Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB.

FICHE TECHNIQUE N°11 : Dénombrement des Pseudomonas sur

gélose au Cétrimide.

Gélose au Cétrimide : Milieu sélectif destiné à l’isolement et au dénombrement de

Pseudomonas aeruginosa dans les produits biologiques d’origine animale, les produits
pharmaceutiques, alimentaires et cosmétiques.
Composition : Pour litre de milieu :
o Peptone ……………………………………………….………………… 20 g.
o Chlorure de magnésium (agent différentiel) …………………...…. 1.4 g.
o Sulfate dipotassique (agent différentiel) ..……………………...……. 10 g.
o Cetrimide : cetyltrimethylammonium bromide (agent sélectif) . 0.3 g.
o Glycérol ………………………………………………………….………. 10 g.
o Agar ……………………………………………………………………. 13.6 g.
pH du milieu prêt – à - l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.
Principe : Le cétrimide (bromure de cétyl-triméthyl-ammonium), composé ammonium
quaternaire, agit comme inhibiteur d’une grande variété de germes, y compris les
espèces de Pseudomonas autres que Pseudomonas aeruginosa.
La production de pyocyanine (pigment bleu, non fluorescent, soluble dans l’eau et le
chloroforme) est stimulée en présence de chlorure de magnésium et de sulfate de
potassium.
Le milieu favorise également la production de pigments fluorescents (pyoverdines) par
certaines souches de Pseudomonas aeruginosa.
La plupart des Pseudomonas aeruginosa sont identifiables à leur odeur
d’aminoacétophénone.
Technique :
1) Préparation des dilutions décimales : voir fiche technique 1.
2) Ensemencement en surface (en nappe) : voir fiche technique 5.
3) Incubation : incuber à 30-35 ± 1°C pendant 24 ± 2h.
4) Lecture :
5) Pseudomonas aeruginosa présente des colonies pigmentées en jaune-vert
fluorescentes sous rayons ultra-violets à 254 nm.
6) Dénombrement : Compter les colonies typiques sur les boîtes contenant entre
15 et 150 colonies. Faire la moyenne des trois boîtes pour la même dilution.
Appliquer la loi de Kass : N = m x 1/V x 1/D (UFC/ml).
N : le nombre d’unités formant une colonie de P. aeruginosa. m : la moyenne des boîtes. V : le volume
ensemencé. D : la dilution correspondant aux boîtes choisies.

1
 Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB.

1 gr 1 ml 1 ml Préparation des
dilutions décimales

9 ml
yaourt TSE

Dilution Dilution Dilution

0,1 ml 10 -1 10 -2 10 -3
Ensemencement
(en surface)

Incubation
37°C 24 h

Confirmation : test
de coagulase .. . . ..
.. .. . .
.
.
75 UFC 61 UFC 65 UFC …
5 UFC 3 UFC 7 UFC
615 UFC 596 UFC 589 UFC

Comptage
Des colonies

m1 = 600 UFC m2 = 67 UFC m3 = 5 UFC

Dénombrement

Appliquer la loi de Kass N = m x 1/V x1/D.

Choisir la moyenne située entre 15 et 150 colonies : 15 < m2 <150.
La dilution qui correspond à la série de tubes de m2 est 10-2 .
Le volume ensemencé V =0,1 ml.
N = 67 x 0.1/1 x 1/10-2
N = 67.103 UFC de P. aeruginosa /gr (ou ml).