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0.1
5 7
1. Introduction
Absorbance at 273nm
0.09 0.08
8 10 2 4 3 6 9 12 13 11 14 15
20
50
60
1.INTRODUCTION 1 INTRODUCTION
HPLC: phasemobileliquide phasestationnairetrsfinementdivise Injectiondelluantsousdespressionsdeplusieurscentaines debarspourobtenirundbitsuffisant. d b b i dbi ffi Possibilitdagirdemaniretrsprcisesurlaslectivit b l d d l l entrelescompossparlechoixdelaPSetdelacomposition delaPM de la PM Exploitationdesinteractionssolut/PM/PS
2.POMPES 2 POMPES
Pompesdbitmtriquesconuespourmaintenirundbitnon P dbit t i i t i dbit pulsetstable. Prsencedegazdissous(N O CO ) dans les solvants Prsence de gaz dissous (N2,O2,CO2,)danslessolvants ncessitdedgazerlessolvantsparultrasonsoubarbotage dhlium. Eluantdecompositionfixe:modeisocratique 1pompe Eluantdecompositionvariable gradient dlution Eluant de composition variable =gradientd lution pompe pompe binaire,ternaireouquaternaireselonlenombredesolvants quellepeutmlanger
solvantA
solvantB
solvantA
solvantB
vanne proportionnelle
chambredemlange
pompe1
pompe2
pompehaute pression i
colonne
chambredemlange
Gradientbassepression
Gradienthautepression
Pompequaternaire
3.INJECTEURS 3 INJECTEURS
Injectionrapidedunvolumeprcis vannehautepression I j ti id d l i h t i plusieursvoiesmanuelleouautomatique Fonctionnementen2temps:
Chargement:communicationentrepompeetcolonneseulement, introductiondelchantillonpressionatmosphriquelaidedune i d i d l h ill i h i l id d seringuedansunpetitvolumetubulaireappelboucle(nombreuxchoix devolumes) Injection:insertiondelchantillondanslefluxdePMparrotationdela vanne inversiondusensdecirculationdanslaboucle
Boucledinjection
reproductibilitduvolumeinject
Colonnes:
Type Analytical Solventsaver 4.6 3.0 ID (mm) SampleLoad (approx.) 0.1 1.5mg 150 500g Typical FlowRate 0.53ml/min 0.3 1.5ml/min + Relative Sensitivity Applications Standardseparations Savesolvent StandardHPLC instruments Highsensitivity Limitedsample LC/MS Highsensitivity High sensitivity Limitedsample LC/MS Veryhighsensitivity LC/MS Peptidesandproteins Veryhighsensitivity LC/MS Peptidesandproteins mgpreparativeseparation Hundredsmgupto1g Hundreds mg up to 1 g
Narrowbore
2.1
50 120g
0.1 0.5ml/min
++
Microbore
1.0
10 50g
10 100L/min
+++
Capillary
0.5 0.3
1 10g
115l/min
++++
+++++
Phases: Chromatographiesurphasenormale g p p Chromatographiesurphaseinverse Chromatographieparpairesdions Chromatographie par change dions (cf chap 7) Chromatographieparchanged ions(cfchap7) Chromatographieparexclusionstrique(cfchap7) Chromatographiechirale Fast HPLC FastHPLC
Classificationdesphases: Classification des phases : Type(monolithique,poreuse,nonporeuse) Matriauxdebase(silice,zircone,polymre,) Gomtrie(surface,volumeetdiamtredespores,taille Gomtrie (surface, volume et diamtre des pores, taille etformedesparticules,) Chimiedesurface(typedeligandslis,) Chimie de surface (type de ligands lis )
Type yp
Majorit:particulesporeusesdediamtreentre3et10m Laporositaugmentelasurfacencessairelartentiondel analyte(de100 La porosit augmente la surface ncessaire la rtention de lanalyte (de 100 400m2/g). Lespaceinterparticulepermetdesdbitsde13mL/minavecdespressions acceptables. t bl
delacapacitdechargement
Matriauxdebasedelacolonne Matriaux de base de la colonne Matriaux Silice Alumine Zircone GammedepH Gamme de pH 28 28 612 713
Gomtrie
Chimiedelasilice
Trspolaireparlaprsencedesfonctionssilanols lescoefficientsdadsorption sparationbasesur
Modificationschimiquesdelasilice:lessilicesgreffes
Fixationdemolculesorganiquessurlesfonctionssilanolspardesliaisons Fi i d l l i l f i il l d li i covalentes ajustementdelapolarit sparationbasesurlescoefficients departage
di outrichlorosilane
R=(CH R = (CH2)17CH3 R=(CH2) 7CH3 R (CH R =(CH2)3C6H5 R=(CH2)6C6H5 R (CH R=(CH2)3NH2 R=(CH2)3CN R=(CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH ( ( )
octadecyl(C18) octadecyl (C18) octyl(C8) phenylpropyl phenyl propyl phenylhexyl aminopropyl cyanopropyl diol Bonded phases
Endcapping
Silanisationsecondaireavecdu TMS dsactivationdessitesde silanolsrestslibres
solut
Si Si O OH OH OH OH O
solut
X
Si Si O O O O Si Si Si O Si O
Chromatographiesurphasenormale siliceporeuse g p p
SiO2
Phasenormale:modedinteraction
Adsorption
Interactionspolaires pontshydrognes Phasestationnairepolaire Phasemobile:solvantsnonoupeupolaires
Chromatographiesurphaseinverse g p p
PartageentrePMetPS
Phasestationnaireapolaire Phasemobile:solvantspolaires
SiO2
ExempleRP C18
Source:ThermoFisher
Reverse phaseavec100%H2OcommePM???
MeCN H2O H2O MeCN MeCN MeCN MeCN H2O MeCN H2O MeCN
conditionsnormales ex:H2O/ACN50/50
aprs10volumesdecolonne dePM100%H2O
Reverse phaseavec100%H OcommePM:solution Reverse phase avec 100% H2O comme PM solution polarshielding
MeCN H2O
P
MeCN
Phasesgreffesetinteractionshydrophiles HILICmode
Peuttreconsidrecommeunechromatographieenphasenormaleavec unephasemobileaqueuseorganique h bil i ColonnesHILICpluspolairesquecolonnesRP augmentationdu%deau danslaPM diminutiondelartention(inversedelaRP)
SparationdoligosaccharidesparHILIC,variationdu%eaudelaPM
Exemples:HILICmode
Phaseaminopropyl
Mixte:RP,HILIC,changeanionfaiblesuivantPM
Source:Phenomenex
Phasecyanopropyl
Diltiazem
N C N O O O
Verapamil
Nicardipine
Nifedipine p
Source:GraceDavison
PhaseZicHILIC
zwitterionic
Source:SeQuant
C18RPmode
NH2 RPmode
S.U.BajadetalJCA,1125(2006)7688
CNHILICmode CN HILIC d
H HO
CH 2 OH O H OH H H NH 2 OH H
SiO2 HILICmode
O O H2N N H
OH O N H NH2
AmideHILICmode
N
NH2
NH2 HILICmode
O O
OH
OH
SourceThermoFisher
Phaseengraphiteporeux:
SourceThermoFisher
Solventpropertiesandmiscibility
SourceThermoFisher
AnalysesurRP18avecdiffrentsmlangesCH3CN/H20 Dbit:1ml/min
100%ACN PP+NB
40%ACN PP+NB
sec.
sec.
sec.
sec.
Diffrentsprofilsdegradient
Elutiongradient:effetduprofildegradient
ChoixdunecolonneHPLC
organic soluble MW<2000 aqueous q soluble Sample
hexane soluble organic soluble methanol methanol/H2O acetonitrile acetonitrile/H2O / soluble THF soluble
MW<2000
hexane soluble
organic soluble
MW<2000
reversed phase
THF soluble
gelpermeation GPC
nonionic
ionic
organic soluble
gelpermeation
MW>2000
gelfiltration l fl
aqueous soluble
Chromatographieparpairesdions g p p p
Objectif: amliorerlasparationdecompossioniquesoutrspolairesquiont troppeud affinitpourunePSapolaire trop peu daffinit pour une PS apolaire Ncessitdaugmenterlartention Solutions: ModifierlepH AjouterlaPMuncomposporteurlafoisdunechanecarboneetdun groupementdechargeopposecelleducompossparer Crationdunepairedionsglobalementneutre,stableetlipophilequisera retenuesurlaPS retenue sur la PS Solut ionis Paire dions
(acides) A+R+ AR+
+ +
diminutiondeleurcaractreionique
(R=agentpairant) (R t i t)
Basedelartention: Base de la rtention : SoitunsolutacideionisA pairparR+. Lapairedionsformeensolutionestretenueparlacolonne,lquilibrede p p , q rtentiondusolutestdcritpar: AR+ (phasemobile)AR+ (phasestationnaire) Lartentiondpendde: 1) lafractiondesmolculesdesolutAdanslaPM(dtermineparlepHde laPMetlepKadusolut) la PM et le pKa du solut) 2) laconcentrationdelagentpairantetsatendanceformerunepaire dions 3) lavaleurdek(facteurdertentionoudecapacit)delapairedionsAR+
X:principeactif,baseforte X1,X2,X3:produitsdedgradationdeX,basesfortes MP,PP:methyletpropylparaben MP, PP : methyl et propylparaben BetHP:acidebenzoqueetacidehydroxybenzoque,produitsdedgradationdeMPetPP Conditionschromatographiques: a)30%MeOH/70%actate,pH=3.5 ) 30% M OH/70% t t H 3 5 b)45%MeOH/55%actate+65mMoctanesulfonate
Chromatographiechirale(nantioslective) g p ( )
Pourquoi? Propritspharmacologiquesdesstroisomresparfoistrsdiffrentes. h l d f d ff Exemple:stroslectivitdanslactiondesmdicaments.
Principe: deuxnantiomresRetSconduisentdeuxpicsdontlesairessont deux nantiomres R et S conduisent deux pics dont les aires sont proportionnelleslabondancedechacunedesdeuxformes. Formationdecomplexesdiastromresrversiblesentreles2nantiomresetun agentcomplexantchiral(slecteurchiral,CS) (R)X+(R)CS(R)X(R)CS Deuxmthodes: h d PSchirale PM+additifchiral PM dditif hi l et (S)X+(S)CS(S)X(S)CS
Phasestationnairechirale Moyenleplussimpleetlepluspratiquepourlessparationsdnantiomres. Leslecteurchiralestlideprfrenceparliaisoncovalente(alternativementpar forteadsorptionphysique)ausupportdelaPS,habituellementdesparticulesde siliceporeuse. LaPMestachirale. La PM est achirale. Pendantlamigrationdelchantillondanslacolonne,lesnantiomressont retenusparassociationavecleslecteurdelaPS.Descomplexes diastrosisomresseformentdanslaPS.Sileurvaleurdekestsuffisamment di t i f td l PS Si l l d k t ffi t diffrente,leursparationestpossible. NcessitdunePSchiralequiinteragisseplusfortementavecundesdeux nantiomre.
Mcanismesdelareconnaissancechirale Modle 3points :ncessitdavoiraumoins3pointsdinteractionpour quunslecteurchiralpuissedistinguer2nantiomres(rgledeDagliesh) Complmentaritdetailleetdeformeentreanalyteetslecteurchiral Interactionsintermolculairesnoncovalentes(principalementlectrostatiques): Interactionsioniques Pontshydrogne Iondiple,diplediple, I di l di l di l Interactions Sileslecteuretlanalytepossdentdesrgionshydrophobescorrespondantes, liaisonparinteractionshydrophobes
Lescyclodextrines Les cyclodextrines =enchanementscycliquesde57molculesdeglucosegreffespar lintermdiairedun bras dequelquesatomesdecarbonesurlaPS. Deformecylindrique,ellesprsententunecavithydrophobetandisquela paroiexterneesthydrophile. Inclusionslectivedecompossquiformentlasurfacedelaphase chiraledescomplexesdiastroisomresrversibles
cyclodextrine
FastHPLC
Tendance:sparationstrsrapides,demoinsduneminutepourleschantillons simplesquelquesminutespourdesmlangespluscomplexes. simples quelques minutes pour des mlanges plus complexes. Unefoisoptimiseslesvaleursdeketde (optimisationdelacapacitetdela slectivit),larsolutionetletempsdanalysenedpendentplusquedeN. Lesconditionsquifavorisentlessparationsrapidesincluentlutilisationdepetites particules,decolonnespluscourtesetdedbitsplusimportants. Ladiminutiondutempsd analyse(sansperted efficacitN)peuttreeffectuepar La diminution du temps d analyse (sans perte defficacit N) peut tre effectue par lutilisationde Ultrahautepression=UPLCouUHPLC(>6000psiou400bar) Tempratureplusleve=HTHPLC Particulesspciales
UPLC UHPLC
Evolutiondestaillesdeparticules E l ti d t ill d ti l
10min Late1960s 40mpellicularnonporouscoated 100500psi(740bar) 100 500 psi (7 40 bar) 10min 10 i 5,000plates/meter Early1970s 10mIrregularmicroporous 1000 2500psi(70 180bar) 10002500 psi (70180 bar) 40,000plates/meter 10min 1980stopresentday 3.5 5msphericalmicroporous 15004000psi(110280bar) 80,000 115,000plates/meter
ExemplesdePSutilisesenUHPLC C18 TrifunctionallyBondedC18 P ProprietaryEndcapping i t E d i WidestpHrange C8 TrifunctionallyBondedC8 ProprietaryEndcapping Widest pH range WidestpHrange ShieldRP18 Monofunctionallybonded Monofunctionally bonded Embeddedpolargroup Phenyl y TrifunctionallyBondedC6Phenyl ProprietaryEndcapping
LechallengedelacourbedeVanDeemter g
A+
B + (CS + C M )u u
Particule=lmentcentraldela sparation Pluspetitesparticules meilleures sparationssurdeplusgrandes plagesdevlocits augmentationdelavitesseetde larsolutiondelasparation la rsolution de la sparation
Exemples
SourceThermoFisher
HT HPLC
Augmentationdelatemprature: Diminution de la viscosit de la PM DiminutiondelaviscositdelaPM dbit plus lev pression gale dbitpluslevpressiongale, quivalentuneaugmentationdelapression(cfUHPLC) Augmentationducoefficientdediffusiondusolut mmeefficacitundbitpluslevetuntempsdanalysepluscourt efficacitamlioretempsdanalysegal
Inconvnients Dgradation des chantillons haute t Dgradationdeschantillonshautet Possibilitdegradientsdet danslacolonne Instabilitdescolonnes Diminutiondelaslectivit meilleure temprature=compromisentreNmax etmax! ill t t i t N t manqueduniformitdelat
Augmentationdelatemprature: H A t ti d l t t
A+
C
B + (CS + C M )u u
quandT
5.Dtecteurs 5 Dtecteurs
Lanalyseparchromatographieaprincipalementpourbutdereprerla prsenceoudedoseruncomposprsentpourlequelonachoisiun dtecteurbienadapt. Qualitsdudtecteur: Q alits d dtecte r
Sensibilit Bruitngligeable Largegammedynamique Large gamme dynamique Rponseindpendantedesvariationsdesparamtresdutilisation (pression,temprature,dbit,compositiondelaphasemobile) Faiblevolumemort Faible volume mort Nondestructif Stableaucoursdutemps Slectivit Slectivit Grandevitessederponse
Modesdedtectionlespluscourantsbasssurlespropritsoptiques descomposs:absorption,fluorescence,indicederfraction
Rapportsignalsurbruit(S/N)
LOD LOQ
S/N=3 S/N=10
Detector
Relative sensitivity
T sensitivity
Analytes
IR
Refractive Index Conductivity UVVis ELSD Electrochemical Fluorescence MS +
No
Moderate
Moderate
Dtecteurindicederfraction
Unfaisceaulumineux(mono oupolychromatique)passetraversunecellule deuxcompartimentsdontlunestrempliaveclaPMseuleetlautreaveclaPM sortantdelacolonne.Ladiffrencedindicederfractionentrelesdeuxliquides q quiapparatlorsquunanalyteestmlanglaPMprovoqueundplacement angulairedurayondiffract.
LeRIestutiledanslecasdecompossquinepossdentpasdechromophores (UV),fluorophores(F),depotentielredox(lectrochimique),oud activitionique (UV) fluorophores (F) de potentiel redox (lectrochimique) ou dactivit ionique (conductimtre) Gnralementutilisenconjonctionavecuneautretechniquededtection Applications:Sucres,Alcools,Lipides,Polymres,
Avantages Rponseuniverselle Dtectetoutcequisetrouveensolution. SaufsilanalyteaexactementlemmeRIquelaphasemobile Utilisationfacile Peudeparamtres Trsrobuste Peusensiblelencrassementetauxbulles Dsavantages Faiblesensibilit Absencedeslectivit Sensibleauxchangementsdedbit,tempratureetviscosit S ibl h t d dbit t t t i it Pasdutilisationdegradients
DtecteurspectrophotomtriqueUVVisible:
MesurelapertedintensitdelumireUVouVis.lorsdupassagedansune solution DtectionbasesurlaloideLambertBeer(A=lC):labsorbanceAdela phasemobileestmesureensortiedecolonne,lalongueurdonde ou plusieurslongueursd ondedansl UVoulevisible. plusieurs longueurs donde dans lUV ou le visible
LaPMnedoitpas,outrspeu,absorberparelle mme. La PM ne doit pas ou trs peu absorber par ellemme Lasensibilitoptimaleestobtenueenutilisantledtecteurlalongueur dondeolabsorbanceducomposdintrtestlaplusgrande(max) LedtecteurUV/VisestleplusrpanduenHPLC Bienqu ayantdeslimitations(particulirementpourlescompossquine Bien quayant des limitations (particulirement pour les composs qui ne possdentpasdechromophoreUV),ilpossdelameilleurecombinaison de: Sensibilit Linarit Gammedynamique Robustesse R b t Facilitdutilisation Sipasdespectred absorptionexploitable Si pas de spectre dabsorption exploitable composs. ncessitdedrivatiserles ncessit de drivatiser les
Dtecteurbarrettedediodes(PDAouDAD)
Soit: Soit : Changementdelongueurdondeencoursdanalyse Enregistrementdel absorbanceplusieurslongueursd onde Enregistrement de labsorbance plusieurs longueurs donde simultanment Enregistrementdelabsorbancesurtoutundomainedelongueurs g g donde
Caractristiquesdequelqueschromophores:
SourceThermoFisher
SourceThermoFisher
Dtecteurspectrofluorimtrique
Lescompossfluorescentsrmettentsousformedelumiretoutouune partiedurayonnementdelasourcelumineuseauquelilssontsoumis. Lintensitdefluorescenceestproportionnellelaconcentrationdelanalyte.
Lampeaudeuteriumouauxenon dexcitationslectionneparunfiltreouunmonochromateur Isolementdela d missionparunsecondfiltreoumonochromateur Isolement de la dmission par un second filtre ou monochromateur dmissiondirigeverslephotodtecteur
Ladtectionparfluorescencealieuquandunemolculeabsorbedela La dtection par fluorescence a lieu quand une molcule absorbe de la lumire,atteignantainsiunniveaudnergiepluslev(excitation). Quandlamolculeretournesontatnergtiqueinitial,l nergie Quand la molcule retourne son tat nergtique initial, lnergie perdueestmisesousformedelumire(mission) Lamolcule fluoresce. LeFLenregistrelafoisleslongueursdondedexcitationetdmission,ce quidonnelieudetrsgrandesslectivitetsensibilit. Ceslongueursdondesontspcifiqueschaquecomposfluorescent. C l d d t ifi h fl t
Avantages Sensibilit 101000xplussensiblequ unUV 10 1000x plus sensible quun UV Recherchedetraces Slectivit Faiblebruitdefond Techniquesimpleetnondestructive Dsavantages Peudecompossfluorescents Besoindedrivatiserlesanalytes Reproductibilitinterlabo RponsedpenddeT,pH,viscosit,polaritsolvant LesEx etEmpeuventvarier N Ncessiteplusieursscanspourtrouverlesvaleursoptimales i l i l l i l
Dtecteurlectrochimique(ampromtrique)
Lescomposspouvanttrerduitsouoxydsenprsencedunpotentiel lectriquepeuventtredtectsdetrsfaiblesconcentrationspardes mesureslectrochimiquesslectives. q Potentielconstant variationducourant
Dtecteurconductimtrique q
Mesurelechangementdeconductivitlectriqueduelaprsenced'un solutdanslaphasemobile(defaonabsolueoudiffrentielle). Avantage: dtecteurutilispoursolutsioniques. Inconvnient: sensibilittrsgrandelatemprature.
DtecteurELSD(EvaporativeLightScatteringDetector) ( p g g )
EvaporationdelaPMsuiviedelamesuredelalumirediffuseparles particulesdanalytenonvolatile. UtilepourtouslessolutsayantunevolatilitplusfaiblequelaPM. Lintensitdelalumirediffusedpenddelatailledesparticules danalyte.
3tapes: Nbulisation:effluenttransformenarosol b l ffl f l vaporation:lapartievolatiledeleffluentestlimine(solvants),les compossnonvolatilesrestentsousformedeparticulessolides composs non volatiles restent sous forme de particules solides Dtection:lesparticulesinterceptentunrayondelumire,lintensit delumirediffracteestproportionnellelaquantitdeparticules p p q p dtectes
Source:Grace
Avantages DtectelescompossquinabsorbentpasenUVVis. Pe t tre tilis a ec des sol ants q i absorbent bea co p en UV PeuttreutilisavecdessolvantsquiabsorbentbeaucoupenUV. Utilisationdegradients(avantagesurRI). PossibilitdevarierlaT denbulisationpouroptimiserladtection. Applications:Sucres,Polymres,Triglycrides Dsavantages Pasdetampons/additifsnonvolatils Techniquedestructive. q Besoindegazdenbulisation(habituellementN2). TOUSlesELSDsontnonlinaires. Moins sensible que dautres dtecteurs (UV par exemple) Moinssensiblequed autresdtecteurs(UVparexemple).
Dtecteurdemasse
OptimisationdesdtecteursdemassepourtravailleraveclUPLC Vitessesd acquisitionde10000da/s Vitesses dacquisition de 10000 da/s Vitessesdechangementdemodedionisationminimiss ESI + ESI ESI APCI+ APCI Dwelltimesminimiss Simpleettriplequadruple Tempsdevol(TOF,QTOF)
Principauxdtecteursutiliss Pi i dt t tili