08 0 201-Iso - 15216-2

Projet de PNM ISO 15216-2
IC 08.0.201
Norme Marocaine 2020
ICS : 07.100.30
ne
Microbiologie de la chaîne alimentaire
ai
oc
Méthode horizontale pour la recherche
des virus de l'hépatite A et norovirus par
ar
la technique RT-PCR en temps réel
Partie 2 : Méthode de détection

m
e
rm
no
Norme Marocaine homologuée

Par décision du Directeur de l’Institut Marocain de Normalisation N°........ , publiée au B.O N° ....
de
La présente norme annule et remplace la NM ISO/TS 15216-2 homologuée en 2014.
Correspondance
et
La présente norme est une reprise intégrale de la norme ISO 15216-2:2019.

oj
Pr
Droits d'auteur
Droit de reproduction réservés sauf prescription différente aucune partie de cette publication ne peut
être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé électronique ou
mécanique y compris la photocopie et les microfilms sans accord formel. Ce document est à usage
exclusif et non collectif des clients de l'IMANOR, Toute mise en réseau, reproduction et rediffusion, sous
quelque forme que ce soit, même partielle, sont strictement interdites.
Institut Marocain de Normalisation (IMANOR) © IMANOR 2020 – Tous droits réservés

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Tél : 05 37 57 19 48/49/51/52 - Fax : 05 37 71 17 73
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PNM ISO 15216-2:2020
Avant-Propos National
L’Institut Marocain de Normalisation (IMANOR) est l’Organisme National de Normalisation. Il a été créé
ne
par la Loi N° 12-06 relative à la normalisation, à la certification et à l’accréditation sous forme d’un
Etablissement Public sous tutelle du Ministère chargé de l’Industrie et du Commerce.
ai
Les normes marocaines sont élaborées et homologuées conformément aux dispositions de la
Loi N° 12- 06 susmentionnée.
oc
La présente norme marocaine NM ISO 15216-2 a été examinée et adoptée par la
Commission de Normalisation des méthodes d'analyse, échantillonnage alimentaires (029)
ar
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Pr
NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Sommaire Page
Avant-propos.................................................................................................................................................................................................................................v
Introduction................................................................................................................................................................................................................................. vi
1 Domaine d’application.................................................................................................................................................................................... 1
ne
2 Références normatives.................................................................................................................................................................................... 1
3 Termes et définitions........................................................................................................................................................................................ 1
4 Principe........................................................................................................................................................................................................................... 3
ai
4.1 Extraction de virus............................................................................................................................................................................... 3
4.2 Extraction d’ARN..................................................................................................................................................................................... 3
4.3 RT-PCR en temps réel......................................................................................................................................................................... 3
oc
4.4 Témoins.......................................................................................................................................................................................................... 4
4.4.1 Virus témoin de processus....................................................................................................................................... 4
4.4.2 Témoin ARN CE.................................................................................................................................................................. 4
4.5 Résultats des essais.............................................................................................................................................................................. 4
ar
5 Réactifs............................................................................................................................................................................................................................ 5
5.1 Généralités................................................................................................................................................................................................... 5
5.2 Réactifs utilisés dans l’état............................................................................................................................................................. 5
6
5.3
m
Réactifs nécessitant une préparation................................................................................................................................... 6
Équipement et consommables................................................................................................................................................................ 7
7 Échantillonnage...................................................................................................................................................................................................... 9
e
8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 9
8.1 Exigences générales de laboratoire........................................................................................................................................ 9
rm
8.2 Extraction de virus............................................................................................................................................................................... 9

8.2.1 Généralités............................................................................................................................................................................. 9
8.2.2 Virus témoin de processus....................................................................................................................................... 9
8.2.3 Témoin négatif de processus.................................................................................................................................. 9
no
8.2.4 Surfaces..................................................................................................................................................................................... 9
8.2.5 Baies et légumes feuilles, tiges et bulbes.................................................................................................. 10
8.2.6 Eau embouteillée........................................................................................................................................................... 11
8.2.7 Mollusques bivalves (MBV).................................................................................................................................. 11
8.3 Extraction d’ARN.................................................................................................................................................................................. 12
de
8.4 RT-PCR en temps réel...................................................................................................................................................................... 12

8.4.1 Exigences générales.................................................................................................................................................... 12
8.4.2 Analyse de RT-PCR en temps réel.................................................................................................................... 13
9 Interprétation des résultats...................................................................................................................................................................15
9.1 Généralités................................................................................................................................................................................................ 15
et
9.2 Élaboration des courbes étalon d’ARN du virus témoin de processus.................................................. 15

9.3 Contrôle de l’inhibition de la RT-PCR................................................................................................................................ 15
9.4 Calcul du rendement d’extraction........................................................................................................................................ 16
oj
10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................16

11 Caractéristiques de performance de la méthode.............................................................................................................17
11.1 Étude de validation........................................................................................................................................................................... 17
Pr
11.2 Sensibilité.................................................................................................................................................................................................. 17
11.3 Spécificité................................................................................................................................................................................................... 17
11.4 LDD50............................................................................................................................................................................................................... 17
12 Rapport d’essai.....................................................................................................................................................................................................17
Annexe A (normative) Diagramme de mode opératoire...............................................................................................................19
Annexe B (normative) Composition et préparation des réactifs et des tampons................................................20
Annexe C (informative) Mélanges réactionnels de RT-PCR en temps réel et paramètres de cycles.23
© ISO 2019 – Tous droits réservés iii

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Annexe D (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la RT-PCR en temps réel pour la

détection du VHA, du norovirus GI et GII et du mengovirus (témoin de processus)...................24
Annexe E (informative) Multiplication de la souche du mengovirus MC0 utilisé comme
témoin de processus.......................................................................................................................................................................................27
Annexe F (informative) Extraction d’ARN avec le système NucliSens® de chez BioMérieux....................28
ne
Annexe G (informative) Solutions mères d’ARN contrôle externe (ARN CE).............................................................30
Annexe H (informative) Disposition de plaque optique type...................................................................................................33
Annexe I (informative) Études de validation de la méthode et caractéristiques de performances..35
ai
Bibliographie............................................................................................................................................................................................................................ 47
oc
ar
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iv © ISO 2019 – Tous droits réservés

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
ne
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
ai
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
oc
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
ar
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
m
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
e
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
rm
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique du Comité européen de normalisation (CEN)
no
CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires — Méthodes horizontales, en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de
coopération technique établi entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace ISO/TS 15216-2:2013, qui a fait l’objet d’une révision
de
technique avec les changements suivants:

— une exigence concernant l’utilisation d’un tampon adapté pour la dilution des témoins a été ajoutée;
— la méthode de préparation de l’ARN du virus témoin de processus pour la courbe étalon a été
modifiée;
et
— des points d’arrêt avec des paramètres définis de température et de temps dans les méthodes
d’extraction ont été ajoutés;
oj
— le terme «efficacité d’amplification» a été remplacé par «inhibition de la RT-PCR»;

— des réactions supplémentaires de RT-PCR en temps réel pour l’ARN de l’échantillon et les témoins
Pr
négatifs ont été ajoutées;

— les caractéristiques de la méthode et les résultats des études de validation de la méthode ont été
ajoutés.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 15216 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
© ISO 2019 – Tous droits réservés v

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Introduction
Le virus de l’hépatite A (VHA) et les norovirus sont des agents importants de maladies virales d’origine
alimentaire, chez l’humain. Aucune méthode de routine n’existe pour la culture des norovirus, et les
méthodes de culture du VHA ne sont pas adaptées à l’application en routine aux matrices alimentaires.
La détection dépend ainsi des méthodes moléculaires qui utilisent une transcription inverse suivie
ne
d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Étant donné que de nombreuses matrices
alimentaires contiennent des substances inhibitrices de la technique RT-PCR, il est nécessaire d’utiliser
une méthode d’extraction produisant des préparations d’ARN extrêmement pures et adaptées à
l’usage. En ce qui concerne les surfaces, les virus sont prélevés par écouvillonnage. L’extraction de
ai
virus dans les baies et les légumes feuilles, tiges et bulbes s’effectue par élution sous agitation suivie
d’une précipitation au PEG/NaCl. Pour l’eau embouteillée, une adsorption et une élution utilisant
des membranes chargées positivement, suivies d’une étape de concentration par ultrafiltration sont
oc
utilisées. Les virus contaminant les mollusques bivalves (MBV) sont extraits des tissus digestifs par
traitement avec une solution de protéinase K. Pour toutes les matrices qui ne sont pas couvertes par le
présent document, il est nécessaire de valider cette méthode. La méthode d’extraction d’ARN, commune
à toutes les matrices, est basée sur la lyse de la capside du virus par des réactifs chaotropiques, suivie
ar
d’une adsorption de l’ARN sur des particules de silice. La technique de RT-PCR en temps réel permet
de suivre l’amplification tout au long des cycles de RT-PCR en temps réel en mesurant l’excitation de
molécules marquées par fluorescence. Lors d’une RT-PCR en temps réel utilisant une sonde d’hydrolyse,
le marqueur fluorescent est fixé à une sonde nucléotidique spécifique d’une séquence, ce qui permet
m
une confirmation simultanée de la présence de la séquence cible. Ces modifications augmentent la
sensibilité et la spécificité de la méthode de RT-PCR en temps réel, et rendent alors inutiles les étapes
de confirmation post RT-PCR du produit amplifié. En raison de la complexité de la méthode, il est
nécessaire d’inclure une série exhaustive de témoins. La méthode décrite dans le présent document
e
permet la détection des ARN viraux dans l’échantillon pour essai. L’Annexe A présente un diagramme
de mode opératoire.
rm
Les principales modifications énumérées dans l’Avant-propos, introduites dans le présent document
par rapport à l’ISO/TS 15216-2:2013, sont considérées comme mineures (voir l’ISO 17468).
no
de
et
oj
Pr
vi © ISO 2019 – Tous droits réservés

NM ISO 15216-2:2020
NORME INTERNATIONALE ISO 15216-2:2019(F)
Microbiologie dans la chaine alimentaire — Méthode

horizontale pour la recherche des virus de l'hépatite A et
norovirus par la technique RT-PCR en temps réel —
ne
Partie 2:
Méthode de détection
ai
oc
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détection du virus de l’hépatite A (VHA) et des norovirus
des génogroupes I (GI) et II (GII) dans des échantillons pour essai d’aliments (baies, légumes feuilles,
ar
tiges et bulbes, eau embouteillée, mollusques bivalves) ou sur des surfaces par RT-PCR en temps réel.
Cette méthode n’est pas validée pour la détection des virus cibles dans d’autres aliments (y compris
les aliments à plusieurs composants) ou d’autres matrices, ni pour la détection d’autres virus dans les
aliments, sur les surfaces ou dans d’autres matrices.
2 Références normatives
m
e
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
rm
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l'amplification et à la détection
no
pour les méthodes qualitatives

ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
de
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
et
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 20838, l’ISO 22119, l’ISO 22174
ainsi que les suivants, s’appliquent.
oj
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp;
Pr
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/.

3.1
aliment
substance utilisée ou préparée pour être utilisée comme aliment
Note 1 à l'article: Pour les besoins du présent document, cette définition inclut l’eau embouteillée.
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NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

3.2
surface
surface des aliments, surface de préparation des aliments ou surface en contact avec les aliments
3.3
baies
petit fruit comestible sans noyau
ne
EXEMPLE Fraises, framboises, groseilles.
3.4
légumes feuilles, tiges et bulbes
ai
feuilles, tiges et bulbes de végétaux consommés en tant que légumes
EXEMPLE Laitue, oignons verts.
oc
3.5
virus de l’hépatite A
VHA
ar
membre de la famille des Picornaviridae responsable d’hépatite infectieuse
Note 1 à l'article: Génétiquement, le VHA peut être subdivisé en six génotypes sur la base de la région VP1/2A
(des génotypes 1, 2 et 3 ont été trouvés chez les humains alors que les génotypes 4, 5 et 6 sont d’origine simienne).
Il n’existe qu’un sérotype.
m
Note 2 à l'article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation
d’aliments (3.1) contaminés, par contact avec de l’eau ou des surfaces (3.2) contaminées, ou par contact avec des
matières contaminées. Le VHA est classé comme étant un agent biologique de groupe 2 par l’Union européenne et
e
un agent pathogène du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.
rm
3.6
norovirus
membre de la famille des Caliciviridae responsable de cas sporadiques et d’épidémies de
gastroentérites aiguës
no
Note 1 à l'article: Génétiquement, les norovirus peuvent être subdivisés en sept génogroupes distincts. Trois de
ces génogroupes, GI, GII et GIV, ont été impliqués dans des troubles gastro-intestinaux chez l’homme. GI et GII
sont responsables de la grande majorité des cas cliniques.
Note 2 à l'article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments
(3.1) contaminés, par contact avec de l’eau ou des surfaces (3.2) contaminées, ou par contact avec des matières
de
contaminées. Les norovirus GI et GII sont classés comme étant des agents biologiques de groupe 2 par l’Union
européenne et des agents pathogènes du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.
3.7
détection du VHA
détection de l’ARN du VHA (3.5) dans une masse ou un volume d’aliments (3.1) ou sur une superficie de
et
surface (3.2) prédéterminés

3.8
oj
détection des norovirus

détection de l’ARN du norovirus (3.6) dans une masse ou un volume d’aliments (3.1) ou sur une superficie
de surface (3.2) prédéterminés
Pr
3.9
virus témoin de processus
virus ajouté à la prise d’échantillon, avant de commencer l’extraction du virus, afin de contrôler le
rendement d’extraction
3.10
ARN du virus témoin
ARN extrait du virus témoin de processus (3.9) permettant d’établir une courbe étalon en vue de
l’estimation du rendement d’extraction
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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ISO 15216-2:2019(F)

3.11
témoin négatif d’extraction d’ARN
témoin sans ARN cible soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’ARN et de détection
permettant de s’assurer de l’absence de contamination
3.12
témoin négatif de processus
ne
échantillon de la matrice alimentaire sans agent pathogène cible, ou échantillon n’appartenant pas à la
matrice sans agent pathogène cible, soumis à toutes les étapes du processus analytique
3.13
sonde d’hydrolyse
ai
sonde fluorescente couplée à une molécule fluorescente et une molécule quencher, qui sont séparées de
façon stérique par l’activité d’exonucléasique 5‘-3‘ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
oc
3.14
témoin négatif de RT-PCR en temps réel
aliquot d’eau très pure utilisée dans une RT-PCR en temps réel permettant de s’assurer de la non-
contamination des réactifs de RT-PCR en temps réel
ar
3.15
ARN contrôle externe
ARN CE
m
ARN de référence pouvant être utilisé pour évaluer l’inhibition de l’amplification d’une réaction de
RT-PCR en temps réel appropriée, qui est ajouté à un aliquot d’ARN de l’échantillon selon une quantité
donnée dans une réaction distincte
e
EXEMPLE ARN synthétisé par transcription in vitro à partir d’un plasmide portant une copie du gène cible.
rm
3.16
valeur Cq
cycle de quantification, correspondant au moment réactionnel où la cible est quantifiée pour une
réaction donnée de RT-PCR en temps réel
no
Note 1 à l'article: Cela correspond au cycle auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.
4 Principe
de
4.1 Extraction de virus

Les aliments et les surfaces couverts par le présent document sont souvent des matrices hautement
complexes et les virus cibles peuvent être présents à de faibles concentrations. Il est donc nécessaire
d’effectuer une extraction et/ou une concentration du virus propre à la matrice afin de produire un
substrat pour les parties communes ultérieures du processus. Le choix de la méthode dépend de la
et
matrice.
4.2 Extraction d’ARN

oj
Il est nécessaire d’extraire l’ARN en utilisant une méthode qui permet d’obtenir des préparations d’ARN
de pureté appropriée afin de réduire les effets des inhibiteurs de RT-PCR. Dans le présent document,
Pr
le thiocyanate de guanidinium, réactif chaotropique, est utilisé pour la lyse de la capside virale. L’ARN
est ensuite adsorbé sur de la silice afin de faciliter la purification à travers plusieurs étapes de lavage.
L’ARN viral purifié est libéré de la silice dans un tampon avant la RT-PCR en temps réel.
4.3 RT-PCR en temps réel

Le présent document utilise la RT-PCR en temps réel en une étape avec des sondes d’hydrolyse. Dans la
technique de RT-PCR en temps réel en une étape, la transcription inverse et l’amplification par PCR sont
effectuées consécutivement dans le même tube.

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

La RT-PCR en temps réel utilisant des sondes d’hydrolyse comprend une sonde d’ADN courte marquée
par une molécule fluorescente et un quencher fluorescent respectivement aux extrémités 5’ et 3’. La
chimie de cette réaction garantit qu’au cours du processus d’amplification de la cible, la sonde est
hydrolysée et le signal fluorescent libéré par la sonde augmente proportionnellement.
En raison des faibles concentrations de virus cible dans les aliments ou sur les surfaces et de la diversité
des souches dans les virus cibles, il est important de sélectionner de façon adéquate des réactifs pour
ne
RT-PCR en temps réel en une étape, des amorces PCR et des sondes d’hydrolyse adaptés aux virus cibles.
Pour cela, des lignes directrices sont données en 5.2.19 et 5.2.20. Des exemples détaillés de réactifs,
d’amorces et de sondes (utilisés lors de l’élaboration du présent document) sont fournis dans les
Annexes C et D.
ai
4.4 Témoins
oc
4.4.1 Virus témoin de processus
Des pertes de virus cible peuvent se produire à différentes étapes lors de l’extraction de virus dans
l’échantillon et de l’extraction de l’ARN. Afin de contrôler ces pertes, les échantillons sont contaminés
ar
artificiellement dès que cela est possible avant de commencer l’extraction du virus avec une quantité
définie de virus témoin de processus. Le niveau de récupération du virus témoin de processus doit être
déterminé pour chaque échantillon.
m
Le virus sélectionné en tant que témoin de processus doit être un virus cultivable, non enveloppé, à
ARNsb (simple brin) de polarité positive, de taille similaire aux virus cibles afin de fournir un modèle
morphologique et physico-chimique correct. Le virus témoin de processus doit montrer une persistance
dans l’environnement semblable aux virus cibles. Le virus doit être suffisamment différent sur le plan
e
génétique par rapport aux virus cibles afin de ne pas avoir de réactions RT-PCR en temps réel croisées
entre virus cibles et virus témoins, et sa présence dans les aliments ou sur les surfaces à l’état naturel
rm
ne doit normalement pas être possible.

Un exemple de préparation du virus témoin de processus (utilisé lors de l’élaboration du présent
document) est fourni à l’Annexe E.
no
4.4.2 Témoin ARN CE
Des substances inhibitrices de la RT-PCR sont contenues dans de nombreuses matrices alimentaires,
mais peuvent également provenir d’une contamination due à un traitement effectué en amont. Afin
d’évaluer l’éventuelle inhibition de la RT-PCR dans un échantillon individuel, un ARN CE (une séquence
de
d’ARN comportant la séquence cible d’intérêt, 5.3.11) est ajouté à un aliquot d’ARN de l’échantillon et
soumis à essai en utilisant la méthode RT-PCR en temps réel. Une comparaison des résultats de cet essai
avec les résultats d’un ARN CE amplifié en l’absence d’ARN de l’échantillon permet la détermination du
niveau d’inhibition de la RT-PCR pour chaque échantillon soumis à essai. De plus, dans cette méthode, le
témoin ARN CE agit comme un témoin positif de la RT-PCR en temps réel pour les virus cibles.
et
Il est permis d’appliquer des approches différentes pour l’évaluation de l’inhibition de la RT-PCR à
condition qu’il soit possible de démontrer que les performances sont équivalentes à celles de la méthode
oj
utilisant l’ARN CE.
4.5 Résultats des essais

Pr
En ce qui concerne les surfaces, cette méthode fournit un résultat exprimé par «génome de virus
détecté» ou par «génome de virus non détecté», suivi de «dans x cm2» où x est la surface approximative
de la zone prélevée. Lorsqu’il n’est pas possible d’enregistrer la surface de prélèvement, les résultats
sont exprimés par «génome de virus détecté» ou «génome de virus non détecté». Pour les autres types
d’échantillons, les résultats sont exprimés par «génome de virus détecté» ou par «génome de virus non
détecté» suivi de «dans x ml» ou «dans x g», où x est la quantité d’échantillon soumis à essai.

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

5 Réactifs
5.1 Généralités
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
En ce qui concerne les pratiques de laboratoires en vigueur, voir l’ISO 7218.
ne
5.2 Réactifs utilisés dans l’état
ai
5.2.1 Eau de qualité biologie moléculaire.
5.2.2 Polyéthylène glycol (PEG), de masse moléculaire relative moyenne 8 000.
oc
5.2.3 Chlorure de sodium (NaCl).
ar
5.2.4 Chlorure de potassium (KCl).
5.2.5 Hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4).
5.2.6 Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4).
5.2.7 Tris base.

m
e
5.2.8 Glycine.
rm
5.2.9 Extrait de bœuf en poudre.
5.2.10 Protéinase K.
no
5.2.11 Pectinase d’Aspergillus niger ou A. aculeatus.
5.2.12 Chloroforme.
de
5.2.13 n-Butanol.
5.2.14 Hydroxyde de sodium (NaOH) (≥10 mol/l).

et
5.2.15 Acide chlorhydrique (HCl) (≥5 mol/l).
5.2.16 Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), sel disodique dihydraté.

oj
5.2.17 Silice, tampons de lyse, de lavage et d’élution pour l’extraction de l’ARN viral. Les réactifs
doivent permettre de traiter 500 μl d’extrait d’échantillon, par réaction de lyse dans un tampon
Pr
chaotropique contenant du thiocyanate de guanidinium[4] et en utilisant la silice comme matrice de

capture de l’ARN. Après traitement de l’ARN lié à la silice par un ou des tampons de lavage éliminant les
impuretés, l’ARN doit être élué dans 100 µl de tampon d’élution.
La préparation d’ARN doit être d’une qualité et d’une concentration adaptées aux fins prévues. Voir
l’Annexe F pour les détails d’un exemple de réactifs d’extraction d’ARN (utilisés lors de l’élaboration de
la méthode décrite dans le présent document).

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5.2.18 Réactifs pour la RT-PCR en temps réel en une étape. Les réactifs doivent permettre le
traitement de 5 µl d’ARN dans un volume total de 25 µl. Ils doivent être adaptés à la RT-PCR en temps
réel en une étape en utilisant des sondes d’hydrolyse (l’ADN polymérase utilisée doit posséder une
activité exonucléasique 5’-3’) et ils doivent présenter une sensibilité suffisante pour la détection de
concentrations des ARN viraux attendus dans les aliments et les surfaces contaminés par des virus. Voir
l’Annexe C pour les détails d’un exemple de réactifs utilisés pour la RT-PCR en temps réel en une étape
(utilisés lors de l’élaboration du présent document).
ne
5.2.19 Amorces et sondes d’hydrolyse pour la détection du VHA et des norovirus GI et GII. Les
séquences d’amorces et de sondes d’hydrolyse doivent être publiées dans une revue révisée par des
pairs et doivent être vérifiées par utilisation sur un large éventail de souches du virus cible. Les amorces
ai
de détection du VHA doivent cibler la région 5’ non codante du génome. Les amorces de détection du
norovirus GI et GII doivent cibler la jonction ORF1/ORF2 du génome. Voir l’Annexe D pour les détails
d’un exemple d’amorces et de sondes d’hydrolyse utilisées pour la détection du VHA et des norovirus GI
oc
et GII (utilisés lors de l’élaboration du présent document).
5.2.20 Amorces et sondes d’hydrolyse pour la détection de virus témoin de processus. Les
ar
séquences d’amorce et de sonde d’hydrolyse doivent être publiées dans une revue révisée par des pairs
et doivent être comparées aux séquences de la souche de virus témoin de processus. Elles ne doivent
démontrer aucune réactivité croisée avec les virus cibles. Voir l’Annexe D pour les détails d’un exemple
d’amorces et de sondes d’hydrolyse utilisées pour la détection du virus témoin de processus (utilisés lors
de l’élaboration du présent document).
5.3 Réactifs nécessitant une préparation

m
e
En raison du nombre élevé de réactifs requérant une préparation individuelle, les détails de composition
et de préparation sont donnés dans l’Annexe B. Les instructions données dans l’Annexe B doivent être
rm
suivies lors de la préparation des réactifs indiqués en 5.3.1 à 5.3.8.
5.3.1 Solution de 5 × PEG/NaCl (PEG 8 000 500 g/l, NaCl1,5 mol/l). Voir B.1.

no
5.3.2 Mélange chloroforme/butanol (1:1 v/v). Voir B.2.
5.3.3 Solution de protéinase K (3 000 U/l). Voir B.3.
5.3.4 Tampon phosphate salin (PBS). Voir B.4.

de
5.3.5 Tampon Tris/glycine/extrait de bœuf (TGBE). Voir B.5.
5.3.6 Solution Tris (1 mol/l). Voir B.6.

et
5.3.7 Solution d’EDTA (0,5 mol/l). Voir B.7.

oj
5.3.8 Tampon Tris EDTA (TE) (Tris 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l). Voir B.8.
5.3.9 Virus témoin de processus. La solution mère de virus témoin de processus doit être diluée par
Pr
un facteur de 10 au minimum dans un tampon approprié, par exemple le PBS (5.3.4). Cette dilution doit
permettre une détection sans inhibition du génome du virus témoin de processus lors d’une RT-PCR
en temps réel, mais doit être suffisamment concentrée pour déterminer, de façon reproductible, la plus
faible dilution utilisée pour la courbe étalon de l’ARN du virus témoin de processus (voir 8.4.2.2). Diviser
la solution de virus témoin de processus en aliquots à usage unique et les conserver à une température
inférieure ou égale à −15 °C. Voir l’Annexe E pour les détails d’un exemple de préparation de virus témoin
de processus (utilisé lors de l’élaboration de la méthode décrite dans le présent document).

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5.3.10 Mélanges réactionnels pour la RT-PCR en temps réel pour les virus cibles et témoin de
processus. Les réactifs doivent être ajoutés dans des quantités telles que spécifiées par les fabricants
(5.2.18) afin d’obtenir un mélange réactionnel de 20 µl par réaction dans un volume total de 25 µl. Des
concentrations optimales d’amorces et de sondes doivent être utilisées, après leur détermination, en
suivant les recommandations des fabricants de réactif. Voir l’Annexe C pour les détails d’un exemple de
mélanges réactionnels pour la RT-PCR en temps réel (utilisés lors de l’élaboration du présent document).
ne
5.3.11 ARN contrôle externe (CE). Des ARNsb purifiés portant chacun la séquence cible de chaque virus
cible doivent être utilisés. Ils doivent contenir des concentrations d’ADN cible contaminant inférieures à
0,1 % et ne doivent pas induire d’inhibition de la RT-PCR. Les concentrations de chaque solution mère
d’ARN CE en nombre de copies par microlitre doivent être déterminées puis la solution mère doit être
ai
diluée dans un tampon approprié, par exemple le tampon TE (5.3.8), jusqu’à une concentration de 1 × 102
à 1 × 105 copies d’ADN par microlitre. La concentration utilisée doit être adaptée aux types d’échantillons
soumis à essai et doit garantir que les calculs d’inhibition de la RT-PCR ne sont pas affectés par la présence
oc
d’ARN cible endogène dans les échantillons. L’EDTA pouvant jouer un rôle d’inhibiteur de la RT-PCR, les
tampons utilisés pour diluer l’ARN CE ne doivent pas contenir d’EDTA à des concentrations supérieures
à 1 mmol/l. Diviser la préparation d’ARN CE diluée (témoin ARN CE) en aliquots à usage unique et les
conserver à 5 °C (6.4) jusqu’à 24 h, à une température inférieure ou égale à −15 °C jusqu’à 6 mois, ou à
ar
une température inférieure ou égale à −70 °C pour une conservation plus longue. Voir l’Annexe G pour les
détails d’un exemple de préparation d’ARN CE (utilisée lors de l’élaboration du présent document).
m
e
6 Équipement et consommables
rm
Un équipement courant de laboratoire de microbiologie (voir ISO 7218) doit être utilisé, notamment ce
qui suit.
6.1 Micropipettes et pointes de différentes capacités, par exemple 1 000 μl, 200 μl, 20 μl, 10 μl. Des
no
pointes résistant aux aérosols doivent être utilisées, sauf si des pointes sans filtre sont exigées, par
exemple pour l’aspiration (comme en 6.8 et F.3).
6.2 Poire à pipeter et pipettes de différentes capacités, par exemple 25 ml, 10 ml, 5 ml.
de
6.3 Agitateur vortex.
6.4 Réfrigérateur, capable de fonctionner à (5 ± 3) °C.
6.5 Agitateur, capable de fonctionner à une vitesse d’environ 50 oscillations min−1.

et
6.6 Incubateur agitateur, fonctionnant à (37 ± 2) °C à une vitesse d’environ 320 oscillations min−1 ou

équivalent.
oj
6.7 Plateforme(s) rotative(s) ou équivalent pour une utilisation à température ambiante et à

Pr
(5 ± 3) °C à une vitesse d’environ 60 oscillations min−1.
6.8 Système d’aspiration ou appareillage équivalent pour l’élimination du surnageant.
6.9 Bain-marie, capable de fonctionner à (60 ± 2) °C ou l’équivalent.

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6.10 Centrifugeuse(s) et rotor(s) ayant les fonctionnalités suivantes en termes de capacités du rotor,
de vitesses et de températures:
a) 10 000 x g à (5 ± 3) °C et acceptant des tubes d’un volume d’au moins 35 ml;
b) 10 000 x g à (5 ± 3) °C et acceptant des tubes résistants au chloroforme d’un volume de 2 ml;
ne
c) 4 000 x g à température ambiante, fonctionnant avec des filtres centrifuges concentrateurs (6.16).
6.11 Tubes et flacons pour centrifugeuses de différentes capacités, 1,5 ml, 5 ml, 15 ml, 50 ml, etc. Des
tubes résistants au chloroforme ayant une capacité de 2 ml sont nécessaires.
ai
6.12 pH-mètre (ou bandelettes indicatrices de pH avec des graduations de 0,5 unité de pH ou moins).
oc
6.13 Écouvillons stériles en coton.
6.14 Sacs avec filtres (400 ml).
ar
6.15 Membranes filtrantes chargées positivement, avec une taille de pores de 0,45 μm (47 mm de
diamètre).
m
6.16 Filtres centrifuges concentrateurs, d’une capacité de 15 ml et avec un seuil de coupure de masse
moléculaire relative de 100 kDa.
e
6.17 Source de vide ou appareil à pression positive équivalent pour la filtration et tour de filtration
ayant une ouverture pour une membrane de 47 mm de diamètre.
rm
6.18 Couteau à huître stérile ou outils équivalents pour l’ouverture des mollusques bivalves.
6.19 Bloc de caoutchouc ou appareil équivalent pour le maintien des mollusques bivalves pendant
no
l’ouverture.
6.20 Ciseaux et pinces ou outils équivalents pour la dissection des mollusques bivalves.
6.21 Boîtes de Petri stériles.

de
6.22 Lames de rasoir ou outils équivalents pour hacher les tissus digestifs des mollusques bivalves.
6.23 Gants de sécurité résistants.

et
6.24 Appareil d’extraction de l’ARN, approprié pour les méthodes utilisant la silice et les réactifs
associés (5.2.17). Voir l’Annexe F pour les détails d’un exemple d’appareil d’extraction de l’ARN (utilisés
lors de l’élaboration du présent document).
oj
6.25 Machine(s) PCR en temps réel, c’est-à-dire thermocycleur(s) équipé(s) d’une source appropriée
Pr
pour l’excitation des molécules fluorescentes et d’un système de détection optique pour la détection
en temps réel des signaux de fluorescence générés pendant la RT-PCR en temps réel avec la chimie des
sondes d’hydrolyse.
6.26 Consommables associés à la technique RT-PCR en temps réel, par exemple des plaques optiques
et des bouchons, appropriés à l’utilisation avec la machine de RT-PCR en temps réel sélectionnée.

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7 Échantillonnage
S’il n’existe aucune Norme internationale spécifique traitant de l’échantillonnage du produit concerné,
il est recommandé que les parties concernées parviennent à un accord sur le sujet.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif et qui n’ait pas été endommagé
ni modifié lors du transport ou de l’entreposage, c’est-à-dire les échantillons ayant été congelés lors de
ne
leur prélèvement ne doivent pas être décongelés avant la réception par le laboratoire, et les échantillons
non congelés lors de leur prélèvement ne doivent pas être congelés avant la réception par le laboratoire.
8 Mode opératoire
ai
8.1 Exigences générales de laboratoire
oc
Le mode opératoire doit être tel que présenté dans le diagramme de l’Annexe A.
L’extraction de l’échantillon et la RT-PCR en temps réel doivent être effectuées dans des zones ou des
pièces séparées telles que spécifiées dans l’ISO 22174.
ar
8.2 Extraction de virus
8.2.1 Généralités
m
Le choix de la méthode dépend de la matrice alimentaire soumise à essai.
e
8.2.2 Virus témoin de processus
rm
Juste avant le traitement d’un lot d’échantillons pour essai, regrouper suffisamment d’aliquots du virus
témoin de processus (5.3.9) pour tous les échantillons pour essai (prévoir 10 µl par échantillon pour
essai et un excédent de 25 µl).
no
Conserver un aliquot de (20 ± 1) μl de virus témoin de processus pour l’extraction de l’ARN et la
préparation de la courbe étalon de l’ARN du virus témoin de processus (voir 8.4.2.2). Conserver à 5 °C
(6.4) jusqu’à 24 h, à une température inférieure ou égale à −15 °C jusqu’à 6 mois, ou à une température
inférieure ou égale à −70 °C pour une conservation plus longue.
8.2.3 Témoin négatif de processus

de
Un échantillon de témoin négatif de processus doit être soumis à essai en parallèle des échantillons
analysés à une fréquence établie dans le cadre du programme d’assurance qualité du laboratoire.
8.2.4 Surfaces
et
En utilisant un écouvillon en coton stérile préalablement imbibé de PBS (5.3.4), effectuer un prélèvement
intensif de la surface soumise à essai (zone maximale de 100 cm2), en appliquant une légère pression
oj
afin de détacher les particules virales. Lorsque c’est possible, enregistrer approximativement la surface
échantillonnée en centimètres carrés.
Pr
Traiter l’écouvillon immédiatement, ou le placer dans un récipient adapté et le conserver à 5 °C (6.4)
jusqu’à 72 h, à une température inférieure ou égale à −15 °C jusqu’à 6 mois, ou à une température
inférieure ou égale à −70 °C pour une conservation plus longue.
Ajouter (10 ± 0,5) μl de virus témoin de processus (voir 8.2.2) sur l’écouvillon.
Immédiatement après l’ajout du virus témoin de processus, plonger l’écouvillon dans un tube contenant
(490 ± 10) µl de tampon de lyse, tel qu’utilisé pour l’extraction d’ARN (5.2.17), puis presser contre la
paroi du tube afin de libérer le liquide. Répéter le cycle d’immersion et de pression trois ou quatre fois
afin d’assurer une récolte maximale de virus.

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Procéder immédiatement à l’extraction de l’ARN (voir 8.3).
8.2.5 Baies et légumes feuilles, tiges et bulbes
Les baies et les légumes feuilles, tiges et bulbes pour analyse doivent être frais ou congelés. Les
échantillons ne doivent avoir été soumis à aucun traitement autre que le hachage, le découpage, le
lavage, la décontamination, le conditionnement, etc., comme dans le cas des baies et des légumes feuilles,
ne
tiges et bulbes, etc., prédécoupés et conditionnés. La boue adhérant à la surface doit être enlevée avant
analyse en la frottant délicatement, mais sans immersion des échantillons dans l’eau.
Hacher grossièrement (25 ± 0,3) g de baies ou de légumes feuilles, tiges ou bulbes en morceaux
ai
d’environ 2,5 cm × 2,5 cm × 2,5 cm (il n’est pas nécessaire de hacher si, par exemple, les fruits sont plus
petits que la taille susmentionnée) et les disposer dans le compartiment réservé à l’échantillon d’un sac
avec filtre de 400 ml. Ajouter (10 ± 0,5) μl de virus témoin de processus (voir 8.2.2) sur l’échantillon.
oc
Ajouter (40 ± 1) ml de tampon TGBE (5.3.5) (pour les baies, ajouter ≥ 30 unités de pectinase d’A. niger
ou ≥ 1 140 unités de pectinase d’A. aculeatus au tampon [5.2.11]).
Incuber à température ambiante sur une table d’agitation à basculement constant à une vitesse
ar
d’environ 60 oscillations min−1 pendant (20 ± 1) min. En ce qui concerne les baies acides, le pH de l’éluat
doit être contrôlé toutes les 10 min pendant l’incubation. Si le pH descend en dessous de 9,0, il doit être
ajusté à 9,5 ± 0,5 avec du NaOH (≥ 10 mol/l). Prolonger la période d’incubation de 10 min chaque fois que
le pH est ajusté. Ne pas effectuer plus de trois ajustements de pH de ce type par échantillon. Décanter
recueillir la totalité du volume).

m
l’éluat à partir du compartiment filtré dans un tube à centrifuger (utiliser deux tubes si nécessaire pour
Clarifier par centrifugation à 10 000 x g pendant (30 ± 5) min à 5 °C (6.10).

e
Décanter le surnageant dans un seul tube ou flacon propre et ajuster le pH à 7,0 ± 0,5 avec du HCl
(≥ 5 mol/l).
rm
Ajouter 0,25 volume de solution de 5 × PEG/NaCl (5.3.1) (pour obtenir une concentration finale de
100 g/l de PEG, 0,3 mol/l NaCl), homogénéiser par agitation pendant (60 ± 5) s puis incuber sur une
table d’agitation à basculement constant à une vitesse d’environ 60 oscillations min−1 à 5 °C pendant
no
(60 ± 5) min (6.7).
Centrifuger à 10 000 x g pendant (30 ± 5) min à 5 °C (6.10). Répartir le volume dans deux tubes à
centrifuger si nécessaire.
Décanter et éliminer le surnageant, puis centrifuger à 10 000 x g pendant (5 ± 1) min à 5 °C (6.10) pour
de
obtenir un culot de centrifugation plus compact.

Éliminer le surnageant et mettre de nouveau en suspension le culot de centrifugation dans (500 ± 10) μl
de PBS (5.3.4). Pour les échantillons produisant de gros culots après centrifugation, un volume
supérieur allant jusqu’à (1 000 ± 20) µl de PBS peut être nécessaire pour remettre complètement le
culot en suspension. Si un seul échantillon a été réparti dans deux tubes, remettre en suspension les
et
deux culots de centrifugation au fur et à mesure dans un même aliquot de PBS en utilisant la même
pointe de pipette.
oj
Pour une extraction à partir de légumes feuilles, tiges ou bulbes, transférer la suspension dans un
tube approprié et le réserver pour l’extraction d’ARN (voir 8.3). L’extrait d’échantillon doit être traité
immédiatement, ou conservé à 5 °C (6.4) jusqu’à 24 h, à une température inférieure ou égale à −15 °C
Pr
jusqu’à 6 mois, ou à une température inférieure ou égale à −70 °C pour une conservation plus longue.
Pour une extraction à partir de baies, une étape supplémentaire d’extraction est requise. Transférer la
suspension dans un tube à centrifuger résistant au chloroforme (6.11). Ajouter (500 ± 10) μl de mélange
chloroforme/butanol (5.3.2), mélanger au vortex, puis incuber à température ambiante pendant 5 min.
Si plus de 500 μl de PBS ont été utilisés pour remettre le culot en suspension, ajouter un volume égal de
mélange chloroforme/butanol.
Centrifuger à 10 000 x g pendant (15 ± 1) min à 5 °C (6.10). Transférer avec soin la phase aqueuse
(supérieure) dans un nouveau tube et réserver pour l’extraction d’ARN (voir 8.3).

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L’extrait d’échantillon doit être traité immédiatement, ou conservé à 5 °C (6.4) jusqu’à 24 h, à une
température inférieure ou égale à −15 °C jusqu’à 6 mois, ou à une température inférieure ou égale à
−70 °C pour une conservation plus longue.
8.2.6 Eau embouteillée
Le présent document est approprié pour des volumes allant jusqu’à 2 l. Pour chaque échantillon, noter
ne
le volume soumis à essai.
Ajouter (10 ± 0,5) μl de virus témoin de processus (voir 8.2.2) à l’échantillon soumis à essai. Agiter pour
mélanger.
ai
En utilisant une source de vide ou une source de pression positive (6.17), filtrer l’ensemble de
l’échantillon sur une membrane de 47 mm chargée positivement (6.15). Transférer le filtre dans un tube
oc
stérile puis ajouter (4 ± 0,1) ml de tampon TGBE (5.3.5).
Ajouter (10 ± 0,2) ml de tampon TGBE dans la bouteille ayant contenu l’échantillon vide. Agiter le tube
et la bouteille à une vitesse d’environ 50 oscillations min−1 pendant (20 ± 5) min.
ar
Regrouper les éluats du tube et de la bouteille dans un seul et même tube propre.
Rincer les parois internes de la bouteille avec (2 ± 0,1) ml supplémentaires de tampon TGBE en agitant
m
et en retournant délicatement à la main et ajouter au tube.
Ajuster le pH des éluats à 7,0 ± 0,5 avec de l’HCl (≥ 5 mol/l) et transférer dans un filtre centrifuge
concentrateur (voir 6.16).
e
Centrifuger à 4 000 x g pendant (15 ± 1) min. Transférer le concentré dans un tube propre.
Ajuster le volume à (500 ± 10) μl avec du PBS (5.3.4). Réserver pour l’extraction d’ARN (voir 8.3).
rm
L’extrait d’échantillon doit être traité immédiatement, ou conservé à 5 °C (6.4) jusqu’à 24 h, à une
−70 °C pour une conservation plus longue.
no
8.2.7 Mollusques bivalves (MBV)
Les MBV destinés à être analysés doivent être vivants ou, s’ils sont congelés, non endommagés. Ils ne
doivent pas être cuits ni avoir été soumis à un autre traitement thermique. La vase restée sur la coquille
de
doit être enlevée. Les MBV ne doivent pas être replongés dans l’eau.
Ouvrir au minimum 10 MVB avec un couteau à huître stérile ou un outil équivalent. Lors de l’ouverture,
s’assurer que la main tenant l’animal est protégée par un gant de sécurité résistant et que l’animal est
maintenu à l’aide d’un bloc de caoutchouc ou équivalent.
et
Disséquer les tissus digestifs de tous les animaux en utilisant des ciseaux et des pinces ou des outils
équivalents et les transférer dans une boîte de Petri propre. Une masse minimale totale de (2,0 ± 0,2) g
de tissus est requise.
oj
Hacher finement les tissus digestifs avec une lame de rasoir ou des outils équivalents afin d’obtenir une
consistance pâteuse puis transférer une portion de (2,0 ± 0,2) g dans un tube à centrifuger.
Pr
Les tissus digestifs doivent être traités immédiatement, ou conservés à 5 °C (6.4) jusqu’à 24 h, ou à une
−70 °C pour une conservation plus longue [les tissus digestifs restant après le prélèvement de la portion
de (2,0 ± 0,2) g peuvent être conservés à une température inférieure ou égale à −15 °C jusqu’à 6 mois, ou
à une température inférieure ou égale à −70 °C pour une conservation plus longue].
Ajouter (10 ± 0,5) μl de virus témoin de processus (voir 8.2.2) directement à la portion de (2,0 ± 0,2) g.

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Ajouter (2,0 ± 0,2) ml de solution de protéinase K (5.3.3) et mélanger. Incuber à 37 °C sous agitation à
une vitesse d’environ 320 oscillations min−1 dans un incubateur agitateur (6.6) ou l’équivalent pendant
(60 ± 5) min.
Effectuer une deuxième incubation en plaçant le tube dans un bain-marie ou un dispositif équivalent à
60 °C (6.9) pendant (15 ± 1) min.
ne
Centrifuger à 3 000 x g pendant (5,0 ± 0,5) min à température ambiante, décanter le surnageant dans
un tube propre, mesurer et enregistrer le volume de surnageant en millilitres (les volumes récupérés
sont généralement compris entre 2,0 ml et 3,0 ml) et conserver pour l’extraction d’ARN (voir 8.3).
Le surnageant doit être traité immédiatement, ou conservé à 5 °C (6.4) jusqu’à 24 h, à une température
ai
inférieure ou égale à −15 °C jusqu’à 6 mois, ou à une température inférieure ou égale à −70 °C pour une
conservation plus longue.
oc
8.3 Extraction d’ARN
Extraire l’ARN à partir de (500 ± 10) μl de surnageant de chaque échantillon (MBV) ou de la totalité
de l’échantillon préparé (autres matrices) en utilisant une méthode appropriée basée sur une lyse par
ar
du thiocyanate de guanidinium et une adsorption sur silice. Éluer l’ARN purifié dans (100 ± 2) μl de
tampon d’élution et le réserver pour l’analyse par RT-PCR en temps réel.
m
L’ARN extrait doit être traité immédiatement, ou conservé à 5 °C (6.4) jusqu’à 24 h, à une température
inférieure ou égale à −15 °C jusqu’à 6 mois, ou à une température inférieure ou égale à −70 °C pour une
conservation plus longue. Pour chaque série d’échantillons pour essai, un témoin négatif d’extraction
d’ARN doit être inclus sauf si la série inclut un témoin négatif de processus (voir 8.2.3). Une extraction
e
d’ARN doit être effectuée en utilisant la même méthode en parallèle sur (500 ± 10) μl d’eau (5.2.1).
Voir l’Annexe F pour les détails d’un exemple de méthode d’extraction d’ARN (utilisés lors de l’élaboration
rm
du présent document).
8.4 RT-PCR en temps réel

no
8.4.1 Exigences générales
Les exigences minimales pour l’amplification et la détection des séquences d’acides nucléiques par RT-
PCR en temps réel sont spécifiées dans l’ISO 20838, l’ISO 22119 et l’ISO 22174.
de
Le présent document spécifie des méthodes de détection du VHA, des norovirus GI et des norovirus GII.
Dans certains cas, l’analyse des trois virus dans le même échantillon n’est pas nécessaire. Le mode
opératoire décrit dans les articles qui suivent permet l’analyse d’un échantillon pour essai pour un seul
type de virus (c’est-à-dire VHA, norovirus GI ou norovirus GII) et il comprend l’ensemble des témoins
recommandés. Les laboratoires souhaitant analyser plusieurs cibles doivent ajuster le format de la
et
réaction pour tenir compte des essais supplémentaires. Une disposition de plaque type est incluse à
l’Annexe H.
oj
Les résultats générés avec l’ARN de l’échantillon dilué au dixième (10−1) ne sont utilisés que si l’inhibition
de la RT-PCR est en dehors des limites d’acceptabilité pour l’ARN de l’échantillon non dilué (valeur Cq du
puits contenant l’ARN de l’échantillon non dilué + l’ARN CE est ≥ 2,00 fois la valeur Cq du puits contenant
Pr
l’eau + ARN CE) (voir 9.3). Pour les matrices pour lesquelles l’inhibition de la RT-PCR est normalement
comprise dans les limites d’acceptabilité (surfaces, eau embouteillée, MBV), les laboratoires sont donc
autorisés à ne pas inclure l’ARN de l’échantillon dilué au dixième (10−1) dans l’analyse initiale du virus
cible et du virus témoin de processus. Dans ce cas, lorsque l’inhibition de la RT-PCR se situe en dehors
des limites d’acceptabilité pour l’ARN de l’échantillon non dilué, l’analyse par RT-PCR en temps réel de
chaque virus cible concerné et du virus témoin de processus doit être répétée en utilisant l’ARN de
l’échantillon dilué au dixième. L’ARN de l’échantillon dilué au dixième ne doit pas être omis de l’analyse
initiale pour les baies et les légumes feuilles, tiges et bulbes (matrices où l’inhibition de la RT-PCR est
souvent en dehors des limites d’acceptabilité).

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

8.4.2 Analyse de RT-PCR en temps réel
ne
8.4.2.1 Analyse du virus cible
Préparer des dilutions au dixième (10−1) de chaque échantillon d’ARN dans de l’eau (5.2.1).
Pour chaque échantillon, préparer:
ai
— deux puits d’une plaque optique avec (5 ± 0,5) μl de l’échantillon d’ARN non dilué;
oc
— deux puits avec (5 ± 0,5) μl de l’échantillon d’ARN dilué au dixième (10−1);
— un puits avec (5 ± 0,5) μl de l’échantillon d’ARN non dilué et (1 ± 0,2) μl de l’ARN CE non dilué
(5.3.11);
ar
— un puits avec (5 ± 0,5 μl) de l’échantillon d’ARN dilué au dixième (10−1) et (1 ± 0,2) μl de l’ARN CE
non dilué.
Pour l’ARN CE, préparer:
m
— un puits avec (5 ± 0,5) µl d’eau (5.2.1) et (1 ± 0,2) μl d’ARN CE non dilué.
Pour les témoins négatifs, préparer:
e
— deux puits avec (5 ± 0,5) μl d’eau (5.2.1) agissant comme un témoin négatif de RT-PCR en temps réel;
rm
— deux puits avec (5 ± 0,5) μl de témoin négatif d’extraction d’ARN ou d’ARN témoin négatif de
processus.
Ajouter (20 ± 1) μl de mélange réactionnel de RT-PCR en temps réel (5.3.10) approprié à chaque puits. Le
no
mélange réactionnel peut aussi être ajouté à tous les puits appropriés avant l’ajout des acides nucléiques.
Dans la situation décrite ci-dessus, les échantillons d’ARN non dilué et dilué au dixième (10−1) sont
soumis à essai simultanément. Lorsque l’ARN n’est soumis à essai qu’à une concentration (voir 8.4.1), les
puits contenant l’autre concentration ne sont pas nécessaires.
de
8.4.2.2 Analyse du virus témoin de processus
Pour chaque série d’échantillons soumis à essai, préparer (10 ± 0,5) μl de virus témoin de processus
(voir 8.2.2) dans un volume de (500 ± 10) μl d’eau. Extraire et conserver l’ARN de chaque série en
utilisant la méthode et les conditions appliquées aux échantillons pour essai (voir 8.3).
et
Préparer des dilutions au dixième (10−1) de chaque échantillon d’ARN dans de l’eau (5.2.1).
Préparer des dilutions au dixième (10−1), au centième (10−2) et au millième (10−3) de l’ARN du virus
oj
témoin de processus dans de l’eau (5.2.1) ou dans un tampon approprié, par exemple le tampon TE
(5.3.8), pour chaque virus témoin de processus. L’EDTA pouvant être inhibiteur de la RT-PCR,
les tampons utilisés pour diluer l’ARN du virus témoin de processus ne doivent pas contenir de
Pr
concentrations d’EDTA supérieures à 1 mmol/l.

Pour chaque échantillon, préparer:
— un puits avec (5 ± 0,5) µl de l’échantillon d’ARN non dilué;
— un puits avec (5 ± 0,5 μl) de l’échantillon d’ARN dilué au dixième (10−1).

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Pour la courbe étalon d’ARN du virus témoin de processus, préparer:

— un puits avec (5 ± 0,5) µl d’ARN du virus témoin de processus non dilué;
— un puits avec (5 ± 0,5) µl d’ARN du virus témoin de processus dilué au dixième (10−1);
— un puits avec (5 ± 0,5) µl d’ARN du virus témoin de processus dilué au centième (10−2);
ne
— un puits avec (5 ± 0,5) µl d’ARN du virus témoin de processus dilué au millième (10−3).
Pour les témoins négatifs, préparer:
ai
— un puits avec (5 ± 0,5) μl d’eau (5.2.1) agissant comme un témoin négatif de RT-PCR en temps réel;
— un puits avec (5 ± 0,5) μl de témoin négatif d’extraction d’ARN ou d’ARN témoin négatif de processus.
oc
Ajouter (20 ± 1) μl de mélange réactionnel pour la RT-PCR en temps réel pour le virus témoin de
processus (5.3.10) approprié à chaque puits. Le mélange réactionnel peut aussi être ajouté à tous les
puits appropriés avant l’ajout des acides nucléiques.
ar
soumis à essai simultanément. Lorsque l’ARN n’est soumis à essai qu’à une concentration (voir 8.4.1), les
puits contenant l’autre concentration ne sont pas nécessaires.
8.4.2.3 Amplification
m
Soumettre la plaque à un cycle réactionnel comprenant une première étape de transcription inverse et
au moins 45 cycles de réaction PCR, au moyen d’une machine PCR en temps réel (6.25). La durée et les
e
températures de chaque étape (transcription inverse, désactivation de la RT, dénaturation, hybridation,
extension) dépendent des réactifs utilisés. Elles doivent être basées sur les recommandations du
rm
fabricant mais peuvent être optimisées ultérieurement.

Pour les machines PCR en temps réel pour lesquelles l’utilisateur peut sélectionner le point de collecte
des données de fluorescence, ce dernier doit être établi à la fin de l’étape d’extension.
no
Voir l’Annexe C pour les détails d’un exemple de méthode d’amplification (utilisés lors de l’élaboration
du présent document).
8.4.2.4 Analyse des données de fluorescence

de
Les exigences minimales concernant l’analyse des données d’amplification sont spécifiées dans
l’ISO 22174. Les courbes d’amplification doivent être analysées en utilisant l’approche recommandée
par le fabricant de la machine PCR en temps réel. Le seuil doit être établi de manière à croiser la zone où
les courbes d’amplification (échelle logarithmique) sont parallèles (phase exponentielle).
Toutes les courbes d’amplification doivent être vérifiées afin d’identifier des résultats faux positifs
et
(réactions avec des valeurs Cq non associées à l’amplification exponentielle) causés par un bruit
de fond élevé ou irrégulier. Cela doit être noté et les résultats issus de toutes les réactions affectées
de cette façon doivent être considérés comme négatifs. De plus, toutes les courbes de fluorescence
oj
positives valides doivent être vérifiées afin de s’assurer que la valeur Cq générée par le logiciel d’analyse
correspond à la phase exponentielle d’amplification pour ladite réaction (et qu’elle n’est pas perturbée
par un signal de bruit de fond élevé ou irrégulier). Lorsque les valeurs Cq sont perturbées, les valeurs Cq
Pr
corrigées doivent être enregistrées en plus de la valeur générée par le logiciel. Les valeurs Cq corrigées
doivent être utilisées pour les calculs de rendement d’extraction.

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9 Interprétation des résultats
9.1 Généralités
Chaque témoin (ARN CE, ARN du virus témoin de processus) possède une valeur ou une plage de valeurs
attendues valides. Si le résultat observé pour un des témoins est différent de la valeur attendue, il peut
ne
être nécessaire de soumettre de nouveau à essai les échantillons.
Les témoins négatifs [eau (5.2.1) et témoin de processus ou d’extraction d’ARN négatif] doivent toujours
être négatifs; si des résultats positifs apparaissent pour ces témoins, alors tous les échantillons donnant
des résultats positifs doivent être soumis de nouveau à essai.
ai
Lorsque les duplicats d’un échantillon donnent un résultat positif et un résultat négatif, le résultat
global pour cet échantillon doit être considéré comme positif.
oc
9.2 Élaboration des courbes étalon d’ARN du virus témoin de processus
Utiliser les résultats de la série de dilution de l’ARN du virus témoin de processus pour créer une
ar
courbe étalon, en représentant les valeurs Cq obtenues en fonction du log10 de la concentration afin de
déterminer r2 (où r est le coefficient de corrélation de Pearson), la pente et l’ordonnée à l’origine.
Les courbes ayant des valeurs r 2 < 0,980, ou dont la pente n’est pas comprise entre −3,10 et 3,60
m
(correspondant à des efficacités d’amplification comprises entre environ 90 % et 110 %), ne doivent
pas être utilisées pour les calculs. Dans ces cas, vérifier les valeurs Cq de la courbe étalon pour toutes
les valeurs aberrantes et supprimer ces valeurs de la série. Il ne doit pas être supprimé plus d’une telle
valeur Cq aberrante par série.
e
Répéter les calculs pour déterminer r2, la pente et l’ordonnée à l’origine. Lorsque la courbe modifiée
rm
présente une valeur r 2 < 0,980, ou lorsque la pente n’est pas comprise entre −3,10 et −3,60, la pente
modifiée ne doit pas être utilisée pour les calculs.
9.3 Contrôle de l’inhibition de la RT-PCR

no
Si la valeur Cq pour le puits contenant de l’ARN de l’échantillon non dilué + de l’ARN CE est < 2,00 fois
plus que la valeur Cq du puits contenant de l’eau + de l’ARN CE, les résultats de l’ARN non dilué doivent
être utilisés pour cet échantillon. Si la valeur Cq pour le puits contenant de l’ARN de l’échantillon non
dilué + de l’ARN CE est ≥ 2,00 fois plus que la valeur Cq du puits contenant de l’eau + de l’ARN CE, répéter
la comparaison avec le puits contenant l’ARN de l’échantillon dilué au dixième + l’ARN CE.
de
Si la valeur Cq pour le puits contenant de l’ARN de l’échantillon dilué au dixième + de l’ARN CE

est < 2,00 fois plus que la valeur Cq du puits contenant de l’eau + de l’ARN CE, les résultats de l’ARN
dilué au dixième doivent être utilisés pour cet échantillon. Si la valeur Cq du puits contenant de l’ARN
de l’échantillon dilué au dixième + de l’ARN CE est ≥ 2,00 fois plus que la valeur Cq du puits contenant de
et
l’eau + de l’ARN CE, les résultats peuvent ne pas être validés et il peut être nécessaire de soumettre de
nouveau à essai l’échantillon.
oj
soumis à essai simultanément. Lorsque seul l’ARN de l’échantillon non dilué est soumis à essai dans
un premier temps (voir 8.4.1), et lorsque la valeur Cq du puits contenant de l’ARN de l’échantillon non
dilué + de l’ARN CE est ≥ 2,00 plus que la valeur Cq du puits contenant de l’eau + de l’ARN CE, la RT-PCR
Pr
en temps réel doit être répétée en utilisant l’ARN de l’échantillon dilué au dixième et le calcul répété en
utilisant les résultats de l’analyse répétée.
Un échantillon montrant un niveau d’inhibition de la RT-PCR inacceptable mais produisant un résultat
positif par ailleurs valide peut, le cas échéant, être rapporté comme étant positif tel que décrit dans
l’Article 10.
Si la valeur Cq pour le puits contenant de l’ARN de l’échantillon non dilué + de l’ARN CE est < 2,00 fois plus
que la valeur Cq du puits contenant de l’eau + de l’ARN CE, mais que l’échantillon fournit des résultats

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positifs uniquement en utilisant l’ARN de l’échantillon dilué au dixième, les résultats de l’ARN dilué au
dixième doivent être utilisés pour cet échantillon.
Si d’autres méthodes sont utilisées pour la détermination de l’inhibition de la RT-PCR, ce mode
opératoire nécessite d’être adapté afin de fournir le même niveau de rigueur.
9.4 Calcul du rendement d’extraction
ne
Utiliser la valeur Cq de l’essai du virus témoin de processus à partir du puits contenant l’ARN de
l’échantillon pour essai (non dilué ou dilué au dixième selon les résultats de l’inhibition de la RT-PCR;
voir 9.3) pour estimer la récupération de virus témoin de processus à partir de la courbe étalon de
ai
l’ARN du virus témoin de processus (si les résultats de l’échantillon d’ARN dilué au dixième sont utilisés,
multiplier par 10 afin de corriger le facteur de dilution):
oc
Récupération du virus témoin de processus = 10(ΔCq/m) × 100 %
où
ar
ΔCq est la valeur Cq [ARN de l’échantillon] – valeur Cq [ARN du virus témoin de processus non
dilué];
m
m
est la pente de la courbe étalon d’ARN du virus témoin de processus.
Pour les échantillons de MBV, calculer le rendement d’extraction par référence à la récupération du
virus témoin de processus de la manière suivante:
e
Rendement d’extraction = (p/0,5) × v
rm
où
p est la récupération du virus témoin de processus;

no
v est le volume mesuré total de surnageant en ml (voir 8.2.7).

Pour les autres matrices, le rendement d’extraction est égal à la récupération du virus témoin de
processus.
Lorsque le rendement d’extraction est < 1 %, les résultats de l’échantillon ne sont pas valides et il peut
de
être nécessaire de soumettre l’échantillon de nouveau à essai.

Dans la situation où la courbe étalon établie pour l’ARN du virus témoin de processus présente une
pente idéale de −3,32, un échantillon pour essai (non MBV) avec un ΔCq de 0,00 possède un rendement
d’extraction de 100 % et un échantillon pour essai avec un ΔCq de 6,64 possède un rendement
et
d’extraction de 1 %. Lorsque ΔCq est ≤ 6,64, le rendement d’extraction est ≥ 1 % et donc acceptable. Si
ΔCq est > 6,64, le rendement d’extraction est < 1 % et n’est donc pas acceptable.
Pour des types spécifiques de baies, de légumes feuilles, tiges ou bulbes ou de mollusques bivalves pour
oj
lesquels il n’existe pas de données de validation formelles, d’autres seuils de rendement d’extraction
peuvent être appliqués, à condition de faire l’objet d’une validation appropriée.
Pr
Un échantillon montrant un rendement d’extraction inacceptable mais produisant un résultat positif

par ailleurs valide peut, le cas échéant, être rapporté comme étant positif tel que décrit dans l’Article 10.
10 Expression des résultats

Dans le cas des surfaces, les résultats positifs pour chaque virus cible doivent être exprimés par
«génome du virus détecté dans x cm2» lorsque la surface approximative peut être mesurée, ou par
«génome du virus détecté» lorsque la surface approximative ne peut pas être mesurée. Pour les autres

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types d’échantillons, les résultats doivent être exprimés par «génome de virus détecté dans x ml» ou
par «génome de virus détecté dans x g», où x est la quantité d’échantillon soumise à l’essai.
Si le virus cible n’est pas détecté, les résultats pour les surfaces doivent être exprimés par «génome du
virus non détecté dans x cm2» lorsque la surface approximative peut être mesurée, ou par «génome du
virus non détecté» lorsque la surface approximative ne peut pas être mesurée. Pour les autres types
d’échantillons, les résultats doivent être exprimés par «génome de virus non détecté dans x ml» ou par
ne
«génome de virus non détecté dans x g».
Si un résultat valide n’est pas obtenu, les résultats doivent normalement être exprimés comme «invalide».
Cependant, si un résultat positif par ailleurs valide est obtenu à partir d’un échantillon démontrant une
ai
inhibition de la RT-PCR ou un rendement d’extraction inacceptable, les résultats peuvent être exprimés
tels que détaillés ci-dessus. Les détails doivent être inclus dans le rapport d’essai.
oc
11 Caractéristiques de performance de la méthode
11.1 Étude de validation
ar
Les caractéristiques de performance de la méthode ont été déterminées dans une étude de validation
incluant à la fois des résultats d’un seul laboratoire et les résultats d’essai interlaboratoires pour
déterminer la spécificité, la sensibilité et, lorsqu’elle est disponible, la LDD50 de la méthode. Les données
m
sont résumées dans l’Annexe I. Il est admis que les valeurs issues de l’étude de validation ne soient pas
applicables à des types d’aliments autres que ceux indiqués dans l’Annexe I.
11.2 Sensibilité
e
La sensibilité est définie comme le nombre d’échantillons trouvés positifs divisé par le nombre
rm
d’échantillons réellement positifs analysés à un niveau donné de contamination. Les résultats sont donc
dépendants du niveau de contamination de l’échantillon.
11.3 Spécificité
no
La spécificité est définie comme le nombre d’échantillons trouvés négatifs divisé par le nombre
d’échantillons réellement négatifs (ou blancs) analysés.
11.4 LDD50
de
La LDD50 est la concentration (en copies/cm2, copies/g ou copies/ml) pour laquelle la probabilité de
détection est de 50 % (limite de détection à 50 %).
12 Rapport d’essai
et
Le rapport d’essai doit contenir au moins les informations suivantes:

— la méthode d’essai utilisée, avec référence au présent document, c’est-à-dire à l’ISO 15216‑2;
oj
— la méthode d’échantillonnage utilisée, si elle est connue;

Pr
— la taille de la prise d’essai;

— toutes les conditions opératoires non spécifiées dans le présent document, ou considérées comme
facultatives, ainsi que les détails de tout incident susceptible d’avoir un impact sur le(s) résultat(s)
d’essai;
— tout écart par rapport au présent document;
— tous les renseignements nécessaires à l’identification complète de l’échantillon;

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— le(s) résultat(s) d’essai obtenu(s), exprimé(s) conformément à l’Article 10;

— le rendement d’extraction de l’échantillon (voir 9.4);
— la date de réalisation de l’essai.
ne
ai
oc
ar
m
e
rm
no
de
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
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Annexe A
(normative)
Diagramme de mode opératoire
ne
ai
oc
ar
m
e
rm
Figure A.1 — Diagramme de mode opératoire

no
de
et
oj
Pr

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Annexe B
(normative)
Composition et préparation des réactifs et des tampons
ne
B.1 Solution de 5 × PEG/NaCl (PEG 8 000 500 g/l, NaCl 1,5 mol/l)
ai
B.1.1 Composition
oc
Polyéthylène glycol (PEG) 8 000 (n° CAS 25322‑68‑3; Mr 8 000) (500 ± 2) g
Chlorure de sodium (NaCl) (n° CAS 7647‑14‑5; Mr 58,44) (87 ± 1) g
ar
Eau tel que requis en B.1.2
B.1.2 Préparation
m
Dissoudre les poudres dans (450 ± 5) ml d’eau, en chauffant doucement si nécessaire. Ajuster le volume
à (1 000 ± 10) ml avec de l’eau et bien mélanger. Stériliser à l’autoclave.
Conserver à température ambiante jusqu’à 6 mois.
e
B.2 Mélange chloroforme/butanol (1:1 v/v)
rm
B.2.1 Composition
no
Chloroforme (n° CAS 67‑66‑3; Mr 119,38) (10 ± 0,1) ml
n-Butanol (n° CAS 71‑36‑3; Mr 74,12) (10 ± 0,1) ml
B.2.2 Préparation
de
Mélanger les composants ensemble.

Conserver à température ambiante dans un flacon en verre foncé jusqu’à 12 mois.
B.3 Solution de protéinase K (3 000 U/l)

et
B.3.1 Composition
oj
Protéinase K tel que requis (voir ci-dessous)
Eau stérile (200 ± 2) ml

Pr
B.3.2 Préparation
Calculer, à partir de l’activité spécifique de la protéinase K fournie par le fabricant, la quantité requise
pour obtenir 600 unités de l’enzyme (par exemple, pour une activité spécifique de 30 U/mg, la quantité
requise est de 20 mg).
Dissoudre cette quantité de protéinase K dans l’eau. Bien mélanger.

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Conserver dans des volumes de travail à une température inférieure ou égale à −15 °C pendant une
durée maximale de 6 mois. Après décongélation, la conserver à 5 °C (6.4) et l’utiliser dans un délai d’une
semaine.
B.4 phosphate salin (PBS)
ne
B.4.1 Composition
Chlorure de sodium (n° CAS 7647‑14‑5; Mr 58,44) (8,0 ± 0,1) g
ai
Chlorure de potassium (n° CAS 7447‑40‑7; Mr 74,55) (0,2 ± 0,01) g
Hydrogénophosphate disodique (n° CAS 7558‑79‑4; Mr 141,96) (1,15 ± 0,01) g
oc
Dihydrogénophosphate de potassium (n° CAS 7778‑77‑0; Mr 136,09) (0,2 ± 0,01) g
Eau (1 000 ± 10) ml
ar
B.4.2 Préparation
Dissoudre les poudres dans l’eau. Ajuster le pH, si nécessaire, à 7,3 ± 0,2 à 25 °C. Stériliser à l’autoclave.
Conserver à 5 °C (6.4) jusqu’à 6 mois.
B.5 Tampon Tris/glycine/extrait de bœuf (TGBE)

m
e
B.5.1 Composition
rm
Tris base [tris(hydroxyméthyl) aminométhane] (n° CAS 77‑86‑1; Mr 121,14) (12,1 ± 0,2) g
Glycine (n° CAS 56‑40‑6; Mr 75,07) (3,8 ± 0,1) g

no
Extrait de bœuf en poudre (n° CAS 68990‑09‑0) (10 ± 1,0) g
Eau (1 000 ± 10) ml
B.5.2 Préparation
de
Dissoudre les poudres dans l’eau. Ajuster le pH, si nécessaire, à 9,5 ± 0,2 à 25 °C. Stériliser à l’autoclave.
et
B.6 Solution Tris (1 mol/l)

B.6.1 Composition
oj
Tris base [tris(hydroxyméthyl) amino- (n° CAS 77‑86‑1; Mr 121,14) (12,1 ± 0,2) g

Pr
méthane]
Eau (5.2.1) tel que requis en B.6.2
B.6.2 Préparation
Dissoudre la poudre tris base dans (90 ± 1) ml d’eau. Ajuster le pH, si nécessaire, à 8,0 ± 0,2 à 25 °C.
Ajuster le volume à (100 ± 1) ml avec de l’eau. Stériliser à l’autoclave.

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B.7 Solution d’EDTA (0,5 mol/l)

B.7.1 Composition
Acide éthylènediaminetétraacétique (n° CAS 6381‑92‑6; Mr 372,24) (18,6 ± 0,2) g

(EDTA), sel disodique dihydraté
ne
Eau (5.2.1) tel que requis en B.7.2
B.7.2 Préparation
ai
Dissoudre le sel disodique dihydraté d’EDTA dans (90 ± 1) ml d’eau. Ajuster le pH, si nécessaire, à
8,0 ± 0,2 à 25 °C. Ajuster le volume à (100 ± 1) ml avec de l’eau. Stériliser à l’autoclave.
oc
B.8 Tampon Tris EDTA (TE) (Tris 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l)
ar
B.8.1 Composition
Solution Tris (1 mol/l) (B.6)
Solution d’EDTA (0,5 mol/l) (B.7)
Eau (5.2.1)
m (1 000 ± 10) µl
(200 ± 10) µl
(100 ± 1) ml
e
B.8.2 Préparation
rm
Mélanger les composants ensemble.

no
de
et
oj
Pr

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Annexe C
(informative)
Mélanges réactionnels de RT-PCR en temps réel et paramètres

de cycles
ne
Pour la composition des mélanges réactionnels de RT-PCR en temps réel en une étape utilisant le système
ai
RNA UltrasenseTM one step qRT-PCR de chez Invitrogen1), voir le Tableau C.1. Pour les paramètres de
cycles, voir le Tableau C.2.
oc
Tableau C.1 — Mélange réactionnel
Concentration finale Volume par réaction
Réactif
(dans 25 μl de volume réactionnel) μl
ar
5 × mélange réactionnel UltraSense 1 × 5 ± 0,25
Amorce sens (FW) 0,5 pmol/µl tel que requis
Amorce antisens (REV)
Sonde
Marqueur fluorescent de référence
ROX (50 × )
m
0,9 pmol/µl
0,25 pmol/µl
tel que requisa

tel que requis
tel que requis
tel que requis

e
Mélange d’enzyme RNA UltraSense — 1,25 ± 0,1
Eau (5.2.1) — tel que requis
rm
Volume total — 20 ± 0,5

a Avec les machines PCR en temps réel Applied Biosystems, le marqueur fluorescent de référence ROX doit être utilisé à
une concentration 1 ×; pour le Stratagene MX3000, le ROX peut soit être utilisé à une concentration de 0,1 × , soit ne pas être
utilisé dans le mélange réactionnel. Pour les autres machines, consulter les instructions du fabricant.
no
Les machines PCR en temps réel Applied Biosystems et le Stratagene MX3000 sont des produits disponibles sur le marché.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve
ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
Tableau C.2 — Paramètres de cycles

de
Description de l’étape Température et durée Nombre de cycles

RT 55 °C pendant 1 h 1
Dénaturation initiale 95 °C pendant 5 min 1
Dénaturation 95 °C pendant 15 s
et
Amplification Hybridation-extension 60 °C pendant 1 min 45

65 °C pendant 1 mina
oj
a Pour les machines PCR en temps réel pour lesquelles l’utilisateur peut sélectionner le point de collecte des données de
fluorescence, ce dernier doit être établi à la fin de l’incubation à 65 °C.
Pr
1) Invitrogen RNA UltraSenseTM est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Invitrogen. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.

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Annexe D
(informative)
Amorces et sondes d’hydrolyse de la RT-PCR en temps réel pour

la détection du VHA, du norovirus GI et GII et du mengovirus
ne
(témoin de processus)
ai
D.1 VHA
oc
HAV68 (FW): TCA CCG CCG TTT GCC TAG Référence [5]
HAV240 (REV): GGA GAG CCC TGG AAG AAA G Référence [5]
ar
HAV150(-) (PROBE): CCT GAA CCT GCA GGA ATT AA Référence [5]
Sonde marquée: à l’extrémité 5’ par la 6-carboxyfluorescéine (FAM); à l’extrémité 3’ par le MGBNFQ

(Minor Groove Binder/quencher non fluorescent)
m
Cette combinaison d’amorces amplifie un produit de longueur variable (157 à 188 paires de bases [bp])
selon la souche virale; par exemple, un produit de 174 bp correspondant aux nucléotides 68 à 241 de la
e
souche du VHA HM175 (numéro d’accès GenBank M14707).
L’alignement de toutes les séquences de la région cible disponibles dans GenBank démontre que cette
rm
combinaison d’amorces et de sondes est adéquate pour la détection de tous les génotypes du VHA. De
plus, l’analyse de quasi-espèces du spectre des mutants indique que cette région n’est pas sujette à une
variabilité, et ledit essai doit ainsi fournir une robustesse à long terme. La spécificité des amorces a été
vérifiée avec 10 picornavirus différents: le poliovirus (souche de vaccin de sérotype 1), l’entérovirus
no
humain B (échovirus 1), l’entérovirus humain B (échovirus 11), l’entérovirus humain B (échovirus 30),

l’entérovirus humain B (Coxsackie virus-B5), l’entérovirus humain C (Coxsackie virus-A24), l’entérovirus
humain D (entérovirus 70), l’entérovirus bovin, le teschovirus porcin (entérovirus porcin 1) et le virus
de l’encéphalomyocardite. D’autres virus entériques tels que le virus de l’hépatite E, le rotavirus humain
et porcin (groupe A), un norovirus, le mamastrovirus (astrovirus humain de type 1) et l’adénovirus
de
humain F (adénovirus entérique de type 40) ont aussi été employés. Aucun des virus soumis à essai n’a
donné de résultats positifs que ce soit à une forte concentration (106 à 108 TCID50/ml ou suspensions
fécales à 0,1 g/ml non diluées) ou à une faible concentration (104 TCID50/ml ou suspensions fécales à
0,1 g/ml diluées au dixième). La LDD des essais est de 10 molécules d’ARNsb, de 1 molécule d’ARN viral
et de 0,05 virus infectieux par réaction[5].
et
D.2 Norovirus GI
oj
QNIF4 (FW): CGC TGG ATG CGN TTC CAT Référence [6]
NV1LCR (REV): CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC Référence [7]
Pr
Au cours de l’élaboration et de la validation du présent document, deux sondes différentes ont été utili-
sées pour les norovirus GI. L’une et l’autre peuvent être utilisées avec les amorces FW et REV décrites ici.
NVGG1p (SONDE): TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT Référence [7]

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Sonde marquée: à l’extrémité 5’ par la 6-carboxyfluorescéine (FAM); à l’extrémité 3’ par la 6-carboxy-

tétraméthylrhodamine (TAMRA)
TM9 (SONDE): TGG ACA GGA GAT CGC Référence [8]

ne
Cette combinaison d’amorces amplifie un produit de 86 bp correspondant aux nucléotides 5291 à 5376
du virus Norwalk (numéro d’accès GenBank M87661).
ai
D.3 Norovirus GII
oc
QNIF2 (FW): ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA Référence [5]
COG2R (REV): TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA Référence [10]
QNIFs (SONDE): AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG Référence [9]
ar
Sonde marquée: à l’extrémité 5’ par la 6-carboxyfluorescéine (FAM); à l’extrémité 3’ par la 6-carboxy-
tétraméthylrhodamine (TAMRA)
du virus Lordsdale (numéro d’accès GenBank X86557). m

Cette combinaison d’amorces amplifie un produit de 89 bp correspondant aux nucléotides 5012 à 5100
La zone sélectionnée pour la détection des norovirus cible est la région conservée à l’extrémité 5′
e
de l’ORF2.[10] Les alignements de toutes les séquences de la région cible disponibles dans GenBank
démontrent que ces combinaisons d’amorces et de sondes sont adéquates pour la détection de toutes
rm
les souches de norovirus GI et GII. De plus, l’efficacité et la sensibilité des amorces et des sondes ont
été vérifiées par l’utilisation de 18 souches de référence de norovirus: GI.1 (virus de Norwalk), GI.2
(Whiterose), GI.3 (Southampton), GI.4 (Malte), GI.5 (Musgrove), GI.6 (Mikkeli), GI.7 (Winchester), GI.10
(Boxer), GII.1 (Hawaii), GII.2 (Melksham), GII.3 (Toronto), GII.4 (Grimbsy), GII.6 (Seacroft), GII.7 (Leeds),
no
GII.10 (Erfurt), les variants GIIb et GIIc et GIV (Alphatron).

La spécificité des amorces a été vérifiée avec six virus entériques humains différents: le poliovirus
(souche de vaccin de sérotype 1), le VHA, le virus de l’hépatite E, le virus Aichi, l’astrovirus et le
rotavirus. La spécificité a aussi été soumise à essai sur sept bactéries qui pourraient être détectées
dans les MBV: Escherichia coli, Shewenella putrefaciens, Chromobacterium violaceum, Aeromonas sobria,
de
Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus et Vibrio cholerae. Aucun des virus ou des bactéries soumis
à essai n’a donné de résultats positifs. Les LDD des essais sont de 1 à 10 molécules d’ARN viral (selon la
souche de norovirus)[9][11].
D.4 Mengovirus
et
Mengo 110 (FW): GCG GGT CCT GCC GAA AGT Référence [12]
oj
Mengo 209 (REV): GAA GTA ACA TAT AGA CAG ACG CAC AC Référence [12]
Mengo 147 (SONDE): ATC ACA TTA CTG GCC GAA GC Référence [12]

Pr

Cette combinaison d’amorces amplifie un produit de 100 bp correspondant aux nucléotides 110 à 209 de
la souche du mengovirus MC0 délétée utilisée pour l’élaboration du présent document. Cela correspond
aux nucléotides 110 à 270 de l’isolat M du mengovirus non délété (numéro d’accès GenBank L22089).

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La région cible sélectionnée pour la détection du mengovirus est aussi semblable que possible à celle
du VHA en termes de structure, de longueur et de composition en bases.[5] Les séquences d’amorces
ne s’alignent pas avec d’autres séquences disponibles dans GenBank. La spécificité des amorces a été
vérifiée avec 10 virus entériques humains différents: le virus de l’hépatite A, le virus de l’hépatite E,
le norovirus GI, le norovirus GII, l’entérovirus humain B (échovirus 1), l’entérovirus humain B
(échovirus 11), l’entérovirus humain B (échovirus 30), l’entérovirus humain C (Coxsackie virus-A24),
l’entérovirus humain D (entérovirus 70) et l’astrovirus humain de type 2. Aucun des virus soumis à
ne
essai n’a donné de résultats positifs, que ce soit à 106 TCID50/ml ou 105 TCID50/ml (ou à 106 copies de
génome/ml ou 105 copies/ml dans le cas des norovirus GI et GII).
ai
oc
ar
m
e
rm
no
de
et
oj
Pr

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Annexe E
(informative)
Multiplication de la souche du mengovirus MC0 utilisé comme

témoin de processus
ne
ai
E.1 Généralités
Le mengovirus est un virus murin de la famille des Picornaviridae. La souche du mengovirus MC0
oc
(CECT 10000)2) est un virus recombinant (délété) dépourvu de la séquence poly(C) par rapport au
mengovirus de type sauvage, ayant des propriétés de croissance identiques à celles du virus de type
sauvage mais ayant un phénotype avirulent.[13] Cette souche a été utilisée comme virus témoin de
processus dans les méthodes de détection du VHA et des norovirus[5][11] et comme témoin de processus
ar
dans l’élaboration du présent document.
La souche MC0 du mengovirus est un organisme génétiquement modifié (OGM). Pour les laboratoires
m
où l’utilisation d’OGM est interdite ou problématique, un témoin de processus différent doit être utilisé.
E.2 Réactifs et appareils

e
E.2.1 Le milieu de culture cellulaire recommandé pour les cellules HeLa est le milieu essentiel minimum
de Eagle contenant 2 mmol/l de l-glutamine et de BSS de Earle, ajusté à 1,5 g/l d’hydrogénocarbonate de
rm
sodium, 0,1 mmol/l d’acides aminés non essentiels, 1,0 mmol/l de pyruvate de sodium, 1 × solution de
streptomycine/pénicilline, 100 ml/l (croissance) ou 20 ml/l (maintien) de sérum de veau fœtal.
E.2.2 Pour la préparation des cultures cellulaires et la croissance du virus, des équipements de
no
culture cellulaire comprenant un ou plusieurs incubateurs avec des niveaux de CO2 contrôlables et des
consommables de culture cellulaire (flacons, etc.) sont requis.
E.3 Mode opératoire

de
Le mengovirus doit être cultivé sous atmosphère à teneur en CO2 de (50 ± 10) ml/l (flacons ouverts)
ou sous atmosphère non contrôlée (flacons fermés) sur des monocouches confluentes à 80 % à 90 % de
cellules HeLa (ATCC® CCL-2TM)2 jusqu’à ce qu’au moins 75 % de l’effet cytopathique soit atteint.
Soumettre le flacon de culture cellulaire à un cycle unique de congélation-décongélation, puis
et
centrifuger le contenu à 3 000 x g pendant (10 ± 1) min.

Conserver le surnageant (de la culture cellulaire) pour la préparation du virus témoin de processus
oj
(5.3.9).
Pr
2) CECT 10000 et ATCC® CCL-2TM sont les appellations commerciales de produits fournis respectivement par
Spanish Type Culture Collection et American Type Culture Collection. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils répondent aux
exigences du mode opératoire.

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Annexe F
(informative)
Extraction d’ARN avec le système NucliSens®3) de chez BioMérieux
ne
F.1 Réactifs
ai
F.1.1 Tampon de lyse NucliSens®3).
oc
F.1.2 NucliSens® Magnetic extraction reagents (comprenant une solution de silice magnétique, des
tampons de lavage 1, 2 et 3 et un tampon d’élution).
ar
F.2 Appareillage
F.2.1 Portoir magnétique pour tubes de 1,5 ml.
m
F.2.2 Agitateur chauffant ou dispositif équivalent pour l’agitation des tubes de 1,5 ml à (60 ± 2) °C et
à une vitesse d’environ 1 400 oscillations min−1.
e
F.3 Mode opératoire
rm
Ajouter (2 ± 0,1) ml de tampon de lyse NucliSens®3) dans un tube. Ajouter (500 ± 10) μl d’échantillon
(MBV) ou l’échantillon dans sa totalité (autres matrices) et mélanger au vortex brièvement.
Incuber pendant (10 ± 1) min à température ambiante.
no
Ajouter (50 ± 2,5) μl de la solution de silice magnétique bien mélangée dans un tube et mélanger au
vortex brièvement.
Incuber pendant (10 ± 1) min à température ambiante.
de
Centrifuger pendant (120 ± 10) s à 1 500 x g ou laisser la silice se sédimenter en utilisant un portoir

magnétique, puis retirer soigneusement le surnageant, par aspiration par exemple.
Ajouter (400 ± 10) μl de tampon de lavage 1 et mettre de nouveau en suspension le culot de centrifugation
par pipetage ou agitation au vortex en veillant à éviter la formation de mousse.
et
Transférer la suspension dans un tube propre de 1,5 ml. Fermer le tube et laver la silice pendant
(30 ± 2) s en mélangeant au vortex. Après lavage, laisser la silice se sédimenter en utilisant le portoir
magnétique. Retirer le surnageant par aspiration, par exemple.
oj
Ajouter (400 ± 10) μl de tampon de lavage 1. Fermer le tube et laver la silice pendant (30 ± 2) s en
mélangeant au vortex, laisser la silice se sédimenter en utilisant le portoir magnétique puis retirer le
Pr
surnageant.
Ajouter (500 ± 10) μl de tampon de lavage 2. Fermer le tube et laver la silice pendant (30 ± 2) s en
mélangeant au vortex, laisser la silice se sédimenter en utilisant le portoir magnétique puis retirer le
surnageant. Répéter l’opération.
3) BioMerieux NucliSens® est l’appellation commerciale d’un produit fourni par BioMerieux. Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.

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Ajouter (500 ± 10) µl de tampon de lavage 3 (les échantillons ne doivent pas être laissés dans le tampon
de lavage 3 plus de temps que nécessaire). Fermer le tube et laver la silice pendant (15 ± 1) s, laisser la
silice se sédimenter en utilisant le portoir magnétique puis retirer le surnageant.
Ajouter (100 ± 5) μl de tampon d’élution. Fermer le tube et le transférer dans l’agitateur chauffant ou
dans un appareil équivalent, puis incuber pendant (5,0 ± 0,5) min à 60 °C avec une agitation d’environ
1 400 oscillations min−1.
ne
Placer le tube dans le portoir magnétique et laisser la silice se sédimenter, puis transférer l’éluat dans
un tube propre.
Les plateformes automatisées pour extraction d’ARN utilisant les NucliSens®3) Magnetic extraction
ai
reagents peuvent également être utilisées.
oc
ar
m
e
rm
no
de
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
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Annexe G
(informative)
Solutions mères d’ARN contrôle externe (ARN CE)
ne
G.1 Généralités
ai
Une attention particulière doit être portée à la séparation des zones de travail utilisées pour la
production des solutions mères d’ARN CE et celles utilisées pour l’extraction de l’échantillon.
oc
Dans l’élaboration du présent document, des plasmides linéarisés portant des copies des gènes cibles
ont été utilisés pour la production d’ARN CE. Pour le VHA, un plasmide témoin a été construit par
l’insertion de la séquence d’ADN cible dans le vecteur pGEM-3Zf(+) au niveau d’un site de restriction
ar
HincII de sorte que la séquence cible soit en aval de la séquence promotrice pour l’ARN polymérase SP6.
Pour les norovirus GI et GII, des plasmides témoins ont été construits séparément par l’insertion de la
séquence d’ADN cible dans le vecteur pGEM-3Zf(+) au niveau d’un site de restriction SmaI de sorte que
dans chaque cas, la séquence cible soit en aval de la séquence promotrice pour l’ARN polymérase T7.
m
Pour les trois plasmides, des sites de restriction BamHI uniques ont été introduits dans les inserts de
séquence cible par insertion dans ou remplacement des séquences de type sauvage, afin d’agir comme
une mesure de contrôle de la contamination. Lorsqu’une contamination des échantillons par l’ARN CE
est suspectée, la présence du site BamHI peut être contrôlée soit par digestion des produits de PCR par
e
l’enzyme de restriction BamHI, soit par séquençage des produits de PCR. Les séquences cibles complètes
des inserts de ces plasmides sont les suivantes:
rm
VHA
1 TCACCGCCGT TTGCCTAGGC TATAGGCTAA ATTTTCCCTT TCGGATCCCC CTTTCCTATT

no
61 CCCTTTGTTT TGCTTGTAAA TATTGATTTG TAAATATTGA TTCCTGCAGG TTCAGGGTTC
121 TTAAATCTGT TTCTCTATAA GAACACTCAT TTCACGCTTT CTGTCTTCTT TCTTCCAGGG
181 CTCTCC
norovirus GI
de
1 CGCTGGATGC GCTTCCATGA CCTCGGATTG TGGACAGGAG ATCGCGATCT TCTGCGGATC
61 CGAATTCGTA AATGATGATG GCGTCTAAGG
norovirus GII
et
1 ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCAGATCTG AGCACGTGGG AGGGCGATCG CAATCTGGCT

oj
61 CGGATCCCCA GCTTTGTGAA TGAAGATGGC GTCGA
G.2 Réactifs et appareils

Pr
G.2.1 Enzymes de restriction pour la linéarisation et tampons associés.
G.2.2 Réactifs de purification de produits PCR.
G.2.3 Réactifs de transcription d’ARN in vitro (ARN polymérase, nucléotides triphosphates (NTPs),
tampons, etc.).

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G.2.4 DNase exempte de RNase.
G.2.5 Réactifs de purification d’ARN.
G.2.6 Réactifs et équipement pour l’électrophorèse sur gel de l’ADN.
ne
G.2.7 Réactifs et équipement pour RT-PCR en temps réel en une étape en utilisant des sondes
d’hydrolyse.
G.2.8 Incubateur, pouvant fonctionner à (37 ± 2) °C.
ai
G.2.9 Bloc chauffant ou l’équivalent pour l’incubation de tubes de 1,5 ml à (95 ± 2) °C.
oc
G.3 Linéarisation de l’ADN plasmidique
Ajouter 1 µg d’ADN plasmidique purifié à un mélange réactionnel contenant une enzyme de restriction
ar
appropriée (afin de permettre la linéarisation du plasmide à un point légèrement en aval de la séquence
cible)4) et les tampons selon les recommandations du fabricant de l’enzyme.
Incuber à 37 °C pendant (120 ± 5) min.
m
Purifier l’ADN du mélange réactionnel en utilisant des réactifs de purification de produits PCR, éluer
dans (50 ± 2,5) μl de tampon d’élution.
e
Vérifier la linéarisation par une électrophorèse sur gel (comparer un aliquot du plasmide linéarisé
purifié avec un aliquot du plasmide non linéarisé).
rm
G.4 Transcription d’ARN in vitro

Ajouter 1 µg d’ADN plasmidique linéarisé purifié à un mélange réactionnel de transcription d’ARN
no
in vitro préparé selon les recommandations du fabricant de l’enzyme ARN polymérase5).

Incuber à 37 °C pendant (120 ± 5) min.
Ajouter la DNase exempte de RNase et incuber à 37 °C pendant (15 ± 1) min.
de
Purifier l’ARN en utilisant les réactifs de purification d’ARN, en l’éluant dans (100 ± 5) μl d’eau (5.2.1).
G.5 Vérification de la contamination de l’ADN

Préparer un mélange réactionnel pour RT-PCR en temps réel propre à la cible (5.3.10), le partager
et
en deux et désactiver l’enzyme RT dans une des parties du mélange en chauffant à 95 °C pendant
(5,0 ± 0,5) min.
oj
Soumettre l’ARN CE ou une dilution appropriée de cette solution à une RT-PCR en temps réel en utilisant
en parallèle les mélanges réactionnels non traité et traité à la chaleur.
Si dans la solution mère de l’ARN CE soumis à essai avec le mélange réactionnel traité à la chaleur, les
Pr
niveaux détectables sont > 0,1 % à ceux présents dans la partie avec un mélange réactionnel non traité
(si la différence entre les valeurs Cq de l’ARN CE soumis à essai avec le mélange réactionnel traité à la
chaleur et non traité est < 10), la solution mère est contaminée par de l’ADN et elle doit être traitée à
4) Pour les plasmides utilisés dans l’élaboration du présent document, les enzymes de restriction adaptées sont
EcoRI pour le plasmide du VHA et XbaI pour les plasmides des norovirus GI et GII.
5) Pour les plasmides utilisés dans l’élaboration du présent document, les enzymes ARN polymérase adaptées
pour la transcription in vitro de l’ARN sont la SP6 pour le plasmide du VHA et la T7 pour les plasmides des norovirus
GI et GII.

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nouveau avec de la DNase (voir G.4). Si les niveaux sont < 0,1 %, conserver à une température inférieure
ou égale à −15 °C jusqu’à utilisation pour la préparation du témoin ARN CE (5.3.11).
G.6 Quantification de l’ARN CE

Déterminer par spectrophotométrie l’absorbance à 260 nm de la solution mère de l’ARN CE traitée par
ne
DNase (voir G.4).
Multiplier le résultat de la mesure d’absorbance par 4 × 10−8 (et par le facteur de dilution utilisé si
la solution mère d’ARN CE diluée est mesurée) pour obtenir la concentration d’ARN en grammes par
microlitre.
ai
Diviser ce nombre par la masse en grammes d’une seule molécule d’ARN CE pour calculer la
concentration d’ARN en nombre de copies par microlitre.
oc
La masse d’une molécule d’ARN individuelle peut être calculée en multipliant la longueur de l’ARN en
ribonucléotides par 320,5 (masse moléculaire relative d’un ribonucléotide moyen) et en divisant par
la constante d’Avogadro (6,02 × 1023), par exemple une molécule d’ARN de 200 ribonucléotides a une
ar
masse de 1,06 × 10−19 g.6)
m
e
rm
no
de
et
oj
Pr
6) Pour les témoins ARN CE utilisés dans l’élaboration du présent document, les longueurs et masses respectives
sont les suivantes : VHA – 250 ribonucléotides, 1,33 × 10-19 g ; Norovirus GI – 126 ribonucléotides, 6,73 × 10-20 g ;
Norovirus GII – 131 ribonucléotides, 7,00 × 10-20 g.

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Annexe H
(informative)
Disposition de plaque optique type
ne
ai
oc
ar
m
e
rm
no
de
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
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Tableau H.1 — Disposition de plaque optique type
ne
ai
oc
ar
m
e
rm
no
de
et
oj
Pr
5 μl ARN (±1 μl ARN CE) et 20 μl mélange réactionnel par puits

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Annexe I
(informative)
Études de validation de la méthode et caractéristiques de

performances
ne
Une étude de validation, incluant une série d’études effectuée par un laboratoire unique (pour la
ai
détermination de la LDD50) et une comparaison interlaboratoires internationale (pour la détermination
de la sensibilité et de la spécificité), impliquant 18 laboratoires dans 11 pays, ont été menées sur des
surfaces (surfaces extérieures de poivrons), des framboises, des laitues, des oignons verts, de l’eau
oc
embouteillée, des huîtres creuses et des moules. Concernant les études réalisées par le laboratoire
unique, de nombreuses séries de dilution au 100,5 d’échantillons d’aliments contaminés ont été soumises
à essai, tandis que dans les comparaisons interlaboratoires, les échantillons d’aliments étaient chacun
soumis à essai à trois niveaux différents de contamination, les niveaux «élevé» et «moyen» étant
ar
conçus pour être de respectivement 25 × et 5 × environ les niveaux «faibles», plus un témoin négatif.
Les génotypes des virus utilisés pour la contamination étaient HM175/43c (surnageant de culture
tissulaire de VHA), GI.4 (suspension fécale de norovirus GI) et GII.4 (suspension fécale de norovirus
m
GII) et le mode de contamination des échantillons pour essai était la bioaccumulation (huîtres creuses
et moules) ou la contamination directe (autres matrices). L’étude a été organisée en 2013 à 2014 par le
Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science, Weymouth, Royaume-Uni.
e
La méthode soumise à l’étude de validation incluait les méthodes spécifiques de RT-PCR en temps réel et
d’extraction de l’ARN détaillées respectivement dans les Annexes C et F. Les valeurs des caractéristiques
de performances dérivées de cette étude de validation sont présentées pour chaque combinaison de
rm
virus cible et de chaque matrice dans les Tableaux I.1 à I.21.

Les caractéristiques de LDD50 ont été déterminées en utilisant les données générées dans les études
dans un laboratoire unique. Pour ces ensembles de données, les niveaux de référence pour les
no
échantillons pour essai présentant le niveau le plus élevé de contamination au sein de chaque série de
dilution préparée étaient calculés directement en utilisant la méthode de quantification décrite dans
l’ISO 15216-1. Pour les autres échantillons au sein de la série de dilution, les niveaux de référence
étaient calculés en multipliant le niveau de référence pour l’échantillon présentant le niveau le plus
élevé de contamination par le facteur de dilution.[14] Les valeurs de LDD50 ont ensuite été calculées en
comptant les résultats positifs et négatifs à différents niveaux de référence et en utilisant la méthode
de
d’estimation de la fonction de PDD (probabilité de détection) et de la LDD d’une méthode de mesure

microbiologique qualitative comme décrit dans la Référence [15]. Pour certaines matrices, en raison de
problèmes pratiques survenus durant les études menées par laboratoire unique, il n’a pas été possible
de déterminer les valeurs de LDD50.
et
Les caractéristiques de sensibilité et de spécificité étaient déterminées en utilisant les données

générées dans les comparaisons interlaboratoires. Les niveaux de référence pour les différents niveaux
de contamination étaient déterminés comme étant la moyenne géométrique des résultats obtenus par
oj
les laboratoires participants, en utilisant la méthode de quantification décrite dans l’ISO 15216-1.

La méthode utilisée pour la détermination des niveaux de référence à la fois dans les études de laboratoire
Pr
unique et interlaboratoires (quantification des échantillons de matrice positifs après contamination)

pourrait avoir conduit à des caractéristiques de méthode différentes de ce qu’elles auraient été si une
autre méthode de détermination des niveaux de référence (par exemple, quantification des solutions
mères de virus avant la contamination) avait été utilisée.

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Tableau I.1 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le VHA sur les surfaces (poivrons)
Blanc Niveau faible de Niveau moyen de Niveau élevé de
contamination contamination contamination
(4,9 × 100 copies/ (2,5 × 101 copies/ (1,5 × 102 copies/
cm2) cm2) cm2)
ne
Nombre de collaborateurs
10 10 10 10
participants
Nombre de collaborateurs retenus
10 10 10 10
après évaluation des données
ai
Nombre d’échantillons 20 20 20 20
Nombre d’échantillons retenus
20 20 20 20
oc
Sensibilité, % n/a 100 95,0 100
Spécificité, % 95,0
LDD50 , copies/cm2 Non déterminé
ar
Tableau I.2 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GI sur les surfaces
(poivrons)
Blanc Niveau faible de
contamination
m
(6,2 × 100 copies/
cm2)
Niveau moyen de
contamination
(3,0 × 101 copies/
cm2)
Niveau élevé de
contamination
(1,1 × 102 copies/
cm2)
e
10 10 10 10
participants
rm

10 10 10 10
no
20 20 20 20
Sensibilité, % n/a 95,0 95,0 100
Spécificité, % 100
LDD50, copies/cm2 Non déterminé
de
et
oj
Pr

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ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.3 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GII sur les surfaces
(poivrons)
Blanc Niveau faible de Niveau moyen de Niveau élevé de
ne
cm2) cm2) cm2)
10 10 10 10
participants
ai
10 10 10 10
oc
Nombre d’échantillons retenus après
20 20 20 20
évaluation des données
ar
LDD50, copies/cm2 Non déterminé
Blanc
m
Tableau I.4 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le VHA dans les framboises
Niveau faible de
contamination
Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
(1,2 × 101 copies/g) (7,6 × 101 copies/g) (3,7 × 102 copies/g)
rm
10 10 10 10
participants
10 10 9 10
no
20 19 18 19
Sensibilité, % n/a 89,5 100 100
de
LDD50, copies/g 0,92 (0,41 à 2,04)

et
oj
Pr

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ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.5 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GI dans les

framboises
Niveau faible de Niveau moyen de Niveau élevé de
Blanc contamination contamination contamination
ne
10 10 10 10
participants
ai
10 10 10 10
oc
18 19 19 18
ar
LDD50, copies/g 0,15 (0,06 à 0,35)
Blanc
framboises
contamination
m
Tableau I.6 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GII dans les
Niveau faible de Niveau moyen de

contamination
Niveau élevé de
contamination
e
rm
10 10 10 10
participants
10 9 10 10
no
20 18 19 19
de
LDD50, copies/g 0,18 (0,07 à 0,45)

et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.7 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le VHA dans la laitue

ne
10 10 10 10
participants
9 9 9 10
ai
oc
16 18 18 19
Sensibilité, % n/a 88,9 100 94,7
ar
LDD50, copies/g 0,74 (0,36 à 1,49)
Tableau I.8 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GI dans la laitue
Blanc m
Niveau faible de
contamination
Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
10 10 10 10
participants
rm

10 9 10 10
17 18 19 19
no

LDD50, copies/g 0,11 (0,05 à 0,22)
de
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.9 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GII dans la laitue
ne
10 10 10 10
participants
10 9 9 10
ai
oc
17 18 18 19
ar
LDD50, copies/g 0,20 (0,10 à 0,41)
Tableau I.10 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le VHA dans les oignons verts
Blanc contamination
m
Niveau faible de Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
10 10 10 10
participants
rm

9 8 9 9
18 16 17 18
no

Sensibilité, % n/a 100 100 94,4
LDD50, copies/g Non déterminé
de
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)


oignons verts
ne
10 10 10 10
participants
ai
10 9 10 9
oc
20 18 18 18
Sensibilité, % n/a 100 100 94,4
ar
Blanc
m
oignons verts
Niveau faible de
contamination
Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
rm
10 10 10 10
participants
Nombre de collaborateurs rete-
10 8 10 9
nus après évaluation des données
no
19 16 17 17
Sensibilité, % n/a 87,5 94,1 94,1
de

et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.13 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le VHA dans l’eau embouteillée
Blanc
ne
ml) ml) ml)
10 10 10 10
participants
ai
10 10 10 10
oc
20 20 20 20
Sensibilité, % n/a 100 100 100
ar
LDD50, copies/ml 0,093 (0,046 à 0,189)
embouteillée
Niveau faible de
contamination
m
Tableau I.14 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GI dans l’eau
Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
Blanc
(4,7 × 10−1 copies/ (2,1 × 100 copies/ (9,3 × 100 copies/
ml) ml) ml)
rm
10 10 10 10
participants
10 10 10 10
no
20 20 20 20
de
LDD50, copies/ml 0,043 (0,021 à 0,087)
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.15 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GII dans l’eau
embouteillée
ne
Blanc
(5,5 × 10−1 copies/ (1,6 × 100 copies/ (8,9 × 100 copies/
ml) ml) ml)
10 10 10 10
participants
ai
10 10 10 10
oc
20 20 20 20
ar
LDD50, copies/ml 0,016 (0,008 à 0,033)
Blanc
m
Tableau I.16 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le VHA dans les huîtres creuses
Niveau faible de
contamination
Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
rm
10 10 10 10
participants
10 8 10 10
no
19 15 20 19
de
LDD50, copies/g 45,9 (22,8 à 92,3)

et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)


huîtres creuses
ne
10 10 10 10
participants
ai
10 8 10 10
oc
19 15 20 19
ar
LDD50, copies/g 7,8 (3,9 à 15,7)
Blanc
huîtres creuses
Niveau faible de
contamination
m
Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
rm
10 10 10 10
participants
10 8 10 10
no
19 15 20 19
de
LDD50, copies/g 12,4 (6,2 à 24,7)

et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.19 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le VHA dans les moules
ne
10 10 10 10
participants
8 8 7 8
ai
oc
15 15 13 15
ar
Tableau I.20 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GI dans les moules
Blanc m
Niveau faible de
contamination
Niveau moyen de
contamination
Niveau élevé de
contamination
e
10 10 10 10
participants
rm

8 7 8 8
16 13 15 15
no

de
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Tableau I.21 — Résultats de l’analyse de données obtenus avec le norovirus GII dans les moules
ne
10 10 10 10
participants
8 7 8 8
ai
oc
15 13 15 15
ar
m
e
rm
no
de
et
oj
Pr

NM ISO 15216-2:2020
ISO 15216-2:2019(F)

Bibliographie
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PCR using a 3′-minor groove binder-DNA probe. BMC. Infect. Dis. 2006, 6:69
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oj
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A virus and norovirus in food matrices. Int. J. Food Microbiol. 2019, 288, pp 82–90
Pr
[15] Wilrich C., Wilrich P.T. Estimation of the POD function and the LOD of a qualitative
microbiological measurement method. AOAC International. 2009, 92, pp. 1763–1772

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Projet de PNM ISO 15216-2

Partie 2 : Méthode de détection

Norme Marocaine homologuée

La présente norme annule et remplace la NM ISO/TS 15216-2 homologuée en 2014.

La présente norme est une reprise intégrale de la norme ISO 15216-2:2019.

Institut Marocain de Normalisation (IMANOR) © IMANOR 2020 – Tous droits réservés

8.2 Extraction de virus............................................................................................................................................................................... 9

8.4 RT-PCR en temps réel...................................................................................................................................................................... 12

9.2 Élaboration des courbes étalon d’ARN du virus témoin de processus.................................................. 15

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................16

© ISO 2019 – Tous droits réservés ﻿ iii

Annexe D (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la RT-PCR en temps réel pour la

iv ﻿ © ISO 2019 – Tous droits réservés

technique avec les changements suivants:

— le terme «efficacité d’amplification» a été remplacé par «inhibition de la RT-PCR»;

négatifs ont été ajoutées;

© ISO 2019 – Tous droits réservés ﻿ v

vi ﻿ © ISO 2019 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 15216-2:2019(F)

Microbiologie dans la chaine alimentaire — Méthode

pour les méthodes qualitatives

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:​//www​.electropedia​.org/.

© ISO 2019 – Tous droits réservés ﻿ 1

surface (3.2) prédéterminés

détection des norovirus

2 ﻿ © ISO 2019 – Tous droits réservés

Note 1 à l'article: Cela correspond au cycle auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.

4.1 Extraction de virus

4.2 Extraction d’ARN

4.3 RT-PCR en temps réel

© ISO 2019 – Tous droits réservés ﻿ 3

ne doit normalement pas être possible.

4.4.2 Témoin ARN CE

utilisant l’ARN CE.

4.5 Résultats des essais

4 ﻿ © ISO 2019 – Tous droits réservés

5.2.2 Polyéthylène glycol (PEG), de masse moléculaire relative moyenne 8 000.

5.2.5 Hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4).

5.2.6 Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4).

5.2.7 Tris base.

5.2.9 Extrait de bœuf en poudre.

5.2.11 Pectinase d’Aspergillus niger ou A. aculeatus.

5.2.14 Hydroxyde de sodium (NaOH) (≥10 mol/l).

5.2.15 Acide chlorhydrique (HCl) (≥5 mol/l).

5.2.16 Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), sel disodique dihydraté.

chaotropique contenant du thiocyanate de guanidinium[4] et en utilisant la silice comme matrice de

© ISO 2019 – Tous droits réservés ﻿ 5

5.3 Réactifs nécessitant une préparation

suivies lors de la préparation des réactifs indiqués en 5.3.1 à 5.3.8.

5.3.1 Solution de 5 × PEG/NaCl (PEG 8 000 500 g/l, NaCl1,5 mol/l). Voir B.1.

5.3.2 Mélange chloroforme/butanol (1:1 v/v). Voir B.2.

5.3.3 Solution de protéinase K (3 000 U/l). Voir B.3.

5.3.4 Tampon phosphate salin (PBS). Voir B.4.

5.3.5 Tampon Tris/glycine/extrait de bœuf (TGBE). Voir B.5.

5.3.6 Solution Tris (1 mol/l). Voir B.6.

5.3.7 Solution d’EDTA (0,5 mol/l). Voir B.7.

6 ﻿ © ISO 2019 – Tous droits réservés

6.3 Agitateur vortex.

6.4 Réfrigérateur, capable de fonctionner à (5 ± 3) °C.

6.5 Agitateur, capable de fonctionner à une vitesse d’environ 50 oscillations min−1.

6.6 Incubateur agitateur, fonctionnant à (37 ± 2) °C à une vitesse d’environ 320 oscillations min−1 ou

6.7 Plateforme(s) rotative(s) ou équivalent pour une utilisation à température ambiante et à

(5 ± 3) °C à une vitesse d’environ 60 oscillations min−1.

© ISO 2019 – Tous droits réservés iii

iv © ISO 2019 – Tous droits réservés

© ISO 2019 – Tous droits réservés v

vi © ISO 2019 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 15216-2:2019(F)

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/.

© ISO 2019 – Tous droits réservés 1

2 © ISO 2019 – Tous droits réservés

© ISO 2019 – Tous droits réservés 3

4 © ISO 2019 – Tous droits réservés

© ISO 2019 – Tous droits réservés 5

6 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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8 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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10 © ISO 2019 – Tous droits réservés

© ISO 2019 – Tous droits réservés 11

12 © ISO 2019 – Tous droits réservés

© ISO 2019 – Tous droits réservés 13

14 © ISO 2019 – Tous droits réservés

© ISO 2019 – Tous droits réservés 15

16 © ISO 2019 – Tous droits réservés

© ISO 2019 – Tous droits réservés 17

18 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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20 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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