Cours

 Master  MES  
Module  transgénèse  et  génie  géné8que  

Les  banques  d’ADN  

Synthèse  et  réalisa8on  Dr  Bouraoui  H.  

Défini8on  d’une  banque  d’ADN  
Une  banque  d'ADN  est  une  collec8on  de  vecteurs  contenant    
des  fragment  d'ADN  divers  représenta8f  d'un  type  cellulaire,  d'un  
génome,  d'un  stade  par8culier  de  développement  

Une  Banque  est  caractérisée  par  :  

-­‐  le  type  de  vecteur  
-­‐  la  nature  des  inserts  (ADN  genomique,  ADNc),  leur  origine  
-­‐  le  pourcentage  de  vecteurs  possédant  un  insert  
-­‐  la  taille  moyenne  des  inserts  
-­‐  la  taille  de  la  banque  c.a.d  la  quan8té  de  clones  /  ml  de  banque  

Deux  types  principaux  de  banques:  Banque  génomique  et  Banque  ADNc  
 Les  banques  génomiques  
organisme   Taille  du  génome(kb)  
E  coli   4,7x1O  3  
•   Source  d’ADN:  ADN  génomique  
B.sub,lis   4,2x103  
Saccharomyces  cerevisiae   1,35x104  
Homme   2,8x106  
•   choix  de  l’enzyme  de  restric8on:  
 diges8on  par8elle:  idéalement  les  sites  de  restric8on  doivent  
être    répar8es  d’une  façon  aléatoire  dans  le  génome  
 Des  enzymes  avec  une  fréquence    
de  coupure  prédite  

Exemple:  
-­‐Sau3AI  coupe  environ  toutes  les  300  bp    
et  sera  appropriée  pour  la  cons8tu8on  de    
Banques  plasmidiques  ou  phagiques  
-­‐  BamH1  coupe  environ  tous  les  4  kb  et    
sera  convenable  pour  cons8tuer  une  banque  de  YACs.    
Les  banques  génomiques  
•   Choix  du  vecteur  ?     taille  de  la  banque  

Tableau:  Vecteurs  et  taille  des  banques  

•   Choix  du  vecteur  ?     criblage  

Les  banques  génomiques:  leurs  construc8on?  
Un  clonage  dans  le  phage  lamda  
Le  vecteur:  
 Les  banques  ADNc   La traduction chez les Eucaryot

5’ 3’
 moins  de  10  %  du  génome  des  grands  
eucaryotes  est  effec8vement  codant  et  
que  les  gènes  eux  même  con8ennent   5’ 3’
de  très  grands  introns  :  les  ARNm  
matures  sont  bien  plus  courts  que  les  
gènes  qui  les  codent  

5’ 3’

NH2 COOH
Les  banques  ADNc:  synthèse  de  l’ADNc  

A partir de l’ARN:
La    "reverse  Transcrip8on  »  

Technique  à  la  nucléase  S1  

Les  banques  ADNc:  synthèse  de  l’ADNc  
24/10/2011
Technique  de  Gubler  et  Hoffman     Addi8on  d’une  queue  polyG   au  premier  b57rin  

5’ AAAAAA 3’ Technique de Gubler et Hoffman

hybridation avec un oligodT
reverse transcriptase + dNTP
Ici on synthétise un premier brin d’ADNc
ARN AAAAAA
comme précédemment avec une reverse

Banque d’ADNc
ADN

ADN
TTTTTT

traitement alcalin

TTTTTT
transcriptase après avoir hybridé une amorce, mais
l'ARN est éliminé par digestion ménagée à la RNase
cDNA simple brin
H. Les fragments restants servent alors d'amorce
+ RNASe H pour une DNA polymérase qui comble les trous au
AAAAAA fur et à mesure que la RNase H continue son action.
TTTTTT
Les fragments d'ADN sont alors reliés grâce à
RNAse H + T4 DNA polymérase
l'action d'une ligase. Noter que les bouts sont ici
AAAAAA francs, grâce à l'action 3'5' exonucléase de la
Le problème ici est
cDNA double brin
TTTTTT
polymérase.
l’obtention de clone dit
Avec les deux techniques, on n'a généralement pas de copie de l'extrémité 5' de l'ARN.
full lenght.
Les  banques  ADNc:  la  Rt-­‐PCR  
RT:  
Ajout:  
65ºC  –  10  min   37  ºC  –  1  hour  
 ARN  total  +   RNase   ADNc  
oligodT   dNTPs  
denatura6on   Hybrida6on  et   prêt  
Enzyme   élonga6on  

PCR:   1-­‐5  ul  

matrice   95ºC  –  30  sec  

95ºC   55ºC  –  30  sec   72ºC  
tampon   3  min   72ºC  –  1  min   10  min  
MgCl2  
Produit  
30  cycles  
dNTPs   amplifié    
denatura6on   amplifica6on   fini6on  
DNA  pol  

primers  

Analyse  sur  Gel    

Les  banques  ADNc:  clonage  de  l’ADNc  

Il  faut  maintenant  intégrer  l’ADNc  double  brin  à  un  vecteur  

Et  si  on  ud8lise  

Addi8on   directement  
e  linkers:   les  bouts  francs??  
des  oligonucléo8des   palindromiques  
Linker  EcoRI  

Hybrida8on   Diges8on  

Adaptateur  EcoRI  

Hybrida8on  
 Les  banques  ADNc:  clonage  de  l’ADNc  

que d’A D N c
que d’A D N c

blème ici est

tion de ici
oblème clone est dit
ght.
ntion de clone dit
Addi8on  d’extension  
nght.
hompolymérique  

matériel de départ?
e matériel de départ?
 Obtention de l’ADN de l’organisme
Les  banques  ADNc:  clonage  de  l’ADNc   donneur
Obtention de l’ADN de l’organisme donneur
Addi8on  d’adaptateur  
A partir de l’ARN:
Obtention
APrincipe
partir de la
l’ARN:de l’ADN
reverse de
transcription: l’organisme donneur
Principe de la reverse transcription:
A partir de l’ARN:

Principe de la reverse transcription:

S S S
Adaptateurs  Sal1,  ligature  

Inser8on  dans  le  vecteur  coupé   An Introduction to Genetic Analysis

Sal1,  EcoR1   S S S

Dans ce cas là, quel matériel de départ prendriez-vous? An

An Introduction
Introduction to
to Genetic
Genetic Analysis
Analysis

Dans
Toutesceles
cascellules
là, quelexpriment-elles
matériel de départ R prendriez-vous?
le mêmeR gène? S S S R R
Clivage  par  Sal1,  EcoR1  
Toutes les cellules expriment-elles le Emême
Adaptateurs   gène?
coR1,  ligature   An Introduction to Genetic Analysis
Les  banques  ADNc:  clonage  de  l’ADNc  
Addi8on  d’adaptateur  

5’ AAAAAA 3’ Technique de Guble

hybridation avec un oligodT
reverse transcriptase + dNTP
Ici on synth
ARN AAAAAA
ADN TTTTTT S comme précédem

traitement alcalin
transcriptase après
ADN TTTTTT l'ARN est éliminé p
cDNA simple brin
Inser8on  dans  le  vecteur  coupé   H. Les fragments
Sal1,  EcoR1   + RNASe H pour une DNA poly
AAAAAA S fur et à mesure que
TTTTTT
Les fragments d'A
Adaptateurs  EcoR1,  ligature   RNAse H + T4 DNA polymérase
l'action d'une ligas

R R
AAAAAA
S R francs,
R grâce à l'
Clivage  par  Sal1,  EcoR1   R
cDNA double brin
TTTTTT
polymérase.

Avec les deux techniques, on n'a généralement pas de co

D'autres techniques permettront de l'obtenir. Ce n'est souvent pas g
codante, la partie 5' situé en amont de l'ATG est dans ce cas moins im