Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus
at 3 A resolution. Nature 289(5796): 366-373

Wingfield PT, Stahl SJ, Williams RW, Steven AC (1995) Hepatitis core antigen produced in Escherichia coli:
subunit composition, conformational analysis, and in vitro capsid assembly. Biochemistry 34(15): 4919-4932

Wollersheim M, Debelka U, Hofschneider PH (1988) A transactivating function encoded in the hepatitis B virus X
gene is conserved in the integrated state. Oncogene 3(5): 545-552

Wounderlich G, Bruss V (1996) Characterization of early hepatitis B virus surface protein oligomers. Arch Virol
141(7): 1191-1205

Wu HL, Chen PJ, Tu SJ, Lin MH, Lai MY, Chen DS (1991) Characterization and genetic analysis of alternatively
spliced transcripts of hepatitis B virus in infected human liver tissues and transfected HepG2 cells. J Virol 65(4):
1680-1686

Wu TT, Coates L, Aldrich CE, Summers J, Mason WS (1990) In hepatocytes infected with duck hepatitis B virus,
the template for viral RNA synthesis is amplified by an intracellular pathway. Virology 175(1): 255-261

Wynne SA, Crowther RA, Leslie AG (1999) The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid. Mol Cell
3(6): 771-780

Xu Z, Bruss V, Yen TS (1997a) Formation of intracellular particles by hepatitis B virus large surface protein. J
Virol 71(7): 5487-5494

Xu Z, Jensen G, Yen TS (1997b) Activation of hepatitis B virus S promoter by the viral large surface protein via
induction of stress in the endoplasmic reticulum. J Virol 71(10): 7387-7392

136
Yaginuma K, Shirakata Y, Kobayashi M, Koike K (1987) Hepatitis B virus (HBV) particles are produced in a cell
culture system by transient expression of transfected HBV DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 84(9): 2678-2682

Yamaguchi M, Sugahara K, Shiosaki K, Mizokami H, Takeo K (1998) Fine structure of hepatitis B virus surface
antigen produced by recombinant yeast: comparison with HBsAg of human origin. FEMS Microbiol Lett 165(2):
363-367

Yamamura K, Araki K, Hino O, Tomita N, Miyazaki J, Matsubara K (1990) HBV production in transgenic mice.
Gastroenterol Jpn 25 Suppl 2: 49-52

Yang HI, Lu SN, Liaw YF, You SL, Sun CA, Wang LY, Hsiao CK, Chen PJ, Chen DS, Chen CJ (2002) Hepatitis B
e antigen and the risk of hepatocellular carcinoma. N Engl J Med 347(3): 168-174

Yang W, Guo J, Ying Z, Hua S, Dong W, Chen H (1994) Capsid assembly and involved function analysis of twelve
core protein mutants of duck hepatitis B virus. J Virol 68(1): 338-345

Yee JK (1989) A liver-specific enhancer in the core promoter region of human hepatitis B virus. Science 246(4930):
658-661

Yeh CT, Liaw YF, Ou JH (1990) The arginine-rich domain of hepatitis B virus precore and core proteins contains a
signal for nuclear transport. J Virol 64(12): 6141-6147

Yeh CT, Ou JH (1991) Phosphorylation of hepatitis B virus precore and core proteins. J Virol 65(5): 2327-2331

Ying C, Van Pelt JF, Van Lommel A, Van Ranst M, Leyssen P, De Clercq E, Neyts J (2002) Sulphated and
sulphonated polymers inhibit the initial interaction of hepatitis B virus with hepatocytes. Antivir Chem Chemother
13(3): 157-164

Yoshimori T, Yamamoto A, Moriyama Y, Futai M, Tashiro Y (1991) Bafilomycin A1, a specific inhibitor of
vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol
Chem 266(26): 17707-17712

Yu M, Summers J (1991) A domain of the hepadnavirus capsid protein is specifically required for DNA maturation
and virus assembly. J Virol 65(5): 2511-2517

Yu M, Summers J (1994) Phosphorylation of the duck hepatitis B virus capsid protein associated with
conformational changes in the C terminus. J Virol 68(5): 2965-2969

Yuen MF, Sablon E, Yuan HJ, Wong DK, Hui CK, Wong BC, Chan AO, Lai CL (2003) Significance of hepatitis B
genotype in acute exacerbation, HBeAg seroconversion, cirrhosis-related complications, and hepatocellular
carcinoma. Hepatology (Baltimore, Md 37(3): 562-567

Yuh CH, Ting LP (1990) The genome of hepatitis B virus contains a second enhancer: cooperation of two elements
within this enhancer is required for its function. J Virol 64(9): 4281-4287

Zahn A, Allain JP (2005) Hepatitis C virus and hepatitis B virus bind to heparin: purification of largely IgG-free
virions from infected plasma by heparin chromatography. The Journal of general virology 86(Pt 3): 677-685

Zhang X, Zhang H, Ye L (2006) Effects of hepatitis B virus X protein on the development of liver cancer. J Lab
Clin Med 147(2): 58-66

Zheng YW, Riegler J, Wu J, Yen TS (1994) Novel short transcripts of hepatitis B virus X gene derived from
intragenic promoter. J Biol Chem 269(36): 22593-22598

Zhou DX, Yen TS (1990) Differential regulation of the hepatitis B virus surface gene promoters by a second viral
enhancer. J Biol Chem 265(34): 20731-20734

Zhou S, Yang SQ, Standring DN (1992) Characterization of hepatitis B virus capsid particle assembly in Xenopus
oocytes. J Virol 66(5): 3086-3092

Zhu Y, Yamamoto T, Cullen J, Saputelli J, Aldrich CE, Miller DS, Litwin S, Furman PA, Jilbert AR, Mason WS
(2001) Kinetics of hepadnavirus loss from the liver during inhibition of viral DNA synthesis. J Virol 75(1): 311-322

137
Zlotnick A, Cheng N, Stahl SJ, Conway JF, Steven AC, Wingfield PT (1997) Localization of the C terminus of the
assembly domain of hepatitis B virus capsid protein: implications for morphogenesis and organization of
encapsidated RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 94(18): 9556-9561

Zlotnick A, Palmer I, Kaufman JD, Stahl SJ, Steven AC, Wingfield PT (1999) Separation and crystallization of T =
3 and T = 4 icosahedral complexes of the hepatitis B virus core protein. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55(Pt
3): 717-720

138
VU : VU :

Le Directeur de Thse Le Responsable de lEcole Doctorale


(Nom et Prnom)

VU pour autorisation de soutenance

Rennes, le

Le Prsident de lUniversit de Rennes 1

Guy CATHELINEAU

VU aprs soutenance pour autorisation de publication :

Le Prsident du Jury,
(Nom et Prnom)

139
R ESUMES

Le virus de lhpatite B (VHB) est un agent pathogne humain, trs contagieux,


responsable de pathologies hpatiques telles que la cirrhose ou le carcinome hpatocellulaire. A
l'heure actuelle, on estime que 2 milliards de personnes ont t infectes par ce virus dans le
monde, parmi lesquelles on recense 350 millions de porteurs chroniques. Malgr lexistence dun
vaccin efficace, le nombre de personnes atteintes par la maladie reste lev. Pour ces dernires,
des traitements puissants existent consistant en lutilisation dinterfrons, efficaces dans 30
40% des cas, ou dantiviraux dont linconvnient majeur est la slection de virus rsistants au
traitement. Le mcanisme d'entre du VHB dans les hpatocytes est encore inconnu. Dans ce
contexte, l'objectif de ma thse a t d'tudier ce mcanisme afin, notamment, de contribuer au
dveloppement de nouvelles thrapeutiques empchant l'entre virale. Une des approches
utilises pour tudier le processus dentre dun virus consiste tudier limplication de ses
protines de surface dans ce phnomne. Ainsi, nous avons recherch la prsence de motifs
indispensables au processus d'infection dans ces protines. Pour cela, nous y avons introduit des
mutations puis nous avons analys leur impact sur la capacit des virus infecter des cellules
saines. Cette stratgie nous a permis didentifier, au sein de la grande protine de surface du
VHB, un nouveau dterminant de linfectivit possiblement impliqu dans un processus de
fusion permettant lenveloppe lipoprotique virale de fusionner avec une membrane cellulaire
afin quelle libre sa nuclocapside, contenant lADN viral, dans le cytoplasme de la cellule
infecte.

The hepatitis B virus is an extremely contagious human pathogen responsible for severe
hepatic diseases like cirrhosis or hepatocellular carcinoma. Even though infection can be
prevented by immunization with an efficient vaccine, about 2 billion people have been infected
worldwide, resulting in 350 million chronic carriers that are prone to develop liver diseases.
Current treatments consist either in the use of interferon, which modulates antiviral defenses and
controls infection in 30 to 40% of cases, or in the use of viral polymerase inhibitors that allow a
stronger response to treatment but require long-term utilization and frequently lead to the
outcome of resistant viruses. A better understanding of the virus life cycle, and particularly of
the mechanism by which the virus enters the cell, could provide background for therapeutics that
inhibit the early steps of infection. Then, the objective of my PhD work was to study the
mechanism of HBV entry. One approach to decipher viral entry is to interfere with the function
of envelope proteins. Therefore, we introduced mutations in HBV surface proteins to identify
new motives necessary for viral infectivity. This strategy highlighted the role of a new infectivity
determinant, in the HBV large envelope protein, which is probably implicated in a fusion process
allowing the release of nucleocapsids into the cytosol of infected cells.

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