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Microbiologie Biologie des µorganismes

!bactéries !levures, moisissures, champignons


procaryotes (mycètes)
2 groupes taxonomiques !algues
Physiologie bactérienne eubactéries
archées
!protozoaires (amibes, parasites)
eucaryotes inférieurs (protistes)
appliquée
à l’identification

Sophie Bleves
bleves@imm.cnrs.fr

Comment observer les bactéries? Microscopie optique

Etat frais Fixation + Coloration


c épithéliales (35!m) GR (8!m) Bactéries (1!m) Virus (10-100nm)
1 000 b sur 1 mm
Bleu de méthylène

- microscopie optique (G 1 000-1 500 fois) bactéries d’un frottis


de yaourt
- microscopie électronique (G >10 000 fois)

Contraste de phase

Encre de chine!

Acinetobacter
(cocci isolés ou en chaîne
entourés d’une capsule)
E. coli
Formes différentes selon les espèces Coloration de Gram

coques bacilles sprirales

épaisse couche de PG fine couche relâchée de PG (7 à 8 nm) dans le


périplasme + membrane externe

Peptidoglycane: réseau de
sphériques
longues chaînes polysaccharides
pontées par peptides
bâtonnets fuseau

incurvées

Coloration de Gram

épaisse couche de PG fine couche dans le périplasme relâchée+ membrane externe

Gram - Gram +
Mb externe
(bicouche asymétrique
phospholipides et LPS)

Peptidoglycane Périplasme

Membrane plasmique ou Mb interne


(bicouche symétrique de
phospholipides)
Autres colorations Microscopie électronique

Coloration spores
(vert de malachite, contre Coloration flagellaire
coloration fushine) (Leifson, fuschine basique)
Bacillus thuringiensis Vibrio

Microscopie électronique à balayage


E. coli x30 000

Microscopie électronique à transmission


E. coli

Identification de bactéries Identification de bactéries

Echantillon Enrichissement Identification


- biologique (sang, urines...) Isolement (culture pure)
- eaux
- aliments
- environnement

?
Echantillon -------------------------> Identification -…

Il existe de nombreuses espèces bactériennes, qu’on peut classer d’après


quelques critères fondamentaux :
- morphologie des colonies
- forme & taille des cellules
- coloration GRAM
- quelques caractères biochimiques simples d’orientation
- mode respiratoire
- mobilité
Les milieux de culture

Croissance et maintien des µorganismes en laboratoire


- aliments essentiels (acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres…),
- éléments minéraux : fer, phosphore, soufre, magnésium,....
-facteurs de croissance (sang, protéines, vitamines)

Système tampon pour éviter les variations importantes du pH

Milieu liquide ou semi-solide ou solide (agar)

1-milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue (croissance de


la plupart des µorganismes)
peptones (hydrolysats de protéines à partir digestion viande, caséine, soja,
gélatine....) = source C et énergie

ex LB (Luria Broth), bouillon au soja

2-milieux synthétiques (ou minimums)


composés chimiques purs (phosphate, azote, soufre....) en solution dans l’eau
ex milieu M9

Morphologie des colonies


Une espèce dans l’échantillon Plusieurs espèces dans l’échantillon
1- Enrichir 1- Isoler la bactérie d’intérêt
Couleur
2-Enrichir

Aspect (sec, gras, transparent…)

--> Morphologie des colonies


Les types de milieux de culture La température peut être sélective

Milieux solides pour l’isolement


liquides pour culture de bactéries pures ou lors d’infection monoµbienne Serratia marcescens
60°C E. coli
!: bactéries incultivables (Mycobacterium leprae: intracellulaire obligatoire) 37°C Bacillus stearothermophilus
4°C
1- milieux sélectifs empêchent la croissance de certaines bactéries et favorisent
la croissance de celles d’intérêt = SELECTION
ex Antibiotique
Drigalski (cristal violet) : croissance G-
SS (sels biliaires) : croissance Salmonella, Shigella Thermophiles
Chapman (75% NaCl) : croissance Staphylococcus Mésophiles Extrêmophiles
Pshycrophiles

E. coli et Proteus mirabilis S. aureus


(Drigalski) (Chapman) Antibiogramme
(inhibition croissance)

test catalase (addition H2O2 ) test uréase!:


Les types de milieux de culture +: dégagement H2 Production NH3 --> "pH (indicateur
coloré, rouge de phénol)
2- milieux différentiels: distinction de différents groupes de bactéries
(caractéristiques biologiques) = IDENTIFICATION

Mee propriétés biochimiques d'une bactérie pour commencer à l'identifier: étude


du métabolisme respiratoire, des glucides, des protéines, des lipides....
milieu jaune d’oeuf!: hydrolyse des lipides
E. coli -
Utilisation du Lactose
MacConkey utilisation --> "pH
(indicateur coloré, rouge neutre) E. coli - Proteus vulgaris +

Caractère fermentaire (2 &3) ou oxydatif (1)


Dégradation Glu -->déchets acides (indicateur de pH, rouge de phénol)
Production soit de CO2 soit de CO2 et H2 (insoluble) Bacillus +
gélose au sang!: bactéries hémolytiques ou
non
Alcaligenes -
Lac+ (colonies rouges) mobilité (0,5% agar)

E. coli - S. aureus +

Fermentation - +- + + +
Lac- (colonies incolores) Production H2 - - - + +
Effet de l’oxygène Tests d’identification en microméthode
Galerie API20-E (Biomérieux)

- activité fermentaire est révélée avec un milieu type contenant un sucre, un


indicateur coloré des changements de pH (fermentation sucre " pH)

1 3 2 4

+ O2 + O2 Effet de l’O2 Exemples


Aérobie strict + - Accepteur final d’électrons lors Pseudomonas, Acinetobacter,
- milieux de culture dont la composition permet de mee une activité enzymatique: ß-
(1) respiration aérobie (réduit en eau) Neisseria
galactosidase (ONPG), lysine décarboxylase (LDC), ornithine décarboxylase (ODC), uréase
(URE)
Microaérophile +- - Nécessaire à < 0,2 atm (PP < celle air) Campylobacter, Mycobacteriaceae
(3)
Aéro-anaérobie + + Pas nécessaire, mais utilisé (switch) Entérobactéries (Escherichia,
facultatif (2) (oxydation des substrats et fermentation) Salmonella), streptocoques,
staphylocoques
Anaérobie Pas nécessaire, non utilisé (fermentation)
aérotolérant + +

Toxique (fermentation, respiration Bactéries intestinales (Bacteroides,


Anaérobie anaérobie, photosynthèse) Fusobacterium, Clostridium) et flore
strict (4) - + Culture sous atmosphère réductrice commensale

Systèmes automatisés
Identification de bactéries

plus sensibles
mesures photométriques en continu Echantillon Enrichissement Identification
--> identification des principales bactéries isolées en pratique médicale en moins de 5 h
- biologique (sang, urines...) Isolement sur culture pure
- eaux
- aliments
--environnement…

caractères morphologiques

caractères physiologiques et métaboliques

caractéristiques moléculaires :
- composition en bases des AN (GC%)
- amplification-séquençage gène codant ARN16S
(phylogénie moléculaire : appareils de traduction sont
très conservés, non échangés par transferts
horizontaux)
- comparaison de protéines (séquençage, Ac)
Caractères biochimiques simples

Catalase (+ ou -)
G-

G+ Oxydase (+ ou -)

Coagulase (+ ou -)

12 groupes de bactéries Indole (+ ou -)

Utilisation des sucres (fermentation on non)


Thiobacillus Desulfovibrio
Enterobacteria Activité enzymatique ou non (uréase, gélatinase, nitrate réductase…)
Agrobacterium Pseudomonads Helicobacter
Production d’H2S …..

Tous ces caractères permettent d’obtenir une identification de plus en plus


précise, et finalement exacte de la bactérie

Gram +

Gram-
Proteobacteria

Gram + En amas : Staphylocoques


Coques Gram + (grappe de raisins)

Commensaux (peau, muqueuses, tube digestif)

En chaînettes: Streptocoques, entérocoques


Staphylococcus aureus
(supuration, septicémie)

En diplocoques: Pneumocoques

Streptococcus pyogenes
(angine, scarlatine)

Streptococcus pneumoniae
(otite, pneumonie, méningite)
Bacilles Gram +
Gram -
Listeria monocytogenes
(méningite, avortement)

Clostridium difficile
(diarrée post antibiotique)

Bacillus anthracis
(maladie du charbon,
herbivores transmissible à
l’homme)

Coques Gram - Gram -

Neisseria meningitidis (méningocoque: méningite, septicémie) Entérobactéries

Neisseria gonorrhoe (gonocoque, MST)


Bacilles Gram - Autres genres importants en pathologie humaine

2 familles importantes en pathologie humaine :


Mycobactéries
Les entérobactéries (Enterobacteriacae) Bacilles acido-alcoolo résistants ou «BAAR»
Les Pseudomonas (Pseudomonacae) Gram impossible --> coloration : Ziehl Nielsen

E. coli - commensal (infection urinaire) Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch)
- ETEC, EHEC, EIEC (gastro, speticémie) Burkholderia Mycobacterium leprae
Salmonella (infection digestive simple à fièvre thyphoïde) Pathogènes opportunistes
Shigella dysenteriae (infection digestive mineure à grave- (infections nosocomiales et
mucoviscidose)
Yersinia pestis

Spirochètes
Treponema pallidum (syphilis)

Vibrio cholerae (eau, épidémie Choléra) Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme, morsure tique)
Bordetella pertussis (coqueluche)

Germes intracellulaires : exemples

Mycoplasma pneumoniae

Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis (MST)

Rickettsia conorii (fièvre boutonneuse-tiques-)


Rickettsia typhi (typhus -puces et poux)

Bartonella henselae: maladie des griffes du chat