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Chantier 2 :

Du prélèvement à l’analyse, vers une approche


multicontaminants

Délivrables 2.1, 2.2, 2.3 et 2.4


Recueil des méthodes d’analyse, modalités de
prélèvement des échantillons végétaux,
protocoles de traitement et de conservation des
échantillons

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1) Recueil de méthodes de prélèvement des végétaux

Une recherche bibliographique a permis de recenser différents protocoles de prélèvement de végétaux. Ces
protocoles ont été établis par des instituts et présentent les modalités de prélèvement des céréales (nombre de
plantes à prélever, localisation des placettes et sous placettes…) ainsi que la préparation des échantillons (séchage,
broyage). Cf. définitions en Annexe 1.

Ces protocoles ont été rassemblés sous forme de tableau comparatif donné en Annexe 2.

Certains protocoles proposent des paramètres de prélèvement basés sur des dimensions données de placettes,
indépendantes de la taille de la parcelle et donnant un nombre défini de sous placettes et de plantes identiques pour
chaque campagne de prélèvement. D’autres proposent au contraire des placettes de prélèvement de dimensions
non fixées et une répartition aléatoire des plantes à prélever.

A partir de ce recensement, il a été décidé de tester deux protocoles (voir ci-après).

2) Protocole d’échantillonnage de plantes

Les protocoles retenus sont le protocole du RMQS et le protocole PGM.

Le protocole du RMQS (Réseau des Mesure de la Qualité du Sol) est initialement prévu pour un prélèvement de sol. Il
a été adapté au prélèvement de plante afin de réaliser des études de transfert des métaux du sol à la plante. Il
permet de quantifier et de visualiser les variations de contaminations en éléments traces métalliques (ETM) et de
mycotoxines à l’échelle d’une placette du RMQS. Un descriptif détaillé de ce protocole est joint en Annexe 3. La
placette de prélèvement de plante s’étend sur 20m x 20m et requiert le prélèvement de 25 plantes (1 par sous
placette).

Le protocole PGM (Protocole Générique Multi-contaminants) a été rédigé par le doctorant embauché dans le cadre
du projet CASDAR/Région, en collaboration entre le LCABIE, l’USRAVE de l’INRA de Bordeaux et l’ENITAB. Il a été
également élaboré en vue de l’étude du transfert-sol plante et afin d’être représentatif d’une contamination en ETM
et mycotoxines à l’échelle de la parcelle. Le protocole PGM est détaillé en Annexe 4.

Afin d’évaluer et in fine de disposer de protocoles d’échantillonnage validés (livrable du projet), les protocoles RMQS
et PGM ont été testés sur site. Pour cela, à partir du réseau de parcelles disponible dans le cadre de ce projet et à
l’issue d’une discussion entre les différents partenaires, il a été décidé d’effectuer ces tests sur le site d’Auzeville-
Tolosane (Région Midi-Pyrénées (31)). Ainsi, des plants de blé en phase récolte ont été prélevés une parcelle de ce
domaine le 27/06/2011.

Pour les deux protocoles, les plantes ont été prélevées manuellement en vue d’une analyse d’ETM et mycotoxines
(sans gants). Elles ont été coupées à environ 5 cm au-dessus du sol à l'aide d'un couteau en céramique. Elles ont
ensuite été placées dans des sacs en polyéthylène (un sac par échantillon).

La totalité des échantillons a ensuite été stockée dans une voiture climatisée puis transportée à l'USRAVE de L'INRA
de Bordeaux, Unité dans laquelle les plantes ont été analysées.

Deux éléments de la plante ont été étudiés : les grains et la paille (feuilles + tige). Le traitement des échantillons a
entièrement été mené au laboratoire.

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3) Protocole de traitement des échantillons de plantes

Le protocole de traitement des échantillons de blé utilisé dans cette étude est un protocole validé et approuvé par
l’USRAVE pour le RMQS, et également retenu pour le PGM. Il est fourni en Annexe 5. Ce protocole décrit les
opérations à suivre en vue d’une étude de spatialisation (répartition de la contamination en ETM et mycotoxines au
sein de la placette RMQS) et d’une étude globale (contamination moyenne de la placette par la réalisation
d’échantillons composites).

Dans l’étude réalisée afin d’évaluer les deux méthodes de prélèvement, 112 échantillons de plantes ont été ainsi
préparés.

De plus, une étude complémentaire a été réalisée. Elle a permis de déterminer quel était le nombre minimal de
plantes à sélectionner par lot afin d’obtenir des résultats statistiquement représentatifs de la teneur en
contaminants au niveau du point de prélèvement. Pour cela, un prélèvement correspondant à 30 échantillons
supplémentaires a été effectué au niveau d’un point de prélèvement. Les manipulations correspondantes sont
décrites en Annexe 6.

Parallèlement, la possibilité de contamination lors du battage des épis (par la batteuse) a également été soulevée. En
effet, la batteuse mécanique étant constituée de pièces métalliques susceptibles de contaminer les échantillons en
ETM, des contaminations peuvent s’ajouter pendant le traitement des échantillons et donc fausser les analyses.
C'est pourquoi il a été décidé de procéder à des essais simultanés, un dans lequel les épis seront battus par la
batteuse et l'autre dans lequel les épis seront égrainés manuellement. Ne disposant pas de batteuse mécanique
pour le moment, tous les échantillons ont été égrainés à la main. Cette étude sera cependant menée ultérieurement.

Au bilan 142 échantillons ont été analysés à l’USRAVE. Des tableaux répertoriant les différents échantillons et leurs
nomenclatures sont joints en Annexe 7.

- Le protocole PGM est amené à être ajusté afin d’être optimisé en fonction des résultats obtenus (nombre de
plantes à échantillonner par point de prélèvement et nombre de points de prélèvement à déterminer)

- de sa facilité à être mis en œuvre par un professionnel sur le terrain. Il a d’ores et déjà été prévu que cet
aspect opérationnel soit discuté avec les personnes impliquées sur les sites expérimentaux, des agriculteurs
et les personnels des instituts.

Ref:

Erwin E.J.M Temminghoff et Victor J.G. Houba, Plant Analysis Procedures, Second Edition, 2005;
Handbook of Reference Methods for Plant Analysis, Yash P. Kalra, 1997

4) Le protocole de conservation des échantillons

Ce protocole a été défini selon l’expérience acquise par l’USRAVE. Il sera donc appliqué dans le cadre de ce projet.
Ainsi, pour réaliser l’analyse d’éléments minéraux (majeurs, oligoéléments et traces) ainsi que des mycotoxines, il est
nécessaire que l’échantillon soit conservé sec (moins de 10 % d’humidité). La température de séchage et de stockage
ne doit pas excéder 50°C (certains éléments ne seraient plus analysable : certains composés de l’azote ou du soufre,
le Hg, le Se). Les contenants doivent limiter au maximum les échanges gazeux avec l’extérieur afin d’éviter que
l’échantillon reprenne de l’humidité ou puisse être contaminé par des poussières (flacons à cape ou à bouchon à
lèvre, sacs soudés). Les flaconnages en verre, en matière métalliques, en PVC ou « en matières plastiques colorées »
doivent être évités (ou ne doivent pas être en contact direct avec les échantillons : bouchons par exemple).

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La protection contre la lumière est une précaution supplémentaire (aucune donnée ne permet d’affirmer qu’une
dégradation des minéraux ou mycotoxines d’un échantillon peut apparaître lorsque celui-ci était exposé à la
lumière).

Les échantillons conservés en entier ne subissent pas plus de dégradation que les échantillons broyés. La seule
difficulté dans ce cas est de trouver un contenant de volume adapté à l’échantillon (cas de tiges de blé par exemple).

Pour les échantillons végétaux, une difficulté peut être la présence de rongeurs dans les locaux (même les
flaconnages épais en matière plastique ne garantissent pas une bonne protection de l’échantillon).

Les échantillons de grains qui seront conservés sous forme de farine, doivent impérativement être placés, dès le
broyage fini, dans des flaconnages hermétiques (afin de prévenir la prolifération d’insectes).

5) Conservation des échantillons à long terme

Test de différentes conditions de stockage.

Il peut être nécessaire de ré-analyser des échantillons de végétaux après plusieurs années de stockage et ce pour
diverses raisons :

- Vérification de la validité d’une nouvelle méthode d’analyse ;

- Nouveaux paramètres à analyser (les résultats obtenus seront-ils alors comparable aux résultats qui auraient
été obtenus si l’analyse avait été faite de suite ?)

- Confirmer un résultat ancien.

Nous proposons de tester le protocole de conservation à long terme sur plusieurs échantillons représentant les
matrices ciblées dans le RMT Quasaprove : blé, maïs, tournesol (tiges et grains) soit 6 échantillons différents.

Le mode de conservation de référence est celui décrit dans le protocole de conservation : température ambiante,
flacons en polyéthylène hermétiques, à l’abri de la lumière directe, échantillon séché et broyé.

Les deux modes de conservation alternatifs concernent :

- la conservation à froid avec deux températures cible (-18°C, -80°C)

- la conservation en sachet sous vide d’air.

Les contaminants ciblés sont prioritairement les minéraux et les mycotoxines, mais l’étude pourra être étendue aux
composés organiques si des financements complémentaires sont acquis.

Tous les échantillons utilisés pour le test seront séchés et broyés (ce protocole ne pourra être appliqué aux tests de
conservation des échantillons pour l’analyse des composés organiques volatils qui seront faits sur de la matière
fraiche broyée ou entière). Chaque échantillon sera homogénéisé puis divisé en utilisant les normes en vigueur.

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4 x 10 sous échantillons seront préparés. « 4 » correspond au nombre de conditions testées (TA, -18°C, -80°C et
sous vide à TA) ; et « 10 » correspond au nombre de fois où les échantillons seront ré analysés. Les nouvelles
analyses sont prévues avec une fréquence de :

- deux fois par an l’année 1 à 6 mois d’intervalle

- tous les ans de l’année 2 à l’année 5

- tous les deux ans de l’année 5 à l’année 11

- l’année 20

Ref: F. Mutsch et al, Experimental design to detect chemical changes of forests soils during long term storage, 2011.

6) Résultats

Les échantillons de pailles et de grains ont été analysés à l’USRAVE au début du mois de décembre. Une page de
résultats bruts est fournie en Annexe 8. Ces résultats correspondent aux éléments analysés sur l’échantillon de paille
A1 prélevé selon le protocole RMQS (cf. Annexe 3). L’Annexe 8 présente en particulier les quantités d’éléments
traces métalliques retenus dans le cadre du volet de ce projet à savoir l’arsenic, le cadmium, le cuivre, le plomb et le
zinc. Des travaux de traitements des données et de calculs statistiques seront effectués dès le début du mois de
janvier 2012 afin d’évaluer le nombre de plantes à prélever par point de prélèvement et le nombre de points de
prélèvement à sélectionner afin d’être représentatif de la placette et de la parcelle.

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Annexe 1 : Accord au niveau du vocabulaire

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Surface Prélèvement
Dimensions Localisation des sous Échantillon Précautions
Protocoles Sous placettes des sous par sous Opérations à suivre
de la placette placettes par placette particulières
placettes placette
Pesée, comptage, battage des
3 sous
Épis : 1 sac épis
Maïs 9 m x 10 m placettes : 15,75 m2 Grains : 6 kg
Rang 3, rang 7 Grains : 2 kg Pesée, homogénéisation des
INRA 12 rangs sur la 1 rang sur Rafles : 15 /
et rang 10 Rafles : 5 grains puis séchage à 50 °C.
Colmar largeur 7 m de 17,5 % Tiges : 15
Tiges : 5 Pesée des tiges et rafles puis
longueur
séchage et broyage au SM 2000
1ère placette à 10 m des
limites de la sous placette
5 sous Épis : / Pesée des épis puis battage et
dans le sens de la longueur
placettes sur Grains : 1 kg pesée des grains
et 3,2 m dans le sens de la
Maïs les 6 rangs 20 m2 Grains : / Séchage à 50°C des grains puis
10,4 m x 48,5 largeur.
Feucherolles centraux : Rafles : / récupération et séchage des /
m
2005 2 rangs sur 4% Rafles : / rafles.
Distance entre sous
2,5 m de Tiges : 5 Récolte des tiges puis pesée
placettes :
longueur Tiges : 6 puis séchage à 50 °C
4 m sur la longueur et un
rang sur la largeur.
Prélèvement des épis puis
Palier à la variabilité
séchage à l'étuve 60 °C ou
16 sous Épis : 100 verticale
Céréales Pas de taille conditionneur puis
placettes Grains : / Épis : 1600 Éviter les tournières
ARVALIS Institut fixe de / Aléatoire conditionnement dans sacs
réparties Rafles : / Tiges : / et passage de roues
du végétal placette plastiques
aléatoirement Tiges : / Tiges coupées au
Battage, pesée des grains puis
ciseau sous le rachis
broyage
RMQS 25 sous 100 m2 Gants, couteaux
Une sous placette sur deux
RMT 20 m x 20 m placettes de 1 individu 25 individus / céramiques, glacière,
et un rang sur deux
Quasaprove 2 m sur 2 m 25 % poches plastiques
Coupe du blé, pesée des gerbes
4 sous Première et quatrième
Blé et orge 9 m x 10 m 2,7 m2 Épis : / Battage, pesée et Assembler le blé par
placettes : sous placettes situées à 1 Grains : /
INRA 18 rangs sur la Grains : / homogénéisation des grains. gerbe pour chaque
3 rangs sur 1,5 m de chaque limite de la Tiges : /
Colmar largeur 3% Tiges : / Récupération des résidus de sous placette
m de longueur placette.
récolte, séchage à 50 °C et
7
broyage au SM 2000 puis
homogénéisation
Les sous placettes 1 et 10
se situent à 10 m de la
limite de la placette selon
le sens de la longueur et la
placette 6 se situe à 25 m
de cette limite. Épis : / Comptage des épis et
Grains : / séparation des tiges.
10 m x 45 m 10 sous
Blé 2,5 m2 Les sous placettes 1, 5, 6 et Pesée des épis et des tiges
80 rangs de placettes : Blé coupé à 5 cm du
Feucherolles 10 sont à 2,5 m du bord de Grains : / après séchage à 50 °C pendant
blé sur la 4 rangs sur 0,5 sol
2009 0,6 % la placette. 5 jours
largeur m
Tiges : / Battage des épis, séchage des
L’écartement entre les sous Tiges : / grains à 50 °C pendant 3 jours.
placettes est de
1 m et la distance entre
deux sous placettes dans le
sens de la longueur est de
3 m.
Tournière* = Espace réservé pour faire tourner la charrue au bout du sillon / = Non Renseigné

Annexe 2 : Recueil des méthodes d’analyse (du prélèvement au champ à la préparation des échantillons)

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Annexe 3 : Protocole d’échantillonnage du RMQS

Théorie :

Une placette a été définie dans la parcelle. Son géo-référencement a été localisé et enregistré par GPS. Cette placette
a une dimension fixe de 20m x 20m quelle que soit la surface de la parcelle. Elle a ensuite été découpée en 100 sous
placettes (2m x 2m). Les prélèvements ont eu lieu sur 25 sous placettes, chacune d’entre elles étant séparée d’un
inter rang. La figure 1 ci dessous est un modèle d’illustration :

A9 C9 E9 G9 I9

A7 C7 E7 G7 I7
20 m

A5 C5 E5 G5 I5

A3 C3 E3 I5 I3

A1 C1 E1 G1 I1

Inter - rang

Figure 1 : Placette du RMQS

A la parcelle :

Au total, quatre plantes ont été prélevées au centre de chaque sous placette retenue (25) et ont été placées dans un
sac poubelle (un lot).

Une des quatre plantes de chaque lot a été analysée individuellement en vue d’une étude de spatialisation de la
placette du RMQS (spatialisation en termes d’ETM et de mycotoxine).

Le reste des plantes a servi à préparer trois échantillons composites. Pour cela, une plante de chaque lot
correspondant aux différents points de prélèvements du RMQS a été sélectionnée. La totalité des plantes (25
plantes) a été regroupée. Ceci a été reproduit deux fois supplémentaires pour obtenir trois échantillons composites.

Idéalement, il aurait été préférable d'un point de vue pratique de ne prélever qu'une plante par lot puis procéder à la
spatialisation et à la réalisation de l'échantillon composite par la suite. Cela dit, la matière prélevée dans cette
optique ne suffit pas, d’où le prélèvement de quatre plantes par lot.

Au total, 100 plantes de blé ont alors été prélevées sur la placette pour ce protocole.

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Figure 2 : Grille de prélèvement du RMQS

La grille de prélèvement du protocole RMQS fournie en figure 2 a été préalablement positionnée à l’aide d’un GPS.
Les points A, B, C, D représentés sur la figure 2 sont des repères qui permettent de localiser la grille sur la parcelle. Ils
ne correspondent pas à des points de prélèvements.

Cette grille a été positionnée au centre de la parcelle. La figure 3 permet de situer la grille de prélèvement dans la
parcelle.

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Figure 3 : Localisation de la grille de prélèvement du RMQS dans la parcelle

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Annexe 4 : Protocole d’échantillonnage du PGM

Théorie :

Le nombre de placettes de prélèvement est fixé à 25 (identique au protocole du RMQS).


Afin d’être applicable pour toutes parcelles quelles que soient leurs dimensions, les 25 placettes sont positionnées
sur la parcelle selon la méthodologie suivante :
-
Les bordures de la parcelle sont redéfinies afin de ne pas avoir de placette de prélèvement située trop près
des bords (la bordure est redéfinie à 4 mètres à l’intérieur de la bordure réelle de la parcelle) ;
-
La parcelle (corrigée de la bordure) est ensuite découpée en 20 placettes (division par 5 sur la longueur et
par 4 sur la largeur) ;
-
Pour les placettes situées à chaque coin de la parcelle, les points de prélèvement doivent être situées à
chaque coin de la bordure redéfinie* ;
-
Pour les autres placettes, les points de prélèvement sont définis aléatoirement (type A) ;
-
La parcelle entière (corrigée de la bordure) est ensuite découpée en 4 « grandes placettes »
-
4 points de prélèvement sont placées aléatoirement (1 dans chaque « grande placette ») (type B) ;
-
Enfin, un dernier point est sélectionné aléatoirement dans toute la parcelle (corrigée de la bordure). Il
convient de choisir un point suffisamment éloigné de tous les autres points de prélèvement (type C).

Un plan résumant cette méthodologie et indiquant le positionnement des 25 points de prélèvement sur la parcelle
d’Auzeville-Tolosane est fourni en Figure 4.

*Bordure redéfinie : permet de retracer la parcelle en retirant les bordures (située à 4 mètres à l’intérieur de la
bordure réelle de la parcelle).

Ce protocole mêle ainsi à la fois des paramètres définis mais également de l’aléatoire.

A la parcelle :

Au total, environ vingt plantes ont été prélevées au niveau de chaque point de prélèvement (25). Ce qui représente
une quantité totale de 500 plantes. Des tests ont été effectués afin d’étudier s’il est possible de réduire ce nombre de
plantes prélevées par point de prélèvement (cf. paragraphe 3))

L’idée initiale est de déterminer le nombre de plantes à sélectionner dans chacun des lots afin que l’échantillon
constitué soit représentatif de la teneur en ETM et mycotoxines contenue dans les plantes situées au niveau du point
de prélèvement.

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Figure 4 : Points de prélèvements du PGM

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Annexe 5 : Protocole de traitement des échantillons de blé

A) Etude de spatialisation :

Chacun des 25 échantillons a été préparé et analysé de façon individuelle. Le protocole suivi fut le suivant :

(1) Prélever aléatoirement une des quatre plantes de chaque lot. Le prélèvement se fait à la main (sans gants).

(2) Séparer l’épi de la paille à l'aide d'un couteau en céramique.

(3) A) 1/ Placer la paille dans un sac/flacon plastique étiqueté.

2/ Sécher les 25 sous échantillons de paille à l’étuve à 50°C. Veiller à l’homogénéité de la température
dans l’étuve.

3/ Broyer les 25 sous échantillons de pailles individuellement et les homogénéiser. Utiliser un broyeur à
lame de type SK1.

4/ Minéraliser les 25 sous - échantillons de paille individuellement (Minéralisation voie sèche, HNO3)

B) 1/ Égrainer chaque épi individuellement à la main. Pour ce faire, retirer les barbes de chaque épi (si les
épis en sont pourvus) puis broyer grossièrement les épis à la main de sorte à ce que les grains se séparent des
épillets (enveloppes des grains). Ensuite, se munir d’un aspirateur et fixer un grillage à fines mailles
(dimensions de la maille << dimensions du grain) sur son embout. Mettre l’aspirateur en marche et
l’approcher des sous échantillons. Ainsi, seules les parties légères des épis sont aspirées et se fixent sur le
grillage, les grains restant dans le flacon contenant initialement les épis. Se débarrasser des enveloppes fixées
sur l’embout et renouveler l’opération jusqu'à ce que le flacon ne contienne que les grains.

2/ Placer les grains dans un sac/flacon plastique étiqueté.

3/ Sécher, broyer et minéraliser les 25 sous - échantillons de grains individuellement selon les même
méthodes que précédemment. Utiliser dans ce cas un broyeur de type M20 ou ZM100.

Les broyeurs utilisés doivent être non contaminants et ne doivent pas engendrer de pertes de sous échantillons.

Ce protocole est illustré par le schéma présenté en figure 5 relatif au lot RMQS A1 (cf. Annexe 7 pour la
nomenclature des échantillons) et à appliquer pour les 25 lots :

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Figure 5 : Schéma du protocole opératoire mené pour une analyse ETM, mycotoxines

Au total, pour l’analyse de spatialisation, 50 sous - échantillons différents ont été analysés (25 de pailles et 25 de
grains pour une analyse d’ETM et de mycotoxines).

B) Échantillons composites :

(1) Prélever aléatoirement à la main une des trois plantes restantes dans chaque lot.

(2) Regrouper chacune des plantes prélevées dans chaque lot (25 plantes).

(3) Séparer les épis des pailles pour les 25 plantes à l’aide d’un couteau en céramique.

A) 1/ Placer toutes les pailles dans un même sac/flacon plastique étiqueté.

2/ Sécher, broyer et minéraliser l’échantillon composite de pailles.

B) 1/ Égrainer la totalité des épis

2/ Placer l’ensemble des grains dans un sac/flacon plastique étiqueté.

3/ Sécher, broyer et minéraliser l’échantillon composite de grains.

Renouveler ces opérations deux fois de sorte à obtenir 3 échantillons composites de pailles et 3 échantillons
composites de grains.

Annexe 6 : Détermination du nombre de plantes minimal représentatif du point de prélèvement

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L'étude a été menée sur des plantes prélevées au niveau d’un point de prélèvement parmi les 25 : Le lot PGM 19 (cf.
Annexe 7 pour la nomenclature des échantillons).

Procéder à des sélections successives de plantes issues du lot PGM 19. Les nombres de plantes à prélever
simultanément sont : 1 ; 2 ; 5 ; 10 et 20. Cela représente 5 sous-lots à partir du lot initial PGM 19.

Cette étape est à répliquer trois fois. Le nombre de sous-lots total est donc de 15.

Pour chaque sous - lot, procéder aux opérations suivantes :

(1) Séparer l’épi de la paille à l'aide d'un couteau en céramique.

(2) A) 1/ Placer la paille dans un sac/flacon plastique étiqueté.

2/ Sécher, broyer et minéraliser les 15 échantillons de paille individuellement.

B) 1/ Égrainer chaque épi individuellement.

2/ Placer les grains dans un sac/flacon plastique étiqueté.

3/ Sécher, broyer et minéraliser les 15 sous - échantillons de grains individuellement.

Les échantillons étant préparés, procéder aux analyses ETM et mycotoxines puis tracer un graphe
[ETM, mycotoxines] = f(nombre de plantes formant le sous - lot) et déterminer le nombre minimal à prélever pour
lequel la concentration en contaminant ETM et mycotoxines ( [ETM, mycotoxines] ) devient constante pour les ETM
et pour les mycotoxines (prendre le nombre le plus élevé des deux) à la fois pour les pailles et pour les grains.
Ce nombre est noté X étant donné qu’il est encore inconnu à ce niveau de l’étude

Voici présenté en figure 6 ci-après un exemple de ce qui peut être obtenu :

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Figure 6 : Exemple de résultats
pouvant être obtenus pour la
détermination du nombre significatif
de plantes à prélever X (PGM)

Dans l’exemple de la figure 6, le


nombre minimal de plantes à
sélectionner pour procéder aux
analyses d’ETM et de mycotoxines
dans les grains et dans la paille est de
X = 10 plantes.

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Annexe 8 : Résultats bruts : Point de prélèvement A1 du protocole RMQS

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