Introduction

L’extraction d’ADN est requise pour des applications de biologie moléculaire telles que la PCR, la
digestion par les enzymes de restriction, le Southern blotting etc., et pour l’analyse d’échantillons
médico-légaux et cliniques de même que les échantillons de terre et environnementaux. Il existe
beaucoup de kits d’extraction et de purification de l’ADN dans le commerce. Cependant il a été
montré que la sensibilité de détection par PCR de l’ADN extrait varie selon le kit utilisé [1]. Choisir le
kit adéquat peut permettre de gagner du temps sur l’optimisation du kit et l’exécution de
l’expérience.

Les facteurs à prendre en considération dans le choix du kit sont:

1. L’origine de l’échantillon: Des kits différents sont utilisés pour des échantillons de sources
différentes car ils doivent être traités différemment. Par exemple, un échantillon de sang
sera traité différemment d’une tache de sang séché. Les sources des échantillons devant être
considérées lors de la sélection du kit d’extraction incluent les sources humaine, le sang, les
cheveux, les rongeurs,les feuilles, les bactéries,les levures, les champignons, les insectes, les
matières fécales, les fluides corporels, les spores,la terre, les échantillons cliniques, (ex.
biopsies, ponctions à l'aiguille fine), les échantillons médico-légaux (ex. taches de sang séché,
, frottis buccal), et les empreintes digitales.
 2. La méthode de préparation de l’échantillon: Le kit doit être compatible avec la méthode de
préparation de l’échantillon. Les différentes méthodes de préparation des échantillons
peuvent être: fraiche ou à partir de culots cellulaires préalablement congelés, de sections de
tissus fixés dans la formaline ou inclus en paraffine, de sections de tissus congelés, de cellules
fixées dans l’éthanol et des échantillons préservés dans Oragene™.

3. Usage prévu: La qualité et la pureté de l’ADN obtenues avec le kit d’extraction doivent être
adéquates pour l’application prévue en aval qui peut être du séquençage, du fingerprinting,
de la PCR, de la qPCR, du southern blotting, de RAPD, de l’AFLP, et du RFLP, des digestions
avec des enzymes de restriction, la préparation de librairies shotgun.

4. Contenu humique: Si l’échantillon présente un contenu humique tel que du compost, des
sédiments ou du purin, un kit qui permet l’élimination du contenu humique doit être utilisé
car ces substances peuvent inhiber les applications en aval comme la PCR.

5. La quantité d’échantillon: Différent kits sont adéquats pour traiter des échantillons de
différente taille. Le kit utilisé va dépendre du nombre de cellules mammaliennes cultivées
(105-107) et de cellules bactériennes (106-1011), mg de tissu, quantité de sang (100 µl to 1 ml),
mg de terre (250 mg -10 g), mg de tissu végétal etc.

6. Rendement obtenu.

7. La possibilité d’automatiser la procédure d’extraction.

8. Simplicité: La simplicité du protocole doit être considérée en fonction de l’expérience du

personnel qui réalise l’extraction d’ADN.

Excepté les facteurs décrits ci-dessus, les critères de bases que doit suivre une méthode d’isolation
d’ADN incluent :

1. L’efficacité de l’extraction.

2. La quantité d’ADN obtenue doit être suffisante pour les applications en aval.

3. L’élimination des contaminants.

4. La qualité et la pureté de l’ADN. L’absorbance en ultraviolet peut être utilisée pour

déterminer la pureté de l’ADN extrait. Pour un échantillon d’ADN pur, le the ratio de
l’absorbance à 260 nm et de l’absorbance à 280 nm (A260/A280) est de 1.8. Un ratio
inférieur à 1.8 indique que l’échantillon est contaminé avec des protéines ou un solvant
organique comme le phénol.

Les différentes étapes impliquées dans l’extraction d’ADN sont les suivantes:

1. Lyse cellulaire. la première étape implique la lyse cellulaire pour accéder à l’ADN. Celle-ci
peut être accomplie par des méthodes physiques ou chimiques.

2. L’élimination des lipides. L’élimination ou la séparation des lipides membranaires et des

débris cellulaires se fait généralement à l’aide de détergents comme le sodium dodecyl
sulfate et par centrifugation.
 3. L’élimination des protéines de l’extrait cellulaire. La dénaturation des protéines est effectuée
à l’aide d’une protéase telles que la pronase ou la protéinase K. Aprés quoi, les protéines
dénaturées sont séparées de l’extrait cellulaire.

4. L’élimination de l’ARN. L’élimination de l’ARN est effectuée par addition de RNase qui
dégrade rapidement l’ARN en ribonucléotides. Cette étape est généralement optionnelle
dans chaque kit.

5. La précipitation/agrégation/élution de l’ADN.

Les méthodes d’extraction de l’ADN communément utilisées dans les kits d’extraction ou de
purification de l’ADN sont:

1. L’extraction organique. Cette méthode a été très largement utilisée et est une méthode
d’extraction de l’ADN conventionnelle. Dans la première étape, les cellules sont lysées et les
débris cellulaires éliminés par centrifugation. Dans un deuxième temps, les protéines sont
dénaturées à l’aide d’une protéase. Dans la méthode d’extraction organique, après
dénaturation, les protéines sont éliminées à l’aide de solvants organiques tels que le phénol,
ou un mélange 1:1 de phénol et de chloroforme. Les solvants organiques précipitant les
protéines laissant les poly nucléotides (ADN et ARN) en solution, le précipité de protéines est
ensuite séparé par centrifugation. Dans la dernière étape, l’ADN purifié est généralement
récupéré par précipitation à l’aide d’éthanol ou d’isopropanol. En présence de cations
monovalent tel que Na+, et à une température inférieure à 20°C, l’éthanol absolu précipite
l’ADN efficacement. Une autre propriété de l’éthanol est qu’il ne précipite que les acides
nucléiques polymères et laisse en solution les acides nucléiques monomères et de petite
taille comme les ribonucléotides provenant du traitement à la RNase. L’ADN précipité est
généralement resuspendu dans un tampon TE ou de l’eau distillée. Les limites de cette
méthode sont: l’utilisation de solvants organiques dangereux et le temps nécessaire pour
accomplir l’extraction. De plus, des résidus de phénol ou de chloroforme peuvent être
présents dans l’ADN extrait et peuvent inhiber certaines applications en aval telles que la
PCR. Un exemple de kit basé sur une modification de cette méthode est le kit Easy-DNA™
(Invitrogen).

2. Technologie utilisant la silice. C’est une méthode largement utilisée dans les kits courants.
L’ADN est absorbé spécifiquement sur la membrane/billes/particules de silice en présence de
certains sels et à un pH particulier. Les contaminants cellulaires sont éliminés par les
différentes étapes de lavage. L’ADN est finalement élué dans un tampon faible en sel ou
tampon d’élution. Des sels chaotropes sont inclus pour aider à la dénaturation de protéines
et l’extraction d’ADN. L’avantage de cette technologie est qu’elle peut être incorporée dans
des colonnes de centrifugation ou des micro-puces, elle est rentable, présente une
procédure plus simple et plus rapide que l’extraction organique et est adaptée pour
l’automatisation. Les kits basés sur cette méthode comprennent Purelink Genomic DNA
extraction kit (Invitrogen), DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) etc.

3. Séparation magnétique. Cette méthode est basée sur la liaison réversible de l’ADN à une
surface solide/billes/ particules magnétiques qui ont été recouvertes d’un anticorps liant
l’ADN ou d’un groupe fonctionnel qui interagit spécifiquement avec l’ADN. Après liaison de
 l’ADN, les billes sont séparées des autres composants cellulaires contaminants, lavées et
finalement l’ADN purifié est élué par extraction à l’éthanol. L’avantage principal de cette
méthode est qu’elle est rapide et adaptable à l’automatisation. Cependant, elle peut être
plus coûteuse par rapport aux autres méthodologies présentées dans cette revue. Des
exemples de kits basés sur cette méthode sont Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter),
Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Geneaid) etc.

4. Méthode d’échange d’anion. Cette méthode est basée sur l’interaction spécifique entre des
phosphates négativement chargés de l’acide nucléique et les molécules de surface
positivement chargées du substrat. L’ADN se lie spécifiquement au substrat en présence de
faible concentration de sels, les contaminants sont éliminés par les étapes de lavage utilisant
un tampon à concentration faible ou moyenne en sels, et l’ADN purifié est élué à l’aide d’un
tampon à concentration élevée en sels. Cette technologie est plus couramment utilisée dans
les kits d’isolation des plasmides tels que PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification Kits
(Invitrogen), Qiagen plasmid mini/midi kits (Qiagen), and NucleoBond® PC kits (Macherey
Nagel).

D’autres méthodes sont aussi utilisées telles que la purification par « salting out », les gradients de
densité au chlorure de césium, et la résine chelex 100. Les méthodes d’isolation de l’ADN sont
souvent modifiées et optimisées pour différents types cellulaires. Le cetyltrimethylammonium
bromide (CTAB) et le thiocyanate de guanidium (GITC) sont souvent inclus dans les protocoles
d’extraction d’ADN de tissue végétal et sont discutés plus en détails dans “ Kits pour l’extraction
d’ADN de tissus et cellules végétales ".

Chaque kit disponible dans le commerce présente certaines caractéristiques et avantages. Une liste
des kits communément utilisés pour l’extraction et la purification de l’ADN a été compilée indiquant
la technologie utilisée, les applications, le rendement et les avantages associés à chaque kit. Les kits
d’extraction d’ADN mammalien, microbien et de matériel végétal sont revus ci-dessous. (Table 1)

Isolation d’ADN de microbes

Les cellules bactériennes sont les plus couramment étudiées et utilisées parmi les microorganismes.
Tout d’abord, une courbe de croissance est obtenue pour un type cellulaire donné en mesurant la
densité optique (OD) à 600 nm, à différents temps durant la culture. Pour l’extraction d’ADN, les
cellules bactériennes sont cultivées en milieu liquide jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité
maximum de 2-3x109 cellules/ml, elles sont ensuite récoltées. La croissance des cellules peut être
surveillée par l’analyse de la turbidité de la culture, et quantifiée en mesurant la densité optique à
600 nm et en la correlant à la courbe de croissance établie précédemment. Les cellules collectées
peuvent être ensuite traitées pour l’extraction de l’ADN en utilisant différents kits. La lyse cellulaire
pour l’extraction d’ADN bactérien est souvent effectuée par des méthodes chimiques utilisant le
lysozyme, l’EDTA, le lysozyme et l’EDTA, des détergents etc. Comme décrit dans l’introduction, la lyse
cellulaire est suivie par l’élimination des composants cellulaires de l’ADN à l’aide d’une méthode
d’extraction organique, ou d’une technologie utilisant la silice etc. La dernière étape implique la
précipitation de l’ADN pour obtenir une solution d’ADN pur de concentration élevée. Une procédure
similaire est suivie pour les levures et autres microbes.
Beaucoup de kits sont disponibles pour l’extraction d’ADN à partir de microbes comme les bactéries,
levures, et champignons. Bien que le principe derrières les différentes étapes soit le même, les kits
présentent beaucoup de modifications dans le tampon de lyse, la méthode de séparation de l’ADN, la
membrane utilisée, le tampon de lavage et d’élution de ADN. Le but de ces modifications est
d’améliorer l’efficacité de l’extraction d’ADN du kit. Les kits d’extraction d’ADN à partir de cellules
microbiennes disponibles dans le commerce sont brièvement décrits ci-dessous. Ces kits sont
également présentés dans la Table 1.

1. Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (BayGene/Sigma-Aldrich): Ce kit peut être utilisé pour
isoler de l’ADN de haute qualité, à partir de bactéries Gram négatives et positives, qui est
utilisable pour des digestions par les endonucléases de restriction, la PCR et le Southern blot.
Il emploie un système basé sur la silice avec un format de micro colonnes de centrifugation
et peut isoler de l’ADN de taille allant jusqu’à 50 kb en longueur. Brièvement, les cellules sont
lysées enzymatiquement dans une solution de sels chaotropes, l’ADN est absorbé
spécifiquement sur une membrane de silice, les autres composants du lysat sont éliminés par
lavage. Finalement l’ADN est élué dans un tube de collection dans un tampon adapté.

2. BACMAX DNA purification kit (Epicentre Biotechnologies/ Cambio): Ideal pour l’isolation
d’ADN de clones BAC simple copie ou de clones induit CopyControl™, pour des applications
comme le séquençage, fingerprinting, PCR, la préparation de librairies shotgun. Il est basé sur
une méthode modifiée de lyse alcaline et utilise l’EPICENTREs® RiboShredder™ RNase Blend
avec différentes étapes de précipitation sélective pour éliminer les contaminants.

3. PowerSoil DNA isolation kit (MO BIO Laboratories Inc): Ce kit peut être utilisé pour isoler de
l’ADN microbien provenant de tous types de terre et d’échantillons environnementaux, de
même que d’échantillons de matières fécales, de selles et de biosolides. Il fournit une
méthode brevetée d’élimination de substances humiques qui élimine les inhibiteurs de PCR,
de tous types d’échantillons de terre même les plus difficiles et produit un ADN de haute
qualité qui peut être utilisé pour les applications en aval telles que la PCR, la qPCR et le « next
generation sequencing ».

4. PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc): Ce kit permet l’isolation d’ADN à
partir de large quantité de n’importe quelle terre ou d’échantillons environnementaux
présentant une charge microbienne faible ou élevée qui inclue les bactéries Gram-positives
et Gram-négatives, les champignons, les algues, et les actinomycètes, et avec un contenu
humique incluant le compost, les sédiments ou du purin. Il est basé sur le kit d’isolation
d’ADN PowerSoil® et utilise aussi un nouvel inhibiteur breveté Removal Technology® pour
éliminer les composés inhibiteurs de PCR présents dans la substance humique. La couleur
brune est souvent associée avec l’ADN isolé d’échantillons de terre.

5. UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc): Ce kit permet l’isolation
d’ADN génomique de haute qualité de taille allant jusqu’à 50 kb, à partir de 1.8 ml de culture
microbienne de différents types de microorganismes comme les levures, les champignons,
les bactéries Gram-négatives et Gram-positives, et spores bactériennes et fongiques. Le
principe de ce kit est de lyser les microorganismes en utilisant une combinaison de
détergents, chaleur et de forces mécaniques contre des billes spécialisées. L’ADN libéré est
ensuite lié à un filtre de silice, lavé et élué dans du tampon Tris certifié sans ADN.
Extraction d’ADN à partir de cellules animales et tissus

Les étapes de base impliquées dans l’extraction d’ADN à partir de cellules animales ou tissus sont
identiques à celles discutées dans l’introduction et dans le chapitre sur les microbes. Cependant, les
kits incluent des modifications à la méthode de base prenant en compte les caractéristiques
particulières des cellules animales. La culture et la préparation de cellules animales sont très
différentes de celles de cellules microbiennes. La plupart des cellules animales ne présente pas de
paroi cellulaire comme les cellules microbiennes et sont donc plus facilement lysées à l’aide de
détergents uniquement. Les cellules animales doivent, cependant, être homogénéisées
mécaniquement ou traitées par des enzymes avant la lyse. La lyse cellulaire est suivie par la
séparation de l’ADN des autres composants cellulaires et sa purification. Beaucoup de kits n’utilisent
pas la méthode conventionnelle d’extraction organique au phénol/chloroforme et de précipitation à
l’éthanol. Ceci minimise les dommages induits par les solvants sur l’ADN. Par exemple AccuPrep
Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer) et GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare)
utilisent des colonnes contenant de la fibre de verre pour extraire l’ADN. QIAamp DNA mini kit
(Qiagen) utilise des colonnes contenant des membranes de silice, qui sont capable de retenir l’ADN
de manière spécifique en ajustant le pH et les conditions salines. Agencourt DNAdvance Kit (Beckman
Coulter) utilise la séparation magnétique.