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METHYLATION DE LADN
par Dr UME
Vos ractions, vos avis cafaitdebat@labosp.com

Rsum
Le programme gntique, sil est trs important, est loin dtre le seul responsable du dveloppement de lorganisme. De nombreuses maladies, et notamment le cancer, sont aussi lies de nombreux autres facteurs dits pigntiques. Lenvironnement produit des gnotoxiques, ou substances potentiel mutagne, dune part et, dautre part des substances non gnotoxiques qui dstabilisent lADN sans modifier le gnome. Le processus de mthylation de lADN est un de ces facteurs pigntiques. Lexpression de nombreux gnes dpend fortement de la conformation de la chromatine, cest dire de son degr de condensation. Les rgions de lADN qui doivent un instant donn tre plus ou moins actives sur le plan transcriptionnel sont dtermines par les signaux que la cellule reoit de son environnement. Les modifications chimiques responsables du changement de conformation ninfluencent en aucun cas la squence codante et sont rversibles. La conformation dpend du degr de mthylation ou dactylation des histones et, en ce qui concerne directement lADN, la mthylation au niveau des bases cytosine, elles-mmes au sein dlots riches en CpG. Des souris knock out chez qui tait inactivs les gnes codant pour les protines impliques dans la mthylation mouraient au cours de lembryogense, dmontrant limportance de ces mthyltransfrases dans le dveloppement des organismes. La plus belle russite de la biologie moderne est la dcouverte des fondements gntiques du vivant. Mais une conception plus dynamique de la gntique sest aussi impose. Toutes les instructions ncessaires la constitution d'un organisme, quel qu'il soit, sont codes dans son ADN.

Reste un grand mystre : le fait que des cellules ayant le mme ADN soient capables d'exprimer des fonctions diffrentes et uniques. Chaque organe, chaque tissu des organismes complexes, comme le ntre, est form de nombreuses cellules diffrentes, units lmentaires du vivant. Les cellules qui composent un tissu expriment des fonctions spcifiques, caractristiques de ce tissu. Pourtant, l'ADN est identique dans toutes les cellules d'un organisme

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donn, car tous les organismes complexes se dveloppent partir d'une cellule unique, forme lors de la fcondation. L'ADN de cette premire cellule se divise de nombreuses fois et se rplique fidlement au fil du dveloppement dans toutes les cellules filles.

Lnigme de la diffrenciation. Comment lexpliquer ? C'est pendant l'embryogense que les cellules acquirent la capacit d'exprimer certains fragments de leur ADN, les gnes l'exclusion des autres (chez homme 100.000 gnes)

Reprsentation dun gne On sait que le processus de diffrenciation est orchestr par une interaction entre l'ADN et diffrentes protines. Celles-ci agissent sur l'ADN des moments prcis et activent ou inactivent tel ou tel gne spcifique. Dans les cellules, l'ADN est associ des structures composes de multiples protines pour former la chromatine. Certaines de ces protines, comme les histones, sont communes tous les gnes alors que d'autres, qui activent ou inactivent les gnes auxquels elles sont associes sont spcifiques de ceux-ci. La disposition et la rpartition des protines qui interagissent avec l'ADN dterminent si la chromatine d'un gne se prsente sous une conformation active permettant sa transcription ou sous une forme inactive qui rduit le gne au silence. Ce sont ces diffrentes interactions entre protines et ADN qui expliquent comment le mme gnome peut exprimer diffrentes fonctions dans diffrentes cellules. En outre, les vertbrs, mais aussi les vgtaux et les bactries, disposent d'un mcanisme qui confre l'ADN une identit spcifique de cellule. Leur gnome est modifi par un processus enzymatique qui attache l'ADN de petits groupes chimiques, les groupements mthyle (CH3). La mthylation de l'ADN est une modification de l'une des quatre bases azotes (thymine, adnine, guanine et cytosine) de l'ADN. Cette modification consiste en l'ajout d'un groupement mthyle (-CH3) la place d'un atome d'hydrogne. Bien que les quatre types de base puissent tre mthyls, la cytosine est la plus frquemment mthyle.
GENE

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Le groupement CH3 se fixe la cytosine mais seulement lorsque celle-ci se trouve ct d'une autre base, la guanine (squence CG). Cependant, la mthylation ne concerne pas toutes les squences CG du gnome, mais seulement 80 % d'entre elles environ.

Mthylation de la cytosine

Le groupement CH3 s'ajoute au carbone 5 de la cytosine. L'une des caractristique importante de la mthylation de l'ADN est le fait que les groupements mthyles se loge dans le grand sillon de l'ADN sous forme B, dont la conformation en double hlice tourne vers la droite, est l'agencement naturel de l'ADN quand l'humidit est leve et la salinit basse et la forme d'ADN la plus commune dans l'organisme. Ce changement a non seulement d'importantes rpercussions sur le gnome, puisque c'est la structure mme de l'ADN qui est modifie, mais il modifie radicalement les interactions des protines avec l'ADN Alors que chaque cellule humaine contient 100 000 gnes, seulement un petit nombre d'entre eux est activ dans une cellule en fonction du stade du dveloppement de l'organisme, du type cellulaire, de signaux extrieurs l'organisme... Le fait que les groupements mthyle dans le gnome se caractrisent par une distribution spcifique de chaque type cellulaire a conduit les biologistes penser qu'ils jouent un rle important dans la programmation de l'expression des gnes propre chaque cellule. De fait, une longue srie d'expriences ralises dans de nombreux laboratoires a rvl que l'tat de mthylation d'un gne traduit son tat d'activit. Dans la plupart des cas dcrits jusqu' prsent, la mthylation de rgions ou sites rgulateurs prcis d'un gne rduisent ce dernier au silence. En effet, puisque seulement une fraction des gnes d'une cellule s'exprime, le reste des gnes doit tre inactiv. Chaque type de cellule aurait donc un patron de mthylation qui dterminerait quels gnes sont activs. Ce patron serait hritable aux cellules filles aprs une division cellulaire, c'est pourquoi le type cellulaire reste gnralement le mme dans une mme ligne de cellule. On a galement observ que les patrons de mthylation sont spcifiques aux tissus, c'est--dire qu'ils sont diffrents pour chaque type cellulaire.

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Mthylation et expression des gnes On a galement compris selon quels mcanismes molculaires le gne est inactiv. La prsence d'un groupement mthyle en un site prcis empche l'interaction entre le gne et les protines activatrices, c'est-dire les facteurs de transcription. Mais il arrive, l'inverse, aussi que la mthylation de la rgion rgulatrice d'un gne attire des protines spcifiques qui reconnaissent l'ADN mthyl. Lorsqu'elles interagissent avec le gne, ces protines en recrutent d'autres qui bloquent la capacit d'expression du gne en gnrant une chromatine de structure inactive

Transcription normale

stimule ARN polymrase transcrire le gne Protine activatrice

Promoteur
Transcription seffectue

Site amplificateur Site dinitiation

Gne transcrire

En fait, la mthylation modifie beaucoup les interactions entre les protines et l'ADN. Les enzymes de restriction ont une forte affinit pour les sites non-mthyls et une affinit et une activit rduite pour les sites mthyls. De plus, il semble que la mthylation des rgions rgulatrices correspond l'inactivation des gnes.

Prsence de groupes mthyles

Pas de transcription

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Les groupes CH3 empchent les facteurs dactivation de se fixer sur le site damplification, et au promoteur et lARN polymrase de se fixer sur le site dinitiation. D'autre part, la 5-mCyt semble empcher la fixation des activateurs de transcription ou favoriser la fixation des inhibiteurs.
Des rpresseurs peuvent se lier spcifiquement sur les groupes CH3 Transcription ne peut dbuter

Ces rpresseurs empchent lARN polymrase de transcrire le gne

On a trouv que la rpression dpendait de la densit de mthylation du gne. Un gne faiblement mthyl peut inhiber un gne compltement, mais l'inhibition sera contrecarre par l'effet des amplificateurs, des squences de nuclotides loignes du promoteur o se fixent des protines stimulant la transcription

Quel est le rle vritable de la mthylation ? La relation entre la mthylation et l'expression des gnes ne peut tre mise en doute. La mthylation intervient aussi dans la rparation de lADN et joue un rle dans la capacit de lorganisme rparer les cellules endommages avant quelles ne deviennent cancreuses. Aprs lsion du DNA, les enzymes de rparation vont tre impliqus pour une transmission fidle du DNA. Les mcanismes appels conservatifs maintiennent l'intgrit de l'information gntique. Ils sont constitutifs et toujours prsents dans la cellule, prts intervenir tout instant. On dcrit des insrases, des glycosylases et mthyltransfrases qui rparent les liaisons localises une base. En cas de lsion plus importante, le mcanisme d'excision et de resynthse intervient, faisant appel aux protines de reconnaissance uvrA, uvrB et uvrC (uvr pour ultraviolet rays), l'endonuclase, l'exonuclase, l'ADN polymrase puis une ligase. Les mcanismes de rparation 'fautifs' (systme SOS) prennent le relais des systmes de rparation conservatifs. En cas d'une agression massive, les systmes conservatifs sont saturs, pouvant aboutir la mort cellulaire. Les systmes fautifs supplent au prix d'un manque de fidlit dans la transmission du code gntique La mthylation des protines (par dautres mthyltransfrases que lADN mthyltransfrase) est essentielle la communication entre les cellules par lactivation des rcepteurs membranaires tandis que la mthylation des phospholipides, permet de maintenir la flexibilit et la permabilit des membranes cellulaires, indispensables

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aux changes entre les cellules. La mthylation est ncessaire la fabrication de notre plus important antioxydant qui est le Glutathion. Elle fabrique aussi l'adrnaline partir de la norpinphrine, et la mlatonine partir de la srotonine et rgule en grande partie lactivit crbrale. Outre le cerveau, le foie utilise aussi la mthylation pour effectuer son rle de dtoxification de lorganisme.

Insuffisance de Mthylation Les effets de la sous-mthylation peuvent tre observs dans le vieillissement prmatur, le cancer, les maladies cardio-vasculaires, les affections hpatiques, la dpression. Toutes les ractions de mthylation exigent de la Sadenosylmethionine (SAMe) qui est fabrique dans le corps partir de la mthionine et de l'ATP. applications Puisque le SAMe est la substance de mthylation par excellence, tout ce qui puise le SAMe abaisse la mthylation. Tout ce qui entrave la synthse de l'ATP (tel que l'alcool) puisera le SAMe. Le manque de vitamines B6, B12 et acide folique applications puisera galement le SAMe. Si la squence des quatre bases de l'ADN est la mme dans tous les tissus, le gnome n'est pas partout marqu de la mme faon par la mthylation.

Comment est gnre cette diversit des motifs de mthylation ? Trois mcanismes interviennent dans la mise en place de la distribution des groupements mthyle. 1. Aprs la fcondation, le schma de mthylation hrit des parents est effac pour permettre la mise en place d'un nouveau schma dans l'embryon. C'est ce que l'on appelle la dmthylation globale. 2. Une fois que les diffrents types cellulaires de l'embryon sont forms, des groupements mthyle sont transfrs en des sites spcifiques de l'ADN par une enzyme, l'ADN mthyltransfrase, qui catalyse leur transfert partir d'une molcule donneuse, appele S-adnosyl-mthionine (SAM) : c'est la mthylation de novo . 3. Enfin, lorsque le schma de mthylation d'un type cellulaire est tabli, il est fidlement reproduit par l'ADN mthyltransfrase. Cest la mthylation de maintenance.

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Mthylation de lADN et cancer Longtemps, la quasi-totalit des biologistes restrent persuads que la mthylation de lADN ntait quun phnomne pigntique sans importance, un piphnomne sur lequel il ne fallait pas sattarder. Depuis le dbut des annes 1990, la mthylation de lADN est considre comme un phnomne majeur. Il y a dj 20 ans, des cancrologues de Baltimore avaient montr que les cellules cancreuses peuvent prsenter des aspects inhabituels de la mthylation de l'ADN. Des altrations relatives la mthylation de lADN sont prsentes dans plus de 65 % des cancers. Victimes dun excs de mthylation, des gnes suppresseurs de tumeurs (p53, p21) sont anormalement rduits au silence et ne peuvent plus freiner la croissance tumorale. Pour le chercheur belge F. Fuks, un des spcialistes de la mthylation de lADN (ULB-FNRS) , ce processus a 2 caractristiques essentielles : dune part, elle est un marqueur de silence des gnes dautre part, elle ne sopre pas au hasard, mais en des positions bien prcises du gnome. On a longtemps tudi la rgulation des gnes en se focalisant sur leur activation, alors quil apparat aujourdhui que la rpression de lexpression est une cl dimportance similaire pour le devenir de la cellule. En ralit, la mthylation de lADN ne fait pas cavalier seul. Un autre lment semble agir de concert avec elle pour rguler lexpression des gnes : la structure dune entit compacte mais dynamique, la chromatine ouverte (expression du gne) ou ferme (gne silencieux) La chromatine est la substance constitutive du noyau. Elle se condense lors de la division cellulaire pour former les chromosomes. Son unit de base est le nuclosome, association de lADN et de protines, les histones. Quand on parle dun changement de structure de la chromatine, on se rfre la modification des histones par des enzymes dites modificatrices de la chromatine (HMT fermeture, HDAC ouverture). Les histones sont les protines basiques de la chromatine (pH voisin de 10). On trouve 5 types dhistones qui se distinguent par leur richesse en lysine et arginine et par leur mobilit lectrophortique. H1 trs riche en lysine H2A et H2B, modrment riche en lysine H3 et H4 riches en arginine H2A, H2B, H3 et H4 sont prsentes dans la chromatine en quantit quimolculaires et tendent se combiner entre elles ainsi qu un fragment dADN de 140 paires de nuclotides .

Les histones peuvent tre phosphoryles sur les srines et thronines, actyles et mthyles sur lamine distale des lysines par des enzymes spcifiques.

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H1 est prsente en quantit deux fois plus petite que les autres et forme un pont entre le nuclosome et lADN voisin. La phosphorylation de H1 pourrait tre le signal dclenchant de la mitose en provoquant la condensation des chromosomes au cours du cycle cellulaire. Lactylation de H3 et H4 pourrait tre un signal de mise en activit des gnes, la mthylation une interruption du signal. Les modifications pigntiques sont probablement aussi importantes que les mutations gntiques dans lapparition et le dveloppement des cancers. Et mme dans la plupart des cas, plusieurs mcanismes gntiques et pigntiques se conjuguent. La cancrognse est multifactorielle et la combinaison de ces deux types de dfauts aboutit une activation doncognes et/ou une dsactivation de gnes suppresseurs de tumeurs. Mais contrairement aux mutations, les phnomnes pigntiques (mthylation de lADN, fermeture de la chromatine) sont rversibles. Ladministration de drogues inhibant la mthylation de lADN a conduit des rmissions chez certains cancreux mais sans aucune slectivit. La dcouverte inattendue d'une enzyme capable de briser cette carapace molculaire ouvrirait d'immenses perspectives. Plusieurs quipes ont mis en vidence des altrations multiples de la mthylation de l'ADN dans les cellules tumorales. Cependant, ces modifications vont dans un sens qui ne rpond pas un modle simple. Si les cellules cancreuses sont globalement hypomthyles, certains gnes - et surtout les gnes dits suppresseurs de tumeurs dont le rle est de freiner la croissance tumorale - sont hypermthyls, comme l'ont montr plusieurs quipes dont celle de Stephen Baylin John Hopkins. Le mystre de la dmthylation a persist jusqu' ces derniers temps.

Comment interprter la coexistence d'une hypomthylation globale et d'une hypermthylation localise dans les cellules cancreuses? Une hypothse a t propose pour expliquer cette hypermthylation des gnes suppresseurs de tumeurs : le gne codant l'ADN mthyltransfrase s'exprimerait davantage dans les cellules cancreuses que dans les cellules saines. De fait, beaucoup de processus connus pour transformer une cellule normale en cellule cancreuse majorent le niveau d'expression de l'ADN mthyltransfrase. En se fondant sur cette observation, on peut supposer que cette enzyme est un acteur crucial et commun de nombreux mcanismes de cancrisation. L'ADN mthyltransfrase pourrait donc tre la cible de traitements anticancreux, et ses inhibiteurs pourraient bloquer la croissance tumorale. (De tels inhibiteurs sont d'ailleurs actuellement l'tude en tant qu'agents anticancreux dans le cadre d'essais de phase I conduits par l'entreprise MethylGeneInc. Montral)

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Ce modle est sduisant, mais subsiste une question gnante. Pourquoi le gnome des cellules cancreuses est-il globalement hypomthyl si ces cellules expriment abondamment l'ADN mthyltransfrase ? Comme la dmthylation globale se produit un stade trs prcoce de l'embryogense, suite laction probable dune dmthylase, on pense que les cellules cancreuses expriment sans doute, elles aussi, une dmthylase. A partir de cellules de cancer bronchique, on a pu isoler et purifier une fraction protique ayant une activit de dmthylation de l'ADN. Elle a pour le dinuclotide CG la mme spcificit que l'ADN mthyltransfrase. En effet, seules sont dmthyles les cytosines appartenant une squence mCG, l'exclusion de toutes celles faisant partie de squences diffrentes. Cette dmthylase existe et catalyse une raction nouvelle, o le groupement hydroxyle (OH) de l'eau ragit avec le groupement mthyle pour donner du mthanol, le proton libre de la molcule d'eau ragissant alors avec l'anneau de la cytosine pour reconstituer la molcule.

Dimportantes questions restent en suspens ! D'abord, les vertbrs possdent-ils d'autres ADN dmthylases, et jouent-elles des rles diffrents au cours du dveloppement ? Ensuite, y a-t-il dmthylation dans les cellules totalement diffrencies qui ne se divisent pas ? Comme la dmthylase pourrait avoir la capacit de supprimer la mthylation de l'ADN qui ne se rplique pas, il se peut que la mthylation soit un signal transitoire d'activation ou de dsactivation des gnes, non seulement pendant le dveloppement, mais galement chez l'animal pleinement diffrenci. Si tel est le cas, nous sommes peut-tre passs ct de tout un pan de la rgulation physiologique des gnes. La dmthylase peut-elle servir reprogrammer des cellules diffrencies pour les faire redevenir plus primitives et pluripotentes ? Ces cellules pourraient-elles alors tre utilises pour des clonages et des transplantations exprimentales et thrapeutiques ? A quoi tient la spcificit de la dmthylase ? Pourquoi la dmthylation ne porte-t-elle que sur certaines squences mme lorsque la dmthylase est prsente ? L'hypomthylation globale est l'un des faits les plus constants dans le cancer : la dmthylase est-elle, tout comme l'ADN mthyltransfrase, surexprime dans les cellules cancreuses ? Les rgions hypomthyles dans ces cellules jouent-elles un rle important dans le contrle de leur multiplication ? La dmthylase joue-t-elle un rle causal dans le cancer et si oui, reprsente-t-elle alors une cible unique et spcifique pour mettre au point de nouveaux traitements anticancreux? Le fonctionnement des cellules cancreuses fait souvent intervenir des reprogrammations pigntiques. Le risque de cancer li la mthylation pourrait tre le prix payer pour lutilisation de la mthylation dans le dveloppement embryonnaire ?

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Personne ne remet en cause le fait que ce sont des mutations au niveau du gnome qui expliquent lapparition de nouveaux gnotypes ou phnotypes. Le cancer reste une maladie de lADN. De nombreuses observations font remarquer que la plupart de ces changements ne rsultent pas de mutations accidentelles alatoires (Monod : le hasard et la ncessit) mais de modifications du mode dexpression et de rorganisation du gnome au cours de processus qui nont rien dalatoire. Ils ont t slectionns depuis lorigine parce quils aidaient lindividu mieux valoriser ses ressources gntiques et biochimiques, ce sont des mutations immdiatement adaptatives, qui permettent de faire face des contraintes nouvelles, gnralement transmises aux descendants. Lhomme doit sadapter aux changements, sinon il sera limin. On trouve des adaptations : culturelles qui concernent son mode de vie et sont transmises par imitation des modifications du gnome, transmissibles aux descendants par les lois de lhrdit (Mendel) qui sont gntiques avec changement de la squence des nuclotides et/ou pigntiques par dstabilisation du gnome, sans changement de squence. Les nouvelles techniques de gnie gntique montrent que des facteurs extrieurs rsultant de linteraction de lindividu avec son environnement, peuvent modifier lexpression des gnes ou des parties non codantes de lADN, soit de modifier les gnomes eux-mmes en y introduisant des lments codants emprunts des organismes extrieurs. Vos ractions, vos avis cafaitdebat@labosp.com