Enzymologie

Biochimie métabolique
1
 Plan
Introduction
1. Historique et définitions
2. Nomenclature et classification des enzymes
3. Structure des enzymes
4. Catalyse enzymatique
5. Cinétique enzymatique
6. Facteurs modifiant la cinétique enzymatique
7. Cinétique à deux substrats
8. Régulation des enzymes
9. Applications cliniques des enzymes
Conclusion
2
5- Cinétique enzymatique

3
 Cinétique enzymatique

• Est l’étude des variations de la vitesse des

réactions catalysées par des enzymes en
fonction de la concentration en substrat

4
 Vitesse de réaction

Modèle de réaction

V = dP/dt = -dS/dt

Est la quantité de substrat transformé ou de

produit formé par unité de temps
5
 La vitesse de la réaction
C’est la quantité de substrat qui va être transformée par unités de temps
[S ou P]
mmol/L S P

-dS Apparition de P

V = - dS = + dP
dt dt

dP
Disparition de S

t en min
dt

C’est la quantité de produit qui va être formée par unités de temps

6
 Cinétique d'une enzyme au cours du temps
K1 K2 K3
E+S ES EP E+P
K-1 K-2 K-3

Apparition du produit au cours du temps

[P]
mmol/l

La vitesse peut être mesurée

avec l'apparition du produit.
Vitesse initiale d P 
v =
dt
2- Phase
stationnaire
1- Phase
3- Effet 4- Equilibre
T min
préstationnaire
du produit
[ES] constante
[ES] [ES] [EP]
[S] >>[E] [EP]
L'enzyme La vitesse Le produit qui s'accumule concentration de P et S
se charge est constante. ralentie la réaction restent constantes
(loi d'action de masse)

En enzymologie classique, on s'intéresse à la phase stationnaire (linéaire) en mesurant la vitesse initiale.

Il y a un maximum d'enzyme lié avec le substrat 7
 Cinétique enzymatique
Détermination de la vitesse initiale pour différentes
concentrations en substrat

P Vi

Vi1

S1

Vi1
S1
S
T

Mesure de Vi1 et report sur Vi=F(S)

 Cinétique enzymatique
Détermination de la vitesse initiale pour différentes
concentrations en substrat

Vi
P

Vi2

S2

Vi1
S1

Vi2
Vi1
S1 S2
S
T

Mesure de Vi2 et report sur Vi=F(S)

 Cinétique enzymatique
Détermination de la vitesse initiale pour différentes
concentrations en substrat

Vi
P

S3 Vi3

Vi2

S2

Vi1
S1

Vi2 Vi3 Vi4= Vi5

Vi1
S1 S2 S3
S
T

Mesure de Vi3et report sur Vi=F(S)

 Mesure de Vi4 et report sur Vi=F(S)

Vi
S4
P
Vi4
Vi3
S3 Vi2

S2

Vi1
S1

Vi2 Vi3 Vi4= Vi5

Vi1
S1 S2 S3 S4 S
T
 Cinétique enzymatique : Mesure de Vi6 et report sur Vi=F(S)

S5
Vi
S4
P
Vi5 = Vi4
S3 Vi3

Vi2

S2

Vi1
S1

Vi2 Vi3 Vi4= Vi5

Vi1
S1 S2 S3 S4 S5
S
T
 Cinétique enzymatique : Vi = F(S)
Relation hyperbolique entre la [S] et la vitesse de la réaction

Vi

S
 Effet de la concentration en enzyme sur la vitesse initiale

Plus [E] est grande plus la Vitesse initiale est grande

P Vi
Vi4

Vi3

E4 E3
E2 Vi2

E1 Vi1

Vi2 Vi3 Vi4

Vi1

E1 E2 E3 E4 E
T
 Cinétique enzymatique
Equation de Michaelis-Menten

15
 Équation de Michalis et Menten
• 1913: proposition d’une théorie générale de l’action
enzymatique compatible avec les données
expérimentaux

16
 Équation de Michaelis et Menten

• Hypothèse de la phase stationnaire

– [ES]: atteint rapidement sa constante d’équilibre
– d[ES] /dt =0

• Hypothèse de la vitesse initiale

– Vitesse initiale: vitesse immédiatement après avoir mélangé E et S en
l’absence de P
– La transformation de ES en E + P n’est pas directe
– Possibilité de négliger l’étape intermédiaire de EP

K1 K2
E+S ES E+ P
K-1

17
 Équation de Michaelis-Menten
K1 K2
E+S ES E+ P
K-1

L’étape la plus lente et qui détermine la vitesse de

l’ensemble de la réaction: dissociation [ES] en E et P
V = k2 [ES]

La vitesse maximale de la réaction survient lorsque

toutes les molécules d’enzyme sont saturées de substrat:
Vmax= = k2 [ET]= k2 ([E]+[ES])

Si on fait le rapport V = [ES] équation F1

Vmax [E]+[ES]

18
 Équation de Michaelis-Menten
Phase stationnaire:
– Vitesse formation ES = vitesse de dissociation ES
K1 K2
K1([E][S]) = k-1[ES]+K2[ES] E+S ES E+ P
k-1+K2 / K1 = [E][S] / [ES] K-1
KM = [E][S] / [ES] KM constante de Michaelis
[ES] = [E][S] / KM
Remplaçons [ES] par sa valeur dans l’équation F1 V = [ES]
Vmax [E]+[ES]
V = [E] [S] = [S]
Vmax KM([E]+[E][S]) KM(1+[S])
KM KM

19
 Cinétique enzymatique : Vi = F(S)
Relation hyperbolique entre la [S] et la vitesse de la réaction

Vi

Vmax Asymptote à la courbe permettant de déterminer la vitesse maximale (Vmax)

Vmax/2

S
KM
Signification des paramètres cinétiques
Vitesse maximale initiale

V0

V m ax

V m a x/2

0 [S ]

Km

Vitesse maximale initiale:

-vitesse initiale d’une réaction enzymatique pour une concentration
infinie en Substrat

-asymptote de la branche hyperbolique V= f([S])

21
 Signification des paramètres cinétiques KM

• KM :
– Concentration en substrat pour laquelle la vitesse
est égale à la moitié de Vmax
– Traduit l’affinité du S pour l’E
– L’affinité du substrat pour l’enzyme est
inversement proportionnelle à la valeur de KM
– Indépendante de la quantité d’enzyme
– Paramètre spécifique de l’enzyme

22
 Km de certaines enzymes
Enzyme Substrate km

Catalase H2O2 25

Hexokinase ATP 0.4

D-Glucose 0.05

D-Fructose 1.5

Carbonic anhydrase HCO3- 9

Chemotrypsin Glycyltyrosinylglycine 108

N-Benzoyltyrosinamide 2.5

Galactosidase D-Lactose 4

Threonine dehydratase L-Threonine 5

23
 Signification physique de Kcatalytique
• Vmax = Kcat . [Et]

• Kcat ou k2 est une constante de vitesse (unité s-1)

• Désigne le nombre de molécules de S converti en P par

molécule d’E et par unité de temps

• Représente la fréquence à laquelle l’E accomplit l’acte

catataytique (en anglais « turn over »)

• Valeur de Kcat donne la mesure de l’efficacité de la catalyse par

l’E sur le S

24
 Signification physique de Kcat / KM
• Kcat : mesure l’efficacité de la catalyse par l’E
sur le S

• KM : mesure l’affinité de l’E pour le S

• Kcat / KM: constante de spécificité

– reflète la spécificité globale d’une E vis-à-vis d’un S

25
Quelques valeurs de constantes catalytique, de
Michaelis et de spécificité

26
Détermination de Vmax et de Km
Vmax
Vitesse initiale Vo

La forme hyperbolique de la courbe:

-ne permet d’obtenir Vmax que par extrapolation
-Intérêt transformation mathématique de l’équation
Vmax / 2 de Michaelis- Menten en équation linéaire

Km

Concentration en S

27
 1- Représentation des inverses de Lineweaver-Burk

S
Vi= Vmax 1 1 KM 1
= x +
KM + S Vi S Vmax Vmax
Vi
Vmax 1/Vi

Vi5 = Vi4
Vi3

Vi2
Vmax/2

Vi1
1/Vmax

S1 S2 S3 S4 S5 S 1/S
KM
-1/KM
Représentation de Lineweaver et Burk

1/v0 = (Km/vmax )( 1/[S]) + 1/vmax

Équation type y= ax+b (équation d’une droite)

a = pente
b= 1/Vmax

29
30
Représentation de Eadie- Hofstee

31
32
Représentation de Hanes

33
6- Facteurs modifiant la
réaction enzymatique

34
Facteurs modifiants la réaction enzymatique

• Paramètres physiques:
– Température
– pH

• Paramètres chimiques: Effecteurs

– Inhibiteurs
– Activateurs

35
 Effet de la température
2 .0

E n z y m a tic a c tiv ity

1 .5

1 .0

0 .5

10 20 30 40 50 60 T e m p . (C )
Ce type de courbe est la somme de deux effets superposés de la température sur la
vitesse de la réaction enzymatique.
• Au dessus de 40 ou 45°C, courbe de dénaturation: la chaleur dénature les
structures secondaires et tertiaires de l’enzyme et l’activité tend rapidement vers
zéro.
• Pour les températures inférieures, courbe d’activation: la chaleur du milieu
apporte un supplément d’énergie qui facilite la réaction enzymatique.
• La température optimale est celle où les 2 phénomènes s’équilibrent 36
 Effet du pH
• Le pH intervient de deux manières
différentes :
• soit en modifiant la structure
secondaire ou tertiaire de l’enzyme
• soit en modifiant les charges électriques
des radicaux des acides aminés du site
actif

37
 Charges électriques des acides aminés

100
NH3+ COO-
NH3+
50 COO-

COOH NH2

4 7 10 pH

• Aux pH très acides la plupart des fonctions ionisables sont sous la forme
protonée c’est à dire COOH pour la fonction acide carboxylique et NH3 + pour la
fonction amine.

• Aux pH les plus alcalins les fonctions ionisables de ces mêmes radicaux sont
sous la forme déprotonée c’est à dire COO- pour la fonction acide carboxylique, et
NH2 pour la fonction amine.

• Il existe un pH du milieu réactionnel où les charges électriques des

radicaux du site actif de l’enzyme seront les plus favorables à la liaison
enzyme-substrat : on appelle ce pH le pH optimum de la réaction
enzymatique. 38
• pH= 7.0 est le pH optimum pour la majorité des enzymes.
• Cas particuliers:
pH (pepsine) = 1.8 enzyme du suc gastrique
pH (trypsine) = 7.8 enzyme de l’intestin grèle

2 .0 p e p s in
E n z y m a t ic a c tiv ity

1 .5

tr y p s in
1 .0

0 .5

2 .0 4 .0 6 .0 8 .0 1 0 .0 pH

39
 Influences des effecteurs
• Corps chimiques capables de se lier avec
l’enzyme et d’en modifier la vitesse :

– Soit en l’accélérant : activateur

– Soit en la ralentissant : inhibiteur

40
 les inhibiteurs enzymatiques
• sont des molécules qui diminuent la vitesse
des réactions enzymatiques.

• peuvent être des métabolites normaux ou

des substances exogènes (médicaments,
toxiques).

• Le processus d’inhibition peut être

– réversible
– irréversible.

41
 Inhibition irréversible

• Les inhibiteurs sont reliés par une liaison

covalente avec les enzymes:
– Substrat suicide

• Ils ne peuvent être déplacer par simple

dialyse ou super filtration

• La liaison peut diminuer partiellement ou

complètement l’activité enzymatique.
42
 Exemple d’inhibition irréversible
• Penicilline: antibiotique

• Liaison covalente avec résidu sérine de l’enzyme

de synthèse de la paroi bactérienne
(glycoprotéine transpeptidase)

• Blocage de la synthèse de la paroi bactérienne

• Lyse bactérienne

43
 Inhibition réversible

• Inhibiteurs sont liés par une liaison non

covalente à l’enzyme.

• L’inhibition réversible est caractérisée par

un équilibre entre l’enzyme libre et
l’enzyme liée à l’inhibiteur

44
Inhibition compétitive

45
 Inhibiteur compétitif
- La fixation se fait au même site actif que le substrat

- Analogie structurale entre substrat et inhibiteur

- La fixation de l’inhibiteur empêche celle du substrat

- Si le site actif est bloqué par un inhibiteur compétitif,

l'enzyme ne peut plus fonctionner

- Modification de l’affinité de l’enzyme pour le substrat soit

le Km.

- On peut déplacer l’équilibre par un excès de substrat

46
 Facteurs d’inhibition

• Compétition au niveau du site de liaison:

– Km augmente
– affinité diminue.

• Quand [S] augmente, l’effet de l’inhibiteur

diminue: pas de changement de Vmax.

47
Inhibition compétitive (hyperbole)

48
Inhibition compétitive (double inverse)

C o m p e t it iv e
in h ib it o r
1 /V in c r e a s e

N o in h ib it o r
1 /V m a x

-1 / K m

1 /[ S ]

- 1 / K m ( 1 + [ I] / K i )

49
 Exemple d’inhibition compétitive
la succinate déshydrgénase

COOH COOH

s u c c in a t e
H 2C HC
d e h y d ro g e n a s e

CH2 CH

HOOC HOOC

s u c c in a t e
f u m a r ic a c id

COOH C O -C O O H

H 2C H 2C

COOH COOH

m a lo n ic a c id o x a lo a c e t a t e
50
 La succinate déshydrogénase
• Le succinate: substrat diacide à 4 carbones

•Le malonate : inhibiteur compétitif

- diacide , distance entre ses deux charges négatives est voisine de
celle qui sépare les deux fonctions acides du succinate
-peut se fixer aussi sur le site actif de l’enzyme
-la structure de son unique carbone intermédiaire ne permet pas
l’oxydation
-la liaison de la succinate déshydrogénase avec le malonate rend
donc l’enzyme inactive.

• Une concentration plus élevée de l’un de ces deux diacides chassera l’autre
du site actif de l’enzyme, de sorte qu’il y a bien compétition des deux
molécules vis à vis de l’enzyme.

51
Inhibition non compétitive

52
 Un inhibiteur non compétitif
• Se positionne en un site différent de celui du substrat

• Ne limite pas l’accessibilité du substrat sur le site actif (ES, EI, ESI)

• Pas de compétition entre S et I : pas de modification de Km

• Après fixation de l’inhibiteur, l’enzyme est incapable de catalyser la

réaction

• Le complexe E-I-S ne donne pas de produit.

• Vmax↓

53
Inhibition non compétitive (hyperbole)

54
 n o n c o m p e t it iv e
in h ib it o r
1 /V in c r e a s e

( 1 + [ I] /K i ) /V m a x

N o in h ib it o r

-1 / K m

1 /[ S ]

1 Km [ I ] 1 1 [ I ]
= (1 + ) + (1 + )
V V m ax Ki [S ] V m ax Ki

55
 Exemple d’inhibition non compétitive

L’acétazolamide est un médicament utilisé pour traiter le glaucome, les crises

d'épilepsie, l'hypertension intracranienne et l'alcalose métabolique en soins
intensifs. C'est également un diurétique.

56
 Inhibition incompétitive
Inhibition par blocage du complexe intermédiaire

57
• L’inhibiteur incompetitif se lie uniquement au
complexe enzyme-substrate.

• Le complexe E-I-S:
– ne conduit pas à la formation de produit
– ne peut redonner substrat et enzyme.

• Réduction de Vmax et Km : Présence de l’inhibieur

– Facilite la formation du complexe intermédiaire: Km
– Empêche la réaction de se produire: Vmax

58
 1 /V U n c o m p e t it iv e
in h ib it o r
in c r e a s e

( 1 + [ I] /K i ) /V m a x
N o in h ib it o r

1 /V m a x

1 /[ S ]
-1 / K m

- 1 / K m ( 1 + [ I] /K i )

Km 1 1 [ I ]
1
= + (1 + )
V V m ax [S ] V m ax Ki

59
Inhibiteurs réversibles: 3 types

60
 Résumé

type cible Km Vmax

Compétitive E uniquement  constante

Non compétitive E ou ES constante 

incompétitive ES uniquement  

61
 Cas particuliers d’inhibition
• Inhibition par les fortes concentrations de substrat
– La vitesse après avoir atteint un optimum, diminue
– L’enzyme est susceptible de fixer plusieurs molécules de substrats
– Seul le complexe dans lequel le substrat se fixe dans une orientation favorable
donne le produit
– Véritable cas d’inhibition non compétitive par le substrat lui-même
E+S ES E+P
ES + S ES2

• Inhibition par les produits de la réaction

– Le produit présente souvent une structure voisine du substrat ou d’une partie
du substrat
– Possibilité de former un complexe spécifique avec l’enzyme
– Cas d’inhibition compétitive
E+S ES E+P
E+P EP

62
Cinétique enzymatique: les points clés
• Enzyme michaeliène: cinétique hyerbolique

• Équation de Michelis- Menten

• Notion de Vmax, Km, Kcat, Kcat/Km

• Facteurs modifiant la cinétique enzymatique:

– Température
– pH
– Effecteurs: activateurs et inhibiteurs

63