PNM ISO/TS 13136

Norme Marocaine 2013

Indice de classement NM 08.0.193

Microbiologie des aliments

Méthode basée sur la réaction de polymérisation
en chaîne (PCR) en temps réel pour la détection
des micro-organismes pathogènes dans les
aliments

Méthode horizontale pour la détection des Escherichia coli

producteurs de Shigatoxines (STEC) et la détermination des
sérogroupes O157, O111, O26, O103 et O145

Norme Marocaine homologuée

Par décision conjoint du Ministre de l’Industrie, du Commerce et des
Nouvelles Technologies N° , publié au B.O N°

Correspondance
La présente norme reprend intégralement la norme ISO/TS 13136/2012.

Modifications

Examinée et adoptée par la commission de normalisation des méthodes d’analyse et

d’échantillonnage des denrées alimentaires
Editée et diffusée par l’Institut Marocain de Normalisation (IMANOR)

© IMANOR 2013 ICS : 07.100.30

 ISO/TS 13136:2012(F)

Sommaire Page

Avant-propos...................................................................................................................................................................... iv
Introduction......................................................................................................................................................................... v
1 Domaine d’application........................................................................................................................................ 1
2 Références normatives....................................................................................................................................... 2
3 Termes et définitions........................................................................................................................................... 2
4 Principe................................................................................................................................................................... 2
4.1 Généralités............................................................................................................................................................. 2
4.2 Enrichissement microbien................................................................................................................................. 3
4.3 Extraction des acides nucléiques.................................................................................................................... 3
4.4 Gènes cibles.......................................................................................................................................................... 3
4.5 Détection................................................................................................................................................................. 3
4.6 Isolement................................................................................................................................................................ 4
5 Diluants, milieux de culture et réactifs........................................................................................................... 4
5.1 Milieux de culture................................................................................................................................................. 4
5.2 Réactifs pour l’extraction des acides nucléiques....................................................................................... 5
5.3 Réactifs pour la PCR........................................................................................................................................... 5
6 Appareillage........................................................................................................................................................... 6
7 Échantillonnage.................................................................................................................................................... 6
8 Préparation de l’échantillon pour essai......................................................................................................... 6
9 Mode opératoire.................................................................................................................................................... 6
9.1 Prise d’essai et suspension mère.................................................................................................................... 6
9.2 Enrichissement..................................................................................................................................................... 7
9.3 Extraction des acides nucléiques.................................................................................................................... 7
9.4 Amplification par PCR (pour la PCR en temps réel)................................................................................... 7
9.5 Isolement de souches......................................................................................................................................... 8
10 Expression des résultats.................................................................................................................................... 8
11 Données de performances................................................................................................................................. 9
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire de criblage.......................................................................... 13
Annexe B (normative) Schéma du mode opératoire d’isolement et de confirmation..................................... 14
Annexe C (informative) Identification des Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (STEC)
par amplification PCR multiplex des gènes de virulence et détection des amplicons par
électrophorèse en gel d’agarose.................................................................................................................... 15
Annexe D (informative) Contrôle interne d’amplification....................................................................................... 20
Annexe E (informative) Amorces et sondes pour les réactions PCR.................................................................. 21
Annexe F (normative) Isolement des souches STEC.............................................................................................. 23
Bibliographie..................................................................................................................................................................... 24

© ISO 2012 – Tous droits réservés  iii

ISO/TS 13136:2012(F)

Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.

Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:

— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans un
groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des membres
votants du comité dont relève le groupe de travail;

— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.

Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS ou ISO/TS
a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa transformation en
Norme internationale soit de son annulation.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L’ISO/TS 13136 a été élaborée par le Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’Accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).

iv  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Introduction

Les Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (STEC) sont des bactéries pathogènes à l’origine de diarrhée
ou d’affections plus sévères chez l’Homme telles que la colite hémorragique ou le syndrome hémolytique et
urémique (SHU). Bien que les STEC puissent appartenir à un grand nombre de sérogroupes, les souches
qui ont été clairement associées aux formes les plus sévères d’affections, comme le SHU, appartiennent aux
sérogroupes O157, O26, O111, O103 et O145 (Référence [1]).

La nomenclature suivante a été adoptée dans la présente Spécification technique:

— stx: gènes codant une Shigatoxine (synonyme de vtx);

— Stx: Shigatoxine (synonyme de Vtx: Vérocytotoxine);

— STEC: Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (synonyme de VTEC: Escherichia coli producteurs
de vérocytotoxines).

L’Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l’attention sur le fait qu’il est déclaré que la conformité
avec les dispositions du présent document peut impliquer l’utilisation d’un brevet.

L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à la portée de ces droits de propriété.

Le détenteur de ces droits de propriété a donné l’assurance à l’ISO qu’il consent à négocier des licences
avec des demandeurs du monde entier, à des termes et conditions raisonnables et non discriminatoires. À ce
propos, la déclaration du détenteur des droits de propriété est enregistrée à l’ISO. Des informations peuvent
être demandées à:

Agence Nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (ANSES)

10 rue Pierre Curie

F-94700 MAISONS-ALFORT Cedex

France

L’attention est d’autre part attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l’objet de droits de propriété autres que ceux qui ont été mentionnés ci-dessus. L’ISO ne saurait être tenue pour
responsable de l’identification de ces droits de propriété en tout ou partie.

L’ISO (www.iso.org/patents) maintient une base de données en ligne des brevets avec leurs documents
correspondants. Les utilisateurs sont encouragés à consulter les bases de données pour les informations à
jour concernant les brevets.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  v

SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 13136:2012(F)

Microbiologie des aliments — Méthode basée sur la réaction de

polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la détection
des micro-organismes pathogènes dans les aliments —
Méthode horizontale pour la détection des Escherichia coli
producteurs de Shigatoxines (STEC) et la détermination des
sérogroupes O157, O111, O26, O103 et O145
IMPORTANT — Il est nécessaire de considérer toutes les souches STEC comme pathogènes pour
l’Homme dans la mesure où toutes peuvent potentiellement être à l’origine d’affections sévères selon
le risque associé à la présentation de la denrée alimentaire (prête à être consommée ou bien destinée
à être consommée après un traitement technologique comme la pasteurisation, la cuisson, etc., utilisé
pour réduire le nombre des bactéries présentes dans la denrée alimentaire) et selon l’état de santé du
sujet consommant la denrée alimentaire.

De plus, du fait de la plasticité génomique de cette espèce bactérienne, de nouvelles combinaisons

de gènes de virulence peuvent être à l’origine de l’émergence de nouveaux séro-pathovars tels que
les E. coli entéroaggrégatifs et producteurs de Shigatoxines O104, à l’origine des épidémies de
syndrome hémolytique et urémique (SHU) en Allemagne et en France de mai à juin 2011. De nouveaux
séro-pathovars d’E. coli atypiques peuvent apparaître suite à l’acquisition par une souche d’E. coli
appartenant à un pathovar autre que les STEC, d’un bactériophage lysogène portant un gène stx.

Ces souches atypiques sont couvertes par le domaine d’application de la présente méthode et peuvent
être facilement détectées car elles sont positives pour les gènes stx.

1 Domaine d’application
La présente Spécification technique décrit l’identification d’Escherichia coli producteurs de Shigatoxines
(STEC) par détection des gènes suivants:

a) les principaux gènes de virulence des STEC, stx et eae (Références [2][3]);

b) les gènes associés aux sérogroupes O157, O111, O26, O103 et O145 (Références [3][4]).

Dans les deux cas, lorsqu’au moins l’un des gènes stx est détecté, un protocole d’isolement de souches est
mise en place.

L’isolement d’une souche STEC à partir d’échantillons positifs pour la présence des gènes associés aux
sérogroupes couverts par le domaine d’application de la présente méthode peut être facilité par le recours à des
techniques d’enrichissement adaptées au sérogroupe détecté [par exemple par séparation immunomagnétique
(ou IMS pour immunomagnetic separation)].

Le protocole utilise la PCR en temps réel comme technologie de référence pour la détection des gènes de
virulence et des gènes associés aux sérogroupes.

La présente Spécification technique s’applique:

1) aux produits destinés à être consommés par l’Homme et aux aliments pour animaux;

2) aux échantillons environnementaux dans la zone de production et de manipulation des aliments;

3) aux échantillons environnementaux dans la zone de production primaire.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  1

ISO/TS 13136:2012(F)

2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables à l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).

ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l’amplification et à la détection pour
les méthodes qualitatives

ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions

3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

Les définitions 3.1 à 3.3 ont été établies à partir des données épidémiologiques relatives aux affections dues
aux STEC, recensées par les organismes en charge de ces données comme les centres américains pour le
contrôle et la prévention des maladies [CDC (Centers for Disease Control)] et, en Europe, le Centre européen
de prévention et contrôle des maladies [ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control)] et
l’Autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments [EFSA (European Food Safety Authority)].

3.1
Escherichia coli producteurs de Shigatoxines
STEC
souches d’E. coli possédant un des gènes codant une Stx

3.2
Escherichia coli producteurs de Shigatoxines et provoquant des lésions d’attachement et d’effacement
STEC provoquant des lésions d’attachement et d’effacement
souches d’E. coli possédant un des gènes codant une Stx et le gène eae codant l’intimine

NOTE Cette combinaison de gènes de virulence est souvent associée aux formes les plus sévères d’affections
dues aux STEC.

3.3
Escherichia coli producteurs de Shigatoxines et appartenant aux sérogroupes hautement pathogènes
STEC appartenant aux sérogroupes hautement pathogènes
souches d’E. coli possédant un des gènes codant une Stx et le gène eae codant l’intimine et appartenant à l’un
des sérogroupes O157, O111, O26, O103 et O145

4 Principe

4.1 Généralités
La méthode spécifiée comprend les étapes consécutives suivantes:

a) enrichissement microbien;

b) extraction des acides nucléiques;

c) détection des gènes de virulence;

d) détection des gènes associés aux sérogroupes;

e) isolement de souches à partir des échantillons positifs.

2  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

La Figure A.1 fournit un schéma du mode opératoire de criblage.

4.2 Enrichissement microbien

Le nombre de bactéries STEC à détecter est augmenté par incubation de la prise d’essai dans l’un des milieux
nutritifs liquides non sélectifs suivants:

a) bouillon tryptone de soja modifié (TSB supplémenté par 1,5 g/l de sels biliaires n° 3, mTSB) supplémenté
par 16 mg/l de novobiocine (mTSB+N);

b) eau peptonée tamponnée (BPW);

c) bouillon tryptone de soja modifié (TSB supplémenté par 1,5 g/l de sels biliaires n° 3, mTSB) supplémenté
par 12 mg/l d’acriflavine (mTSB+A) pour l’analyse du lait et des produits laitiers.

Le mTSB doit être utilisé pour l’analyse des matrices susceptibles de contenir des niveaux élevés de microflore
contaminante. La novobiocine et l’acriflavine inhibent la croissance des bactéries à Gram positif et favorisent la
croissance des cellules à Gram négatif, dont les STEC. Le BPW doit être utilisé pour analyser les échantillons
qui sont supposés contenir des bactéries cibles stressées (tels que des produits surgelés) afin de revivifier
les bactéries STEC stressées, ainsi que des niveaux de microflore contaminante présumés inférieurs à ceux
d’échantillons frais.

NOTE L’ajout de novobiocine est controversé et a fait l’objet d’études par plusieurs auteurs. Il a été observé que la
concentration minimale inhibitrice (CMI) de l’antibiotique des STEC non O157 est inférieure à celle des souches O157
(Référence [5]). L’ajout de novobiocine dans le bouillon d’enrichissement mTSB à la concentration habituelle de 20 mg/l, tel
que spécifié dans l’ISO 16654[19], semble inhiber la croissance d’environ un tiers des souches non O157 (Référence [6]),
augmentant ainsi le risque de résultats faux négatifs.

4.3 Extraction des acides nucléiques

Les acides nucléiques sont extraits conformément aux exigences du système de détection choisi.

4.4 Gènes cibles

Les acides nucléiques purifiés sont utilisés pour la détection des gènes cibles suivants:

— les principaux gènes de virulence pour les STEC: les gènes stx, codant les Shigatoxines, et le gène eae,
codant une protéine de 90 kDa, l’intimine, impliquée dans le mécanisme d’adhésion dit d’attachement et
d’effacement, caractéristique des souches STEC à l’origine d’affections sévères. Les gènes stx codent
une famille de toxines comprenant deux principaux types: stx1 et stx2. Le gène stx2 comprend sept
variants connus (de stx2a à stx2g) (Référence [22]). Il a été démontré que seuls les variants stx2a, stx2b
et stx2c sont produits par les souches STEC spécifiées à l’Article  1, et les gènes stx correspondants
sont par conséquent ciblés dans la présente Spécification technique. Les numéros d’accession GenBank
correspondant aux gènes variants stx2 sont:

— stx2a: X07865

— stx2b: L11078

— stx2c: M59432

— le gène eae codant l’intimine

— les gènes rfbE(O157), wbdl(O111), wzx(O26), ihp1(O145) et wzx(O103), afin d’identifier les sérogroupes
correspondants.

4.5 Détection
La détection des gènes cibles est réalisée conformément au système de détection choisi.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  3

ISO/TS 13136:2012(F)

4.6 Isolement
Si la présence d’une souche STEC est suspectée, le protocole d’isolement est mis en place. Si l’un des
sérogroupes spécifiés dans le domaine d’application de la présente Spécification technique est détecté,
un enrichissement adapté au sérogroupe détecté (par exemple par séparation immunomagnétique) peut
être réalisé puis mis en culture sur un milieu gélosé tryptone-bile-glucuronide (TBX) ou, si possible, sur un
milieu sélectif spécifique (voir Annexe F, Notes 2 et 3) de manière à faciliter l’isolement de la souche STEC
correspondante de la microflore annexe.

5 Diluants, milieux de culture et réactifs

Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue
et de l’eau distillée ou déminéralisée stérile ou de l’eau de pureté équivalente.

5.1 Milieux de culture

5.1.1 Bouillon tryptone de soja modifié (mTSB)

5.1.1.1 Milieu de base

Composition et pH

Hydrolysat enzymatique de caséine 17 g

Hydrolysat enzymatique de soja 3 g

d(+) Glucose 2,5 g

Chlorure de sodium 5 g

Hydrogénophosphate de di-potassium (K 2HPO4) 4 g

Sels biliaires n° 3 1,5 g

Eau qsp 1 000 ml

pH 7,4 ± 0,2

Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu déshydraté dans l’eau. Ajuster le pH avec un pH-mètre, à pH 7,4 ± 0,2
à 25 °C et stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

5.1.1.2 Solution de novobiocine

Composition

Novobiocine 0,16 g

Eau 10 ml

Préparation

Dissoudre la novobiocine dans l’eau et stériliser par filtration sur membrane au moyen de filtres de 0,22 µm ou
0,45 µm.

Préparer le jour de l’utilisation.

4  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

5.1.1.3 Solution d’acriflavine

Composition

Acriflavine 0,12 g

Eau 10 ml

Préparation

Dissoudre l’acriflavine dans l’eau et stériliser par filtration sur membrane au moyen de filtres de 0,22 µm ou 0,45 µm.

Préparer le jour de l’utilisation.

5.1.1.4 Préparation du milieu complet

Immédiatement avant utilisation, ajouter 1 ml de solution de novobiocine (5.1.1.2) ou d’acriflavine (5.1.1.3) aux
1 000 ml de milieu mTSB refroidi (5.1.1.1).

La concentration finale en novobiocine doit être de 16 mg/l de mTSB.

La concentration finale en acriflavine doit être de 12 mg/l de mTSB.

5.1.2 Eau peptonée tamponnée (BPW)

Composition et pH

Peptone 10 g

Chlorure de sodium 5,0 g

Hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4) 3,5 g

Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) 1,5 g

Eau qsp 1 000 ml

pH 7,0 ± 0,2

Préparation

Dissoudre les composants ou la poudre déshydratée dans l’eau. Ajuster le pH avec un pH-mètre, à pH 7,0 ± 0,2
à 25 °C et stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

5.2 Réactifs pour l’extraction des acides nucléiques

Les réactifs à utiliser pour l’extraction des acides nucléiques ne sont pas listés, car ils dépendent de la méthode
choisie (9.3).

5.3 Réactifs pour la PCR

Voir l’ISO 20838.

5.3.1 Oligonucléotides (amorces) et sondes de détection

Les amorces et sondes utilisées pour la détection spécifique des gènes cibles par PCR conventionnelle et en
temps réel sont données à l’Annexe C et à l’Annexe E.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  5

ISO/TS 13136:2012(F)

6 Appareillage
Matériel de laboratoire courant de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.

6.1 Bain-marie ou bloc chauffant, pouvant être maintenu à des températures allant jusqu’à 100 °C.

6.2 Incubateur, conforme à l’ISO 7218, pouvant être maintenu à 37 °C ± 1° C.

6.3 Appareillage pour l’extraction des acides nucléiques.

Matériel adapté conformément à la méthode choisie (le cas échéant).

6.4 Pipettes, de capacités comprises entre 1 µl et 100 µl, ISO 7550[16].

6.5 Microtubes de PCR en temps réel à parois fines (tubes à essai de 0,2 ml/0,5 ml), microplaques PCR
multipuits ou autre récipient en plastique à usage unique léger et transparent adapté.

6.6 Thermocycleur. Plusieurs marques d’appareils sont disponibles et la marque utilisée peut être choisie
conformément aux règles du laboratoire.

6.7 Appareil pour la détection des produits PCR.

Une émission de lumière suivant la réaction PCR 5’-nucléase est détectée par l’automate de PCR en temps réel.

6.8 Mélangeur péristaltique, avec sacs stériles et éventuellement avec un dispositif de réglage de la vitesse
et de la durée.

7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Spécification technique. Se
référer à la Norme internationale spécifique traitant du produit concerné, ou aux réglementations spécifiques.
S’il n’existe aucune Norme internationale traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé
aux parties concernées de conclure un accord à ce sujet.

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, qui n’a pas été endommagé
ni modifié pendant le transport ou le stockage.

8 Préparation de l’échantillon pour essai

Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique traitant du produit
concerné. S’il n’existe aucune Norme internationale spécifique, il est recommandé aux parties concernées de
conclure un accord à ce sujet.

9 Mode opératoire

9.1 Prise d’essai et suspension mère

9.1.1 Généralités

Utiliser la quantité de milieu d’enrichissement nécessaire pour obtenir une dilution finale de 10 -1 de la prise
d’essai d’origine.

6  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

9.1.2 Pour les matrices alimentaires susceptibles de contenir un niveau élevé de microflore annexe

Pour les matrices solides, transférer stérilement la prise d’essai (x g) de l’échantillon dans un sac de mélangeur
péristaltique contenant 9x  ml de mTSB supplémenté en novobiocine ou en acriflavine (5.1.1.4). Utiliser de
préférence des sacs avec filtres.

Homogénéiser dans un mélangeur péristaltique (voir l’ISO 7218) (6.8).

Pour les matrices liquides, transférer la prise d’essai (x ml) de l’échantillon liquide à l’aide d’une pipette stérile,
dans le tube ou le flacon contenant 9x ml du bouillon d’enrichissement mTSB supplémenté en novobiocine ou
en acriflavine (5.1.1.4).

9.1.3 Pour les matrices alimentaires susceptibles de contenir des bactéries cibles stressées

Laisser les produits surgelés décongeler à température ambiante puis transférer la prise d’essai (x g ou x ml)
dans un sac de mélangeur péristaltique contenant 9x ml de BPW (5.1.2) et procéder comme ci-dessus.

9.2 Enrichissement

9.2.1 Incubation

Incuber le sac de mélangeur péristaltique, le tube ou le flacon (9.1.2) à 37 °C ± 1 °C pendant 18 h à 24 h.

9.2.2 Contrôle de processus (pour la PCR en temps réel)

Procéder à un contrôle de processus conformément à l’ISO 22174.

Des lignes directrices relatives au contrôle interne d’amplification (CIA) et au contrôle de processus sont
fournies à l’Annexe D et en C.3.8.

9.3 Extraction des acides nucléiques

Utiliser un mode opératoire d’extraction d’acides nucléiques approprié pour les bactéries à Gram négatif.
La Référence [10] présente une liste exhaustive de méthodes utilisables. De manière alternative, des kits
disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés conformément aux instructions des fabricants.

9.4 Amplification par PCR (pour la PCR en temps réel)

9.4.1 Généralités

L’approche d’amplification par PCR décrite est basée sur la PCR en temps réel.

Suivre toutes les exigences concernant l’amplification par PCR, comme spécifié dans l’ISO 20838.

Les amorces et les sondes de détection utilisées pour la mise en œuvre de la PCR en temps réel sont décrites
à l’Annexe E.

9.4.2 Détection des produits PCR

L’émission de lumière, une fois produite, est mesurée par l’appareil au cours des amplifications.

9.4.3 Interprétation des résultats PCR

Les résultats PCR obtenus, y compris ceux des contrôles spécifiés dans l’ISO 22174 et à l’Annexe D, sont
interprétés par le logiciel associé à l’appareil. Lors de l’amplification, le logiciel mesure l’amplification par
réaction de PCR 5’-nucléase en analysant les émissions fluorescentes du fluorophore donneur («reporter»)
pour chaque échantillon, Rn. Le ΔRn est égal à Rn moins l’intensité basale du fluorophore donneur mesurée
lors des premiers cycles. À la fin des cycles PCR, une réaction est considérée comme positive si la courbe du
ΔRn dépasse le seuil de détection, défini comme 10 fois l’écart-type de la ligne d’émission moyenne calculée

© ISO 2012 – Tous droits réservés  7

ISO/TS 13136:2012(F)

entre les premiers cycles. Le cycle seuil, Ct, est défini comme le nombre de cycles au-delà duquel le ΔRn d’un
échantillon dépasse la valeur de seuil de détection ainsi déterminée.

Si les résultats sont ambigus, vérifier les courbes d’émission. Les échantillons positifs donnent une courbe
avec une nette augmentation de la fluorescence, à partir d’un nombre de cycles correspondant au Ct.

Si les témoins donnent des résultats inattendus, recommencer le mode opératoire.

La méthode est séquentielle (voir le schéma à la Figure A.1):

— étape 1: détection des gènes stx et du gène eae (PCR A à l’Annexe E — cette recherche peut aussi être
effectuée en PCR duplex);

— étape  2  a): en cas d’obtention de résultats positifs pour les gènes stx et le gène eae, les bouillons
d’enrichissement sont soumis à essai pour sérogroupage moléculaire (PCR B à l’Annexe E);

— étape 2 b): en cas d’obtention de résultats positifs pour les gènes codant une Stx, l’isolement de souches
est mis en œuvre  — un protocole d’enrichissement adapté au sérogroupe détecté (par exemple par
séparation immunomagnétique) peut être utilisé pour faciliter l’isolement d’une souche STEC à partir
d’échantillons positifs pour un des sérogroupes couverts par le domaine d’application de la présente
Spécification technique (voir 9.5 et Figure B.1).

9.5 Isolement de souches

L’isolement de souches STEC est nécessaire pour confirmer que les signaux PCR positifs obtenus sont
associés à des gènes présents dans une seule et même cellule bactérienne vivante.

Pour un échantillon positif pour l’un des gènes associés aux sérogroupes couverts par le domaine d’application
de la présente Spécification technique, afin de faciliter l’étape d’isolement de souches, il est possible d’effectuer
un enrichissement adapté au sérogroupe détecté suivi d’une mise en culture directe sur un milieu gélosé
approprié et d’un criblage des colonies isolées pour la présence des gènes de virulence.

Les protocoles de PCR conventionnelle et de PCR en temps réel présentés à l’Annexe C et à l’Annexe E ou tout
autre protocole de PCR équivalent doivent être utilisés afin de confirmer que les colonies isolées possèdent
les gènes de virulence recherchés.

Le schéma du protocole d’isolement est donné à la Figure B.1 et un mode opératoire est donné à l’Annexe F.

10 Expression des résultats

a) Échantillons négatifs pour les gènes stx: non détection de souche STEC dans la prise d’essai de x g
ou x ml (voir l’ISO 7218).

En l’absence de gènes stx, le protocole est arrêté sans procéder à la recherche du gène eae codant l’intimine
ou des gènes associés aux sérogroupes couverts par le domaine d’application de la présente méthode.

Si aucune souche STEC n’est isolée à partir des échantillons positifs pour la présence de gènes stx en
criblage PCR:

b) Échantillons positifs pour les gènes stx: détection présumée de souches STEC dans la prise d’essai
de x g ou x ml.

c) Échantillons positifs pour les gènes stx et le gène eae: détection présumée de souches STEC
provoquant des lésions d’attachement et d’effacement dans la prise d’essai de x g ou x ml.

d) Échantillons positifs pour les gènes stx et le gène eae ainsi que pour les gènes associés à l’un
des sérogroupes couverts par le domaine d’application de la présente Spécification technique:
détection présumée de souches STEC du sérogroupe XX1) dans la prise d’essai de x g ou x ml.

1) XX désigne le sérogroupe spécifié par la présence des gènes identifiés.

8  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Si une souche STEC est isolée à partir des échantillons positifs pour la présence de gènes stx en criblage PCR
et confirme la suspicion.

e) Souches d’E. coli isolées positives pour les gènes stx: présence de souches STEC dans la prise
d’essai de x g ou x ml.

f) Souches d’E. coli isolées positives pour les gènes stx et le gène eae: présence de souches STEC
provoquant des lésions d’attachement et d’effacement dans la prise d’essai de x g ou x ml.

g) Souches d’E. coli isolées positives pour les gènes stx et le gène eae ainsi que pour les gènes
associés à l’un des sérogroupes couverts par le domaine d’application de la présente Spécification
technique: présence de souches STEC du sérogroupe XX 2) dans la prise d’essai de x g ou x ml.

11 Données de performances

11.1 L’approche PCR en temps réel décrite dans la présente Spécification technique a fait l’objet d’une étude
de validation menée conformément aux règles de l’ISO  16140:2003[17]. Dans la mesure où la seule Norme
internationale de référence disponible à l’époque était l’ISO 16654[19] relative à la détection d’E. coli O157 dans
les aliments, la procédure de validation et de certification NF (Référence [7]) de la méthode n’a porté que sur la
détection des souches STEC appartenant au sérogroupe O157.

Suite à cette étude, la partie de la méthode relative à la détection des STEC O157 a été certifiée par l’AFNOR
comme étant équivalente à l’ISO  16140:2003[17] (numéro de certificat GEN  25/04-11/08). Le dossier de
validation complet est disponible en Référence [7].

11.2 Certaines caractéristiques de performances des étapes de criblage par PCR en temps réel de la méthode
ont été déterminées par des études qui ont été publiées. La sensibilité et la limite de détection de la PCR en temps
réel ont notamment été déterminées en utilisant des dilutions de plasmides contenant les gènes clonés codant les
différentes cibles (Référence [8]). Un récapitulatif des résultats de cette étude est présenté dans le Tableau 1.

Tableau 1 — Sensibilité et limite de détection des réactions PCR 5’-nucléase pour certains des
gènes cibles de la présente Spécification technique (adapté de la Référence [8])

Gène cible Limite de détection Efficacité

Nombre de copies/réaction %
stx1 5 94,7
stx2 5 94
rfbE 1 94,2
wbdI 5 94
wzx 5 97,7
ihp1 5 99,6

Une autre étude (Référence [17]) a étudié les performances des approches PCR en temps réel proposées pour
l’analyse de cultures pures de souches STEC appartenant aux sérogroupes du domaine d’application de la
présente Spécification technique en mélange avec une souche de laboratoire K-12 (C600). Le récapitulatif des
résultats est présenté dans le Tableau 2.

11.3 La présente Spécification technique a été utilisée dans la troisième étude collaborative organisée
en 2009 par le laboratoire communautaire de référence [EURL (European Union Reference Laboratory)]
désigné pour les E. coli y compris les STEC. L’étude a consisté à analyser un panel de cinq éponges humides
expérimentalement ensemencées simulant un prélèvement effectué sur des carcasses contaminées contenant
des organismes d’intérêt, notamment des STEC O157 et O26, ainsi que la flore microbienne naturelle (Tableau 3).

2) XX désigne le sérogroupe auquel appartient la souche isolée, qui a été identifié par la présence des gènes correspondants
ou par détermination phénotypique.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  9

ISO/TS 13136:2012(F)

Le choix d’utiliser des éponges humides expérimentalement ensemencées simulant un prélèvement effectué
sur des carcasses contaminées comme matrices à analyser lors de l’essai d’aptitude a été motivé par les
recommandations de l’Autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments [EFSA (European Food Safety
Authority)] pour les prochains plans de surveillance mis en œuvre par les états membres et relatifs aux STEC
(ISO 16654[19]).

Quatorze laboratoires nationaux de référence (LNR) pour les E. coli ont participé à cette étude. L’évaluation
des performances de la méthode pour la détection des STEC non O157 (STEC O26) a permis d’obtenir les
valeurs suivantes:

Sensibilité (Se): 100 % [intervalle de confiance (IC) à 95 %, 96,97 % à 100 %]

Spécificité (Sp): 99,62 % (IC à 95 %, 97,5 % à 100 %)

Le récapitulatif des résultats obtenus par chacun des LNR participants est présenté dans le Tableau 4.

Les LNR ont également dû isoler les STEC non O157 présents dans les échantillons. Le résultat de cette étape
d’isolement est indiqué dans le Tableau 5.

Le rapport relatif à l’analyse complète des résultats de cette troisième étude collaborative EURL-STEC est mis
à la disposition du public (Référence [9]).

Tableau 2 — Détection de petits nombres de STEC en co-cultures (adapté de la Référence [15])

Valeurs de Ct
Sérotype
ufc/ml rfbE wbd1 wzx ihp1 FliC wzx
STEC stx1/stx2 eae
(O157) (O111) (O103) (O145) (H7) (O26)
2à3 28 à 31 31 à 32 — — — — — 31 à 33
O26:H11                  
10 à 20 25 à 27 28 à 29 — — — — — 29
2à3 29 à 30 31 à 32 — — 32 à 33 — — —
O103:H2                  
10 à 20 26 à 27 29 à 30 — — 29 à 31 — — —
2à3 26 à 27 30 à 31 — 30 à 31 — — — —
O111:[H8]                  
10 à 20 24 à 25 29 à 30 — 27 à 28 — — — —
2à3 32 à 33 31 à 32 — — — 31 à 34 — —
O145:[H28]                  
10 à 20 30 à 32 29 à 31 — — — 30 — —
2à3 29 à 30 29 à 31 31 à 32 — — — 33 à 38 —
O157:H7                  
10 à 20 26 à 28 26 à 29 29 à 31 — — — 31 à 33 —

10  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Tableau 3 — Composition des échantillons pour la troisième étude collaborative EURL-STEC

Valeurs en unités formant colonie par millilitre

Échantillon/contaminant Échantillon A Échantillon B Échantillon C Échantillon D Échantillon E

STEC O157
2 2 × 103 20 0 0
stx1, stx2, eae
STEC O26
0 40 4 × 103 40 0
stx1, eae
E. coli 102 102 102 102 102
K. pneumoniae 2 × 102 2 × 102 2 × 102 2 × 102 2 × 102
S. faecalis 5 × 102 5 × 102 5 × 102 5 × 102 5 × 102

Déterminée conformément à l’ISO/TS 19036:2006[20], l’incertitude étendue, U, liée au niveau d’inoculum est

de 0,22 log10 (ufc/ml) pour les souches E. coli.

Tableau 4 — Détection des gènes de virulence et des gènes associés aux sérogroupes dans les
bouillons d’enrichissement par PCR en temps réel
(partie «criblage» de la méthode, troisième étude collaborative EURL-STEC)

Gène Laboratoires participants

Échantillon
cible L1 L2 L4 L7 L8 L9 L12 L14 L15 L17 L21 L22 L25 L30
A + + + + + + + + + + + + + + +
B + + + + + + + + + + + + + + +
stxa C + + + + + + + + + + + + + + +
D + + + + + + + + + + + + + + +
E - - - - - - - - - - - - - - -
A + + + + + + + + + + + + + + +
B + + + + + + + + + + + + + + +
eae C + + + + + + + + + + + + + + +
D + + + + + + + + + + + + + + +
E - - - - - - - - - + - - - - -
A - - - - - - - - - - - - - - -
B + + + + + + + + + + + + + + +
O26 C + + + + + + + + + + + + + + +
D + + + + + + + + + + + + + + +
E - - - - - - - - - - - - - - -
A - - - - - - - - - - - - - - -
B - - - - - - - - - - - - - - -
O111 C - - - - - - - - - - - - - - -
D - - - - - - - - - - - - - - -
E - - - - - - - - - - - - - - -
A - - - - - - - - - - - - - - -
B - - - - - - - - - - - - - - -
O103 C - - - - - - - - - - - - - - -
D - - - - - - - - - - - - - - -
E - - - - - - - - - - - - - - -

© ISO 2012 – Tous droits réservés  11

ISO/TS 13136:2012(F)

Tableau 4 (suite)

Gène Laboratoires participants

Échantillon
cible L1 L2 L4 L7 L8 L9 L12 L14 L15 L17 L21 L22 L25 L30
A - - - - - - - - - - - - - - -
B - - - - - - - - - - - - - - -
O145 C - - - - - - - - - - - - - - -
D - - - - - - - - - - - - - - -
E - - - - - - - - - - - - - - -
a Inclut soit stx1, soit stx2.

Tableau 5 — Isolement de souches STEC O26 à partir des bouillons d’enrichissement positifs
par PCR en temps réel (confirmation des bouillons d’enrichissement positifs par isolement de la souche
contaminante présente, troisième étude collaborative EURL-STEC)

Échan- Valeur Laboratoires

Essai
tillon vraie L1 L2 L4 L7 L8 L9 L12 L14 L15 L16 L17 L 21 L 25 L30
B + + + + + + + + + + + + + + +
Isolement
de souches C + + + + + + + + + + + + + + +
O26
D + + + + + + + + + + + + + + +

12  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Annexe A
(normative)

Schéma du mode opératoire de criblage

Prise d'essai x g ou x ml

9 x ml mTSB+N/A ou BPW

Enrichissement 18 h à 24 h
37 °C ± 1 °C

Prise d’essai (1 ml) de la culture, purification

d’ADN et détection des gènes stx et eae

Résultat positif pour les gènes stx et eae: Résultat négatif pour les gènes stx:
effectuer l’essai pour les gènes associés
Résultat positif pour les gènes stx
aux sérogroupes
Isolement (voir Annexe B)
Isolement (voir Annexe B)

Rendre les résultats Rendre les résultats Rendre les résultats

Figure A.1 — Schéma du mode opératoire de criblage

© ISO 2012 – Tous droits réservés  13

ISO/TS 13136:2012(F)

Annexe B
(normative)

Schéma du mode opératoire d’isolement et de confirmation3)

Si l’échantillon est positif pour l’un des gènes associés aux sérogroupes couverts par le domaine d’application
de la méthode, un enrichissement adapté au sérogroupe détecté peut être effectué afin de faciliter l’isolement.

Bouillon d’enrichissement ou enrichissement adapté au sérogroupe détecté

étalé sur un milieu gélosé approprié.
Incubation pendant 18 h à 24 h à 37 °C ± 1°C

Prélever jusqu’à 50 colonies présentant un phénotype d’E. coli. Inoculer chaque colonie
sur un milieu gélosé nutritif (colonies séparées ) puis les regrouper
dans de l’eau (pools de 10 colonies chacun).
Procéder à la détection des gènes stx et eae sur les colonies isolées ou les pools

Si une colonie est positive pour la présence de gènes identifiés lors de l’étape de
criblage, passer à l’étape suivante. Si un pool est positif, incuber la gélose nutritive.
Soumettre à essai les colonies individuelles qui composent le pool positif comme
indiqué ci-dessus

S’assurer de l’identification des colonies positives comme des E. coli et vérifier leur
appartenance au sérogroupe recherché si l’échantillon était positif en PCR pour ce sérogroupe
(par exemple par PCR ou agglutination sur lame)

Caractérisation plus précise (facultative): envoyer la souche à un laboratoire de référence

Rendre les résultats

Figure B.1 — Schéma du mode opératoire d’isolement et de confirmation

3) Voir Annexe F.

14  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Annexe C
(informative)

Identification des Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (STEC)

par amplification PCR multiplex des gènes de virulence et détection des
amplicons par électrophorèse en gel d’agarose

C.1 Généralités
Les STEC sont des souches d’Escherichia coli qui ont acquis des bactériophages lysogéniques portant des
gènes qui codent pour la production de Shigatoxines (Référence [12]). La méthode décrite à la présente annexe
vise à détecter par PCR multiplex la présence de gènes codant une Stx dans des cultures pures d’E. coli afin
de confirmer qu’il s’agit bien de souches STEC. La présence du gène eae codant l’intimine est également
recherchée, car ce gène est associé aux souches STEC à l’origine d’affections sévères chez l’Homme.

Les paires d’amorces utilisées, stx1F/stx1R and stx2F/stx2R (Référence [11]), permettent de détecter les gènes
stx1 et stx2, respectivement. Cette paire d’amorces reconnaît tous les variants de stx2 sauf stx2f. Toutefois,
ce variant n’est pas considéré comme d’une importance majeure en termes de santé publique puisqu’il a été
principalement retrouvé dans des souches STEC isolées d’oiseaux (ISO/TS 19036[20]). Les amorces utilisées
pour la détection du gène eae (Référence [11]) permettent de détecter tous les variants connus de ce gène.

AVERTISSEMENT — La méthode décrite dans la présente annexe est destinée à être utilisée uniquement
à partir des cultures bactériennes pures pour confirmation des souches isolées.

C.2 Abréviations
S.U.: Sample Unit (unité d’échantillonnage, U.E.)

C.3 Mode opératoire

C.3.1 Principe de la méthode

La méthode est basée sur l’amplification PCR de régions d’ADN cibles grâce à l’utilisation d’amorces spécifiques.

Les gènes stx1, stx2 et eae sont détectés par réaction PCR multiplex en utilisant des amorces spécifiques
(Tableau C.1). La méthode se compose des étapes suivantes:

— préparation de l’échantillon;

— préparation de la réaction PCR;

— lecture des résultats de la PCR par électrophorèse horizontale en gel d’agarose.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  15

ISO/TS 13136:2012(F)

C.3.2 Préparation de l’échantillon

Les cultures ensemencées sur un milieu gélosé, par exemple gélose trypticase soja (TSA), sont traitées comme suit:

— prélever une seule colonie bactérienne isolée à l’aide d’une oese stérile de 1 µl;

— mettre en suspension la colonie prélevée dans 100 µl d’eau milliQ4) stérilisée par filtration (filtre de 0,22 µm)
et faire bouillir pendant 10 min.

C.3.3 Préparation de la réaction PCR

Pour chaque échantillon, prévoir un volume réactionnel de 50 µl [solution tampon de réaction à 1×, MgCl2 à
1,2  mmol/l, deux solutions de désoxyribonucléotide trisphosphates (dNTP) à 0,2  mmol/l chacune, 50  pmol
de chaque amorce, 2 unités de Taq polymérase et 10 µl d’ADN]. Les volumes de réactifs sont déterminés en
fonction du volume final de réaction. Utiliser de l’eau milliQ pour les réactions PCR.

Dans chaque essai PCR, inclure un témoin positif et deux témoins négatifs. Le témoin positif est un ADN
extrait d’une souche E. coli possédant les gènes de virulence recherchés. L’un des témoins négatifs est l’ADN
extrait d’un isolat d’E. coli non pathogène (ne possédant aucun gène de virulence) et l’autre est constitué de la
solution réactionnelle sans ajout d’ADN.

Procéder aux réactions PCR dans un thermocycleur programmé avec le profil thermique décrit en Référence [11]
(Tableau C.1).

C.3.4 Électrophorèse en gel d’agarose

Préparer un gel d’agarose à 20 g/l dans du tris/borate/EDTA (TBE) ou du tris/acétate/EDTA (TAE) à 1×. Déposer
dans chaque puits du gel, 15 µl de chaque réactif de PCR mélangé auxquels a été ajouté un tampon de charge
à la concentration finale de 1×. Soumettre les échantillons à une tension constante (100 V) dans une solution
de tampon de migration (TBE ou TAE) à 1×. Utiliser un marqueur de poids moléculaire adapté précisément aux
poids moléculaires attendus des amplicons produits (voir Tableau C.1).

AVERTISSEMENT — Dans le but de s’assurer de la présence des gènes de virulence, il est important
de vérifier que les bandes obtenues correspondent bien aux poids moléculaires attendus. De plus,
il faut s’assurer que les bandes obtenues avec les souches de référence correspondent également
parfaitement au poids moléculaire attendu.

Il convient d’ajouter du bromure d’éthidium aux gels d’agarose afin de permettre la visualisation de l’ADN. Ce
réactif est un agent intercalant d’ADN fréquemment utilisé comme marqueur des acides nucléiques dans les
laboratoires de biologie moléculaire. Sous lumière ultraviolette, il émet de la fluorescence rouge-orangée. S’il
est ajouté avant de couler le gel d’agarose dans le moule prévu à cet effet, la concentration finale en bromure
d’éthidium doit être de 0,5 µg/ml. Le gel d’agarose peut également être coloré après l’électrophorèse dans une
solution aqueuse de bromure d’éthidium à 0,5 µg/ml.

D’autres marqueurs d’ADN que le bromure d’éthidium sont disponibles dans le commerce et peuvent être
utilisés conformément aux instructions des fabricants.

C.3.5 Appareillage
Matériel de laboratoire courant de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.

C.3.5.1 Hotte à flux laminaire pour PCR.

C.3.5.2 Pipette, stérile, de capacité 1 ml.

4) milliQ est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Millipore Corporation. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.

16  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

C.3.5.3 Oeses stériles, pour bactériologie.

C.3.5.4 Flacons en verre borosilicaté, de capacité 500 ml.

C.3.5.5 Éprouvettes en verre borosilicaté, de capacité 500 ml.

C.3.5.6 Éprouvettes en verre borosilicaté, de capacité 1 l.

C.3.5.7 Incubateur, pouvant être maintenu à 37 °C ± 1 °C.

C.3.5.8 Balances de laboratoire.

C.3.5.9 Autoclave.

C.3.5.10 Pipeteur.

C.3.5.11 Micropipettes.

C.3.5.12 Pointes de micropipettes, stériles.

C.3.5.13 Tubes de microcentrifugation, de capacité 1,5 ml.

C.3.5.14 Tubes PCR, de capacité 0,2 ml ou 0,5 ml.

C.3.5.15 Thermocycleur.

C.3.5.16 Plaque d’agitation magnétique.

C.3.5.17 Barreaux aimantés, pour plaque d’agitation magnétique.

C.3.5.18 Déioniseur d’eau milliQ.

C.3.5.19 Appareil d’électrophorèse.

C.3.5.20 Révélateur à UV.

C.3.5.21 Machine à glace.

C.3.5.22 Four à micro-ondes.

C.3.6 Réactifs et milieux

Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue
et de l’eau distillée ou déminéralisée stérile ou de l’eau de pureté équivalente.

C.3.6.1 Boîtes de milieux gélosés.

C.3.6.2 Solution mère de dNTP.

C.3.6.3 Solution d’oligonucléotides de synthèse.

C.3.6.4 Taq Polymérase et solution tampon de réaction, à 10× avec ou sans MgCl2.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  17

ISO/TS 13136:2012(F)

C.3.6.5 Solution tampon de migration pour électrophorèse.

C.3.6.6 Marqueur de poids moléculaire pour ADN.

C.3.6.7 Tampon de charge.

C.3.6.8 Agarose.

C.3.6.9 Solution de bromure d’éthidium ou autres marqueurs d’ADN.

C.3.7 Sécurité et dispositifs de protection

Certaines souches STEC sont susceptibles d’infecter les êtres humains même à dose infectieuse très basse
et de provoquer de graves pathologies. Des infections contractées en laboratoire ont été rapportées. Par
conséquent, travailler avec des souches STEC impose d’employer de bonnes pratiques de laboratoire ainsi
que des dispositifs de protection. Le bromure d’éthidium est un agent mutagène et toxique. Il convient donc
de l’utiliser conformément à la fiche de sécurité fournie et avec les dispositifs de protection (blouses et gants
en latex). La lumière UV est susceptible de causer des lésions oculaires. Il est donc obligatoire d’utiliser des
écrans et des lunettes de protection en poly(méthacrylate de méthyle).

C.3.8 Souches de référence et témoin de processus

Utiliser une souche STEC possédant les gènes stx1, stx2 et eae comme témoin positif pour tous les gènes,
comme par exemple la souche de référence E. coli O157 EDL933 (WDCM 00188) (Références [12][13]).

Utiliser une souche d’E. coli K12, telle que la MG1655, comme témoin négatif.

Les témoins PCR sont préparés comme spécifié en C.3.2. Les ADN des témoins peuvent être préparés à
l’avance et conservés en aliquotes de 10 µl prêtes à l’emploi à -20 °C pendant 8 mois.

C.3.9 Interprétation des résultats

Les échantillons pour lesquels des amplicons de la taille attendue (voir C.3.4 et Tableau C.1) sont obtenus sont
considérés comme positifs pour les gènes cibles correspondants.

Les témoins positifs et négatifs inclus dans chaque réaction donnent respectivement des résultats positifs et négatifs.
Si ces témoins donnent des résultats ambigus, il convient de recommencer le mode opératoire depuis le début.

Cette méthode étant destinée à la confirmation de souches isolées et déjà soumises à une PCR en temps réel
pour les mêmes caractéristiques, sa validation par vérification de l’amplicon au moyen d’un séquençage direct
ou d’autres méthodes adaptées peut être considérée comme redondante.

En cas d’obtention de résultats ambigus, il convient de réaliser une vérification des amplicons (par exemple par
séquençage direct ou par digestion par une endonucléase de restriction).

18  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Tableau C.1 — Fragments d’amplification de la taille attendue

Taille de
Nom de l’amorce
Gène cible Séquence de l’amorce l’amplicon
(Référence [11])
pb
eae eaeAF GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC 384
eaeAR CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG
stx1 stx1F ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC 180
stx1R AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC
stx2 (groupe) stx2F GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC 255
  stx2R TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCTG
Profil thermique (Référence  [11]): 35  cycles PCR, comprenant chacun une dénaturation de 1  min à 95  °C, une
hybridation de 2 min à 65 °C pendant les 10 premiers cycles, diminuant jusqu’à 60 °C des cycles 11 à 15 (1 °C par cycle),
et une élongation de 1,5 min à 72 °C, la durée de cette élongation passant à 2,5 min pour les cycles 25 à 35.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  19

ISO/TS 13136:2012(F)

Annexe D
(informative)

Contrôle interne d’amplification

Trois contrôles internes d’amplification (CIA) différents peuvent être utilisés lors de la PCR en temps réel.

— TaqMan®5) est un témoin positif interne exogène. Le kit fourni comprend tous les réactifs nécessaires (les
amorces, une sonde Vic™6), l’ADN cible pour le CIA et la solution de blocage). L’ADN cible pour le CIA
doit être dilué au dixième pour obtenir un nombre de copies d’environ 100 par réaction PCR. La taille de
l’amplicon n’est pas communiquée à l’utilisateur.

— Pour le contrôle interne d’amplification (CIA) basé sur la formule ouverte pUC 19, voir la Référence [27]. Il
convient d’utiliser environ 100 copies d’ADN cible (pUC 19) par réaction PCR. La taille du CIA est de 119 pb.

— Un plasmide recombinant (appelé pIAC-STEC) peut être utilisé lors de la réaction PCR en temps réel pour
la détection des gènes stx 7). Ce CIA contient le fragment d’ADN suivant cloné dans le site EcoRI de pUC19:
5′-ATTTTTGTTACTGTGACAGCTGAAGCTTTACGTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTT
GCGTATAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAATT-3’ (lettres en gras: séquences complémentaires
des amorces stx1/stx2 sens et antisens; séquence soulignée: site d’hybridation de la sonde du CIA).

Le CIA est co-amplifié avec les gènes stx à l’aide des mêmes amorces que stx (Annexe E), dans les
mêmes conditions et dans le même tube PCR (Référence  [14]). Il est détecté par une sonde à ADN
spécifique (5’ [Red640]-CAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCG-[BHQ2] 3’) incluse dans le mélange PCR
à une concentration identique à celle des sondes ADN de stx1 et stx2 (toutes deux marquées avec
[fluorescéine] et [BHQ1] au niveau des extrémités 5’ et 3,’ respectivement). Il convient d’utiliser un total
de 64 copies du CIA par réaction PCR. La taille de l’amplicon du CIA est de 96 pb. Les performances
de la réaction PCR en temps réel pour la détection du CIA-stx ont été évaluées à l’aide d’échantillons
alimentaires contaminés de façon artificielle et naturelle (Référence [5]).

Les deuxième et troisième systèmes peuvent également être utilisés comme contrôles d’extraction en ajoutant
100 copies du plasmide pUC 19 ou du pIAC-STEC à l’aliquote d’échantillon avant l’étape de purification de l’ADN.

5) TaqMan® est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Applied Biosystems. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
6) Vic est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Applied Biosystems. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
7) Communication personnelle, Auvray et al.

20  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Annexe E
(informative)

Amorces et sondes pour les réactions PCR

Le protocole de PCR en temps réel décrit est basé sur l’utilisation des amorces et sondes décrites ci-après, qu’il
convient de considérer comme des réactifs de référence. Cependant, d’autres méthodes utilisant des amorces
et sondes différentes peuvent être utilisées, à condition qu’elles soient reconnues comme équivalentes à celles
indiquées dans les Tableaux E.1 et E.2 conformément aux règles de l’ISO 16140:2003[17].

E.1 Amorces et sondes

Les Tableaux E.1 et E.2 indiquent respectivement les séquences d’amorces et de sondes pour:

— la détection des gènes stx et eae par PCR en temps réel (PCR A);

— la détection des gènes associés aux sérogroupes par PCR en temps réel (PCR B).

Dans les Tableaux E.1 et E.2, la composition chimique des fluorophores donneur et receveur n’est pas indiquée,
car elle dépend en grande partie des appareils de PCR en temps réel disponibles dans chaque laboratoire.

Tableau E.1 — Amorces dégénérées et sondes utilisées pour les réactions PCR 5’-nucléase

Numéro
Taille de Emplacement
Séquences d’amorces sens, d’amorces antisens et d’acces-
Gène cible l’amplicon dans la
de sondes (5’-3’)a sion
pb séquence
GenBank
TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG 878 à 906
stx1 CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC 983 à 1008
131 M16625
Référence [3]
Sonde-CTG GAT GAT CTC AGT GGG CGT TCT TAT 941 à 971
GTAA
TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG 785 à 813
stx2 b
CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC 128 887 à 912 X07865
Référence [3]
Sonde-TCG TCA GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC 838 à 864
CAT TGA TCA GGA TTT TTC TGG TGA TA 899 à 924
eae CTC ATG CGG AAA TAG CCG TTA 1000 à 979
102 Z11541
Référence [2]
Sonde-ATA GTC TCG CCA GTA TTC GCC ACC AAT 966 à 936
ACC
a Dans la séquence, Y correspond à (C, T), S correspond à (C, G), W correspond à (A, T), R correspond à (A, G), M correspond à
(A, C).
b Cette combinaison amorces/sonde cible tous les variants stx2 à l’exception du variant stx2f.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  21

ISO/TS 13136:2012(F)

Tableau E.2 — Amorces et sondes utilisées pour l’amplification des gènes spécifiques des
antigènes O lors des réactions PCR 5’ nucléase

Numéro
Taille de Emplacement
Gène cible Séquences d’amorces sens, d’amorces antisens et d’acces-
l’amplicon dans la
(sérogroupe) de sondes (5’-3’) sion
pb séquence
GenBank
TTT CAC ACT TAT TGG ATG GTC TCAA 348 à 372
rfbE (O157) CGA TGA GTT TAT CTG CAA GGT GAT 412 à 435
88 AF163329
Référence [3]
Sonde-AGG ACC GCA GAG GAA AGA GAG GAA TTA 381 à 410
AGG
CGA GGC AAC ACA TTA TAT AGT GCT TT 3464 à 3489
wbdI (O111) TTT TTG AAT AGT TAT GAA CAT CTT GTT TAGC 3579 à 3609
146 AF078736
Référence [3]
Sonde-TTG AAT CTC CCA GAT GAT CAA CAT CGT 3519 à 3548
GAA
CGC GAC GGC AGA GAA AATT 5648 à 5666
wzx (O26) AGC AGG CTT TTA TAT TCT CCA ACT TT 5757 à 5782
135 AF529080
Référence [3]
Sonde-CCC CGT TAA ATC AAT ACT ATT TCA CGA 5692 à 5724
GGT TGA
CGA TAA TAT TTA CCC CAC CAG TAC AG 1383 à 1408
ihp1 (O145)
GCC GCC GCA ATG CTT 132 1500 à 1514 AF531429
Référence [3]
Sonde-CCG CCA TTC AGA ATG CAC ACA ATA TCG 1472 à 1498
CAA GGT GAT TAC GAA AAT GCA TGT 4299 à 4323
wzx (O103)
GAA AAA AGC ACC CCC GTA CTT AT 99 4397 à 4375 AY532664
Référence [4]
Sonde-CAT AGC CTG TTG TTT TAT 4356 à 4373

22  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

Annexe F
(normative)

Isolement des souches STEC

Adopter le mode opératoire spécifié ci-dessous pour isoler les souches STEC à partir d’échantillons détectés
comme positifs après un premier criblage par PCR en temps réel.

a) En cas d’obtention d’un signal positif en PCR pour l’un des gènes associés aux sérogroupes couverts par
le domaine d’application de la présente Spécification technique, un enrichissement adapté au sérogroupe
détecté à partir du bouillon d’enrichissement restant peut être effectué afin de faciliter l’isolement de la
souche STEC correspondante (voir Note 1).

b) Ensemencer le bouillon d’enrichissement restant ou l’enrichissement adapté au sérogroupe sur un milieu

gélosé TBX ou tout autre milieu approprié (voir Note 2). Incuber pendant 18 h à 24 h à 37 °C ± 1 °C.

c) Prélever jusqu’à 50 colonies présentant un phénotype d’E. coli ou un aspect caractéristique (voir Note 5)
et inoculer chaque colonie sur un milieu gélosé nutritif (voir Note 3) puis les regrouper dans de l’eau (les
colonies peuvent être regroupées jusqu’à un nombre total de 10 par pool).

d) Effectuer la détection des gènes stx sur les colonies isolées ou sur les colonies mélangées dans l’eau
(voir Note 4).

e) Si un pool est positif, reprendre la gélose nutritive inoculée et soumettre à essai les colonies du pool positif
individuellement afin de sélectionner une seule colonie positive.

f) S’assurer de l’identification des colonies en tant que E. coli et confirmer la présence du gène eae et son
appartenance au sérogroupe détecté lors de l’étape de criblage (par exemple par PCR B à l’Annexe E)
(voir Note 5).

g) Les isolats peuvent être envoyés à un laboratoire de référence pour une caractérisation plus précise.

NOTE 1 L’enrichissement adapté au sérogroupe peut être obtenu en utilisant des systèmes d’immunocapture tels que
l’immunoséparation magnétique ou tout autre système équivalent. En règle générale, se référer aux instructions fournies
par le fabricant.

NOTE 2 Pour les échantillons positifs pour O157, la méthode décrite dans l’ISO 16654[19] ou d’autres méthodes validées
conformément à l’ISO 16140-2[18] sont appropriées. Les souches E. coli O157 fermentant le sorbitol sont sensibles à la
tellurite contenue dans le milieu CT SMAC indiqué dans l’ISO 16654[19]. Par conséquent, l’utilisation d’un second milieu
gélosé SMAC sans antibiotiques est appropriée. En l’absence de colonies ne fermentant pas le sorbitol sur les milieux
gélosés, le criblage des colonies le fermentant est indiqué.

Pour l’isolement des souches STEC O26, un milieu gélosé approprié (MacConkey) contenant du rhamnose
à la place du lactose est disponible dans le commerce (RMAC). Il est très efficace pour distinguer des autres
E. coli les souches STEC O26 qui ne fermentent pas le rhamnose.

NOTE 3 Il existe différents types de milieux gélosés nutritifs disponibles dans le commerce, qu’il s’agisse de boîtes
prêtes à l’emploi ou préparées en interne à partir de poudres déshydratées. Chaque type de milieux gélosés nutritifs non
sélectifs (par exemple le TSA) est approprié pour le repiquage des colonies pour une caractérisation ultérieure. La gélose
entérohémolysine peut également être utilisée. Elle présente l’avantage de détecter la production d’entérohémolysine, qui
est une caractéristique fréquente des STEC pathogènes pour l’Homme.

NOTE 4 La PCR en temps réel décrite dans ce protocole peut être utilisée pour confirmer la présence des gènes stx
et eae chez les souches isolées. La PCR conventionnelle peut être utilisée comme méthode alternative (Annexe C).

NOTE 5 Il est possible de confirmer que les colonies sont des E. coli à l’aide d’un dispositif permettant d’effectuer de
multiples essais biochimiques disponible dans le commerce ou en recherchant la production d’indole. Il est possible de
confirmer le sérogroupe par PCR ou par agglutination avec des antisérums disponibles dans le commerce.

© ISO 2012 – Tous droits réservés  23

ISO/TS 13136:2012(F)

Bibliographie

[1] Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards (BIOHAZ) — Monitoring of verotoxigenic Escherichia
coli (VTEC) and identification of human pathogenic VTEC types (Question No EFSA-Q-2007-036). Eur.
Food Saf. Author. J. 2007, (579), pp. 1-61

[2] Nielsen, E.M., Andersen, M.T. Detection and characterization of verocytotoxin-producing Escherichia

coli by automated 5’ nuclease PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, pp. 2884-2893

[3] Perelle, S., Dilasser, F., Grout, J., Fach, P. Detection by 5’ nuclease PCR of Shiga-toxin producing
Escherichia coli O26, O55, O91, O103, O111, O113, O145 and O157:H7, associated with the world’s
most frequent clinical cases. Mol. Cell Probes 2004, 18, pp. 185-192

[4] Perelle, S., Dilasser, F., Grout, J., Fach, P. Detection of Escherichia coli serogroup O103 by real-
time polymerase chain reaction. J. Appl. Microbiol. 2005, 98, pp. 1162-1168

[5] Vimont, A., Delignette-Muller,  M.L., Vernozy-Rozand, C. Supplementation of enrichment broths

by novobiocin for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli from food: A controversial use. Lett.
Appl. Microbiol. 2007, 44, pp. 326-331

[6] Uemura, R., Sueyoshi, M., Nagayoshi, M., Nagatomo, H. Antimicrobial susceptibilities of Shiga toxin-

producing Escherichia coli isolates from pigs with edema disease in Japan. Microbiol. Immunol. 2003,
47, pp. 57-61

[7] GeneSystems. Validation AFNOR des méthodes alternatives d’analyse: Application à la microbiologie
alimentaire. Quimper: Adria Développement. 56 p. Disponible (consulté le 2012-08-02) à l’adresse:
http://www.afnor-validation.org/rapports-synthese/GENESYSTEMS/Synt%20GEN%2025-06%20
11-08%20(fr).pdf

[8] K agkli, D.-M, Weber, T.P., van den Bulcke, M., Folloni, S., Tozzoli, R., Morabito, S., Ermolli, M.,
Gribaldo, L., van den Eede, G. Application of the modular approach to an in-house validation study of
real-time PCR methods for the detection and serogroup determination of verocytotoxigenic Escherichia
coli. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, pp. 6954–6963

[9] European Union Reference L aboratory VTEC. Proficiency tests and ring trials on detection and
typing methods. Rome: Istituto Superiore di Sanità. Disponible (consulté le 2012-08-02) à l’adresse:
http://www.iss.it/vtec/neww/cont.php?id=147&lang=2&tipo=15

[10] Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, 3 vols. Cold Spring
Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001

[11] Paton, A.W., Paton, J.C. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using
multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157. J.
Clin. Microbiol. 1998, 36, pp. 598-602

[12] O’Brien, A.D., Newland, J.W., Miller, S.F., Holmes, R.K., Smith, H.W., Formal, S.B. Shiga-like toxin-

converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.
Science 1984, 226, pp. 694-696

[13] Perna, N.T., Plunkett, III, G., Burland, V., Mau, B., Glasner, J.D., Rose, D.J., et al. Genome sequence
of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature 2001, 409, pp. 529-533

[14] Hoorfar, J., Malorny, B., Abdulmawjood, A., Cook, N., Wagner, M., Fach, P. Practical considerations

in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. J. Clin. Microbiol. 2004, 42,
pp. 1863-1868

24  © ISO 2012 – Tous droits réservés

 ISO/TS 13136:2012(F)

[15] Beutin, L., Jahn, S., Fach,  P. Evaluation of the ‘GeneDisc’ real-time PCR system for detection of
enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O26, O103, O111, O145 and O157 strains according to their
virulence markers and their O- and H-antigen-associated genes. J. Appl. Microbiol. 2009, 106, pp. 1122-32

[16] ISO 7550, Verrerie de laboratoire — Micropipettes à usage unique

[17] ISO 16140:2003, Microbiologie des aliments — Protocole pour la validation des méthodes alternatives

[18] ISO 16140-28), Microbiologie des aliments — Validation des méthodes — Partie 2: Protocole pour la
validation des méthodes propriétaires par rapport à une méthode de référence

[19] ISO 16654, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Escherichia coli O157

[20] ISO/TS 19036:2006, Microbiologie des aliments — Lignes directrices pour l’estimation de l’incertitude
de mesure pour les déterminations quantitatives

[21] ISO 20837, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à la préparation
des échantillons pour la détection qualitative

[22] Scheutz, F., Teel, L.D., Beutin, L., Piérard, D., Buvens, G., K arch, H., Mellmann, A., Caprioli,
A., Tozzoli, R., Morabito, S., Strockbine, N.A., Melton-Celsa, A.R., Sanchez, M., Persson, S.,
O’Brien, A.D. A multi-center evaluation of a sequence-based protocol to subtype Shiga toxins and
standardize Stx nomenclature. J. Clin. Microbiol. 2012 Jul 3

[23] National Center for Emerging and zoonotic infectious diseases. Division of foodborne,
Waterborne, and Environmental Diseases. National Enteric Disease Surveillance: Shiga toxin‐
producing Escherichia coli (STEC) Annual Summary, 2009. Bethesda, MD: CDC, 2012

[24] European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control.
The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and
Food-borne Outbreaks in 2010. Eur. Food Saf. Author. J. 2012, 10, p. 2597

[25] European Food Safety Authority. Technical specifications for the monitoring and reporting of
verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) on animals and food (VTEC surveys on animals and food). Eur.
Food Saf. Author. J. 2009, 7, p. 1366

[26] Schmidt, H., Scheef, J., Morabito, S., Caprioli, A., Wieler, L.H., K arch, H. A new Shiga toxin 2 variant
(Stx2f) from Escherichia coli isolated from pigeons. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, pp. 1205–8.

[27] Fricker, M., Messelhusser, U., Busch, U., Scherer, S., Ehling -Schulz, M. Diagnostic real-time PCR
assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.
Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, pp. 1892–1898

8) À publier (Révision de l’ISO 16140:2003[17]).

© ISO 2012 – Tous droits réservés  25