Cinétique Enzymatique

1 BUT................................................................................................................................................. 2

2 INTRODUCTION ............................................................................................................................ 2

3 PARTIE EXPÉRIMENTALE ........................................................................................................... 4

4 MODE OPÉRATOIRE .................................................................................................................... 4

4.1 GRAPHIQUES............................................................................................................................ 6
4.1.1 Michaelis Menten .................................................................................. 6
4.1.2 Lineweaver Burk Plot ............................................................................ 7
5 CALCUL DES ERREURS EXPÉRIMENTALES............................................................................ 8

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1 But
Etude de la cinétique d'un réaction catalysée par une enzyme contenue de manière
naturelle dans la papaie: la papaine

2 Introduction
Une réaction catalysée par une enzyme E suit le mécanisme réactionnel suivant pour
le substrat S :

K1 K2
S + E ⇐------------⇒ ES ------------⇒ E + P
K-1

La vitesse de formation du produit P est donnée par:

V0=dIPI = K2 • lESl (A)

dt

L'hypothèse de l'état stationnaire pour ES conduit à dIESI = 0 et donc

dt
K1 • lEl • lSl= ( K-1 • K2) • IESI (B)

En remplaçant B dans A :

V0 = K1 • K2 • IEI • lSl = K2 • lEI • lSI (C)

K-1+K2 Km

La constante de Michaelis-Menten vaut :

Km= K-1 + K2 et a pour unité : [M]

K1

Expérimentalement seule la concentration totale en enzyme peut être

Déterminée :

lEtotl=IEI + lESl (D)

En introduisant C dans D :

l Etot l = l E l • (1+ K1 • ISI) = I E I • (1+ ISI )

K-1+ K2 Km

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La fraction libre en enzyme IE I vaut donc

IE I = IEtotI • Km (E)
Km+ISI

La substitution de E dans C mène à l'équation:

V0 = d lPl = K2 • l Etot l • ISI (A)

Dt Km+ISI

-La vitesse de formation du produit est proportionnelle à la concentration de l'enzyme

mais elle dépend de la concentration en substrat de façon plus complexe.

-Si Km<< I S I, V0= K2 • IEtotI = Vmax

La vitesse est d'ordre zéro en substrat et ne dépend plus de sa concentration. Elle
correspond à la vitesse maximale de la réaction enzymatique => Ce qui donne
l'équation de Michaelis-Menten :

V0=Vmax • I S I
Km+ISI

La représentation « Lineweaver-Burk plot »obtenue à partir de l'inverse de l'équation

précédente correspond à une linéarisation de la relation entre Km et Vmax.

1 =1/ ( Vmax • I S I ) = Km • 1 + 1
V0 Km+ISI Vmax ISI Vmax

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A propos de la papaine

C'est une protéase, une enzyme qui peut casser une liaison peptidique par
hydrolyse. Elle se trouve dans la papaye et est utilisée dans nombreuses
applications. (industrie de la bière, nettoyage des lentilles de contact)

3 Partie expérimentale

Le substrat est la Nα-benzyl-arginine-p-nitroanilide (BAPNA), une arginine

synthétique qui est une molécule plus simple qu'une protéine. Son hydrolyse va
casser sa liaison amide et générer un produit de couleur jaune intense : la p-
nitroaniline. Puisque le substrat et le deuxième produit sont incolores, l'évolution de
la réaction peut être étudiée grâce à l'absorption optique de la p-nitroaniline en
fonction du temps.

4 Mode opératoire
5 solutions de concentrations différentes en BAPNA sont réalisées afin de réaliser un
« Lineweaver-Burk plot ».

Ici la relation C1 • V1 = C2 • V2 est utilisée. C1 = 0.02M et V2 = 5 [ml]

Solution n° 5 [mI] (V2) de BAPNA V1 en [ml] de solution mère BAPNA 0.02[M]

C2 en [M]
1 0.003 0.75
2 0.005 1.25
3 0.008 2
4 0.012 3
5 0.016 4

L’appareil est calibré avec un blanc contenant 2.5 [ml] de solution d’enzyme
tamponné à pH 6 qui permet de régler le zéro de l'absorbance à 400[nm]. La cuvette
suivante contient comme le blanc plus 0.5 [ml] de solution n°1 qui sont ajoutés juste
avant d'utiliser le spectromètre puisque la réaction commence dès la présence de
substrat. L'absorption à 400[nm] est suivie pendant 5 minutes. Le contenu des
éprouvettes est au préalable bien mélangé en les couvrant avec un parafilm de
manière a obtenir un mélange homogène. L'expérience est répétée pour les
solutions 2,3,4,5 ainsi que pour la solution mère de 0.02[M].

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Résultats

-Le pH de la solution de l'enzyme est égal à 6.

-La température du laboratoire est de 22°C.
-Le coefficient d'extinction molaire de la p-nitroaniline à 400[nm] est trouvé égale à

Conc. Conc. 1/Conc. 1/Conc.

Solution Pente 1/V0
BAPNA BAPNA BAPNA V0 [M/min] BAPNA
n° [A/min] [min/M]
initiale M cuvette M cuvette M-1 cuvette M

1 0.003 5.00E-04 2000 0.0102 1.020E-06 9.804E+05 2000

2 0.005 8.33E-04 1200 0.0196 1.960E-06 5.102E+05 1200
3 0.008 1.33E-03 750 0.0314 3.140E-06 3.185E+05 750
4 0.012 2.00E-03 500 0.0462 4.620E-06 2.165E+05 500
5 0.016 2.67E-03 375 0.0577 5.770E-06 1.733E+05 375
Mère 0.02 3.33E-03 300 0.0697 6.970E-06 1.435E+05 300

- I BAPNA Icuvette=Vpris = 0.25 • l BAPNAIinitiale

Vtotal

exemple de calcul IBAPNAIcuvette pour la solution 1 :

IBAPNAIcuvette= 0.5[ml] • 0.003 M = 5 • 10-4 M

3[ml]
Pour chaque mesure de l'absorption en fonction du temps, la détermination de
la pente permet de trouver la vitesse initiale V0 selon :

pente dA => V0 = dA • 1 = pente

dt dt εI εI

A= ε • I • c
l= 1 cm
ε= 104AM-1cm-1
exemple de calcul pour la solution 1 :

V0 = 0.0102 [Amin-1] / (104[AM-1cm-1] • 1[cm]) = 1.02 • 10-6 [M/min]

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4.1 Graphiques

4.1.1 Michaelis Menten

Le graphique ci-dessous exprime la vitesse de réaction V0 en fonction de la

concentration de substrat.

Cinétique de Michaelis Menten Série1

Polynomial (Série1)
8.00E-06
y = -0.2078x2 + 0.0029x - 3E-07
7.00E-06
R2 = 0.9995
6.00E-06

5.00E-06
V0

4.00E-06

3.00E-06

2.00E-06

1.00E-06

0.00E+00
4.00E- 9.00E- 1.40E- 1.90E- 2.40E- 2.90E- 3.40E-
04 04 03 03 03 03 03
[BAPNA]cuvette

On devrait observer une forme plus marquée de 2ème degré ce qui n’est pas le cas
dans ces concentrations.

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L'équation du graphe ci-dessous est :

1 = Km 1 + 1
V0 Vmax IBAPNAIcuvette Vmax

Les points qui coupent les axes permettent de trouver les constantes de
Michaelis-Menten :

4.1.2 Lineweaver Burk Plot

Lineweaver Burk Plot Série1

Linéaire (Série1)
2000
y = 0.002x + 61.463
2
R = 0.9909
1500
1/Vo

1000

500

0
0.E+00 2.E+05 4.E+05 6.E+05 8.E+05 1.E+06 1.E+06
1/[BAPNA]

y = 0.002x + 61.463 =0 ⇨ x=- 30269

-1/Km = -30269 ⇨ Km = 3.3 • 10-5

1/Vmax = 61.463 ⇨ Vmax = 1.63 10-2

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5 Calcul des erreurs expérimentales
L'erreur sur les concentrations dans les cuvettes provient de l'erreur commise sur la
préparation des solutions initiales qui se calcule selon

IBAPNA I initiale = Cmère • Vi

Vf

=>∆ IBAPNAI initiale = ∆ Cmère Vi + ∆ Vi Cmère + Cmère Vi (∆Vf = ∆ Vi+ ∆ Vrajouté )

Vf Vf Vf2

ou en sachant que Ln IBAPNAI initiale = Ln C mère + LnVi- LnVf

⇒% d' erreur = ∆ IBAPNAI initiale =∆C mère + ∆Vi + ∆ Vi +∆ Vrajouté

IBAPNAI initiale C mère Vi Vf

Ces deux démarches mathématiques donnent les mêmes valeurs pour ∆ IBAPNAI

Tableau des résultats selon calcul ci-dessus :

Solution Cinitial "+/-" Vi ∆Vi ∆ Vrajouté Vrajouté

n°
%
en M en M [ml] [ml] [ml] [ml] d’erreur
1 0.003 9.80E-05 0.75 0.02 0.01 4.25 3.267%
2 0.005 2.10E-04 1.25 0.04 0.01 3.75 4.200%
3 0.008 1.28E-04 2 0.02 0.01 3 1.600%
4 0.012 1.52E-04 3 0.02 0.01 2 1.267%
5 0.016 3.20E-04 4 0.04 0.01 1 2.000%

Calcul d’erreur sur 1/[BAPNA] :

∆A = ∆S/S2 ⇨ ∆A = 9.8 * 10-5/(0.003)2 = 10.9

Conc. "+/-"
BAPNA
cuvette M
M ∆S S2 ∆S/S2
5.00E-04 9.80E-05 9.80E-05 2.50E-07 392.0
8.33E-04 2.10E-04 2.10E-04 6.94E-07 302.4
1.33E-03 1.28E-04 1.28E-04 1.78E-06 72.0
2.00E-03 1.52E-04 1.52E-04 4.00E-06 38.0
0.00267 3.20E-04 3.20E-04 7.11E-06 45.0

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