J. DIDIER DE ST AMAND J.

DEJARDIN

METHODES DE FRACTIONNEMENT DES CONSTlTUANTS PHOSPHORES VEGETAUX ET DE CORRECTIQN DE RESULTATS DE DOSAGE

J. Didier de Saint-Amand

L Zuckerman .
MBthodes de Fractionnemente t dosage desconstituantsphosphoresvBgtaux appliquees au laboratoire d'analyses vBgBtales de I'0.R.S.T.O.M.

J. Djardin

R. Chaume
Methode de correctiondes resultats de dosage d'un tout e t des Fractions qui le constituent.

OFFICE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

ET TECHNIQUE OUTRE-MER

INITIATIONS

D O C U M E N T A T I O N ST E C H N I Q U E S
N o

O . R. S. T. O . M.
PARIS 1968

J. DIDIER DE SAINT-AMAND

L. ZUCKERMAN

M~THODES FRACTIONNEMENT ET DOSAGE DE

DES CONSTITUANTS PHOSPHORES V~GTAUX

appliques au Laboratoire d'Analyses vgtales de I'0.R.S.T.O.M.

J. DEJARDIN
Service

R. CHAUME
de Biomtrie d e 1'O.R.S.T.O.M.

MTHODE DECORRECTIONDES

RSULTATS DE DOSAGED'UNTOUT

ET DESFRACTIONS QUI LE CONSTITUENT

INITIATIONS

- DOCUMENTATIONSTECHNIQIJES

No 8

1 9 68

J. DIDIER DE SAINT-AMAND

L. ZUCKERMAN

M~THODES FRACTIONNEMENT ET DOSAGE DE

DES CONSTITUANTS PHOSPHORES
appliques au

VGTAUX

Laboratoire d'Analyses vgtales de 1'O.R.S.T.O.M.

INTRODUCTION
La m t h o d e d e s p a r a t i o n e t d e d o s a g e d e s c o n s t i t u a n t s p h o s p h o r s d a n s le m a t r i e l v g tal, expose ci-dessous, fait appel b des techniques analytiques classiques dont les rfrences sont La f o r m e s y n t h t i q u e p r o p o s e v i t e r a u n l o n g t r a v a i l d e r e d o n n e s b la f i n d e c h a q u e c h a p i t r e . cherches bibliographiques.

PREPARATION DES ECHANTILLONS

Les tissus frais a n a l y s e r s o n t s c h s b f r o i d d a n s un l y o p h i l i s e u r b e n v i r o n -60C,sous v i d e , Le m a t r i e l c r y o d e s s c h e s t b r o y b f r o i d puis c o n s e r v b 10C.

+ Acide trichloractique (ATC)

6 8%

Tissuvg4tallyophilis

1 h. b O 8 4 C

r ' Fraction soiuble dans I'ATC ou l'acide perchlorique

labile -

- Phosphore mineral - Phosphore phvtiaue - Nuclotides et

non nuclotides solubles

D i g e s t i o n d e la m a t i r e g r a s s e DterminationduPhosphorelipidique

a. Traitementpar

KOH

b. Traitement B'I'ATC ou

'au

ClOdH

Surnageant 3

p G - 1
D t e r m i n a t i odP h o s p h o r e nu Protique

Dtermination de l'ADN P m e t h o d e b la d i p h n y l a m i n e m t h o d e 8 la p - n i t r o p h n y l h y d r a z i n e

J-

METHODES ANALYTIQUES

A - EXTRACTION ET DOSAGE DES CONSTITUANTS ACIDO-SOLUBLES

1 EXTRACTION DE LA FRACTlON.ACID0-SOLUBLE TOTALE
La f r a c t i o n a c i d o - s o l u b l e e s t e x t r a i t e p a r l ' a c i d e t r i c h l o r a c t i q u e ( A T C ) o u l ' a c i d e p e r c h l o r.ique d o n t la c o n c e n t r a t i o n o p t i m u m d o i t t r e d t e r m i n e p a r d e s e s s a i s p r a l a b l e s .

La c o n c e n t r a t i o n d e I ' A T C , a d o p t e d a n s le c a s d e t i s s u s c h l o r o p h y l l i e n s e t r a d i c u l a i r e s d e c o t o n n i e r e s t d e 8 %. U n e c o n c e n t r a t i o n s u p r i e u r e d e 1 ' o r d r e d e 12 15 % p a r e x e m p l e , r i s q u e r a i t d ' e n t r a n e r d a n s la f r a c t i o n s o l u b l e , u n e p a r t i e d e l ' a c i d e r i b o n u c l i q u e .

Une concentration plus faible, de l'ordre de plet des formes acido-solubles.

5%, peut aboutir un entrainement incom-

L ' e x t r a c t i o n e s t o p r e s u r d e s t r a c t i o n s d e 500 mg d e p o u d r e v g t a l e , l y o p h i l i s e , q u e l'on introduit dans de petites capsules de porcelaine, en prsence de 20 ml e n v i r o n d ' A T C 8 % . L'ensembleestconserv 0-4OC p e n d a n t u n e h e u r e , e t r e m u d e t e m p s a u t r e . Le c o n t e n u des capsules est ensuite transfr quantitativement dans des tubes de centrifugeur, en utilisant de petitsvolumesd'ATC 8 % , froid. Centrifuger, puis traiter par deux fois les rsidus avec de I'ATC 8 % dans les mmes conditions. Les surnageants sont runis, puis l'on amne de I'ATC de mme concentration.
un volume dtermin

(50 o u 100 m l ) a v e c

Le r s i d u e s t c o n s e r v p o u r phore lipidique").

la d t e r m i n a t i o n d u p h o s p h o r e l i p i d i q u e ( c f . p a r a g r a p h e " p h o s -

2 DIGESTION DE LA FRACTION ACIDO-SOLUBLE TOTALE

P r l e v e r u n e . p a r t i e a l i q u o t e (5 15 ml) d e l ' e x t r a i t t r i c h l o r a c t i q u e d a n s un matras conte1 ml d ' a c i d es u l f u r i q u e . n a n tu n eb i l l ed ev e r r e .C o u v r i rd ' u np e t i te n t o n n o i r .A j o u t e r

DIGESTION :
C h a u f f e r t r s l e n t e m e n t p o u r v a p o r e r la p l u s g r a n d e p a r t i e p o s s i b l e d e l ' a c i d e t r i c h l o r a c t i q u e : la m a t i r e o r g a n i q u e s e c o n s u m e . C h a u f f e r j u s q u ' o b t e n t i o n d ' u n e s o l u t i o n h o m o g n e et poursuivrel'oprationjusqu' ce q u e la s o l u t i o n p r e n n e u n e c o l o r a t i o n l g r e m e n t p l u s c l a i r e . le l o n g d e la Ajouter alors, avec prcaution, une goutte d'acide nitrique, de sorte qu'elle coule p a r o id um a t r a s .C o n t i n u e r chaufferenvitantcontinuellementunesurchauffe.Ajouterune n o u v e l l e g o u t t e de NO3H. C h a u f f e r d o u c e m e n t j u s q u ' ce q u e le l i q u i d e s o i t d . c o l o r o u q u ' i l p r s e n t es e u l e m e n tu n et e i n t ej a u n ep a i l l e .P o u r s u i v r e le c h a u f f a g eu n em i n u t ee n c o r e .R e f r o i d i r . et porter bullition deux ou trois minutes pour dhasser les vapeurs. Ajouter un peu d'eau distille T r a n s v a s e r e n fiole d e 25 ml e t a m e n e r ce v o l u m e e n r i n a n t le m a t r a s a v e c d e l ' e a u d i s t i l l e .

3 DOSAGE DU PHOS.PHORE ACIDO-SOLUBLE TOTAL

METHODE GENERALE DE DOSAGE

I MazzgeAlcool-Benz6ne
Mlanger au moment de l ' e m p l o i des volumes gaux d'alcool isobutylique et pour analyses. de benzne,

2 SoIution MoIybdique
Dissoudre 50 g de molybdate d'ammonium dans 400 ml d'acide sulf,uiique 10 N. Amener 1 litre avec de l'eau distille. Garder en bouteille paraffine. Prparerau moment de l ' e m p l o i .

3 Solution de chlorure stanneux

Dissoudre 10 g de SnC122HaO dans 25 m l de HCI concentr et garder dans un flacon brun. A partir de cette solution, prparer au moment de l'emploi une solution dilue en amenant 1 ml 200 ml avec du S04H2N. Ce ractif ne reste pas stable plus d'un jour.

4 Mlange Acide sulfurique-Ethanol

<

Mlanger 980 ml d'thanol 99,5% e t 2 0 mlde SO4H2 concentr (vrifier la raction par rapport la stabilit de la couleur bleue du molybdate. L'instabilit peut tre due quelque II fautalors essayer de changer l aq u a l i t d el ' a l c o o le tr e f a i r el e contaminationdel'alcool. . mlange).

5 Ractif SiIico-tungstiqae
II est utilis pour la dfcation
dans l e dosage du phosphore minral libre, Dissoudre 5,7 g de silicate de sodium 9 H 2 0 , e t 79,4 g de tungstate de sodium 2 H 2 0 , dans 500 ml d ' e a u d i s t i l l e . A j o u t e r 15 ml de SO4H2 concentr. Faire bouillir pendant cinq heures. Refroidir et amener 1 litre.

6 - Solution-talon de P
Prparer une solution-talon 1 mg de P/ml b partir de P04HpK (sch 1 litre). analyses (4,3936 g x facteur de puret, amen

ll0OC) pour

B - MTHODE
Le dosage est effectu sur une partie aliquote de l'extrait trichloractique,

aprhs digestion.

Dans les conditions de concentrations indiques plus haut (soit 500 mg de matire vgtale lyophilise ramene 100 m l dont 15 ml subissent la digestion et sont ensuite ramens b 25 ml), on prlve 1 ml, que l'on introduit dans un tube essaisde 25 x 200 mm. A j o u t e r d e l ' e a u d i s t i l l e pour un volume.de 15ml, puis 25 m l exactement mesursde la solution alcool-benzne (1). Mettre ensuite 5 ml de ractif molybdique (2). Boucher et agiter aussit6t vigoureusement30secondes.Laisun bcher 15 mldumlange acide sulfurique ser l e s deux phases liquides se sparer.Prparerdans thanol (4). Pipeter danslestubes 10 mlde l a phase suprieure organique e t les introduire dans une f i o l e de 25 ml. Ajouter avec la mme p i p e t t e q u i se trouve ainsi rinc6e, 1 O ml du mlange acide sulfurique thanol (4), puis 1 ml de la solution dilue de chlorure stanneux (3). Ajuster les fioles 25 ml avec le mlange acide sulfurique thanol. La coloration bleue obtenue est stable plusieurs heures.Attendreunedizaine deminutespourcolorimtrer 700 m Faire un blanc. Rgler le

zro partir du mlange alcool-acide sulfurique.

Calcul :
mg p r i s e x 0,5

25

'Oo

= mg p a c i d o - s o l u bme etgs c h e lda/ i r e

C a l c u l e r la c o n c e n t r a t i o n e n P e n s e r a p p o r t a n t u n e s o l u t i o n - t a l o n d e dtermine les densits optiques pour quelques points de gamme.

'P ( 6 ) d o n t o n

4 DOSAGE DES FRACTIONS DE L'ENSEMBLE ACIDO-SOLUBLE

- Phosphore minral
est dtermin partir de l'extrait trichloractique, sur une Le p h o s p h o r e m i n r a l l i b r e 1 ml p o u r l e s c o n d i t i o n s d e d i l u t i o n i n d i q u e s p l u s h a u t : Le d o s a g e partiealiquoiedel'ordrede s ' e f f e c t u e d i r e c t e m e n t sans digestion s u i v a n t la m t h o d e i n d i q u e c h a p i t r e 3.

Le r a c t i f s i l i c o - t u n g s t i q u e i n t e r v i e n t v e n t u e l l e m e n t p o u r la p r c i p i t a t i o n d e s p r o t i n e s , si le m i l i e u e n c o m p o r t e d e f a o n n o t a b l e . O n l ' i n t r o d u i t a l o r s , a p r s l ' a d d i t i o n d u m l a n g e a l c o o l i s o b u t y l i q u e - b e n z n e .P u i so np o u r s u i tp a rl ' a d d i t i o nd ur a c t i fm o l y b d i q u e ,e t c . .

- Phosphore phytique
A RACTIFS
1 Solution de chlorure ferrique
D i s s o u d r e 15 g d e F e C 1 3 6 H 2 0 d a n s

1 ' H C In o r m a l ,A m e n e r

1 l i t r ea v e cH C I

N.

2 - HC1 0,6

comportant du sulfate de sodium

500 ml d ' e a u . A j o u t e r
14,5 ml

Dissoudre 100 g d e s u l f a t e d e s o d i u m a n h y d r e d a n s e n v i r o n d e HCI c o n c e n t r . A m e n e r 1 l i t r e a v e c d e l'eau d i s t i l l e .

3 NaOH NI10

4 - NaOH N 5 - Phnolphtaline
S o l u t i o n 1 % d a n s I ' t h a n o l 95 %.

B MZTHODE DE DOSAGE
Une partie de l'extrait acido-soluble dans ATC est neutralise par de la s o u d e N/10 e n 50 ml u t i l i s a n t la p h n o l p h t a l i n e c o m m e i n d i c a t e u r e t e n s u i t e l g r e m e n t a c i d i f i e , O n a m n e avec de l'eau distille. I n t r o d u i r e u n e p r i s e d e 20 m l d e c e t e x t r a i t d a n s d e s t u b e s d e c e n t r i f u g e u s e d e 50 m l . t e r 5 m l d e la s o l u t i o n d e c h l o r u r e f e r r i q u e , e n f a i s a n t t o u r n e r le t u b e p e n d a n t l ' o p r a t i o n . Ajou-

Disposer les tubes dans un bain-marie bouillant avec un petit agitateur. Chauffer 15 minutes en agitant de temps en temps pour aider la f l o c u l a t i o n d u p h y t a t e f e r r i q u e . R e f r o i d i r e n s u i t e l e s tubes environ 20 minutes et rincer les agitateurs avec un peu de HCI 0,6%. Centrifuger 20 minutes une vitesse suprieure 2000 tours/minute. Jeter le l i q u i d e s u r n a g e a n t e t l a v e r le p r c i p i t a v e c 5 c c d ' H C I 0 , 6 % v e r s s la p i p e t t e , p o u r le r e m e t t r e e n suspension.Rincerlesparoisdutubeavec 2 c c d ' H C L 6 % . C e n t r i f u g e r 20 m i n u t e s n o u v e a u e t

dcanter le surnageant. Mettre l e prcipit ensuspension dans 5 m l d'eau bouillante, Ajouter 2 ml de ( N a O H ) N et chauffer 15 minutes au bain-marie bouillant, en agitant detemps entemps. filtrer la solution encore chaude sur f i l t r e sans cendre dans un ballon de 100 ml. Laver l e tube plusieurs fois avec quelques ml d'eau distille bouillante et verser les eaux de lavage sur l e f i l t r e . Le phosphore seradossur que chapitre 2 . une partie aliquote de cette solution, aprs la digestion indi-

- Nuclgotides et non nucleotides solubles

A REACTIFS
K O H 5 N. D i t h y l t h e r (CH3 CH2 OCH2 CH3). Acide formique 4 N contenant du formiate d'ammonium Dowex 1 x 4 (formiate).

0,8 M.

B MTHODE DE DOSAGE
II est prfrable pour utiliser cette mthode de travailler sur des solutions extraites par b des solutions extraites par l'acide trichloractique. l'acide perchlorique, de prefrence
L'extrait acide est purifi par trois extractions successives au dithylther raison de 5 voII est ensuite neutralis par K O H 5 N, puis concentr sous lumes d'ther pour un volume d'extrait. pression rduite b 35OC. Aprs refroidissement, le perchlorate de potassium est spar par nageant est passsur une colonne de rsine Dowex 1 x 4 . Les dimensions optimum pour c e n t r i f u g a t i o n e t l e sur-

la colonne sontles suivantes : hauteur 10 cm, diamgtre 1 cm.

Laver la colonne b l'eau et luer les nuclotides avec du formiate d ' N H 4 (0,8 M).

70 ml d'acide formique contenant

elont Physiology, 1964,va1.39,

Le calcul de la teneur du liquide d'lution n05,pp.735-740).

en nuclotides solubles est indiqu par J . INGLE

- Fraction acide-soluble labile

Cette fraction est gneralement rapporte, partir de l'ensemble acido-soluble, la quande 7 minutes, dont on soustrait la quantit de phosphore tit de phosphore dose apr8s une hydrolyse minral dtermine selon la mthode indique ci-dessus. La quantit P (7 minutes) P minral = P labile, permet d'estimer le phosphore ayant p w r origine le groupement phosphorique terminal de la carboxylase et ceux des n u c l o t i d e s d i e t t r i phosphate.

DOSAGE
Prlever dans un tube une partie aliquote de l'extrait soluble dans l'acide trichloractique. Ajouter une quantit gale de HCI 2 N et chauffer au bain-marie soit b u l l i t i o n e x a c t e m e n t 7 minutes.

100" de sorte que le liquide

Doser ensuite le phosphore suivant la mthode indique au chapitre

3.

16

B - Dl?TERMINATIQN DU PHQSPHQRE LIPID.I<UB

A RBACTIFS
E t h a n o l 95". M l a n g em t h a n o l - c h l o r o f o r m e 1-1 e nv o l u m e . M l a n g e t h a n o l - t h e r t h y l i q u e 2-1 e n v o l u m e . S04H 2

N03H

B MTGODES
Le r s i d u d e m e u r a n t a p r s I ' l i m i n a t i o n d e l'acide t r i c h l o r a c t i q u e q u i c o m p o r t e l e s f r a c 15 ml e n v i r o n d ' a l c o o l i t h y l i q u e 95'. tions solubles, est trait dans un tube de centrifugeuse avec (ilestpossibleaussidetraiter le r s i d u a v e c 15 ml d ' a C t a t e . d e p o t c l s s i u m 0 , l N d a n s I ' t h a n o l p o u r v i t e r u n e c o n t a m i n a t i o n v e n t u e l l e d e l'alcool p a r d e s m a t i r e s p r o t i q u e s ) .
Bien mlanger et laisser reposer environ trente minutes puis centrifuger., Dcanter le l i q u i -

de s u r n a g e a n t s u r u n e f i o l e d i s t i l l e r , e n p r e n a n t s o i n d e n ' e n t r a h e r a u c u n e p a r t i c u l e d u c u l o t . A j o u t r e n v i r o n 15 ml d ' a l c o o l t h , y l i q u e 95O e t f a i r e b o u i l l i r a v e c p r c a u t i o n t r e n t e s e c o n d e s

d a n su nb a i n - m a r i e .C e n t r i f u g e ru n en o u v e l l ef o i s .R u n i rl e ss u r n a g e a n t s .R p t e rl ' . e x t r a c t i o n le m l a n g e d e m t h a n o l - c h l o r o f o r m e , a v e c le m l a n g e d ' t h a n o l - t h e r , t r e n t e s e c o n d e s , p u i s a v e c la m a t i r e g r a s s e t r e n t es e c o n d e s .R u n i rt o u sl e ss u r n a g e a n t s .D i s t i l l e rl e ss o l v a n t s ,p u i se n t r a i n e r 95". Eliminer la p l u s g r a n d e p a r t i e d e l ' a l c o o l , p a r restante,dansunmatrasavecunpeud'alcool bullition, sous hotte. Laver le r s i d u a v e c I ' t h e r e t s c h e r s o u s v i d e o u l ' a i r p o u r o b t e n i r u n e poudre sche sur laquelle on pourra prlever des quantits exactement peses. Effectuer une digestion suivant

la m t h o d e c i - a p r s

Digestion

- Mthode gnrale
la d t e r m i n a t i o n d u p h o s p h o r e l i p i d i q u e e t p o u r c e l l e d u

Cette mthode est valable pour phosphore total.

1 I n t r o d u i r eu n eb i l l ed ev e r r ed a n s le m a t r a s c o n t e n a n t I ' c h a n t i l l o n . C o u v r i r a v e c un petit entonnoir. 2 A j o u t e r 3 ml d ' a c i d e s u l f u r i q u e . C h a u f f e r a v e c p r c a u t i o n j u s q u ' c e q u e la m a t i r e organiqueseconsume,etquel'onobtienneunesolutionhomogne.Continuer le c h a u f f a g e i u s q u ' a c e q u e la s o l u t i o n h o m o g n e p r e n n e u n e c o l o r a t i o n l g r e m e n t p l u s c l a i r e . 3 F a i r e t o m b e r s u r le l i q u i d e e n b u l l i t i o n , u n e g o u t t e d ' a c i d e n i t r i q u e . 4 Continuer chauffer et ajouter, ds que les vapeurs blanches apparaissent, une nouv e l l e g o u t t e d e NO3H. 5 P o u r s u i v r el ' o x y d a t i o np r o g r e s s i v ej u s q u ' ce que le m l a n g e d e d i g e s t i o n p r e n n e u n e t e i n t ep a i l l ec l a i r .C h a u f f e rj u s q u ' c eq u ' i ld e v i e n n ep r e s q u ei n c o l o r e .L a i s s e rr e f r o i d i r . Le l i quide devient incolore au cours du refroidissement. 6 Laverl'ouverturedumatrasavecunjetd'eaudistillesurl'entonnoir. 7 Reprendre I'bullition trois minutes de plus pour liminer toutes traces de, N03H. 8 T r a n s f r e r ,a p r sr e f r o i d i s s e m e n t ,q u a n t i t a t i v e m e n te n fiole j a u g e d e 2 5 ou 50 m l . 'Ajuster le n i v e a u a v e c d e l ' e a u d i s t i l l e . Le d o s a g e d u p h o s p h o r e e s t r a l i s s u i v a n t la m t h o d e indique au chapitre 3.

Bibliographie

11

1 DETERMINATION DE L'ADM

- Mthode de dosage par la Biphenylamine

A - RZACTIFS
Diphnylamine. Acide actique redistill. Acide sulfurique. concentr. Actaldhyde s o l u t i o n 16 mg/ml. A c i d e p e r c h l o r i q u e 5 %. S o u d e 0,0>5 M . Acide dsoxyribonuclique (thymus de veau

- provenance

: Mann Research Lob. inc.).

B - MTHODE
Prparation de l'extrait
Une partie du rsidu sec (2) d e m e u r a n t , a p r s l ' e x t r a c t i o n d u p h o s p h o r e l i p i d i q u e , e s t t r a i 7OoC p a r d e l ' a c i d e p e r c h l o r i q u e 5 %. te pendant deux priodes de vingt minutes chacune, Dans certains cas, pour favoriser la p r c i p i t a t i o n d e s p r o t i n e s , o n p e u t r e n o u v e l e r u n e a d d i t i o n d'acideperchlorique.Conserver le r s i d u p o u r la d t e r m i n a t i o n d u p h o s p h o r e p r o t i q u e ( A v e c c e r tainstissus, i l e s t c o n s e i l l e . d ' l e v e r la t e m p r a t u r e j u s q u ' b 90OC).

Prparation du ractif
Dissoudre 1 ! 5 g d e d i p h n y l a m i n e d a n s 100 ml d ' a c i d e a c 6 t i q u e r e d i s t i l l . A j o u t e r d'acide sulfurique concentr et garder l'obscurit.
Le r a c t i f n e d o i t p a s p r e n d r e u n e t e i n t e b l e u e e n r e p o s a n t

1,5 m l

A v a n t l ' u t i l i s a t i o n , a j o u t e r 0 , l ml d ' a c t a l d e h y d e p o u r 20 ml d e r a c t i f u t i l i s . M l a n g e r 2 ml d e l ' e x t r a i t a c i d e p e r c h l o r i q u e a v e c 4 ml d e r a c t i f l a d i p h n y l a m i n e e t l a i s s e r r e p o s e r e n t u v e 30' p e n d a n t s e i z e v i n g t h e u r e s . Effectuer une mesure de densit optique u n e gamme talon. F a i r e u n b l a n c .
b 600 m,u et c o m p a r e r a u x v a l e u r s o b t e n u e s p o u r

Prparation des standards

La solution-mre (ici 0,4 mg d ' A D w m l ) est p r p a r g e e n d i s s o l v a n t l ' A D N d a n s d e s o u d e 0,005 M, e t c o n s e r v e a u r f r i g r a t e u r .

la

Les standards sont obtenus en melangeant volume v o l u m e la s o l u t i o n - m r e A D N et d e l ' a c i d e p e r c h l o r i q u e a 1 0 % , le m l a n g e e s t c h a u f f 70OC p e n d a n t e n v i r o n q u a r a n t e m i n u t e s . La conservation des standards se fait en rfrigrateur.
La g a m m e - C t a l o n e s t p r p a r e p a r d i l u t i o n d e r i q u e 5 Oh.

la s o l u t i o n s t a n d a r d a v e c d e l ' a c i d e p e r c h l o -

12

- Mthode la p-Nitrophnylhydrazine
A RACTIFS
p-Nitrophnylhydrazine

- solution 0,5

% dans I ' t h a n o l .

A c i d e t r i c h l o r a c t i q u e 5 %. Actate de n-butyle. Soude 2 N. Acide dsoxyribonuclique (thymus de veau

- provenance : Mann Research Lab. inc.).

sec demeurant aprs I'extrac-

B MTHODE
On effectue le dosage sur une phrtie de poids connu du rsidu tion du phosphor- lipidique.

L'hydrolyse est opre dans des tubes de centrltugeuse coniques de 15 ml en prsence de L'orifice du tube est bouch par un pantin afin de limiter le plus possible les pertes par vaporation.

3 ml d'acide trichloractique 5 % .

90-100". ,Aprs refroiLasuspension est chauffe pendant trente minutes au bain-marie dissement, ajouter nouveau 3. ml d'acide trichloractique 5 % et centrifuger. Le culot est conserv pour la dtermination du phosphore protique.
Prlever 2 ml du liquide d'hydrolyse dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Effectuer la mme opration avec 2 ml de la solution standard d'ADN contenant lOOY d'ADN que l'on aura hy4 ml d'ATC 5%). A drolyse dans les mmes conditions. (Prparer simultanment un blanc avec chacun destubes, ajouter 2 ml d'acide trichloractique 5 % e t 0,2 ml du r a c t i f l a p - N i t r o p h 90-lOO", en prenant soin nylhydrazi'ne 0,5%, frai'chement prpar. Chauffer au bain-marie de limiter I'vaporation, pendant quinze minutes. Aprs refroidissement, ajouter 10 ml .d'actate de n-butyle dans chaque tube. Boucher les tubes e t les agiter cinq minutes, puis centrifuger pour achever la sparation des couchesorganiques e t aqueuses. Retirer la plus grande partie de la couche organique. Pipeter ensuite 3 mlde l a phaseaqueuse dans une fiole jauge de 5 ml bouche en verre. Vrifier qu'aucu1 mlde ne gouttelette organique n'a t entraine. Ajouter alors, juste avant de colorimtrer, N a O H 2 N et complter volume avec de l'eau distille et agiter. La couleur dveloppe par l'addition de NaOH plit trs rapidement, s i b i e n q u e l a l e c t u r e d o i t t r e f a i t e dans la minute qui suit cekte addition. Les densits optiques sont mesures b 560 mp avec un blanc d'eau distille. Colorimtrer les standards exactement dans les mmes conditions. (Le temps requis pour chaque mesure 560 mp doit tre dtermin avec prcision et tre toujours l e mme,y compris pour les standards).

Prdparation des ,solutions standards d'BON

M e t t r e dans une fiole jauge de 50 ml, 25 mg d ' A D N (Thymus de veau). Ajouter 40 ml dans un bain-marie d'acide trichloractique 5 %. Couvrir et chauffer pendant trente minutes 90-100". Refroidir, puis amener volume avec de I'ATC 5 % . Desstandards de concentration plus basse sont prpars par la dilution approprie de la solution avec de I'ATC 5 %. (Si l a dissol u t i o n d e l ' A D N dans l ' a c i d e t r i c h l o r a c t i q u e 5 % n'est pas totale, on peut oprer une solution pralable dans l a soude 0,005 M. A partir de cette solution, les gammes sont tablies par une d i l u On ajoute alors un volume choisi de solution-mre, un volume gal d'ATC tion convenable. 10% et on chauffe trente minutes 90-100" ).

Bibliogruphie
4
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13

S i la m t h o d e d c r i t e ici n e , p r s e n t e , p a s la p r c i s i o n d e celle c o n s i s t a n t c h r o m a t o g r a m e s u r e r l e u r d e n s i t o p t , i q u e 2 6 0 m p , elle e s t s u s phier les nuclotides apr&s hydrolyse, puis II e s t n c e s s a i r e c e p t i b l ed ' t r et o u t e f o i sc o m m o d m e n tu t i l i s ed a n sd e sd t e r m i n a t i o n sd er o u t i n e . de disposer d'un spectrophotomtre ultra-violet, pour des mesures de densit.optique 260 mp

- Dosage par
A -.RACTIFS
KOH 0,3 N .

tometrie dan

C12Mg 0,006 M. E t h a n o l 95 %. N a C I 0,Ol M. SolutionHCI-NaCI-tampon distille).

( 5 , 6 g N a C I + 20 ml H C I c o n c e n t r p o u r 2 4 0

ml d ' e a u

B -mTHODE
D p o s e r 20 mg d e l ' e x t r a i t s e c ( R s i d u 2 ) d a n s u n t u b e d e c e n t r i f u g e u s e a v e c 1 ml d e KOH Laisser reposer pendant dix-huit heures 6 [ ' t u v e 6 37C p u i s r e f r o i d i r le t u b e d a n s d e l ' e a u glace. A j o u t e r e n s u i t e la s o l u t i o n d e C 1 2 M g j u s q u ' u n e c o n c e n t r a t i o n e n Mg gale a lO-3M. T o u j o u r s d a n s le b a i n glac, a f i n d ' v i t e r l ' h y d r o l y s e d e s n u c l o t i d e s , a c i d i f i e r a v e c d e l ' a c i d e perchloriquedilujusqu'approximativementpH2..Ajouterunvolumed'thanol 9' 5.

0,3 N .

Laisser le m l a n g e r e p o s e r v i n g t m i n u t e s O p u i s c e n t r i f u g e r et d c a n t e r e n c o n s e r v a n t ' le s u r n a g e a n t . L a v e r le r s i d u a v e c d e l ' a c i d e p e r c h l o r i q u e 1 %, g l a c , e t j o i n d r e le l i q u i d e d e r i n a g e Q U s u r n a g e a n t . J e t e r le r s i d u q u i c o n t i e n t d e s p r o t i n e s et d e l ' A D N ( L ' A D N p e u t t r e 5 %. C e p e n rcupr ventuellement dans ce r6sidu, en hydrolysantavec del'acide perchlorique dant la digestion alcaline peut, avec certains tissus, provoquer une dgradation de l'ADN qui n'est I I estpossibled'effectuerdesdosagescomparaalors, ce stade, qu'incompltement rcuprable. tifs de l'ADN aprs hydrolyse acide directe et hydrolyse du rsidu). Ajuster le l i q u i d e p H 8-9 aveclasolutiondepotassedilue.Refroidirjusqu'formationd'unprcipitqu'onsdpareparcenle s u r n a g e a n t .L a v e r le p r c i p i t l ' e a u f r o i d e . J o i n d r e l e s r i n a g e s a u t r i f u g a t i o n .C o n s e r v e r surnageant.

C PRZ?PARATION DE LA RSINE lk"ANGEUSE D'IONS

Ractifs
R s i n e D o w e x 1 x 10 f o r m e C I 200 - 400 m e s h . C o l o n n e d e 5 c m d e l o n g u e u r s u r 0 , 5 cm2 (Si le t i s s u v g t a l e s t s u s c e p t i b l e d e c o m .porter une forte proportion d'impurets, i l p e u t - t r e n c e s s a i r e d ' a u g m e n t e r la h a u t e u r d e la c o l o n n e ) . HCI N . N a O H o u NH4OH N .

Traitement
La r s i n e d o i t t r e t r a i t e S u c c e s s i v e m e n t p a r d e I ' H C I N , d e l'eau d i s t i l l e , d e la NaOH o u d e I ' N H 4 0 H N, p u i s n o u v e a u d e l ' e a u d i s t i l l e . La r s i n e n e d o i t r e s t e r q u e q u e l q u e s i n s t a n t s a u c o n t a c t d e I ' H C I et d e I'NHdOH, t a n d i s q u e l e s r i n a g e s i n t e r m e d i a i r e s l ' e a u d o i v e n t tre plus prolongs et vacus avec prcaution. Traiter n o u v e a u la r s i n e p a r I'HCI N e n I ' a g i tant quelques secondes dans l'acide. D s q u e la s d i m e n t a t i o n s ' o p r e , d c a n t e r le l i q u i d e q u i e n t r a i n e l e s p l u s f i n e s p a r t i c u l e s . R p t e r p l u s i e u r s f o i s le l a v a g e l ' e a u d i s t i l l e . D c a n t e r .

14

R e m e t t r e n o u v e a u la r s i n e e n s u s p e n s i o n d a n s l'eau, p u i s la v e r s e r s u r la c o l o n n e e t la l a i s s e rs es t a b i l i s e r ,p a rg r a v i t .E v a c u e rl ' e a ua v e cp r c a u t i o n .R p t e rl ' o p r a t i o nj u s q u ' c e Le r i n a g e f i n a l d o i t f o u r n i r u n l i q u i d e n e u t r e . La q u e la c o l o n n e a t t e i g n e la h a u t e u r d s i r e . rsine ainsi prpare ne peut tre utilise qu'une ou deux fois.

D -DOSAGE
F a i r e p a s s e r le l i q u i d e s u r n a . g e a n t ( q u e l ' o n . p e u t c o n c e n t r e r p r a l a b l e m e n t ) r s u l t a n t d e s c e n t r i f u g a t i o n s , s u r la r s i n e o l e s n u c l o t i d e s s e r o n t r e t e n u s . AjouterunesolutiondeNaCl 0,Ol M p o u r l a v e r la c o l o n n e e t j e t e r . E l u e r l e s n u c l o t i d e s p a r la s o l u t i o n N a C I - H C I . P r l e v e r 40 ml d ' l u a t , p u i s d e s f r a c t i o n s s u c c e s s i v e s d e 5 ml j u s q u ' c e q u e l a D.O. s o i t n u l l e 260 m p . Le b l a n c e s t m e s u r s u r la s o l u t i o n H C I - N a C I . La t e n e u r e n A R N e s t e s t i m e s u r

la b a s e d ' u n e s t r u c t u r e t t r a n u c l o t i d e t h o r i q u e
=

D . O . ( 260 mp) x 3 2

y ARN/ml

- Dosage de ARN par la dtermination du Ribose

Ces mthodes de dosage.peuvent conduire sus d e p u r i f i c a t i o n n e s e r a i t p a s c o m p l e t .
des rsultats inexacts dans

le c a s o l e , p r o c e s -

pmmZm MTHODE
Ractif
. S o l u t i o n d ' o r c i n o l 0,4% d a n s H C I 1 2

N c o m p o r t a n t 0,04% d e C 1 3 F e .

Dosage
M e t t r e d a n s u n t u b e e s s a i s u n e p r i s e d e 0 , 2 ml d e la s o l u t i o n d o s e r , d a n s distille.Ajouter 2 ml d e la s o l u t i o n d ' o r c i n o l , f r a i c h e m e n t p r p a r e .

1 ml d ' e a u

les l a i s s e r s u r u n b a i n - m a r i e b o u i l l a n t p e n d a n t q u i n z e Agiter les tubes, les couvrir puis minutes.Lesretireretattendre 7 8 minutes avant de lire les densits optiques 660 mp. F a i r e unblanc.Etalonnerparlessolutionsstandards(voirplusloin).

DEUXIME MTHODE

Rdactif
Composition des constituants : (1) Solutiqnaqueused'orcinol ( 2H CcIo n c e n t r . ) (3) S o l u t i o na q u e u s ed eF e C 1 3 , Prparation du ractif : M l a n g e r : 10 m l d e ( l ) , 40 m l d e (2),1 ml d e (3).
1 % ( c o n s e r v e r a u r f r i g r a t e u r ) .

6 H z 0 10%.

Dosage
A u n e , p r i s e d e 0 , 2 ml d e la s o l u t i o n d o s e r , q j o u t e r 2 ml d e r a c t i f , d a n s d e s t u b e s e s s a i s .A g i t e r ,c o u v r i rp u i sc h a u f f e rh u i tm i n u t e se n v i r o na ub a i n - m a r i eb o u i l l a n t .
les d e n s i t e s o p t i q u e s ( f i l t r e r o u g e ) . C o m p a r e r Laisserrefroidirpuislire prpars comme il est indiqu ci-aprs.

des standards

15

Prparation des standards :Purification deI'ARN de levure

O n p e u t u t i l i s e r comme standard l e d.Ribose ou Drughouse, distribu par Serlabo). La levure est alors purifie de

I'ARN de levure (provenance

: British

la faon suivante :
dans un

Mettre en suspension 10 g d'ARN de levure dans 50 ml d'eau distille. Refroidir bain glac jusqu' environ 2'. Ajouter lentement une solution de N a O H 5 N, jusqu'h clarification du liquide. V e i l l e r b ce que l e mlange demeure f r o i d e t ce que le p H n e dpasse pas 6. Mesurer l e volume, puis lui ajouter cinq fois sa v a l e u r d ' a c i d e a c t i q u e g l a c i a l . reposer une d i z a i n e de minutes b la temprature ambiante.

Laisser

La levure reprcipite par l'acide actique est f i l t r e sous vide, puis lave deux trois fois b l'eau et trois b quatre fois b l ' a l c o o l b 95'.Le p r c i p i t est remis en suspensiondans 40 50 m l d'eau distille et traite une nouvelle fois par la soude et l'acide actique. Finalement il est lav l'eau distill&e, I'thanol, puis b I'ther, et sch b l ' a i r jusqu'b poids constant. L'hydrolyse est opre sur cette poudre, dans pour I'chantillon. O n p e u t v r i f i e r l e c o e f f i c i e n t de puret de des conditions identiques b celles indiques

I'ARN de levure par une dtermination du

ribose,en utilisant pour standard du d-ribose pur. La ,pro.portion thorique de d-ribose ragissant ' I ' o r c i n o l , partir de I'ARN de levure est thoriquement d'environ 23,4% (il s'agit essentiellement des pentoses-purines nuclotides, soit environ la moiti des pentoses totaux, en effet les pentoses-pyrimidiques nuclotides ne donnent pas de raction b I'orcinol, car i l s ne s'hydrolysent pas facilement. Le c a l c u l du pourcentage d'ARN donne :

% ARN =

quantit de ribose retrouve 23,4

aprs l a p u r i f i c a t i o n

x 100

CaIcuI du P-ARN et du P-DNA

Le phosphore nuclique est valu d'aprs l e s proportions moyennes de acides nucliques, soit 9,2% dans l ' A D N e t 9 % dans I'ARN.

dans chacun des

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16

D - PHOSPHORE PROTIQ~UE
Le r s i d u d e m e u r a n t a p r s l ' e x t r a c t i o n d e s a c i d e s n u c l i q u e s e s t t r a i t p a r d a n t q u i n z e m i n u t e s 100' p o u r e x t r a i r e l e s p r o t i n e s .
On peut dterminer sur l'extrait alcalin l'azote total par Kjehldahl e n p r o t i n e s d ' a p r b s la f o r m u l e :

NaOH N , p e n -

e t e n d e d u i r e la t e n e u r

t e n e u r e n p r o t i n e s = A z o t et o t a l x 6 / 2 5 ( O n p e u t g a l e m e n t d t e r m i n e r la t e n e u r e n p r o t i n e s , s u r u n e a u t r e q u a n t i t d e t i s s u v g t a l l y o p h i l i s e , s u i v a n t la m t h o d e i n d i q u e p a r L O W R Y O . H . ( 16).).

II est possible, aussi, sur l'extrait alcalin, d'effectuer une colorimtrie, en utilisant tif au phnol'de Folin.
On peut enfin raliser et'A.3.

le r a c -

le d o s a g e d e P , s u r l ' e x t r a i t , a p r s d i g e s t i o n , v o i r c h a p i t r e s A . 2

L t r a i t e m e n t la s o u d e p e u t , d a n s c e r t a i n s cas, n e p a s d o n n e r u n e e x t r a c t i o n q u a n t i t a t i v e . e le d o s a g e d u p h o s p h o r e O n p e u t a l o r s t r e a m e n e f f e c t u e r s u r le r s i d u u n e m i n r a l i s a t i o n , p u i s ( v o i r d i g e s t i o n , c h a p i t r e B, e t d o s a g e c h a p i t r e A . 3 ) . Le d o s a g e d e l ' a z o t e p r o t i q u e p e u t t r e g a lement fait sur une partie du rsidu.

E - PHOSPHORE T0TA:L
. Le d o s a g ed up h o s p h o r et o t a le s tr a l i s s u r la p o u d r ev g t a l el y o p h i l i s e ,a p r sd i g e s t i o n , s o i t s u i v a n t la m t h o d e i n d i q u e c i - d e s s u s e n A . 3 , s o i t s e l o n l a m t h o d e c o l o r i m t r i q u e a u v a n a d o m o l y b d a t e (14).

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17

INITIATIONS DOCUMENTATIONS TECHNIQIJES

No8

196 8

II*

R. CHAUME

Service de Biomtrie de 1 ' O . R . S . T . O . M .

MTHODE DECORRECTIONDES

RSULTATS DEDOSAGE D'UN TOUT

ET DESFRACTIONS QUI LE CONSTITUENT

PLAN

- Expos du probleme B - Dosage avec fractionnement simple 1 - Mesures d'gale prcision a - Principe de c a l c u l b - Interprtation gomtrique 2 - Mesures d'ingale prcision a - Principe de c a l c u l b - Interprtation gomtrique c - F i x a t i o n des poids d - Procd pratique 3 - Hypothses supplmentaires sur l a forme de la variance a - Varianceproportionnellela moyenne b - Variance proportionnelle au carre de la moyenne C - Dosage avecsous-fractionnement
A
1 2
D

- Sous-fractionnement de toutes les fractions - Sous-fractionnement partiel

-

Exemples numriques 1 Fractionnement simple 2 Sous-fractionnement partiel

E -.Rsum

19

A - EXPOS'

DU PROBLME
le c o n s t i t u e n t ,

Lorsqu'on dose un tout globalement et qu'on dose s6parment les fractions qui

les rsultats des dosages particuliers ne cumulent qu'exceptionnellement au rsultat du dosage du total.Ceciestd particulier.
la v a r i a b i l i t d e s m e s u r e s , v a r i a b i l i t a n a l y t i q u e e t v a r i a b i l i t b i o l o g i q u e e n

Le p r o b l m e d e la c o r r e c t i o n o p t i m a l e d e s r 6 s u l t a t s s e p o s e a l o r s , i m p r a t i v e m e n t
la v r i f i c a t i o n d e la c o n d i t i o n d e c u m u l .

mme,

sileurexploitationncessite

I I s'estentreautrespos

propos du dosage des constituants phosphors vegtaux au Laboratoire d'Analyses vgtales de 1'O.R.S.T.O.M.

(1).

C'estsurcetexempleque

la m t h o d e d e c o r r e c t i o n v a d t r e e x p o s e . la p l a n t e o n t t d o s s . N o u s a p y e n a n ) e t y t la t e n e u r e n p h o s p h o r e

Le p h o s p h o r e t o t a l a i n s i q u e s e s d i f f r e n t e s f o r m e s d a n s
p e l l e r o n s y i la t e n e u r e n i m e f o r m e ( n o u s s u p p o s e r o n s q u ' i l total.
n

L r e l a t i o nd ec u m u lq u ' o nd e v r a i ta v o i rs ' c r i t a

i01

2 yi

= y t .D a n s

la p r a t i q u e c e t t e r e l a t i o n

n'est pas vrifie

et n o u s o b s e r v o n s u n e d i f f r e n c e n o n n u l l e e n t r e y t - e t

D =yt

i pl

3yi.
c apporter aux y. Pour

9 i

yi ; n o u s I ' a p p e l o n s D :

P l

L p r o b l m e e s t d ' e s t i m e r b p a r t i r d e s y d e s t e n e u r s t v r i f i a n t la r e l a t i o n d e c u m u l , a u t r e e

ment dit de calculer des corrections

le r s o u d r e n o u s f e r o n s u n e h y p o t h s e
et i n d p e n d a n t s . M o y e n n a n t cette c

gnrale : tous les carts aux vritables valeurs sont gaussiens

h y p o t h s e la m t h o d e d e s m o i n d r e s c a r r s q u e n o u s a l l o n s u t i l i s e r p o u r e s t i m e r l e s c o r r e c t i o n s s ' i d e n t i f i e la m t h o d e d u m a x i m u m d e v r a i s e m b l a n c e S o i t T~ e t
T~

(2).
i-1

l e sv r i t a b l e st e n e u r s .N o u sa v o n s v i d e m m e n t

C ~i-

7,

= O.

S o i ta u s s it i

Ecrivons enfin que les corrections les teneurs t : ti = y;

apporter aux y s'ajoutent b ces derniers pour donner

ci et t t = y t

ct.

La r e l a t i o n d e c o n t r a i n t e s ' c r i t

soit : n x
i =Il

ci

- ct=

(2) Si cette hypothse n'est pas vrifie, l a mthode des moindres carrs peut encore tre utilise en tant que t e l l e m a i s ne s'identifie plus la mthode du m a x i m u m de vraisemblance.

20

B - DOSAGE

AVEC FRACTIONNEMflNT SIMPLE

I I s ' a g i t d u c a s f r q u e n t o le d o s a g e g l o b a l e s t s i m p l e m e n t s c i n d e n
sans que ceux-ci fassent l'objet d'un fractionnement de deuxime ordre. n dosages lmentaires

1 MESURES D'EGALE PREClSlON

L'hypothse d'gale prcision est en fait peu raliste
: d a n s la p r e s q u e t o t a l i t d e s c a s p r a -

t i q u e s i l f a u d r a la m e t t r e e n d o u t e . C ' e s t p o u r q u o i n o u s l ' a b a n d o n n e r o n s p a r d e la s o l u t i o n e t s o n i n t e r p r t a t i o n g o m t r i q u e s o n t p e u t - t r e

la s u i t e , m a i s l ' e x p o s
ce c a s s i m p l e .

un peu plus clairs sur

a PRINCIPE DE CALCUL
Comme nous l'avons dit ci-dessus, les ci seront estims par la m t h o d e d e s m o i n d r e s c a r r s : n (yi t ; ) 2 + (yt tt)2 = Z cf' f c s e r a r e n d u m i n i m u m c o m p t e t e n u d e : la r e l a t i o n d e

f =

i =J contralnte

'c c i
i

- ct = D .

i.=l

Le p r o b l m e b r s o u d r e e s t u n p r o t l m e d ' e x t r e m u m

li

f = Z c2
avec
g = Z ci

c:

minimum

- c t - D = O.
LAGRANGE n o u s f o u r n i t la s o l u t i o n : n o u s

La t e c h n i q u e c l a s s i q u e d e s m u l t i p l i c a t e u r s d e allons rsoudre df +Adg = O, s o i t :

2c;+ 2ct

A -A

=O =

(nquations) (1 q u a t i o n ) .

En a d d i t i o n n a n t l e s n p r e m i r e s q u a t i o n s e t s o u s t r a y a n t d e la s o m m e la d e r n i r e n o u s o b tenons : 2(Xci soit

- k t ) + (n +

1)

A=O
2,=

2D+ (n+ 1)A=O 2D --n+ 1

d'o

c.=
1

D n+l

et

ct =

D -n+ 1

chaque teneur lmentaire est donc corrige de D/(n+l) et

la t e n e u r e n p h o s p h o r e t o t a l d e

- D/(n

+ 1).

Pour une precision constante nous trouvons une correction constante.

21

Elle e s t a s s e z s i m p l e
l ' o r i g i n e au p o i n t M ( c , , c 2 ,

: dans l'espace

Rn+],

C c2 + i

2 c t r e p r s e n t e le c a r r d e l a d i s t a n c e d e

. . . c n ,c t ) .

C ci

- ct = D

e s tI ' q u a t i o nd ' u nh y p e r p l a n

H.

Le p o i n t

M e s t s u r H p u i s q u e la r e l a t i o n d e c o n t r a i n t e d o i t t r e v r i f i e .
m i n i m a l e l o r s q u e M e s t la p r o j e c t i o n o r t h o g o n a l e d e l ' o r i g i n e s u r

La d i s t a n c e OM e s t v i d e r n m e n t

H.

I I est vident que I'hyperplan est galement inclin sur tous les axes (les coefficients des
c sont tous gaux
1 en valeur absolue) ; les coordonnes de

la p r o j e c t i o n d e l ' o r i g i n e s u r

l u i sont

donc toutes gales : ci = constante = c e t c t = nc

c. 'Nous obtenons partir de 1'6quation de H :

= D

- (-c)
c =- D

n+ 1
=

ct

et

d'o

ci

=x

D --n+ 1 (D/(n+l),

On peut d'ailleurs aisment vrifier que

. ., D/(n+l), - D/(n+l)

) d e H e s tb i e n

l / l, Dm

la d i s t a n c e d e l ' o r i g i n e a u p o i n t

..

v a l e u rf o u r n i ep a rl af o r m u l eg n r a l e ,a u t r e m e n t

dit on peut vrifier que ce point est bien la projection de l'origine sur

H (3) :

URES D'INEGALE PRECl

Nous pouvons maintenant abandonner I'hypothGse de mesures d'gale prcision pour passer au cas rel. Nous conservons l'hypothse gnrale de normalit et d'indpendance des carts aux vritables valeurs.

a - PIUTVCIPE DE CALCUL
n Nousoujours avons t mois cette fois
;=1

Cci - c t = D
minimiser est :
2 $ "i cf + W t Ct I =1 le p o i d s a c c o r d ct e n f o n c t i o n d e la p r c i s i o n d e c h a c u n

la s o m m e d e s c a r r s

w i t a n t le p o i d s a c c o r d des dosages correspondants.

ci e t w t

Appliquant l a mthode des multiplicateurs de LAGRANGE, nous devons rendre

f =~

w cf ; + wt c:

minimum avec

g =

c ci

- ct

-D

= O.

(3j La distance du point (x; ae s t l

, X; , . . ., x; , x;+1 + a2xi +
XI,

. . . + an+lxA+l + b
2

) 6 I'hyperplan a l x l + a 2 x 2 +

... + a n + l x n + l

b=O

n+ 1 la distance de l'origine 6 H est donc

\&j

En drivant, nous obtenons : 2wi ci 2wtct ou encore

+ A=

(n quations)

-A=O

(1 Bquation)

En additionnant les n premires quations et soustrayant de la

somme la dernire,

nous obtenons :

d 'o
ci = .

"F + G

1 - wi

ct t e

- D

. -

S i tous les w i sont gaux nous retrouvons bien les formules prcdentes.

Moyennant l e changement de variable ui dessus reste valable. L'quation de H devient :

= ci

6l'interprtation gomtrique faite

- ut

ci-

Sous sa forme normale, elle s'crit directeurs de la normale

C ui *cosai
1
Jw;'

cos

a, = d.

Les cosusont les cosinus

H e t d la distance de l'origine

H, par consquent :

cosa; =-

Les coordonnes du pied de la normale

D 'Ob

passant par l'origine sont u i = d cosai. 3t ut =

-D

'

23

En revenant aux variables c

nous obtenons :

c -FIXATION DES POLDS

O n peut, surdes considrations particulires, thoriques ou autres, fixer
CI

priori les va-

leurs relatives des w et utiliser les formules ci-dessus. positions correspondant aux hypoth&ses suivantes
:

II

y a d'ailleurs dans cette fixation deux

- Les teneurs v r a i e s r i e t r t d o n t - Les

il

a t question

ci-dessus sont les

vritables teueurs

dans la population tudie (attitude du biologiste).

T sontles vritables teneurs du matriel

soumis l'analyse (attitude du chimiste).

La n6tre sera celle plus globale du biologiste prenant en compte les variabilits naturelle et analytique. Le chimiste ne s'occupera que de la variabilit analytique. Nous considrons en

effet que notre but est l'estimation des teneurs dans l e matriel soumis exprimentation et non dans I'chantillon parvenant au laboratoire. N o t r e a t t i t u d e nous conduira, en particulier t e l l e que c f dans l e p o i n t

8-3,

envisager une hypothse

KT:

(avec w i = l / a i ) qui amne la teneur

en total avoir la plus grande vaest l e plus couramment observ.

riance donc le poids le plus faible. C'est en fait d'ailleurs ce qui

Le chimiste, au contraire, accordera au

comme le plus prcis. C'est

dosage du total le poids le plus lev car

il

l e considrera assez simple

en effet undosage ralis bien souvent par une technique

aprs un nombre restreint de manipulations. O n v o i t donc que les deux attitudes arrivent formules gnrales peuvent tre appliques que lors de l'attribution

tre contradictoires. De toutes faons les

cas, la divergence n'apparaissant tude de prcision de

dans l ' u n e t l ' a u t r e

des poids qui sont fixs par des critres differents :

dosage pour l e chimiste, examen de la variabilit naturelle pour le biologiste. Un exemple de fixation

des poids est le suivant :

au dosage du total, autrement dit on affirme que la diffrence

On accorde toute confiance

D observe ne provient que

accorder unpoids

des fractions. Ceci revient

considrer y t comme certain, donc

lui

i n f i n i : wt

=CO
teneurs et beaucoup les fortes en prenant

O n p e u t aussi dcider de corriger peu les faibles pour chaque rsultat obtient alors ci dedosage

un poids inversement proportionnel y; et t c

b ce dernier

:wi

= l/yi

On

= D/(Cyi)

l.
yt

= O.
des fractions, on remplace au d-

Comme on considre que les erreurs ne proviennent que nominateur C y i

, errone,par

, sr,

pour obtenir en d f i n i t i v e :

24

d 'o
t i = yi (1

D/yt)ettt

= yt.

Ces formules sont cites car elles ont parfois t envisages aprs un tablissement plus ou moins i n t u i t i f . O n v o i t leshypothsesqu'ellessupposent
: yt non alatoire (validit plus

que

douteuse) et variances proportionnelles aux moyennes (cf. point que cas car e l l e n'est pas la plus courante).

8-3, hypothse vrifier dans cha-

d P R O C D ~PRATICUE
Les calculs numriques dans les cas pratiques d'utilisation peuvent tre raliss un tableau de calcul tel que le tableau en utilisant

1.

II

c o n t i e n t tousleslmentsncessaires

l'obtention

des valeurs des corrections qui se trouvent dans les deux dernires colonnes. Toutes

les oprations

faire sont donnes en

tte de colonne.

Les colonnes ( l ) , (2), (4) et (5) contiennent les donnes : teneurs en ( 1 ) et (2), poids en(4)
et

(5).

La diffrence D e s t obtenueencolonne

(3).

En colonnes (6) et (7) sont calculs lesinverses

des poids et en colonne

(8) le dnominateur des coefficients de corrections

=C- 1 +i
Wi

Wt

Le

coefficient constant D/P (c'est--dire A / 2 ) figure en colonne

(9) et les corrections en (10) e t (1 1 ) .

Ces corrections sont b ajouter aux termes correspondants des colonnes (2) e t (1) dans l'ordre.

Habituellement, la prcision d'un

2

dosage est caractrise par sa variance et le poids qu'on w; par l/aq et

l u i a t t r i b u e est l'inverse de cettederni8re.Nouspouvonsdonc,enremplaant wtpar

-l/ut , obtenir

uneexpression

des corrections c i et ct .en fonction de cf et a :

Peu importe

d'ailleurs que ces variances refltent uniquement la variabilit analytique lits qui intressent le biologiste. Les formules obtenues sont ci
:

ou la sommedes variabi-

2 Do; 2 2 x a i + a t

Les c sont proportionnels aux variances

: les corrections apportes aux

mesures peu disper-

ses sont pius faibles que celles apportes aux mesures fort disperses, autrement d i t les rsultats des

dosages prcis sont peu corrigs alors que les rsultats plus importantes, ce qui est tout--fait normal.

des dosages peu prcis subissent des corrections

Les formules donnes ci-dessus c'est

ne'sont utilisables que s i les variances vraies sont connues : Dans la pratique,

l un cas plus qu'exceptionnel.

s i aucune hypothse ne peut tre faite

sur

la nature de la variance (cf. point 8 - 3 ) , il est ncessaire de disposer d'une 2 des a ; et u t Des sriesde dosages raliss dans des conditionsuniformes,

possibilit d'estimation

des plansd'exprience

25

Tobleau

- Tableau de calcul

des corrections dans

le

cas d'un fractionnement simple.

1)

- tot.(2)

Poids dosage total

dosage fraction

1/(4)

wi

l/w t

D/P

ct

w'

D/P

ct

26

fournissant un carr moyen rsiduel, par exemple, tre utiliss pour calculer

des informations tires dedosages des estimationssuffisamment

antrieurs, etc.. peuvent, 2 2 de r e t S, de ut : sres

Les formules de correction utilisables sont obtenues en remplaant les vritables valeurs par leur estimation dans les expressions donnes ci-dessus

1
La mise en

ci =

S.

et

Ct

-D 2
ESi

2
5,

St

Les corrections seront en gnral suffisamment faibles vis--vis 2 mentde u par s* n ' a i t pas grande rpercussion pratique. uvre de ces formules se f a i t de la faon suivante
:

des y pour que le remplace-

- calcul de la diffrence
= D/S.

D entre le rsultat du dosage du.total, yt

Yi

tats des dosages des

diffrentesfractions

( D = Yt

i =1

- .%i ,=1 Y

, et de

la somme des rsul-

- c a l c u l de l a somme detouteslesvariances(fractionsettotal)

:S =

teurconstantC

f=1

2 sf

S,

et du fac-

- c a l c u l des diffrents ci
+
s ;

= Csi e t c t

= -Cs,

et addition des correctionsauxrsultats

ob-

serves : t i = y;

ci t t et

= yt

c,.

II est bien vident que le tableau

directement les e t st
2

1 peut tre utilis

comme indiqu ci-dessus en entrant

encolonnes

(6) e t (7).

3 HYPOTHESES SUPPLEMENTAIRES SUR LA FORME

DE LA VARIANCE
Dans la pratique, certains dosagessont souventcomplexes,longs et surtout coteux.

II

s'ensuit des difficults d'estimation des variances et un cot lev d'utilisation nent d'tre donnes. Heureusement, dans la quasi-totalit desdosages,

des formules qui vien-

les variances ne sont pas quelconques.

Elles sont fonction des moyennes et d'autres expressions plus simples d'emploi peuvent tre obtenues pour les corrections qui sont alors exprimes en fonction des moyennes et non plus des variances.

I'

Deux relations moyenne-variance

sont considrer :

i I

- variance proportionnelle l a moyenne, - variance proportionnelle au carr de l a moyenne (relation la plus frquente).
Ces deux cas vont tre examins.

27

'

a - Variance proportionnelle la moyenne

La r e l a t i o n e s t

ui = K T i.
D
"uf
+Ur"

N o u sp o u v o n sr e m p l a c e r
2 'i

u :
.-

et

0 :

p a rl e u re x p r e s s i o nd a n s
2

ci =

et

ct =

x.;
-D

+: u

=t

pour obtenir : et ct =

CTi

+Tt

Tt

Ces expressions des corrections en fonction des moyennes vraies ne sont videmment pas ,directementutilisables.Sidesestimationsdecesteneursmoyennessontconnues,ellespeuvent tre employes dans les formules ci-dessus pour obtenir des corrections particulires
:

et

- DTt
C F i + Ft

Bien souvent d'ailleurs, surtout en dbut d'tude, nous n'avons mme pas cette connaissance.

Les seules quantits disponibles sont les rsultats des dosages qui viennent d'tre effectus et

.la s e u l e p o s s i b i l i t q u e n o u s a v o n s a l o r s e s t

le r e m p l a c e m e n t d e ~i

par y; et

rt p a r y t p o u r o b t e n i r

Au fur et b mesure de l'accumulation des informations les remplacement des y par les f qui sont des estimations plus prcises des

c p e u v e n t t r e a m l i o r s p.ar
T.

La m i s e e n u v r e d e c e s f o r m u l e s e s t s i m p l e . N o u s p o u v o n s o b t e n i r a i s m e n t l e s e x p r e s s i o n s
d et ;
= yi

ci

ettt

= yt

ct ; a p r sq u e l q u e sc a l c u l sn o u st r o u v o n s

ti =

2 yt

Yi

et

tt =

2 'Yi

Yt
+

'Yi
Le5

+ Yt

XYi

Yt

calculs numriques b excuter pour corriger les observations brutes yi sont donc suc-

cessivement :
1

- o b t e n t i o nd ut o t a ld e st e n e u r se nf r a c t i o n s
S=

y i et a d d i t i o n d e la t e n e u r e n

total b cettesommepourobtenir 2

x y;

+ yt

i *l

- c a l c u ld e

C = 2 y t / Se tC '

= 2I:yi/S.
: t i = C y ie tt t

- c a l c u ld e st e n e u r sc o r r i g e s

= C'y,

l/wt p a r yt e n c o l o n n e s (6) et (7) d u t a b l e a u 1 e s t b i e n il est indiqu dans sr une faon d'oprer tout aussi valable. Les calculs sont alors conduits comme
Le r e m p l a c e m e n t d e l / w ; p a r y ; e t

le c a s g n r a l .

28

b - Variance proportionnelleau carr de la moyenne

Nous en arrivons maintenant au cas d ep h o s p h o r e .
2

le p l u s c o u r a n t . C ' e s t d ' a i l l e u r s

le c a s d e s d o s a g e s
2

La r e l a t i o n e n t r e la v a r i a n c e e t la m o y e n n e s ' e x p r i m e p a r
c n o u so b t e n o n s
2 :

n f = KT;

En r e m p l a a n t

cr p a r K r 2 d a n sl ' e x p r e s s i o ng n r a l ed e s
ci =

Cr2 i

2 +Tt

Ti

et

Ct =

-D
ET? +T,
2

Selon I'tat des connaissances dj acquises les

T sont remplacs dans les formules

:

ci-

dessus pari ou y pour obtenir les expressions pratiquement utilisables

ci =

et

D
i .

-2

CF?
ou

fi

C,

-D

Et'?

t': T:

I
1
2

ci =

Cr:

D Y :

Yi

et

La m i s e e n u v r e d e s d e r n i r e s f o r m u l e s , l e s p l u s u t i l e s d a n s u n b o n n o m b r e d e c a s , s e f a i t
pratiquement sans modifications :
n
I =1

- c a l c u ld e
S=

. -

D = y,

y;

,d e

la s o m m ed e sc a r r sd et o u s

lm d o s a g e s , y compris

c e l u id ut o t a l

+ y, e t d u f a c t e u r c o n s t a n t C = D/S, i=l pourchaquey;,obtentiondeCyi , 1 + Cy; et enfin de ti

o b t e n t i o n d e Cy,

2,:

= (1 t C Y ; ) ~ ; ,

- p o u r y,

, 1 - Cy,ettt

= (1

- Cyt)yt.

Au lieu de raliser directement ces calculs valeursde y : et y : d a n sl e sc o l o n n e s

il est possible, compe ci-dessus, de porter les

(6) e t (7) d u t a b l e a u 1 r s e r v e s a u x i n v e r s e s d e s p o i d s . L ' u t i -

lisation du tableau reste celle qui

a t vue.

29

C - DOSAGE

AVEC SOUS-FRACTIONNEMENT
II arrive, danS.la ralisation de dosagescomme ceux qui nous intressent ici, que les fractions puissent elles-mmes tre scindes en sous-fractions qui sont galement doses. Nous nous trouvons alors en pr6sence de dosages raliss diffrents niveaux : '

- sous-fraction dans la fraction, - f r a c t i o n dans l e t o t a l , - total.

-FRACTIONNEMENT BE TOUTES
Nousnoterons y i i la sous-fraction appartient trieur de la fraction total de sous-fractions teneur en total lesteneursensous-fraction.L'indice
: i = 1 , 2,

LES FRACTIONS
laquelle I'in-

i repre la fra'ction

(il y a k fractions
donc n =

. . . , k) e t j

repre la sous-fraction

(il y a ni sous-fractions
dosesest

k -

dans l a f r a c t i o n i : j = 1 , 2, n i. La teneur en fraction

. . . , ni.).

Lenombre

i sera a p p e l e Y i e t l a

Y,

i -1
la notation utilise pour reprsenter les rsultats des do-

Le tableau ci-dessous schmatise

sages effectus :

sous - f r a c t i o n

Fraction

total

YZ1

f...

Y2j

....

Y2n2

. .
' Yin

Yii

....

'

Yij

....

Pour obtenir les estimations des vritables teneurs les valeurs observes seront corriges d'une quantit additive portant les mmes indices que l'observation correspondante pour pour pour yij
:

ci j
Ci

conduisant .conduisant conduisant

tij

= yij

cij,

Yi
Y,

,
,

Ti Tt

= Yi
= Y ,

ct

+ Ci-, + C,.

30

A l'intrieur de la fraction T i doit tre T t .

Nousavonsdonc
:

l e s teneurs tij doivent cumuler

T i e t l a somme detousles

ETi
i=1
et par voie de consquence :

= Tt

Ces relations entrainent, contrainte suivantes :

comme dans l e cas d'un fractionnement simple, les relations

de

XCi
1

- Ct

= Yt

il

ZYi
i

= Dt

(1 relation)

La contrainte correspondant l a d e r n i r e r e l a t i o n est une consquence des prcdentes, e l l e n ' e n est donc pas indpendante et Appliquant toujours la mthode n'y a pas l i e u d ' e n t e n i r c o m p t e . des moindres carrs nous allons minimiser
:

f = ZXWij c j;
i j wij

+ xwi c + w, c: :
1

est le poids attribu au dosage de la sous-fraction ij, l e poids attribu au dosage du total.

W i le poids attribu au dosage de la

f r a c t i o n i e t Wt

La fonction f sera minimise compte tenu

g

des relations de contrainte ci-dessus qui s'crivent:

= YCi
I

Ct

- D,

= O

(1 relation)

hi = C C i j

- Ci - Di = O
df

(k relations)

La mthode des multiplicateurs de LAGRANGE nous conduit a rsoudre

+ A

dg

+ Cyidhi
I

= O

soit :

(1)

(2)

(3)

+ pi = O (n quations, formant 2Wi C i + X y; = O (k quations) 2wt C t - X = O ( 1 quation)

2 w i jc i j

k groupes, l e ihme comprenant

ni quations)

Pour rsoudre ce systme nous

allons calculer

et

p . ;

puis porter leur valeur

dans les re-

lations ci-dessus pour obtenir les expressions des corrections. En additionnant, a p r h d i v i s i o n par w i j latives l a f r a c t i o n i et soustrayant de ou W i selon l e cas, les n i quationsde

(1) re-

l a som.me I'quation correspondant,e de (2),

nous obtenons :

2(7Cij
1

C i ) +Pi?--

1
-'-

1 wij

wi

+&

wi

31

soit

Nous avons ainsi

quations. aprs division comme ci-dessus les

.En.additionnant maintenant

quations de (2) et sous-

trayant l a dernire de la somme nous obtenons :

soit

donc, au total,

k + 1 quations pour les

k t 1 inconnues A e t p i .
:

Posons pour simplifier I'criture

Pi =

c-

j Wij

1 + -w i 1 + -w,

Pt = N o t r e systme d'quations s'crit :

F 1F
=

2D;
2Dt
d'o nous tirons :

+ P;p;

wi

(k

quations)

+ Pt A - X

( 1 quation)

i Wi

et

Pi x-i wi

- ci

P;W;

[" wi

2Di]

La dernire quation nous donne

d'o la valeur de

x= -

2
Pt-

I x-piwj! i

que nous reportons dans les k premieres quations pour obtenir

32 "

Ces valeurs nous permettent d'obtenir les

expressions des corrections :

13

c,

.A - = -_.
2

Dt+

c -PiWi i c-

- 1

wt

Pt-

. -1

PiWf

wt

L'interprtation gomtrique est ici peut-tre tionnement simple : un changement de variable l ' o r i g i n e u n p o i n t M de l'espace quations sont g = O e t

moins vidente que dans l e cas d'un frac-

prs l a f o n c t i o n f est le carr de la distance de

Rn+k+l. C e p o i n t d o i t se trouver sur les hyperplans dont les

La distance OM est minimale lorsque

hi = O, donc sur leur intersection.

O sur cette intersection.

M est la projection orthogonale de

Lamise

en uvre de ces formulessuit pas pas la rsolution littrale de faon

ordonner

'

les calculs numriques.

On peut utiliser un tableau

de calcul tel que le tableau

2 qui prsente les

oprations dans un ordre systmatique. Les colonnes aurons besoin

Ces oprations sont rappeles en tte de colonne. teneurs observes ainsi que les totaux dont contiennentlesdiffrences nous

(l),(2)
et

et
i

(3)contiennent les

,Tyii

C Y i ; les colonnes

(4)e t (5)

D i e t D,

Dans les colonnes

CS), (7) e t (8) sont prsents les poids, ainsi que leur inverse dans les colonnes
Lessommesdes inverses des poids (Pi e t Pt ) sontobtenues dans les.colonnes (12)

(9), (10) e t (13).

et (11).

Les colonnes

(14) (21)

contiennent les diffrents

termes des corrections qui sont calcules

dans les colonnes (22), (23) e t

(24).

Ces corrections sont ajoutes respectivement aux termes cor-

respondants des colonnes (3), (2) e t (1). Les colonnes

(14),

(15), (16)

et (17) conduisent au calcul

de

A/2, appel i c i A, les sommes

(18),(19)
e t (20)

ncessairessontobtenuesau fournissent pi/2,

bas des colonnes (16).et (17).

Enfin les colonnes

a p p e l i c i B i.

II serait possible d.e dvelopper les formules utilisant .des expressions particulires des poids
telles que celles qui ont t envisagees pas t tablies car l'introduction dans l e cas d'un fractionnement simple. Ces formules n'ont

des expressions des poids dans le tableau gnral semble ici au Les points particuliers associs I ' a t t r i -

moinsaussi simple que l'utilisation de nouvelles formules. bution

d es poids ont t discuts propos du fractionnement simple.

33

Tableau 2

- Tableau de calcul des corrections dans le cas de sous-fractionnement.

-Teneur en total Teneur en fraction Teneur en

sous-

~~

2)

- 5s. tot.(:

11)

- tot.(2)

fraction

Poids dosage total

Poids

Poids
dosage
'Ous-

dosage fraction

110)

+ Ss.tot.(l

fractior

(2)

Yi

Yij

Dt

l/w

1'1

pi
1

z
i

l/Wk

pk

34

-9) 4- tot.(lO 10) x (14)

-A
.(20) x ( 1; 1

10) x (15) 4 x (15) 4) x (14 (18)- (19: 20)

21) x (10)

(21)

Pt

1/Pi

l/Pi wi

Di /Pi Wi

Bi

Bi- A

B1

B1 - A

Bi - A
I

ci

!
L

Bk

Pt

c
i

Di/Pi W

35

2 SOUS-FRACTIONNEMENT PARTIEL
Nous avons dans l e p o i n t C-1 suppos que toutes les fractions conduisaient desous-fractions.Cen'est soient dosesdans pas o b l i g a t o i r e m e n t l e cas gnral.

b des dosages

II arrive que certaines fractions

leur ensemble sans poursuivre la dcomposition plus avant. Nous allons examiner que nous venons d'tablir lorsPour l a commosont

maintenant les modifications qui doivent tre apportes aux formules que certaines fractions restent telles quelles alors dit de l'expos noussupposerons, ce qui ne nuit

que d'autres sont dcomposes.

pas b la gnralit, que les r premieres ne lesrsultatsdeleurdosage.

pas dcompos6es.Nousnoterons

YI,

Y2,

. . . , Y,.

A partir de la

v a l e u r r + 1 de l ' i n d i c e i nous conserverons

la notation prcdente. est maintenant n ni Dans l ' a p p l i c a t i o n i=r+l - r + 1 relations de contrainte, donc k - r + 1

L e nombre total,

n, sous-fractions de

de l a mthode des moindres carrs multiplicateurs de L A G R A N G E : Les q u a n t i t s D l ,

il n ' y aura plus que

h et pi

( i = r + 1, r + 2,

. . . , k).
Pr n'existeront plus ; Dr+l

Dl,

. . . P,

. . .,

Dr et

P l , P2,

. . .,

. .. D k ,

Pr+l

Pt resteront inchanges.

II

est i n u t i l e de redvelopper les calculs dont les rsultats

sont vidents :

.
. .

p i n'existe plus pour

Dt +
A = - 2
Pt
-'

i=r+l

i = 1 , 2, 2. P;
I

. . ,,r .
I

w;

i=r+l

pi reste inchang pour i = r + 1, r + 2 ,

. . .,

( r + l ,< i

<

k)
k)

( r + 1 ,C i ,C

La ralisation des calculs se fait encore en utilisant le tableau modifications qui suivent. Lorsqu'une fraction n'est pas dcompose :

2 moyennant les quelques

. rien n'est inscrit

qui drivent de ces

dans l e s colonnes (3) et (8) correspondantes. Aucune

des quantits

colonnes n'est alors calcule (colonnes

(1 1) (19), l ' e x c e p t i o n de

( 1 3) e t (22) )

36

. le Bi

correspondant est remplac par zro en colonne

(20) p o u r l e c a l c u l d e l a

correction C i

.
comme

A remarquer que la partie du tableau modifie

que le tableau

il vient d'tre indiqu n'est autre

A prs.

1 utilis dans l e cas de fractionnement simple, au calcul de

Lorsque les poids sont pris gaux aux inverses est videmment inutile de remplir les colonnes directement remplies par les variances, les

des carrs des moyennes (ou des teneurs)

il

(6), (7)

e t (8) : les colonnes ( 9 ) , (10) e t (1 1) sont leur carr.

moyennes (ou teneurs) ou

Pour tre complet, termes correctifs.

il resterait examiner le problme des variances et covariances des

l e momentcar, d'une part notre propos tait simplement part,la connaissance de des

II

n'a pas t abord pour

de dgager les corrections

apporter aux rsultats des dosages et, d'autre

ces variances et covariances para2 d'un intrt assez rduit pour les exploitations habituelles rsultats. Enfin, l'hypothse de normalit, toujours variable. tion Les y i j ou y ; , Y;, suppose vraie, peut exiger un changement de

yt ou Y, neserontplusalorslesteneurselles-m8mes
de faon gaussienne.

maisune foncLes exploita-

@ des teneurs t e l l e queles @ i j , @i .et@t soient distribus

sur les @ et lors de la transformation inverse

tions seront faites

il conviendra de tenir compte du

comme l ' i n d i q u e n t

biais introduit par la transformation

dans l'estimation de la tendance centrale

NEYMAN et SCOTT.

D e toute faon, l'hypothse

de normalit n'est pas indispensable lorsqu'aucun

test paramtrique n'est fait sur les teneurs.

D - EmMPLES NUMRIcUES
Deux exemples numriques sont fournis pour illustrer la mthode de correction
:

- correction dans l e cas d'un fractionnement simple

Les donnes numeriques utilises

- correction dans l e cas d'un sous-fractionnement partiel.

i c i nous ont t aimablement communiques par Noustenons

J . DIDIER de SAINT-AMAND e t L. ZUCKERMAN.

Ce sont les rsultats du dosage de phosphore

lesenremercier.

dans les feuilles de la varit de cotonnier

108

F. I l s

sont extraits d'une exprimentation plus importante

; le traitement retenu est le tmoin.

37

Tableau 3

- Calcul des teneurs corrigees

dans l e cas de fractionnement

simple,

Inverses des poids fraction total fraction

Corrections fraction total

Teneurs corrigees total

fraction

(1)

- tot. (2)
D

(6)

+ tot. (7)
P
Ci
C t

Yi

Ihvt

2.200 O . 647 0.520

O. 128

4.8400 0.4186
O . 2704

- O. 0397

2.160 O . 644 0.518

O. 128

0.0164

- O . 0034 - 0.0022 - 0.0001

- O. 0063

O . 880

o. 7744

0.874

4.375

- o. 195

17.4724

6.3198

23.7922

- 0.008196

0.1432

1 FRACTIONNEMENT SIMPLE
Les fractions dosessont phosphore protique, dos.
: l e phosphore acido-soluble total, le phosphore lipidique, le

l e phosphore A D N e t l e phosphore ARN.

Le phosphore total a galement t

Les teneurs observes sont les suivantes, toutes donnes pour une raison d'uniformit

trois

chiffres aprs la virgule bien qu'obtenues

trois chiffres significatifs :

4.180 mg/g 2.200 mg/g 0.647 mg/g 0.520 mg/g O. 128 mg/g O. 880 mg/g

Ph.

Phosphore total acido-soluble total Phosphore l i p i d i q u e

Phosphore protique Phosphore A D N Phosphore ARN

.
que la

Une tude des carrs moyens rsiduels de l'ensemble de l'exprimentation a montr p r o p o r t i o n n a l i t des variances au carr comme poids les inverses l'avons dei dit,

des moyennes peut tre accepte. Nous adopterons donc

des carres des teneurs.

En f a i t d ' a i l l e u r s p o u r l e c a l c u l ,

commenous

I les carrs des teneurs sont introduits directement ? la place des inverses des poids

dans l e tableau 3 qui est la reprise du tableau

1 aprs suppression des colonnes (4) et (5) et adjonction

de tableau. La ralisation des calculs n'appelle aucun de colonne.

de deux colonnes "teneurs corriges'' en fin

commentaire particulier, chaque opration tant prcise en tte

2 SOUS-FRACTIONNEMENT PARTIEL
Pour illustrer la conduite des calculs dans l e cas de sous-fractionnement, pas et dvelopps, a t6 retenu. l e sous-fractionPourlesbesoins

nement partiel, dont les calculs thoriques n'ont

de l'illustration

noussupposeronsque

la fraction "P acido-soluble total" a

donn lieu au dosage de

deux sous-fractions neurs suivantes :

: "P acido-soluble minral'' et

" P acido-soluble organique", fournissant les te-

P acido-soluble minral 1.610 mg/g P acido-soluble organique0.568 mgkg.

Les calculs sont conduits dans l e tableau 4, reprise du tableau 2 l'exception des colonnes

(6), (7)e t (8).

Trois colonnes supplmentaires contenant les teneurs corriges y ont t ajoutes. comme dans l e t a -

Les oprations faites dans chaque colonne sont explicites en tte de celle-ci bleau 3.

Les calculs sont conduits de bout en bout pour la fraction " P acido-soluble total" qui a sous-fractionne alors que autres fractions qui n'ont

B i est remplac par zro,

comme

i l a t dit enC-2

ci-dessus,

pour les

pas fait l'objet d'un fractionnement de second ordre.

39

Tableau

- Calcul des teneurs corrigees

dans l e cas de sous-fractionnement

partiel.

total - Froctior (1)

r
;.fract
2)

Inverses des total fraction

ds

s.fract.

- Ss.tot.(3) 1 (1) - tot.(2]

Di

(1 3)
10) + Ss.tot.(ll] 9) + tot.(lO)

yt Yi --

Yij

Dt

Pt

1/Pi

P acido-soluble minral

1.610

2.5921

P acido-soluble
organique

0.568

O. 3226

2.200

o. O22
4.8400 2.9147 7.7547

P acido-soluble total

2.178

O. 1289

P lipidique

0.647

0.4186

P protique

0.520

O. 2704

P A.D.N.

0.128

0.0164

P A.R.N.

O. 880

o. 7744

P total

4.180

- 20.7714
-0.1813

4.375

- 0.195

6.3198

23.7922

0.01373

A = 3.0208

- 23.7922

0.195

40

Corrections ss.fract. fraction total

Teneurs corrigees total

1)
f

Fraction

ss.fract
3) + (22

(18)

- (19

(20) - A *
Bi

(24:

2) + (23

-(20)x(11

21) x ( 1 C

ix

(9)*

"/Pi

wi

A/Pi Wi

c*

tt

ti

t;.

- 0.006E

1.603

- o. oooa
0.01373 3.0208 1.005447

0.567

O. 002837

O . 00261O

- 0.0061 17
0.008727

'

O. 0296

2.170

2.170

0.0036

O . 643

- 0.008727

O. 0024

0.518

. 0.008727

0.0001

0.128

'

0.008727

O. 0068

O . 873

3.01373

3.0208

0.1525

4.332

4.332

Lorsqu'on procde au

dosage d'un tout et

des fractions qui le constituent

on ne trouve pas

sur les rsultats exprimentaux la relation de cumul qui doit les lier tions n'gale pas la teneur en total. l a r e l a t i o n de cumul soit vrifie. moindrescarrs
: si wi

: l e t o t a l des teneurs en frac-

Les rsultats bruts des dosages doivent tre corrigs pour que Des corrections additives ont t calcules par la mthode dosage de l a f r a c t i o n n o i , w t l e p o i d s a c c o r d a u dosage d u t o t a l y t e t l a sommedes rsultats dudosage de5

est l e poids accord au

dosage du total et

D la diffrence entre le rsultat du

1
1

des dosages des f r a c t i o n s X y i (D = yt

- Tri), la correction

ajouter au rsultat brut yi

de

I Q f r a c t i o n n o i est

Le rsultat corrig du

dosage du total est obtenu en qjoutant

C,

-D

c-

+ Wt

1 __
Wt

Wi

au rsultat brut

y t decedosage.

A partir de ces formules gnrales des formules utilisant des expressions particulires des
poids ont t tablies
: poids inversement proportionnels aux variances, variances proportionnelles

aux moyennes ou au carr

des moyennes.
toutes les formules ont t donns dans chaque cas : ta-

Desschmas de mise en ceuvre de bleau pour le cas gnral et directives

dans les cas particuliers. des f r a c t i o n s a galement t examin. appelant yij la teneur brute en

Le cas de sous-fractionnement de tout ou partie

S i toutes leS.fractions sont

la

dcomposes,nousavons,en la teneur brute

i me

sous-fractionde

l a f r a c t i o n i, Y i

en la ime fraction,

Y t la teneur brute
l a somme

en t o t a l , w i j

, Wi

e t W,

les poids correspondants,

P i l a somme X
j D, la diffrence

1 1 X - + - , Dlia i f f r e n c e i wi w, - d

Yi

1 1 - + - , Pt Wi
Wij

Z y ie t j

Yt

Yi :
1

pour les teneurs en sous-fractions, 'pour les teneurs en fractions,

c,
avec

x 2 wt

pour la teneur en total,

42

et

pi =
Si certaines des fractions (les

A 2 - (- T f D i W i )
Pi w i

r premires) ne donnent pas lieu au dosage de sous-fractions

:

les f o r m u l e s c i - d e s s u s d o i v e n t t r e m o d i f i e s c o m m e s u i t

ci
ij

--2 x wi

p o u r l e ~ sr p r e m i r e s f r a c t i o n s n o n s o u s - f r a c t i o n n e s

- -; 2 ~1
Pi - 1 2wi

Pi

pour les sous-fractions,

ci c,
avec

p o u r l e s k-r d e r n i r e s f r a c t i o n s , c e l l e s q u i o n t d o n n e lieu b sous-fractionnement p o u r le t o t a l ,

x 2wt

x
et

= - 2

Pi

= - - pi

wi (-

Di Wi )

Un t a b l e a u - t y p e a t B t a b l i p o u r g u i d e r la r e a l i s a t i o n d e s c a l c u l s n u m e r i q u e s d a n s gnraldapplication.Moyennantquelquessimplifications

le c a s

il sadapteauxcasparticuliers.

D e u x e x e m p l e s n u m e r i q u e s o n t t f o u r n i s p o u r i l l u s t r e r la m t h o d e d e c a l c u l :

- correction dans - correction dans

le c a s d u n f r a c t i o n n e m e n t s i m p l e ,

le c a s d u n s o u s - f r a c t i o n n e m e n t p a r t i e l .

Bibliographie
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a t r a n s f o r m a t i o no f

O. S.T.O. R. M.
Direction gnrale :

24, rue Bayard, PARIS W

Service Central de Documentation :

70-74, route dAulnay - 93 BONDY

IMP. S. S. C. B o n d y O. R. S T. O. M. edifeur .
D6pe.t l&al:
1 trim. 1968